Metazoano augalų parazitinių nematodų meloidogyne incognita genomo seka | gamtos biotechnologijos

Metazoano augalų parazitinių nematodų meloidogyne incognita genomo seka | gamtos biotechnologijos

Anonim

Anotacija

Augalų parazitiniai nematodai yra pagrindinis žemės ūkio kenkėjas visame pasaulyje, todėl labai reikalingi nauji jų kontrolės būdai. Mes pateikiame šaknies mazgo nematodo Meloidogyne incognita , daugelio augalų, įskaitant pomidorų, medvilnės ir kavos, biotrofinį parazitą, genomo sekos projektą. Didžioji šio aseksualiai dauginančių nematodų sekos dalis, iš viso 86 MB, egzistuoja homologinių, bet skirtingų segmentų poromis. Tai rodo, kad senovės aleliniai regionai M. incognita vystosi link veiksmingos haploidijos, leidžiančios naujus prisitaikymo mechanizmus. Augalų ląstelių sieneles ardančių fermentų skaičius ir įvairovė M. incognita yra neregėtas bet kuriame gyvūne, kuriam yra genomo seka, ir tai gali kilti iš daugybės horizontalių genų perdavimo iš bakterijų šaltinių. Mūsų rezultatai suteikia įžvalgos apie prisitaikymą, reikalingą metazoanams sėkmingai parazituoti imunokompetentingiems augalams, ir atveria kelią naujų antiparazitinių strategijų atradimui.

Pagrindinis

Augalų parazitiniai nematodai sukelia pasaulinius žemės ūkio nuostolius, kurie sudaro maždaug 157 milijardus dolerių per metus. Nors cheminiai nematidai yra patikimiausios priemonės, padedančios kontroliuoti šakniastiebinius nematodus, jų vis daugiau ir daugiau pašalinama dėl jų toksiškumo žmonėms ir aplinkai. Taigi norint sukurti naujas kovos su kenkėjais strategijas, reikia naujų ir konkrečių tikslų.

Pietinis šakniastiebinis nematodas Meloidogyne incognita gali užkrėsti beveik visų auginamų augalų šaknis, todėl tai, ko gero, labiausiai kenkia visiems augalų patogenams 1 . M. incognita yra privalomas sėdimas parazitas, kuris dauginasi mitozinės partenogenezės būdu 2 . Šakniniai nematodai artimai bendrauja su savo šeimininkais. Šeimininko šaknyje suaugusios moterys skatina šaknų ląstelių diferenciaciją į specializuotas „milžiniškas“ ląsteles, kuriomis jos nuolat maitinasi (1 pav.). M. incognita gali užkrėsti Arabidopsis thaliana , paversdamas šį nematodą pagrindine modelio sistema, leidžiančia suprasti metazoanų prisitaikymą prie augalų parazitizmo 3, 4 (Papildomi duomenys, 1 skyrius internete).

Image

Užkrėsti antrosios pakopos jaunikliai (J2) prasiskverbia pro šaknis ir migruoja tarp ląstelių, kad pasiektų augalų kraujagyslių cilindrą. Prie stemplės prijungtas stiliukas (rodyklės galvutė) yra naudojamas augalų ląstelių sienelėms pradurti, stemplės sekretams išlaisvinti ir maistinėms medžiagoms absorbuoti. Kiekvienas J2 indukuoja nuo penkių iki septynių šaknies ląstelių diferenciaciją į daugiabranduolines ir hipertrofuotas maitinimo ląsteles ( * ). Šios milžiniškos ląstelės tiekia maistines medžiagas nematodui (N). Nematodas tampa sėslus ir praeina per tris moliuskus (J3, J4, suaugęs). Kartais patinai išsivysto ir migruoja iš šaknų. Tačiau manoma, kad jie neatlieka jokio vaidmens reprodukcijai. Kriaušės formos patelė gamina kiaušinius, kurie išsiskiria šaknies paviršiuje. Embriogenezę kiaušinyje seka pirmas sukramtymas, sukuriantis antros stadijos jauniklius (J2). Svarstyklės, 50 μm.

Visas dydis

Prieglobstį „Nematoda“ sudaro> 25 000 aprašytų rūšių, iš kurių daugelis yra gyvūnų ar augalų parazitai 2 . Gali tekti dar neaprašyti 10 milijonų rūšių. Nors modeliai laisvai gyvenantys nematodai Caenorhabditis elegans ir Caenorhabditis briggsae buvo intensyvaus 5, 6 tyrimo objektas, mažai žinoma apie kitus šio įvairaus prieglobsčio dalyvius. Šie du laisvai gyvenantys modeliai greičiausiai neišryškins nematodų parazitizmo biologijos (papildomas 1 pav. Internete), ką parodo esminiai skirtumai tarp jų ir žmogaus parazito Brugia malayi 7 genomo sekų.

Čia pateikta M. incognita genomo seka suteikia įžvalgos apie būtinus prisitaikymus, reikalingus metazoanams sėkmingai parazituoti ir kovoti su imunokompetentingų augalų gynyba, ir siūlo naujas kovos su parazitais strategijas.

Rezultatai

Bendrieji M. incognita genomo bruožai

M. incognita genomas buvo išskaidytas naudojant viso genomo šovinių strategiją. Surinkus 8 Arachne, buvo gauti 2 817 superkontigai, kurių bendras kiekis buvo 86 Mb (1 lentelė; papildomi duomenys, 2 skyrius; papildomas 2 pav.; 1 papildoma lentelė internete) - beveik dvigubai didesnis už apskaičiuotą genomo dydį (nuo 47 iki 51 MB haploido genomo) 9 . Palyginus superkontigus, paaiškėjo, kad 648 ilgiausius (apimantys ∼ 55 Mb) sudaro homologiškos, bet išsiskyrusios segmentų poros (2 pav.), Kurios gali parodyti buvusius alelius (papildomi duomenys, 2 skyrius; papildomi 3 ir 4 pav.) prisijungęs). Maždaug 3, 35 Mb agregato yra trečioji dalinė kopija, suderinta su šiomis superkontigso poromis. Vidutinis sekų skirtumas tarp išlygintų regionų yra ∼ 8% (3 pav.). Įvairių procesų derinys gali paaiškinti stebimą M. incognita modelį, įskaitant poliploidiją, polisomiją, aneuploidiją ir hibridizaciją 10, 11 ; visos jos dažnai būna susijusios su aseksualiu dauginimu. Šie stebėjimai atitinka griežtai mitozinį partenogenetinį reprodukcinį režimą, kuris leidžia homologinėms chromosomoms smarkiai skirtis, kaip hipotezuojama dėl bdelloidinių rotiferių 12 (Papildomi duomenys, 2.2 skyrius). Nebuvo nustatyta jokios DNR, priskirtinos bakterijų endosimbiontų genomui.

Pilno dydžio lentelė

Image

Parodyti penki didžiausi superkontigai su genų tankio (oranžinė kreivė), išsaugojimo su C. elegans aminorūgščių lygiu (žalia kreivė) ir EST tankio (rožinė kreivė) grafikais. Mėlynos linijos parodo panašiausias atitiktis baltymų lygyje tarp kiekvieno numatomo geno šiuose penkiuose superkontiguose ir 70 sutampančių superkontigų.

Visas dydis

Image

Egzonai pavaizduoti raudonais langeliais ir susieti kartu, kad sudarytų genus (rodyklės rodo transkripcijos kryptį). Pilkos spalvos dėžės rodo surinkimo spragas. Labai skirtingi aleliniai genai yra susieti, naudojant mėlynąsias dėžutes. Genų tvarka yra gerai išsaugota tarp dviejų į alelį panašių regionų, tik numatomi geno struktūros skirtumai yra nedideli. Nurodomi sekos tapatumo procentai baltymų lygyje tarp dviejų į alelį panašių regionų.

Visas dydis

Nekoduojami DNR pakartojimai ir perkeliami elementai sudaro 36% M. incognita genomo (papildomi duomenys, 3 skyrius; papildomi 5 ir 6 pav. Bei 2 ir 3 papildomos lentelės internete). Viena pakartota šeima su 283 nariais 46 kontiguose užkodavo nematodo trans- suplanuoto lyderio (SL) egzoną SL1, iš kurių 258 nariai buvo rasti siejami su palydovine DNR 13 (papildomas 7 pav. Internete). Nematoduose daugelis subrendusių mRNR turi šį 5 ′ SL egzoną, o transpaprastinimas taip pat yra susijęs su policistinių pre-mRNR, gaunamų iš operonų, raiška. Mes nustatėme 1 585 kandidatus M. incognita operonus, iš viso turinčius 3966 genus. Dviejuose ilgiausiuose operonuose buvo po dešimt genų ir jie nėra alelinės kopijos (4 papildoma lentelė internete). Operonai yra dinamiškas nematodų genomo architektūros komponentas, nes skirtingi genų rinkiniai buvo operoniniai M. incognita , C. elegans ir B. malayi , ir buvo nustatyta, kad tarp trijų nematodų yra griežtai konservuotas tik vienas operonas (Papildomi duomenys, 4 skyrius). ; 8 ir 9 pav.; 5 papildomą lentelę internete).

Genų kiekis augaliniame parazitiniame nematode

Genomo seka buvo komentuojama naudojant integruotą genų prognozavimo platformą „EuGene 14“, specialiai apmokytą M. incognita (papildomi duomenys, 5 skyrius; 6 papildoma lentelė internete). Mes nustatėme 19 212 baltymus koduojančius genus (1 lentelė). Dėl didelių į alelį panašių kopijų variacijų (3 pav.), Kurios gali leisti funkcinius skirtumus, visos kopijos buvo laikomos skirtingais genais. Iš tikrųjų 69% baltymų sekų buvo <95% identiškos bet kuriai kitai (7 papildoma lentelė ir papildomas 10 pav. Internete ) . Baltymus koduojantys genai užima 25, 3% sekos, kai vidutinis tankis yra 223 genai Mb – 1, o 36% yra palaikomi išreikštos sekos žymėmis (EST). Buvo nustatyta, kad „InterPro“ baltymų domenai buvo nustatyti 55% baltymų, o 22% - išskirti. Palyginus M. incognita domenų atsiradimą su C. elegans duomenimis, nustatyta padidėjusi „pektato lipazės“, glikozido hidrolazės šeimos GH5 ir peptidazės C48 (SUMO) domenų gausa ir mažiau chemoreceptorių domenų. Palyginome nustatyto M. incognita baltymo domeno turinį su C. elegans , B. malayi, Drosophila melanogaster ir trijų grybelių domenu , iš kurių du yra augalų patogenai. Trisdešimt du domenai buvo aptikti tik M. incognita , o du papildomi domenai buvo pasidalinti tik tarp dviejų augalų patogeninių grybų ir M. incognita . Funkcijos, priskirtos 34 augalų patogenams būdingiems domenams, apėmė augalų ląstelių sienelės irimą ir chorizmato mutazės aktyvumą (žr. Žemiau). Klasifikuojant OrthoMCL 15 iš tų pačių aštuonių baltymų, 52% M. incognita numatytų baltymų neturėjo ortologų kitoms rūšims. Tarp jų 1819 baltymų (iš kurių 338 palaikė EST) išsiskiria ir neturi jokio žinomo domeno (papildomi duomenys, 6 skyrius; papildomi 11 ir 12 paveikslai; papildomos 8, 9, 10 lentelės internete). Pagrindinis nematoda baltymų komplementas yra santykinai mažas: ∼ 23% ortologų grupių dalijasi M. incognita , C. elegans ir B. malayi (papildomas 12b pav.).

Augalų parazitizmo genų identifikavimas

Nematodo baltymai, gaminami specializuotose liaukų ląstelėse ir išskiriami iš šeimininko, greičiausiai yra svarbūs augalų parazitizmo veiksniai 4, 16 . Mes nustatėme genų produktus, kurie gali būti susiję su parazitine sąveika, ypač tuos, kurie gali modifikuoti augalų ląstelių sienas.

M. incognita turi precedento neturintį 61 augalų ląstelių sienelę skaidančių, angliavandenius veikiančių fermentų (CAZymes) rinkinį. Nors anksčiau kai kuriuose tokiuose augalų parazitiniuose nematoduose ir dviejose vabzdžių rūšyse buvo nustatyta keletas tokių individualių CAZymes ( 4, 16, 17), jų nėra visuose kituose iki šiol tirtuose metazoanuose (2 lentelė; papildomi duomenys, 7.1 skirsnis; papildomos lentelės 11)., 12, 13, 14 internete). Mes nustatėme 21 ląstelę ir šešias ksilanazes iš šeimos GH5, dvi poligalakturonazes iš šeimos GH28 ir 30 pektatų lizazes iš šeimos PL3. Mes taip pat nustatėme CAZymes, apie kuriuos anksčiau nebuvo pranešta iš metazoanų, įskaitant dvi papildomas augalų ląstelių sieneles ardančias arabinazes (šeima GH43) ir dvi invertas (šeima GH32). Invertai katalizuoja sacharozės (gausaus disacharido augaluose) virsmą gliukoze ir fruktoze, kurias M. incognita gali naudoti kaip anglies šaltinį. Taip pat mes nustatėme 20 M. inkognita ekspansinų kandidatų, kurie gali sutrikdyti nekovalentinius ryšius augalų ląstelių sienose, todėl komponentai tampa prieinamesni augalų ląstelių sienelę ardančiams fermentams 18 . Šis augalų ląstelių sienelę ardančių CAZymes, expansins ir susijusių invertazių rinkinys greičiausiai buvo įgytas atliekant horizontalų genų pernešimą (HGT), nes panašiausi baltymai (išoriniai augalų parazitiniai nematodai) buvo bakterijų homologai (12 papildoma lentelė). M. incognita taip pat turi keturias išskiriamas chorizmato mutazes 19, kurios labiausiai primena bakterinius fermentus. Chorizmato mutazė yra pagrindinis aromatinių aminorūgščių ir susijusių produktų biosintezės fermentas, o M. incognita gali pakenkti nuo tirozino priklausomai lignifikacijai ar gynybinei reakcijai. Apskritai šie genai rodo kritinį HGT įvykių vaidmenį augalų parazitizmo evoliucijoje šaknies mazgų nematodų srityje.

Pilno dydžio lentelė

Be genų, apribotų tik M. incognita , mes taip pat nustatėme genų šeimas, kuriose, palyginti su C. elegans, yra didelis išplėtimas. Tarp ryškiausių M. inkognita idiosinkrazių mes nustatėme daugiau nei 20 C48 SUMO (mažo į ubikvitiną panašaus modifikatoriaus) dekonjuguojančių fermentų šeimos cisteino proteazių - keturis kartus daugiau nei C. elegans (papildomi duomenys, 7.2 skyrius; 15 papildoma lentelė). prisijungęs). Kadangi kai kurie fitopatogeniniai bakterijų virulentiškumo faktoriai yra SUMO proteazės 20, sumoilintų substratų-šeimininkų proteolizė gali būti bendra strategija, kurią patogenai naudoja manipuliuoti augalo šeimininko signalo perdavimu. M. incognita genomas taip pat koduoja devynias serino proteazes iš S16 pogrupio (Lon proteazės), tuo tarpu C. elegans nustatomos tik trys. Šios proteazės reguliuoja III tipo baltymų sekreciją fitopatogeninėse 21 bakterijose ir gali turėti panašų vaidmenį M. incognita .

Mes nustatėme ortologus kitiems žinomiems augalų parazitinių nematodų parazitizmo genams kandidatams į M. incognita genomą. Kadangi dauguma šių genų šeimų taip pat yra gyvūnų parazitiniuose nematoduose ir C. elegans , M. incognita nariai, spėjamai susiję su parazitizmu, greičiausiai buvo įdarbinti iš protėvių nematodų šeimų (papildomi duomenys, 7.3 skyrius; 16 papildoma lentelė internete). Genome buvo atrasti dvidešimt septyni anksčiau aprašyti M. incognita ribojami pradiniai genai, išreikšti stemplės liaukose 22 . Buvo nustatyta vienuolika papildomų egzempliorių; visi lieka Meloidogyne spp . specifiniai (papildomi duomenys, 7.4 skirsnis; 17 papildoma lentelė internete). Šie išskiriami dar nežinomos funkcijos baltymai yra tikėtini naujų intervencijos strategijų taikiniai, todėl juos reikia giliau ištirti.

Apsauga nuo aplinkos poveikių

Vienas augalų gynybinių reakcijų aspektas yra citotoksinių deguonies radikalų gamyba. Tačiau M. incognita turi mažiau genų, koduojančių superoksido dismutazes ir glutationo peroksidazes, nei C. elegans (papildomi duomenys, 7.5 skyrius; 18 papildoma lentelė internete). Dar įspūdingesnis buvo glutationo S- transferazių (GST) ir citochromų P450 (CYP), fermentų, dalyvaujančių ksenobiotikų metabolizme ir apsaugančių nuo peroksidacinio pažeidimo, sumažėjimas. C. C. elegans turi 44 GST, įskaitant Omega, Sigma ir Zeta 23 klasės atstovus, M. inkognita turi tik 5 GST, visus iš Sigma klasės. „Sigma“ klasės GST yra svarbūs apsaugai nuo oksidantų, o ne ksenobiotikų. Panašus gst genų sumažėjimas pastebėtas B. malayi 7 . Panašiai, kai C. elegans turi 80 skirtingų cyp genų iš 16 šeimų 24, M. inkognita buvo identifikuoti tik 27 pilni arba daliniai cyp genai iš 8 šeimų. Cogn35 ir kitų ksenobiotikus metabolizuojančių P450 grupių nėra M. incognita (papildomi duomenys, 7.5 skyrius; 18 papildoma lentelė).

Mes nustatėme visų C. elegans 25 įgimtų imunitetą signalizuojančių kelių, išskyrus trf-1 , kuris yra Rinkliavos kelio dalis, genų ortologus (papildomi duomenys, 7.5 skyrius; 19 papildoma lentelė internete). Tačiau imuninių efektorių, tokių kaip lizocimai, C tipo lektinai ir chitinazės, M. incognita buvo daug mažiau nei C. elegans . Kaip anksčiau buvo pastebėta B. malayi 7, iš M. incognita nebuvo ištisų klasių imuninių efektorių, žinomų iš C. elegans , įskaitant antibakterinius genus, tokius kaip abf ir spp 26, ir kelių klasių priešgrybelinius genus ( nlp , cnc , fip , fipr ). 25 (papildomi duomenys, 7.5 skirsnis; 19 papildoma lentelė). Kadangi augalų parazitai, įterpti į šaknies audinius, yra apsaugoti nuo įvairių biologinių ir abiotinių stresų, spėjame, kad cheminės ir imuninės gynybos genų sumažinimas ir specializavimasis yra gyvybė šioje privilegijuotoje aplinkoje.

C. elegans turi platų neįprastų fukozilintų N-glikano struktūrų spektrą, palyginti su kitais metazoanais27. M. incognita turi beveik dvigubai daugiau fukozililtransferazių kandidatų nei C. elegans (papildomi duomenys, 7.1 skyrius; 14 papildoma lentelė). Kaip siūloma gyvūnų parazitiniams nematodams, nematodų odelės paviršiuje esančios daugiafukosilintos struktūros gali padėti M. incognita išvengti atpažinimo 27 .

Pagrindiniai biologiniai procesai

Branduoliniai receptoriai, kinazės, su G-baltymu sujungti receptoriai (GPCR) ir neuropeptidai apima kai kuriuos genų produktus, labiausiai susijusius su pagrindiniais fiziologiniais, vystymosi ir reguliavimo procesais.

C. elegans turi stebėtinai daug branduolinių receptorių, tačiau smalsiai trūksta daugelio rūšių branduolinių receptorių, išsaugotų kituose gyvūnuose, ortologų 28 . Kai kurie iš šių konservuotų branduolinių receptorių yra B. malayi 7 . Iš 92 numatytų branduolinių receptorių M. inkognita mes nustatėme kelių žinomų nematodų branduolinių receptorių ortologus , nors daugelio branduolinių receptorių, esančių B. malayi ir kurių nėra C. elegans, taip pat nebuvo M. inkognita (Papildomi duomenys, skyrius) 7.6; 20 papildoma lentelė internete). Daugelis C. elegans branduolinių receptorių yra klasifikuojami kaip papildomi branduoliniai receptoriai (SupNR), greičiausiai kilę iš hepatocitų branduolio faktoriaus-4 tipo protėvio 29 . M. inkognita rasta ortologų, supNR, įskaitant 41 nario, M. inkognita specifinį išsiplėtimą. Keturiolika SupNR yra vienas prieš vieną ortologai tarp B. malayi , M. inkognita ir C. elegans arba išsaugoti tik tarp M. incognita ir C. elegans , o antriniai nuostoliai yra B. malayi (papildomi duomenys, 7.6 skyrius; papildomi pav. 13 internete). Taigi SupNR išsiplėtimas prasidėjo prieš tai, kai Brugia-Meloidogyne-Caenorhabditis suskilo, ir savarankiškai vyko C. elegans ir M. incognita .

M. incognita turi 499 numatomas kinazes, palyginti su 411 C. elegans 30 ir 215 B. malayi 7 . Kinazės buvo sugrupuotos į 232 OrthoMCL grupes, 24 iš kurių buvo tik nematodų nariai, kas rodo, kad jos turi specifines nematodų funkcijas. Keturose kinazių šeimose buvo tik M. incognita ir B. malayi nariai, ir tai rodo galimą šių genų vaidmenį parazitizme. Galiausiai 66 kinazių šeimos, turinčios 122 genus, yra specifiškos M. incognita (papildomi duomenys, 7.7 skyrius; 21 papildoma lentelė internete). Prognozuojama, kad septyni procentai (1 280) visų C. elegans genų užkoduos GPCR, kurie vaidina lemiamą vaidmenį chemosensacijoje. Šie C. elegans genai buvo suskirstyti į tris serpentino receptorių superšeimas ir penkias solo šeimas 31 . M. incognita turi tik 108 GPCR genus ir jie gaunami iš dviejų iš trijų serpentino receptorių superšeimų ir vienos iš solo šeimų. Šie M. incognita chemosensoriniai genai dažniausiai randami kaip genomo grupių kopijos, kaip pastebėta C. elegans (papildomi duomenys, 7.8 skyrius; papildomas 14 pav.; 22 papildoma lentelė internete).

Neuropeptidų įvairovė nematodais yra nepaprastai didelė, atsižvelgiant į jų nervų sistemos struktūrinį paprastumą. C. elegans turi 28 į Phe-Met-Arg-Phe-amidą panašų peptidą ( flp ) ir 35 į neuropeptidus panašius baltymus ( nlp ) genus, koduojančius ∼ 200 skirtingų neuropeptidų 32 . Identifikuotas M. incognita neuropeptido komplementas yra mažesnis: 19 flp genų ir 21 nlp genai. Tačiau du flp genai, Mi-flp-30 ir Mi-flp-31 , koduoja neuropeptidus, kurie nebuvo identifikuoti C. elegans , rodo, kad jie galėtų atlikti funkcijas, kurios būdingos fitoparazitiniam gyvenimo būdui (Papildomi duomenys, 7.9 skyrius; Papildoma lentelė). 23 internete).

XX-XO lyties nustatymo būdas C. elegans yra glaudžiai susijęs su dozės kompensavimo keliu 33 . M. incognita dauginasi išimtinai per mitozinę partenogenezę, o vyrai genetiškai neprisideda prie palikuonių auginimo 11 . M. incognita taip pat daro įtaką aplinkai lyties nustatymui: esant mažiau palankioms aplinkos sąlygoms, gimsta daugiau vyrų. Šie vyrai gali atsirasti dėl lyties keitimo 34 ir gali būti sukurtos interseksualios formos. Kiekviename C. elegans lyties nustatymo kaskados etape buvo identifikuoti bent vieno nario M. incognita homologai, įskaitant sdc-1 iš dozės kompensavimo kelio, tra-1 , tra-3 ir fem-2 iš paties lyties nustatymo kelio., taip pat pasroviui priklausantys genai, tokie kaip mag-1 (kuris slopina vyrus reklamuojančius genus) ir mab-23 (kontroliuojantis vyrų diferenciaciją ir elgesį). Be to, buvo nustatyta didelė M. incognita išskiriamų baltymų šeima (∼ 35 genai), panašių į C2H2 cinko piršto motyvą, kuriame yra C. elegans tra-1 (papildomi duomenys, 7.10 skyrius; 24 papildoma lentelė internete). Todėl įmanoma, kad M. incognita lyties nustatymui naudoja panašią genetinę sistemą, tačiau vyriškas kelias taip pat moduliuojamas reaguojant į aplinkos užuominas.

Bendrai paėmus, šie lyginamieji genų tyrimai, pagrindžiantys svarbius bruožus, išryškina didžiulę prieglobsčio Nematoda biologinę įvairovę. M. inkognita identifikuotos idiosinkrazijos gali lemti jos parazitinį gyvenimo būdą ir paskatinti naujų kontrolės strategijų, nukreiptų prieš augalų parazitinius nematodus, kūrimą.

RNR trukdžiai ir mirtini fenotipai

RNR trukdžiai (RNR) yra perspektyvi technologija, skirta funkcinei parazitinių nematodų genų analizei. RNR gali būti sužadintos M. incognita maitinant, o įvairus slopinimo efektyvumas priklauso nuo tikslinio geno 35, 36 . M. incognita turi daug C. elegans RNR kelio genų, įskaitant amplifikacijos komplekso komponentus ( ego-1 , rrf-1 , rrf-2 ir rrf-3 ). Tačiau mes neradome sid-1, sid-2, rsd-2 ir rsd-6 , kurie yra genai, dalyvaujantys sisteminėse RNR ir dvigrandėje RNR plinta į aplinkines ląsteles , homologų (4 pav., Papildomi duomenys, 7.11 skyrius; 25 papildoma lentelė internete). Šių genų taip pat nėra B. malayi 7 ir Haemonchus contortus 37, o tai rodo, kad sisteminės RNR gali plisti veikiant naujiems ar mažai konservuotiems veiksniams. Gavome 2 958 C. elegans genus, turinčius mirtiną RNR fenotipą, ir ieškojome ortologų M. incognita . Iš 1 083 nustatytų OrthoMCL šeimų 148 (turinčios 344 M. incognita genus) yra specifiški nematodams (papildomi duomenys, 7.12 skyrius). Dėl savo mirtino RNR fenotipo ir savitų sekų savybių šie genai yra patrauklus rinkinys naujų antiparazitinių vaistų taikinių.

Image

a ) C. elegans ir M. incognita RNR kelio genų palyginimas. Pilkas fonas rodo, kad M. incognita buvo rastas bent vienas homologinis genas, o baltas fonas rodo, kad M. incognita homologinio geno nerasta. b ) Ortologų pasiskirstymas C. elegans mirtinų RNRgenų (Ce, juoda) dalimis tarp M. incognita (Mi, raudona), C. briggsae ir B. malayi (Cb ir Bm, žalia), D. Melanogaster ir trijų grybų. N. crassa , G. zea ir M. grisea (Dm & 3 grybeliai, pilki) naudojant OrthoMCL. Geltonas fonas rodo 148 tik nematodų genų grupes.

Visas dydis

Diskusija

M. incognita genomas turi daug bruožų, dėl kurių jis ypač patrauklus tyrinėjant augalų parazitizmo pagrindus Nematodoje. Svarbus bruožas yra tai, kad didžiąją dalį genomo sudaro homologinių segmentų poros, kurios gali žymėti buvusius išsiskyrusius alelius. Tai rodo, kad M. incognita vystosi be sekso, siekdama veiksmingos haploidijos per Meselsono efektą 38, 39, 40 . Kadangi M. incognita genomas yra pirmasis seka ir surinktas griežtai partenogenetinei rūšiai, mes tikimės, kad jo palyginimas su lytinių nematodų genomais paaiškins mechanizmus, vedančius į jo savitą struktūrą. Funkciniai skirtumai tarp senovės genų, dalyvaujančių šeimininko ir parazito sąsajoje, alelių galėtų paaiškinti ypač platų šio daugiafagio nematodo šeimininko diapazoną ir geografinį pasiskirstymą. Išanalizavus M. incognita genų kiekį, paaiškėjo, kad augalų ląstelių sienelės skaido fermentus, kurie neturi atitikmens nė vienam iki šiol tirtam gyvūnui. Stulbinantis šių fermentų panašumas į bakterijų homologus rodo, kad šie genai buvo įgyti per kelis HGT įvykius. Kaip ir daugelyje bakterinio HGT atvejų, susijusių su genų rinkiniais, susijusiais su prisitaikymu prie naujų šeimininkų ar maisto šaltinių, į M. incognita kandidatus į HGT įvykius įtraukiami genai, turintys galimą vaidmenį sąveikoje su šeimininkais. Alternatyvi hipotezė - kad šie genai buvo įgyti vertikaliai iš bendro protėvio iš bakterijų ir nematodų ir prarasta daugumoje eukariotų rūšių - atrodo mažiau įtartina. Kiti išskirtinumai apima M. incognita ribojamus išskiriamus baltymus arba linijai būdingus išsiplėtimus ir (arba) redukcijas, kurie gali vaidinti šeimininko ir parazito sąveiką.

Vyksta transkripcijos profiliavimas, proteominė analizė ir didelio pralaidumo RNR strategijos, kurios leis giliau suprasti procesus, kuriais nematodas sukelia augalų ligą. Derinant tokias žinias su modelio augalų, turinčių šeimininką, funkciniais genominiais duomenimis, A. thaliana turėtų suteikti naujos įžvalgos intymiame molekuliniame dialoge, reguliuojančiame augalų ir nematodų sąveiką, ir leisti toliau kurti tikslinėms strategijoms skirtus pasėlių pažeidimus. Taikant lyginamąją genomiką laisvai gyvenančių, gyvūnų ir augalų parazitinių nematodų genomų turėjimas turėtų suteikti naujų įžvalgų apie parazitizmą ir pritaikymą nišose.

Metodai

Padermės ir DNR ekstrahavimas.

Mes panaudojome M. incognita kamieną 'Morelos' iš šaknies mazgų nematodų kolekcijos, surengtos INRA (Institut National de la Recherche Agronomique), Sophia Antipolis, Prancūzija. Nematodo kiaušiniai buvo steriliai surinkti iš pomidorų šaknų ir patikrinti, ar nėra augalinės medžiagos teršalų. DNR buvo ekstrahuota, kaip aprašyta Papildomų metodų 8.1 skyriuje internete.

Genomo sekos nustatymas ir surinkimas.

Iš Sander dideoksinukleotidų technologijos gavome porų galų sekas iš plazmidžių ir BAC bibliotekų ABI3730xl DNR analizatoriais. 1 000 873 skaitymai buvo surinkti į 2 817 superkontigus, naudojant Arachne 8 (papildomi metodai, 8.2 skyrius; 26 papildoma lentelė internete).

Genomo struktūra, operonai ir nekoduojantys elementai.

Surinktas genomas buvo ieškomas pasikartojančių ir nekoduojančių elementų. Pastoliai buvo išlyginti, kad būtų galima nustatyti į alelį panašių sričių poras ir tripletus. Genų padėtys išilgai pastolių buvo naudojamos numatant genų, sudarančių tariamus operonus, grupes (Papildomi metodai, 8.3–8.7 skyriai).

Baltymus koduojančių genų numatymas.

Genų prognozavimas buvo atliktas naudojant „EuGene 14“, optimizuotas M. incognita modeliams ir išbandytas su 230 nereikalaujančių, viso ilgio cDNR duomenų rinkiniu. „SpliceMachine“ 41 numatė vertimo pradžią ir suskaidymo vietas. Turimi M. incognita EST buvo suderinti su genomu, naudojant „GenomeThreader 42“ . Panašumai su C. elegans ir kitų rūšių baltymų, genomo ir EST sekomis buvo nustatyti naudojant BLAST 43 . Pasikartojančios sekos buvo užmaskuotos naudojant „RepeatMasker“ (//repeatmasker.org/, Papildomi metodai, 8.8 skyrius; Papildomas 15 pav. Internete).

Automatinis funkcinis komentaras.

Baltymų domenai buvo ieškomi naudojant InterproScan 44 . Toje pačioje „InterproScan“ paieškoje mes taip pat pateikėme baltymus iš septynių papildomų rūšių. Mes įtraukėme dar tris nematodus ( C. elegans , C. briggsae ir B. malayi) , vaismedį ( D. melanogaster ) ir tris grybus ( Magnaporthe grisea, Gibberella zea ir Neurospora crassa ). Norėdami nustatyti ortologinių genų grupes tarp M. incognita ir septynias papildomas rūšis, mes panaudojome OrthoMCL 15 (Papildomi metodai, 8.9 skyrius).

Ekspertų funkcinis komentaras.

Prognozuojamų baltymus koduojančių genų kolekcija buvo rankiniu būdu anotuojama laboratorijų konsorciumo. Kiekviena laboratorija sutelkė dėmesį į tam tikrą procesą ar genų šeimą, susijusią su skirtingais M. incognita biologijos aspektais. Buvo ištirti buvimo ir (arba) nebuvimo, išplėtimo ir (arba) sumažėjimo modeliai, palyginti su C. elegans ir kitomis rūšimis. Numatytų genų kokybė buvo patikrinta rankiniu būdu ir atitinkamai pasiūlyta funkcinė anotacija (Papildomi metodai, 8.10–8.20 skyriai). Genomo naršyklę ir papildomą informaciją apie projektą galite rasti tinklalapyje //meloidogyne.toulouse.inra.fr/.

Prisijungimo kodai.

9538 kontigai, atsirandantys dėl Meloidogyne incognita genomo surinkimo ir anotacijos, buvo saugomi EMBL / Genbank / DDBJ duomenų bazėse registracijos numeriais CABB01000001 – CABB01009538.

Pastaba: papildomą informaciją galima rasti „Nature Biotechnology“ tinklalapyje .

Prisijungimai

EMBL / „GenBank“ / DDBJ

  • CABB01000001
  • CABB01009538

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas tekstas ir figūros

    Papildomi 1–15 paveikslai, 1–26 lentelės, Metodai, duomenys