Genetiškai reguliuojami kepenų nuorašai ir keliai, nustatantys hematologinius, biocheminius ir kūno sudėjimo bruožus | mokslinės ataskaitos

Genetiškai reguliuojami kepenų nuorašai ir keliai, nustatantys hematologinius, biocheminius ir kūno sudėjimo bruožus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Genų išraiška
  • Genų ekspresijos profiliavimas

Anotacija

Kepenys yra pagrindinis medžiagų apykaitos organas ir pasižymi pagrindinėmis hematologinių savybių funkcijomis. Kiaulės modelyje (n = 297) buvo įvertinti kepenų ekspresijos, hematologiniai, biocheminiai plazmos ir kūno sudėjimo požymiai, siekiant nustatyti specifinius audiniams genetinius variantus, turinčius įtakos imuninės metabolizmo koreliuotų ekspresijos tinklų funkcijai. Esant FDR (klaidingų atradimų dažniui) <1%, daugiau kaip 3600 nuorašų buvo koreliuojami kartu (r = | 0, 22–0, 48 |) su bruožais. Funkcinio praturtinimo analizė parodė bendrus metabolinių ir imuninių bruožų ryšius. Siekiant suprasti, kaip imuninis ir metabolinis požymiai paveikiami genų ekspresijos genetiniu reguliavimu, buvo įvertinti eQTL. Buvo nustatyti 20517 reikšmingi (FDR <5%) 1401 nuorašų eQTL, iš kurių 443 nuorašai buvo susieti su bent vienu iš tirtų požymių ir turėjo cis-eQTL (pvz., ACO1 (6, 52 × 10 −7 ) ir SOD1 (6, 41 ×) Šis tyrimas pateikia išsamų kepenų genų veiklos vaizdą, susiejantį metabolinius ir imuninius bruožus kiaulės modelyje medicininiams tyrimams.

Įvadas

Kepenys yra ypač svarbios, atsižvelgiant į gyvybiškai svarbų vaidmenį palaikant homeostazę ir sveikatą bei reguliuojant maistinių medžiagų vartojimą. Atitinkamai, įžvalgos apie kepenų ekspresijos profilių reguliavimą gali turėti įtakos bruožams, susijusiems su fiziniu ir metaboliniu vientisumu. Su riebumu ir kūno sudėjimu susijusios savybės yra svarbios ne tik kaip ekonominiai kiaulienos gamybos veiksniai, bet ir dėl jų ryšio su sunkiomis žmonių ligomis 1, 2 . Kiaulės turi daug panašumų su žmonėmis savo fiziologija ir genomu, todėl yra geras pavyzdys medicininiams tyrimams, įskaitant organų transplantacijos tyrimus 3 .

Atitinkamai, mes panaudojome ekspresijos analizę kepenyse, norėdami nustatyti genus, susijusius su kraujo plazmos hematologiniais ir biocheminiais požymiais, kurie galėtų būti „kepenų funkcionavimo“ biomarkeriai ir kaip imuninės ir metabolinės būklės pakaitalai. Tačiau sudėtingų bruožų kitimai priklauso ne tik nuo pavienių kepenų genų raiškos profilio, bet ir nuo genų tinklų bei nuorašų. Todėl mes toliau atlikome svertinę genų saviraiškos tinklo analizę (WGCNA), kad sistemiškai įvertintume kelius, kuriais bendrai išreikšti genai yra sujungti. Taigi mes gavome tikslesnį parametrų rinkinį, kuris gali būti naudojamas kaip pagrindiniai ūminės metabolinės ir imuninės būklės, veikiamos kepenų funkcijose, biomarkeriai arba kaip genetiškai nustatytų metabolinių ir imuninių galimybių numatytojai.

„Expression-QTL“ (eQTL) analizė integruoja genų ekspresijos lygius ir viso genomo genotipo informaciją, kad būtų galima nustatyti genetinius variantus, susijusius su genų ekspresijos pokyčiais. Sudėtingų požymių variacijos daugiausia atspindi polimorfizmus, turinčius įtakos reguliuojančioms sekoms, o ne koduojančioms sekoms. Analizuotų genų ir žymenų padėties žinojimas leidžia diferencijuoti cis- ir trans-eQTL 4 . Anksčiau mes parodėme, kad nuo bruožų priklausomų išreikštų genų aptikimas atitinkamame audinyje palengvina genų, susijusių su sudėtingais bruožais, tokiais kaip raumenų ir mėsos savybės bei elgesio elgesys, nustatymą; šie genai žymi stiprius kandidatus genus 5, 6 . EQTL tyrimai žmogaus kepenyse leido nustatyti genus, susijusius su klinikiniais fenotipais, ir sudarė pagrindą farmakogenomikai 7 .

Atsižvelgiant į pagrindinį kepenų vaidmenį kontroliuojant metabolinės ir imuninės sistemos homeostazę, kūno sudėjimą ir visus riebalų bruožus, mes hipotezėme, kad šių bruožų kitimas iš esmės gali atspindėti kepenyse aktyvius genus ir metabolizmo kelius. Čia apibūdinome kepenų transkripcijos profilius ir jų raiškos genetinį reguliavimą kartu su kiaulių imuniniais ir metaboliniais bruožais. Kepenų ekspresijos požymių koreliacija, saviraiškos sąveikos analizė ir eQTL nustatymas suteikia bendrą ryšį kepenų funkcijų hematologiniams, biocheminiams ir klinikiniams-cheminiams biomarkeriams, prisidedantiems prie metabolinės homeostazės, įgimtos gynybos ir atsparumo. Šios žinios suteikia racionalų pagrindą ne tik suprasti kiaulių fiziologiją, bet ir kiaulių modelius, naudojamus žmonių medicininiuose tyrimuose.

Rezultatai

Su kepenų bruožais koreliuojama išraiška

2990 asmenų 24904 kepenų nuorašų raiškos lygiai buvo koreliuojami su imuninės ir metabolinės būklės biomarkeriais, įskaitant hematologinius, biocheminius ir kūno sudėjimo bruožus. Visi šių požymių matavimai ir aprašymai pateikti 1 papildomoje lentelėje. Hematologiniai požymiai yra trys komponentai: leukocitai (baltųjų kraujo ląstelių skaičius: WBC, limfocitų skaičius: LYM), eritrocitai (eritrocitų skaičius: RBC, hemoglobino koncentracija: HGB). hematokrito lygis: HCT, vidutinis smegenų kraujo tūris: MCV, vidutinis smegenų kraujo tūris: MCH, vidutinė korpuskulinio hemoglobino koncentracija: MCHC, raudono pasiskirstymo plotis: RDW) ir trombocitų (trombocitų: PLT, vidutinis trombocitų tūris: MPV, trombocitų: PCT) ir atitinkami ląstelių skaičiai yra imuninės ir (arba) uždegiminės reakcijos žymekliai 8, 9 . Esant FDR reikšmingumo ribai <1%, mes aptikome 5387 nuorašus, rodančius ryšius su bent vienu iš 12 tirtų hematologinių požymių. Koreliacija tarp raiškos lygių ir hematologinių požymių svyravo | 0, 22–0, 48 |. Dauguma nuorašų buvo koreliuojami su leukocitais ir eritrocitais, o keli nuorašai buvo susiję su trombocitais.

Norint dar labiau patikslinti genų, turinčių požymių koreliuojamą išraišką, rinkinių funkcinę anotaciją, jų priskyrimas kanoniniams keliams buvo ištirtas naudojant „Ingenuity Pathway“ žinių bazę. Biologinės funkcijos, susijusios su požymiu koreliuojančia išraiška, parodytos 1A pav. Ir 2A papildomoje lentelėje. Ūminės fazės atsako signalo perdavimas ir kepenų fibrozės / kepenų stelatinių ląstelių aktyvacija buvo koreliuojamos su LYM ir WBC. Dauguma su eritrocitais susijusių požymių buvo koreliuojami su oksidaciniu fosforilinimu, mitochondrijų disfunkcija ir Efrin A signalu. Krešėjimo sistema ir komplemento sistema koreliavo su trombocitais susijusiais bruožais.

Image

Kanoniniai nuorašų keliai koreliuoja su ( A ) hematologiniais požymiais, ( B ) biocheminiais požymiais ir ( C ) kūno sudėjimo fenotipu. Šilumos žemėlapis, parodantis nuorašų, susijusių su kanoniniais keliais, koreliaciją su fenotipais; spalvos intensyvumas rodo reikšmingumą nuo šviesios iki tamsios.

Visas dydis

Tiriant koreliacijas su 8 biocheminiais požymiais (albuminas: ALB, amoniako azotas: NH3, karbamido azotas: BUN, bendras cholesterolis: TCHO, trigliceridas: TG, gliukozė: GLU, neorganinis fosforas: IP, kreatininas: CREA), buvo tiriami ryšiai su kepenų raiškos profiliai. Esant FDR reikšmingumui <1%, 6321 nuorašai buvo koreliuojami su bent vienu biocheminiu bruožu, kai r = | 0, 22–0, 41 | Kanoniniai keliai, tokie kaip ūmaus fazės atsako signalizavimas, rodė artimiausią ryšį su CREA, TCHO ir BUN. TCHO, TG ir GLU koreliuojami genai buvo susieti su bendrais PXR / RXR aktyvavimo, FXR / RXR aktyvavimo ir TR / RXR aktyvavimo kanoniniais keliais (1B pav.; 2B papildoma lentelė).

Buvo ištirti kūno sudėjimo bruožai, siekiant apibūdinti metabolinių galutinių produktų fenotipus. Iš viso 11 bruožų, įskaitant 6 riebalų bruožus (riebalų gylis ties petimi: FDS, riebalų gylis ties dešimtu šonkauliu: FDTR, nugarinės riebalų gylis ties juosmeniu: FDL, vidutiniai nugaros riebalai: ABF, riebalų plotas: FA, raumenų riebalų kiekis: MLDIMF ), Buvo naudojami 3 raumenų bruožai (akių srities sritis: LEA, baltymų kiekis: MLDP, raumenų ir riebalų santykis: MFR), kūno svoris (BW) ir kūno ilgis (BL). Esant FDR reikšmingumui <1%, 2571 nuorašai buvo koreliuojami su bent vienu kūno sudėjimo bruožu, kai r = | 0, 22–0, 44 | Su riebalų savybėmis koreliuojamų nuorašų sąrašas buvo susijęs su kanoniniais LPS / IL-1 tarpininkaujamo RXR funkcijos slopinimo keliais, TR / RXR aktyvacija, LXR / RXR aktyvacija, PXR / RXR aktyvacija ir ksenobiotinio metabolizmo signalizavimu. Raumenų bruožų sąrašas buvo praturtintas IGF-1 signalizacijos, alanino biosintezės II, alanino III skilimo, fenilalanino I skilimo ir gliukokortikoidų receptorių signalizacijos signalu (1C pav.; 2C papildoma lentelė).

Iš viso 10064 iš 24904 nuorašų buvo koreliuojami su bent vienu iš surinktų imuninės ir metabolinės būklės požymių, žymiai persidengiant tarp bruožų grupių (2 pav. A). Iš tikrųjų 2661 nuorašai buvo įprasti tarp hematologinių ir biocheminių požymių, o 1282 nuorašai buvo įprasti biocheminiams ir kūno sudėjimo fenotipo bruožams, o 795 nuorašai pasidalino tarp hematologinių ir kūno sudėjimo fenotipo bruožų, o 528 nuorašai buvo bendri visoms imuninėms ir metabolinėms būsenoms. bruožai. Transkriptų, susijusių tik su hematologiniais, biocheminiais ir kūno sudėjimo bruožais, skaičius buvo atitinkamai 2459, 2906 ir 1022.

Image

( A ) Kepenų nuorašų, koreliuotų su hematologiniais ir biocheminiais, taip pat kūno sudėjimo bruožais, skaičius. ( B ) Kepenų nuorašų, koreliuotų su hematologiniais ir biocheminiais požymiais, skaičius ir kūno sudėjimo bruožai, turintys cis eQTL poveikį.

Visas dydis

Kepenų saviraiškos ir su bruožais susiję saviraiškos moduliai

Mes tyrėme transkripcijos pokyčius ne tik atskirų genų lygiu, bet ir atsižvelgiant į genų sąveiką. Taigi WGCNR buvo atlikta naudojant 24904 kepenų nuorašų transkripto duomenis. Penki moduliai buvo labai koreliuojami su fenotipais, kaip parodyta 3 pav. Kiekvieno modulio išraiškos nuorašai buvo priskirti kanoniniams keliams. Raudonos spalvos modulis buvo labai koreliuotas su leukocitų skaičiumi, o žalias modulis buvo labai koreliuotas su eritrocitų skaičiumi. Magenta modulio viršutiniai labai sujungti stebulės genai buvo SOCS3, LOC100154449, JUNB, BTG2 ir IL4R . Raudonos spalvos modulio nuorašai buvo siejami su ūmios fazės atsako signalu, tuo tarpu žaliojo modulio nuorašai buvo mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo komplekso, užkoduoto mitochondrijų genome, pagrindiniai komponentai (4 pav.). Žaliajame modulyje labai sujungti stebulės genai buvo MT-ATP6, MT-ND4L, MT-CO3, MT-ATP8 ir MT-ND5 . Trombocitų skaičius buvo šiek tiek koreliuojamas su raudonu moduliu, kuris buvo praturtintas genais, priklausančiais HIPPO signalizacijai. Raudoname modulyje labai sujungti stebulės genai buvo LOC102159151, LOC102159016, CD86, LOC100511343 ir MAB21L3 . Kūno sudėjimo bruožai, susiję su raumenų mase, buvo koreliuojami su purpuriniu moduliu, tuo tarpu riebalų savybės buvo labiau koreliuojamos su cianiniu moduliu. 85 purpurinio modulio nuorašai buvo praturtinti aktyvinant PXR / RXR, priešingai nei 65 pavyzdžiai cianiniame modulyje, koduojančiame daugelį genų, susijusių su cholesterolio biosinteze (4 pav.). Labiausiai sujungti stebuliniai genai cianiniame modulyje buvo ACACA, ACSS2, EBP, GPAM, GPAT ir THRSP . Biocheminiai požymiai, tokie kaip ALB, GLU ir TG, buvo koreliuojami su purpuriniu moduliu. PPP1R3C, G6PC, PPP1R3B, SLC25A25, SGK1 buvo labiausiai sujungti genai purpuriniame modulyje.

Image

Svertinė genų saviraiškos tinklo analizė (WGCNA) suskirsto genus į modulius, remiantis geno saviraiškos modeliais. Kiekvienas modulis buvo pažymėtas unikalia spalva kaip identifikatorius. 5 moduliai rodo labai reikšmingą ryšį su kūno sudėjimu, biocheminiais ir hematologiniais bruožais. Kiekvienoje ląstelėje viršutinės vertės yra koreliacijos koeficientai tarp modulio savybių ir bruožų; mažesnės vertės yra atitinkamos p vertės.

Visas dydis

Image

Šilumos žemėlapis, parodantis bruožų koreliuojamų ir kartu išreikštų nuorašų modulių koreliaciją su kanoniniais keliais; spalvos intensyvumas rodo reikšmingumą nuo šviesios iki tamsios.

Visas dydis

Kepenų eQTL

Skaitmeninė viso genomo asociacijos tyrimo apie genų ekspresijos lygius kepenyse (eQTL) santrauka parodyta 1 lentelėje. Iš viso 20517 reikšmingų eQTL, atitinkančių 1401 zondų rinkinius, pasiekė FDR ribą <5% ( p <10 −7 ). Šiuo reikšmingumo lygiu 11366 SNP buvo susieti su 1075 anotuotų nuorašų išraiška, o 6865 eQTL buvo identifikuoti kaip cis, priklausantys 1028 zondo rinkiniams (814 anotuotų nuorašų) (3 papildomoji lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Kepenų cis-eQTL ir plazmos hematologiniai bruožai

341 nuorašo išraiškos lygiai buvo reikšmingai koreliuojami su hematologiniais požymiais, susijusiais su SNP, atskleidžiant 2439 eQTL. Didžiausią dėmesį skiriant cis reguliavimui, iš 219 nuorašų buvo nustatyti 808 cis-eQTL, kurie buvo reikšmingai koreliuojami (FDR <1%) su vienu iš hematologinių požymių (4 papildoma lentelė). Požymiams, susijusiems su raudonaisiais kraujo kūneliais, mes nustatėme 47 anotuotus nuorašus su eQTL, rodančiais požymių koreliaciją su RBC, įskaitant 6 HCT, 12 HGB, 27 MCV, 9 MCH, 22 MCHC ir 1 RDW lokusus. Superoksido dismutazė 1 ( SOD1 ) buvo vienas iš nuorašų, kurie buvo labai neigiamai koreliuojami su HCT ir RBC ir parodė cis-eQTL, kurio p vertė svyravo nuo 6, 08 × 10 –10 iki 6, 41 × 10 –30 (5 pav. A). SNP ASGA012109, esantis sąsajos pusiausvyros regionuose, kuriuose yra 205–206 Mb 13 chromosomos (5 pav. B), buvo labai susijęs su SOD1 lygiais (5 pav. C). Dauguma anotuotų įrašų (72 nuorašai) buvo koreliuojami su LYM ir WBC. Iš viso mes nustatėme 5 anotuotus nuorašus, koreliuojamus su MPV, ir 2 anotuotus nuorašus, susijusius su PLT ir PCT. Visi kepenų nuorašai su cis-eQTL, kurių raiškos lygiai buvo koreliuojami su hematologiniais požymiais, 6 pav. Pateikiami kaip tinklas.

Image

( A ) Manhattan SOD1 cis-eQTL diagrama, labai susijusi su SNP ASGA0102109 esant 205, 6 Mb 13-osios chromosomos (SSC13). ( B ) Ryšio pusiausvyros regionai svyruoja nuo 205–206 Mb SSC13, o SOD1 žvaigždės padėtis yra ties 205, 6 Mb. ( C ) ASGA0102109 lokusų genotipas, susijęs su SOD1 nuorašo lygiais.

Visas dydis

Image

Kiekvienas mazgas žymi hematologinius bruožus (mėlyną), sujungtą su įvairiais nuorašais (pilka). Kai kurie nuorašai yra sujungti su daugiau nei vienu mazgu.

Visas dydis

Kepenų cis-eQTL ir plazmos biocheminiai požymiai

Buvo 447 nuorašai, koreliuojami su biocheminiais požymiais, esant reikšmingam 1% FDR lygiui, kurie taip pat buvo siejami su 3554 eQTL, įskaitant 1148 cis-eQTL iš 289 nuorašų (5 papildoma lentelė). Dauguma nuorašų buvo koreliuojami su IP (120), po to sekė BUN (73) ir CREA (62). Mes nustatėme 24 nuorašus, koreliuojamus su ALB, 29 nuorašus, susijusius su GLU, 33 nuorašus, susijusius su TG, 12 nuorašų, susijusių su TCHO, ir tik 4 nuorašus, susijusius su NH3. Kai kurie nuorašai buvo koreliuojami su daugiau nei vienu biocheminiu bruožu. Atitinkamas nuorašų tinklas parodytas 7 pav.

Image

Kiekvienas mazgas žymi biocheminius požymius (žalius), susijusius su įvairiais nuorašais.

Visas dydis

Kepenų cis-eQTL ir kūno sudėjimas

Iš viso 152 nuorašai, kurių išraiškos lygiai buvo koreliuojami su kūno sudėjimo bruožais, pateikė 1582 eQTL, įskaitant 645 cis-eQTL iš 106 nuorašų (6 papildoma lentelė). Dauguma nuorašų buvo koreliuojami su skerdenos bruožais (kūno svoris (172) ir ilgis (80)) skerdžiant. Transkriptų, koreliuotų su riebalų / raumenų bruožais, skaičius svyravo nuo 6–104. Šių nuorašų tinklas parodytas 8 pav.

Image

Kiekvienas mazgas žymi kūno sudėjimo bruožus (raudona), sujungtus su įvairiais nuorašais (pilka). Kai kurie nuorašai yra sujungti su daugiau nei vienu mazgu.

Visas dydis

Kepenų nuorašų genetinis reguliavimas prisideda prie bendrų imuninės ir metabolinės komplekso savybių

1028 nuorašai su cis-eQTL pirmiausia priklausė nuo LPS / IL-1 sąlygoto RXR funkcijos slopinimo, ksenobiotinių medžiagų apykaitos signalų ir glutationo tarpininkaujamos detoksikacijos kanoninių kelių. 443 iš 1028 nuorašų iš viso buvo koreliuojami su vienu iš šių imuninės ir metabolinės būklės surogatinių bruožų, žymiai persidengiant bruožų grupei (2 pav. B). Iš viso 114 nuorašai sutapo su hematologiniais ir biocheminiais požymiais, o 46 nuorašai pasidalino tarp biocheminių požymių ir kūno sudėjimo fenotipo, ir tik 24 nuorašai sutapo su hematologiniais požymiais ir kūno sudėjimo fenotipu. Tarp 443 nuorašų 13 buvo susiję su visų tipų bruožais, priklausančiais 10 anotuotų genų, įskaitant TLR5, KCTD2, SLC16A1, ACTR3B, SORL1, C5orf4, ABHD14B, TMSB10, MASP2 ir LIPC .

Diskusija

Šio tyrimo rezultatai pateikia išsamų kepenų transkripcijos kraštovaizdžio išpjaustymą, atitinkantį klinikinius imuninius ir metabolinius žymenis. Be to, tai yra pirmasis pranešimas apie imuninės ir metabolinės būklės žymenis ir kūno sudėjimą, koreliuojamą su kepenų mRNR ekspresijos profiliais. Be to, buvo išnagrinėta bendra išrašų išraiška naudojant gerai suprojektuotas ir apibūdintas „Snowball“ matricas 10 . WGCNA sugrupuoja panašaus profilio genus į modulius ir stebulės mazgus, kurie vaidina svarbų vaidmenį daugelyje tinklų, o stipriai sujungti stebuliniai genai taip pat vaidina svarbų vaidmenį biologijoje ir reguliavime 11, 12 . Buvo pranešta, kad daugelis šiame tyrime nustatytų stebulės genų, tokių kaip SOCS3 ir JUNB magenta modulyje, yra pagrindiniai makrofagų fagocitozės ir aktyvacijos transkripcijos moduliatoriai 13 . Stebulės genai violetiniame modulyje, tokie kaip PPP1R3B ir PPP1R3C, veikia kaip glikogeno fosforilazės kepenų glikogeno metabolizme 14 . Kiti žalsvos spalvos modulio stebulės genai, tokie kaip ACACA, GPAM, EPB ir ACSS2 , vaidina svarbų vaidmenį lipidų metabolizme.

Mes įvertinome viso genomo raišką kepenyse, kad nustatytume specifinius audiniams genetinius variantus, kurie daro įtaką imuninės metabolizmo koreliuojamų genų funkcijai. Kepenys yra nevienalytis audinys, turintis skirtingus ląstelių tipus; daugiau kaip 80% yra hepatocitai, o nedidelė populiacija yra cholangiocitai, žvaigždžių ląstelės, endotelio ląstelės ir kelios kraujodaros ląstelės. Transkripto gausos kitimas gali būti susijęs su ląstelių populiacijos kitimu arba ląstelių funkcijų pasikeitimu. Tačiau audinių mėginiai buvo paimti iš identiškų sveikų subrendusių kepenų, kurių ląstelių sudėtis normali, anatominės vietos. Be to, kepenų ląstelių sudėtis yra stabili ir šiame tyrime nagrinėjamas genetinio variacijos ir nuorašo gausos ryšys, pirmasis nepriklauso nuo ląstelių tipo. Šie variantai parodo priežastinį ryšį tarp SNP, genų ekspresijos ir imuninės-metabolinės būklės. Norėdami nustatyti genetinį poveikį raiškai, mes sutelkėme dėmesį į cis-eQTL, atsižvelgdami į SNP, esančius genominiuose languose šalia nuorašų. Šie regionai apima promotorius, stipriklius ir UTR, apimančius transkripcijos faktorių surišimo vietas ir reguliavimo elementus 15, 16 .

Kepenų nuorašų ir imuninės būklės genetinis reguliavimas

Eritrocitai

Gyvūnų modelyje buvo pranešta apie galimą eritrocitų, kaip kepenų mitochondrijų oksidacinės būklės pakaitinių biomarkerių, įvairialypėmis oksidacinėmis sąlygomis, vaidmenį 17 . Ankstesni tyrimai pranešė, kad fermentų, dalyvaujančių kepenų hemoso biosintezėje, defektai vaidina svarbų vaidmenį mitochondrijų energetiniame metabolizme, kaip parodyta Hmbs (- / -) pelių modelyje, kur žymiai sumažėja I, II ir III mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai 18. . Čia mes parodėme, kad kepenų energinis metabolizmas buvo susijęs su tokiais hematologiniais požymiais kaip MCV, MCH ir RBC.

Be to, didžioji dalis transkriptų, koreliuojančių su eritrocitų bruožais, rodančiais reikšmingą cis-eQTL, pavyzdžiui, Aconitase 1 ( ACO1 ), Superoxide dismutazė 1 ( SOD1 ) ir tirpių nešiklių šeimos 19 narys 2 ( SLC19A2 ), taip pat buvo susiję su oksidaciniu stresu. ACO1 yra bifunkcinis citozolinis baltymas, kuris kontroliuoja geležies homeostazę ir TCA ciklą energijos apykaitai 19 . Šiame tyrime ACO1 transkripcijos lygiai buvo koreliuojami su eritrocitų ypatumais (RBC, MCH ir MCV) su labai reikšmingais cis-eQTL. Pabrėžtina, kad geležies homeostazė vaidina esminį vaidmenį ląstelės oksidacinėje būsenoje, nes dėl patologinio geležies kaupimosi gali atsirasti papildomų reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) ir atsirasti oksidacinis stresas 20, 21 . SOD1 yra vienas iš svarbiausių antioksidantų ir daro lemiamą įtaką periferinio kraujo raudonųjų kraujo kūnelių gyvenimo trukmei ir kiekiui, kaip parodyta pelėms, kurioms trūksta „Sod1“ („ nokaut“ ) 22 . Taigi „ Sod1“ išmušimo pelės negali kompensuoti oksidacinių streso sukelėjų , sukeliančių proteasominės sistemos disfunkciją ir pagreitintą pažeistų baltymų kaupimąsi. Pelės „ Sod1“ geno mutacija ( išmušimas ) sumažina eritrocitų skaičių ir periferinio kraujo raudonųjų kraujo kūnelių kiekį 22 . Neseniai atliktame tyrime teigiama, kad oksidacinis stresas sukelia proteasomos sistemos disfunkciją ir pagreitina pažeistų baltymų kaupimąsi, todėl sutrumpėja RBC gyvenimo trukmė, taigi ir anemija pelėms, kurių organizme trūksta „Sod1“ 23 . Šiame tyrime nustatyta, kad SOD1 yra labai neigiamai koreliuojantis su HCT ir RBC ir pasižymi cis-eQTL. Susiję SNP buvo nuo 727 bp iki -496 bp nuo SOD1 pradinio kodono. SLC19A2 koduoja tiamino transportavimo baltymą. Tiaminas taip pat vaidina svarbų vaidmenį mažinant ląstelių oksidacinį stresą, sujungdamas energiją gaminančių glikolitinių ir pentozinių fosfatų metabolizmo kelius, o tai yra būtina, norint sugeneruoti geležies redukcinį / antioksidantinį cheminį redukcinį poveikį ląstelėse. Pelės Slc19a2 geno (homozigotinio išmušimo) mutacija taip pat sumažina eritrocitų skaičių pelėse 26 . Šiame tyrime SLC19A2 cis-eQTL buvo teigiama koreliacija su RBC ir neigiama koreliacija su LYM, suderinta su ankstesne ataskaita. Matyt, kepenų vaidmuo kontroliuojant mitochondrijų oksidacinę būklę (ty subalansuojant metabolizmo sukeltą ROS gamybą ir greitą reaktyviųjų tarpinių medžiagų detoksikaciją) daro lemiamą įtaką eritrocitų bruožams.

Mes nustatėme reikšmingas genetinių variantų asociacijas su ribosomų baltymo genu ir eritrocitų bruožais. RPL27A turi stiprų cis-eQTL (1, 09 × 10 –25 –1, 41 × 10 –11 ), ir nustatyta, kad jo išraiškos lygiai yra koreliuojami su eritrocitų ypatumais, tokiais kaip RBC ir MCV. Su ribosomų defektais susijusi keletas patologijų, tarp kurių geriausiai ištirta Diamond-Blackfan anemija (DBA), turinti bendrų klinikinių požymių, įskaitant anemiją, mažą retikulocitų kiekį ir makrocitinius eritrocitus 27, 28, 29 . Šiame tyrime nustatyta, kad hematokrito lygis (HCT) ir RBC labai koreliuoja su Rho guanino nukleotidų mainų koeficientu 10 ( ARHGEF10 ), o SNP, esantys šio geno 1 MB languose, buvo siejami su jo ekspresijos lygiais. ARHGEF10 genas buvo reikšmingai susijęs su aterotromboziniu insultu, kuris įvyksta, kai kraujagyslėje susidaro kraujo krešulys ir užkerta kelią kraujo tėkmei 30 . SNP rs4376531 veikia ARHGEF10 transkripcijos aktyvumą, atspindėdamas Sp1 surišimo afiniteto skirtumus 30 . Mes pademonstravome ryšį tarp eritrocitų ir genetiškai reguliuojamų ARHGEF10 ekspresijos lygių , tačiau funkcija išlieka sunkiai įgyvendinama.

Leukocitai

Pagrindinė kepenų funkcija yra gaminti ir išskirti medžiagas, kurios gabenamos per sisteminę kraujotaką. Iš tikrųjų vietiniai uždegiminiai ar žalingi procesai kepenyse, pvz., Po dalinės hepatektomijos ir kepenų fibrozės, daro didelę įtaką viso kūno leukocitų sukeltam aktyvumui 31 . Kupffer ląstelės, kurios yra specializuoti makrofagai kepenyse, suaktyvinamos po kepenų infekcijos ir sužalojimo. Leukocitai, išskiriantys prouždegiminius citokinus, tokius kaip naviko nekrozės faktorius (TNF), ir reaktyvusis deguonis 32, taip pat regeneruoja IL-6 ir IL-10. .

Mes nustatėme SAA1 , kuri koduoja serumo amiloidą A (SAA), pagrindinį ūminės fazės baltymą, kuris pirmiausia sintezuojamas ir išskiriamas kepenyse, kaip stiprų cis-eQTL ir pademonstravome, kad SAA1 raiška koreliuoja su LYM. Buvo pranešta, kad SAA yra chemoattraktantas fagocitams ir stiebinėms ląstelėms 33, 34, pasižymi į citokinus panašiomis savybėmis 35 ir ūminės fazės atsako metu sukelia T limfocitų migraciją ir adheziją prie endotelio ląstelių 36 . LBP koduoja baltymą, dalyvaujantį ūminės fazės imunologiniame atsake į gramneigiamas bakterines infekcijas, ir pirmiausia indukuojamas kepenyse37. Ankstesnis tyrimas parodė, kad lipopolisacharidus jungiančių baltymų mutacijos susilpnina įgimtą imunitetą, nes sumažėja prisijungimas prie LPS ir lipopeptidų ir sumažėja citokinų reakcija bei koncentracija pneumonijoje 38 . Čia mes nustatėme SNP, supant LBP nuorašą, susijusius su jo išraiškos lygiais, o LBP išraiškos lygiai buvo koreliuojami su LYM. Taigi ne tik struktūriniai pokyčiai, bet ir LBP išraiška gali vaidinti reikšmingą įgimtą imuninį atsaką. SORL1, dar žinomas kaip LR11, koduoja mozaikinį baltymą, priklausantį vakuolinių baltymų rūšiavimo 10 (VPS10) domenų turinčių receptorių šeimai ir mažo tankio lipoproteinų receptorių (MTLR) šeimai. Tirpus LR11 (sLR11) išsiskiria per proteolitinį išsiskyrimą. Cirkuliacinis sLR11 yra biomarkeris, skirtas aterosklerozei, koronarinei stenozei, diabetinei retinopatijai ir ūminei leukemijai gydyti. 39, 40, 41, 42. Taip pat pranešta apie CD9 vaidmenį atliekant LR11 išsiskyrimą leukocituose 43 . Mes nustatėme SORL1 cis-eQTL ir parodėme neigiamą jo išraiškos koreliaciją su LYM. TNFRSF11B (naviko nekrozės faktoriaus receptoriaus superbranduolinis narys 11b) koduoja baltymą, priklausantį TNF receptorių superšeimai. Tyrimai su pele pelės tyrimais taip pat parodė, kad šis baltymas ir jo ligadas vaidina svarbų vaidmenį limfmazgių organogenezėje ir kraujagyslių kalcifikacijoje 44, 45 . Šiame tyrime taip pat buvo nustatyta cis-eQTL TNFRSF11B , o jo transkripcijos lygis buvo stipriai koreliuojamas su WBC (r = 0, 329, p = 1, 85 × 10 –8 ).

Trombocitai

Trombocitai yra maži anukleatiniai kraujo elementai, dalyvaujantys hemostazėse ir trombozėse bei imuninėse reakcijose 46 . Pelėms į veną suleidus mažą lipopolisaharidų (LPS) kiekį, trombocitai kaupiasi kepenyse, kurie ilgainiui grįžta į kraują arba blogėja 47 . Komplemento sistema dalyvauja šiame skilime. Trombocitų ir komplemento sistemos sąveika yra sudėtinga; trombocitai gali suaktyvinti papildymą ir atvirkščiai 48 . Šiame tyrime tik keli kepenų nuorašai buvo koreliuojami su trombocitais, o dauguma šių nuorašų priklausė krešėjimo sistemai ir komplemento sistemai. Mannozę rišantis lektinas ( MBL2 ) koduoja mannozę surišantį baltymą ir gali suaktyvinti komplemento kelią. Komplemento veiksnių ekspresija infekcijos metu yra specifinė audiniams, o komplemento ekspresija kepenyse atsiranda dėl sisteminės ūminės fazės reakcijos į infekciją 49 . MBL2 polimorfizmai buvo siejami su jautrumu infekcinėms ligoms ir imuninės savybės, taip pat su papildomu aktyvumu 50, 51, 52 . Šiame tyrime nustatyta reikšminga teigiama koreliacija tarp trombocitų ir MBL2 transkripto lygio (PCT ir PLT, r = 0, 25 p = 4, 19 × 10 −5 ). Nors kai kuriose ataskaitose pabrėžiamas trombocitų sąveikos su komplemento sistema vaidmuo, tiesioginis MBL2 vaidmuo vis dar nežinomas. MBL2 nuorašų genetinis reguliavimas gali turėti įtakos trombocitų bruožams ir galiausiai imuninei būklei. Α1, 2-fukosiltransferazės I (FUT1) fermentas yra svarbus membranos glikoproteinų, kurie vaidina įvairiose uždegiminėse reakcijose, biosintezei 55 . Kiaulėms FUT1 yra susijęs su atsparumu E. coli F18 infekcijai ir įvairių gynybos kelių ekspresija . Šiame tyrime nustatyta, kad FUT1 turi cis-eQTL ( p = 2, 2 × 10 –12 ), o jo nuorašų lygis buvo reikšmingai teigiamai koreliuojamas su trombocitais (MPV, r = 0, 234, p = 9, 11 × 10 –5 ).

Kepenų nuorašų ir metabolinės būklės genetinis reguliavimas

Kepenų genai dalyvauja įvairiuose fiziologiniuose procesuose. Daugelį nuorašų galima sureguliuoti per branduolinio hormono receptorius, įskaitant α retinoido receptorius (RXRα), kepenų X receptorius (LXR), farnesoido X receptorius (FXR), retinoinės rūgšties receptorius (RAR), konstitucinį androstano receptorių (CAR), rasedano X receptorius ( PXR) ir peroksisomų proliferatorių suaktyvintas receptorius (PPAR). Viena ypatinga kai kurių iš šių receptorių savybė yra jų gebėjimas reguliuoti ne tik metabolinę sistemą, bet ir įgimtas bei adaptacines imunines sistemas 58, 59 .

Tarp šių nuorašų, susijusių su biocheminiais ir kūno sudėjimo bruožais, stebėjome labai reikšmingą nuorašų, susijusių su LXR / RXR, PXR / RXR ir FXR / RXR aktyvavimu, praturtėjimą, suderintą su ankstesniu tyrimu dėl kepenų ekspresijos santykio su kūno sudėtimi kitose kiaulių veislėse 6 . Šie būdai vaidina svarbų vaidmenį angliavandenių, riebalų rūgščių ir cholesterolio metabolizme 60 .

Metilmalono rūgšties cblB tipas ( MMAB ) koduoja baltymą, katalizuojantį vitamino B12 pavertimą adenozilkobalaminu. MMAB daro įtaką TG lygiui per adenozilkobalaminą ir metilmalonil-CoA mutazę 61 . MMAB buvo susijęs su 62 TG lygiais. Šiame tyrime nustatyta, kad MMAB nuorašų lygiai buvo neigiamai koreliuojami su TG, o MMAB rodė cis-eQTL.

BUN yra pagrindinis azoto baltymų ir aminorūgščių katabolizmo produktas ir atspindi aminorūgščių pusiausvyros būklę. Baltymai dažnai naudojami kaip inkstų ir kepenų funkcijos rodiklis. Mes nustatėme nuorašus su cis-eQTL, tokiais kaip SORL1, LTBP1 ir ABHD14B, kurių išraiška buvo koreliuojama su riebalų savybėmis ir BUN. Mažas BUN rodo gerą aminorūgščių balansą ir rodo santykinai mažą karbamido sintezę ir hidrataciją kepenyse bei santykinai aukštą baltymų efektyvumą maiste 63 . Be to, genetiškai reguliuojami nuorašai, tokie kaip SORL1, LTBP1 ir ABHD14B, vaidina svarbų vaidmenį tiek metaboliniuose, tiek imuniniuose procesuose. Šie nuorašai gali būti pleiotropiniai genai, kurių genetiniai keliai būdingi nutukimui, aminorūgščių pusiausvyrai ir imuniniams požymiams.

Vis daugėja įrodymų, kad komplemento sistema vaidina svarbų vaidmenį sergant cukriniu diabetu. Visų pirma, padidėjęs mannozę jungiančio lektino (MBL) kiekis sergantiems cukriniu diabetu 64 . Kaip jau buvo aprašyta anksčiau, MBL2 transkripto lygis reikšmingai teigiamai koreliuoja su trombocitais ir neigiamai koreliuoja su kreatinino lygiu. MASP2 koduoja peptidazės S1 serino proteazių šeimos narį ir skaido komplemento komponentus C2 ir C4, kad sugeneruotų C3 konvertazę komplemento sistemos lektino kelyje. Polymorphisms in MASP2 genes are associated with protein serum levels and functional activity and with susceptibility to or protection against infectious diseases 65 . Significantly higher MASP2 levels are found in children and adults with type 1 diabetes mellitus 66 . In the present study, the expression levels of MASP2 were found to be positively correlated with leukocytes and negatively correlated with ALB, BUN, TCHO and MFR, further supporting the role of MASP2 in immune and metabolic processes. Thymosin beta 10 ( TMSB10 ) was shown to be correlated with haematological, biochemical and body composition traits, and the transcript levels of TMSB10 were positively correlated with leukocytes and negatively correlated with erythrocytes, ALB, BUN and all fat traits. This finding is consistent with previous reports of the correlation of TMSB10 with insulin-stimulated sprouting and adipose tissue expansion 67 .

Išvados

In summary, the analysis of transcript profiles together with information on their genetic regulation provide a new resource for understanding genotype-phenotype mapping associated with hepatic gene expression and the physiological processes of immune, metabolic and body composition traits. Analyses of genetically regulated transcripts and the correlations of liver transcript levels with immune and metabolic as well as body composition traits enable the complexity of this system to be captured and visualized. The liver transcripts whose biological and genetically pathways are common to immune and metabolic status were demonstrated. Our analyses of trait-correlated hepatic expression and eQTL detection complement genome-wide association studies for immune and metabolic traits. This detailed analysis highlighted numerous candidate genes common to both systems.

Medžiaga ir metodai

Animals, sample collection and phenotype measure

Animal care and tissue collection procedures followed the guidelines of the German Law of Animal Protection, and the experimental protocol was approved by the Animal Care Committee of the Leibniz Institute for Farm Animal Biology. Performance-tested pigs of German Landrace pigs were used for GWAS of liver transcript levels (n = 297). Liver samples were collected from pigs at an average age of 170 days. Veterinary inspection of the carcasses and organs after slaughter confirmed lack of any impairments, disease symptoms and pathological signs to avoid any bias of blood phenotypes. The haematological and biochemical traits were determined using an automated analyzer device (ABX Pentra 60 HORIBA, Montpellier, France; (Fuji DriChem 4000i, FujiFilm, Minato, Japan).

SNP genotypes

Genotyping was performed using the PorcineSNP60 BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) per manufacturer's SNP Infinium HD assay protocol. In brief, DNA was amplified, fragmented, and hybridized to the PorcineSNP60 BeadChip containing 62163 locus-specific 50-mers. Single-base extension of captured oligos incorporated labels that were detected by Illumina iScan, and images were subsequently converted to intensity data. Intensity data were normalized and assigned a cluster position, genotype, and quality score with GenomeStudio software (Illumina Inc.). Samples with call rates <99% were removed. Markers with low minor-allele frequency (<5%) as well as those that strongly deviated from Hardy-Weinberg equilibrium (p < 0.0001) were also excluded. The average call rate for all samples was 99.8% ± 0.2. The markers of the 60 K chip were mapped to the porcine reference genome, Sscrofa 10.2.

mRNA microarray analysis

Total RNA was isolated from the liver of 297 animals using TRI Reagent (Sigma, Taufkirchen, Germany). The RNA was amplified using Ambion WT Expression Kit (Affymetrix). Subsequently, 5.5 μg of the resulting cDNA was fragmented and labeled using the Affymetrix Terminal Labeling Kit. The fragmented cDNA was hybridized to the microarray using the Affymetrix Hybridization, Wash and Stain Kit and Affymetrix standard protocols.

Porcine Snowball Microarrays (Affymetrix) containing 47, 880 probe-sets were used to determine the expression profile. Expression Console software was used for robust multichip average (RMA) normalization and the detection of present genes by applying the DABG (detection above background) algorithm. Further filtering was done by excluding transcripts with low signals and probes that were present in less than 80% of the samples. 24, 909 probes passed the quality filtering and were used for further analyses. Expression data are available in the Gene Expression Omnibus public repository (GEO accession number GSE83932: GSM2221843-GSM2222139).

Išankstinis duomenų apdorojimas

After quality control and filtering the expression data were further pre-processed to account for systemic effects. Mixed-model analyses of variance using JMP Genomics (SAS Institute) were used for adjustment. The genetic similarity matrix between individuals was computed as identity by descent of each pair for the k-matrix and used as a random effect. For control of population stratification, top principal components (PC) which explain variation of more than 1% were considered as covariates. In total 17 PCs were included as covariates. Gender was considered as a fixed effect, and carcass weight was used as a covariate. The residuals were retained for further analysis.

eQTL of mRNA

Analyses of eQTLs were conducted using the R-package 'Matrix eQTL´ for testing the association between each SNP and residual of transcript abundancies by modeling the effect of genotype as least squares model (Shabalin; 2012). 'Matrix eQTL' performs a separate test for each gene - SNP pair and corrects for multiple comparisons by calculating FDR 68 . Annotation and localization of SNP sites and probe-sets (Ensembl_Sscrofa_10.2) allowed discrimination of cis- and trans-regulation. We defined an eQTL as 'cis' if an associated SNP was located within an area less than 1 Mb from the probe set/gene. The associations of transcript levels with haematological, biochemical and end production traits were evaluated estimating spearman coefficient of correlation (r) and corrected for multiple comparisons by calculating FDR 68 .

Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA)

A weighted gene co-expression network was constructed using normalized gene expression data of 297 livers with the blockwise Modules function of the WGCNA package in R 69 . The blockwise Modules function allows the entire dataset of 24, 909 probe-sets to be utilised in the construction of the weighted gene co-expression network 12 . Module–trait associations were estimated using the correlation between the module eigengene and the phenotype. Within each module, the intramodular connectivity of each gene was evaluated using two methods, defined as module membership (MM) and the soft connectivity (K). Module membership (MM) is defined as the correlation of expression profile (xi) and each module eigengene (ME),

Image

The intramodular soft connectivity (K) is defined as,

Image
which is the sum of all pairwise adjacencies of a gene to all other genes in the module. Genes within each module were then ranked using both the absolute value of module membership and the intramodular soft connectivity, which enables further identification of key players in the regulation network, defined as hub genes.

Papildoma informacija

How to cite this article : Ponsuksili, S. et al . Genetically regulated hepatic transcripts and pathways orchestrate haematological, biochemical and body composition traits. Mokslas. Rep. 6, 39614; doi: 10.1038/srep39614 (2016).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

„Excel“ failai

  1. 1.

    2 papildoma lentelė

  2. 2.

    3 papildoma lentelė

  3. 3.

    4 papildoma lentelė

  4. 4.

    5 papildoma lentelė

  5. 5.

    6 papildoma lentelė

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.