Viso genomo raiškos analizė suteikia naujų įžvalgų apie fizikinių kompozicijų patento streso kilmę ir raidą | mokslinės ataskaitos

Viso genomo raiškos analizė suteikia naujų įžvalgų apie fizikinių kompozicijų patento streso kilmę ir raidą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Abiotiška
  • Evoliucija
  • Genų išraiška
  • Molekulinė biologija

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Aplinkos pokyčiai, tokie, kuriuos sukelia klimato pokyčiai, gali turėti įtakos augalų augimui, įvairovei ir galiausiai visuotiniam maisto saugumui. Taigi, norint sukurti klimato kaitos padarinių mažinimo strategijas, reikia skubiai sutelkti pastangas, kad būtų galima geriau suprasti augalų reakciją į stresą. Kadangi „ Physcomitrella“ patentai užima svarbią evoliucijos poziciją, užpildydami atotrūkį tarp žaliųjų dumblių ir aukštesnių augalų, ir kadangi jis pasižymi gerai išvystyta atsparumu stresui, jis yra puikus tokio tyrinėjimo modelis. Čia mes panaudojome „ Physcomitrella“ patentus, norėdami išsiaiškinti genomo reakcijas į abiotinį stresą atlikdami transkriptominę analizę, naudodami didelio pralaidumo sekos nustatymo platformą. Mes pateiksime išsamią transkriptominės dinamikos analizę, apibrėždami sukeltų genų reguliavimo reakcijų į abiotinius su stresu susijusius hormonus Abscisic Acid (ABA), peršalimo, sausros ir druskos gydymo profilius. Mes nustatėme daugiau nei 20 000 genų, išreikštų kiekviename aukščiau minėtame streso gydyme, iš kurių 9668 turi skirtingą išraišką reaguojant į stresą. Palyginus „ Physcomitrella patens“ streso reguliuojamus genus su vienaląsčiais dumbliais, kraujagysliniais ir žydinčiais augalais, paaiškėjo genomo apibrėžimas, susijęs su evoliuciniu judėjimu į žemę, įskaitant bendrą genų šeimos sudėtingumą ir genų, susijusių su skirtingomis funkcinėmis grupėmis, praradimą.

Įvadas

„ Physcomitrella “ samanos ( P. patens ) yra svarbus augalų rūšių pavyzdys, padedantis suprasti genų, dalyvaujančių skirtinguose ląsteliniuose procesuose, evoliucijos dinamiką 1, 2 . Kadangi samanos yra evoliucijos etapas, jungiantis žaliuosius dumblius ir kraujagyslių augalus, išlikusių samanų tyrimai gali suteikti informacijos apie augalų reakciją į įvairius aplinkos iššūkius ir pasipiktinimą. Augalų augimui ir derliaus potencialui didelę įtaką daro įvairios abiotinės įtampos, kurias sukelia ribotas vandens tiekimas sausumoje, stiprus saulės spinduliavimas ir kintanti temperatūra. Dėl šių įtempių reikia iš esmės modifikuoti signalizacijos ir fiziologinius procesus, kad būtų galima pakeisti kūno planus ir suaktyvinti sudėtingus reguliavimo tinklus 3, kuriuos sudaro tiek transkripcijos, tiek po transkripcijos reguliatoriai 4, 5 . Nors pripažįstama abiotinio streso signalizacijos svarba, kai kurie molekuliniai komponentai vis dar nežinomi. Norint suprasti rūšies reakciją į aplinkos veiksnius, ribojančius augimą ir vystymąsi neidealiomis sąlygomis, reikia papildomų išsamių tyrimų.

Su abiotiniu stresu susijęs hormonas Abscisic Acid (ABA) yra pagrindinis vaidmuo skatinant augalų prisitaikymą prie streso ir daugelio augalų vystymosi procesų funkcijas 6 . Pavyzdžiui, ABA reikalingas genų indukcijai kaip atsakas į dehidratacijos stresą 7, 8 . Nors transkripcinis ABA reakcijos kelių reguliavimas buvo intensyviai tiriamas sėkliniuose augaluose 6, 8, P. patens žinios apie ABA tarpininkaujamą genų ekspresiją šiuo metu yra tik konservuotam ABA tarpininkaujamam ABA reaguojančių cis elementų (ABRE) aktyvavimui. 9 . Užšalimas arba labai žemos temperatūros poveikis yra pagrindinis augalų augimą lemiantis veiksnys. Užšalimo įtempis esant žemesnei nei 0 ° C temperatūrai ir atšalimo įtempis esant neužšalimo temperatūrai, dėl kurio augaluose indukuojamas atšalimas, yra žinomas kaip aklimatizacija 10 . Sun ir kt. 11 ir Beike ir kt. 12 parodė, kad šaltas aklimatizavimas P. patentuose tam tikrais aspektais turi aiškių skirtumų, palyginti su aukštesniaisiais augalais, ir tai rodo reikšmingus pakitimus sausumos augalų evoliucijos metu.

Manoma, kad tolerancija dehidratacijai yra adaptyvusis bruožas augalų kolonizavimui žemėje ir išlieka plačiai paplitęs tarp berifitų 13 . P. patentai buvo klasifikuojami kaip atsparūs sausrai augalai, nes jie turi didelę galimybę susigrąžinti vandens nuostolius, net ir praradus 92% vandens, atsižvelgiant į šviežią svorį 14 . P. patentai taip pat buvo klasifikuojami kaip halofitai; augalas, natūraliai augantis esant didelei druskos koncentracijai 15 . Jis gali išlaikyti augimą esant Na + koncentracijai, o tai pakenktų daugumai kraujagyslių augalams 14, 16, 17 .

Tačiau lauke augalai patiria įvairių stresų derinį, pvz., Sausra dažnai sutampa su padidėjusiu druskingumu ar aukšta temperatūra. Todėl dėmesys molekuliniams, fiziologiniams ar metaboliniams tyrimams neturėtų apsiriboti tik vieno streso faktoriaus poveikiu.

Remiantis EST gauta transkriptomine analize, pirmieji mikropakopai buvo sukurti ir naudojami palyginamosioms transkriptų analizėms P. patentuose , daugiausia dėmesio skiriant genų, reaguojančių į osmosinį stresą, ir ABA 9, 14, 18 . Transkripto analizė buvo pagrįsta EST sekomis, gautomis daugiausia iš dalinai sekamų cDNR, kurios dažnai yra neišsamios kodavimo sekose ir kuriose trūksta informacijos iš transkriptų, nepateiktų RNR telkiniuose. Didelio pralaidumo sekos nustatymo technologijos yra nepaprastai naudingos analizuojant transkriptų sudėtingumą ir genų reguliavimą. RNAseq metodas 19 sukuria milijonus trumpų cDNR skaitymų, susietų su etaloniniu genomu, kad būtų gautas viso genomo transkripcijos žemėlapis, kuris suteikia daugiau įžvalgos ir tikslumo nei mikrotraumai 19, 20, 21, 22 . Čia panaudojome didelio pralaidumo „Illumina HiSeq“ sekų nustatymo sistemą P. patento transkriptinei analizei atliekant abiotinį streso gydymą. Tai nustatė laikinus ir stresui būdingus genus. Šių genų filogenetinės analizės savo ruožtu išaiškino reagavimo į stresą liniją. Skirtingų ekspresijos klasterių, susijusių su skirtingomis funkcinėmis kategorijomis, genai aiškiai nurodo biologinius, molekulinius ir ląstelinius įvykius, susijusius su P. patens streso reakcijomis.

Rezultatai

Transkripto sekos nustatymas ir kartografavimas pagal P. patens etaloninį genomą

Anotuotas P. patens genomas leido išanalizuoti, identifikuoti ir apibūdinti bryofitų genus 1, 2 . Tiriant RNAseq, visa RNR, sujungta iš trijų kiekvieno mėginio biologinių replikų, buvo tiriama cDNR bibliotekoje, kad būtų gautas platus nuorašų, susijusių su P. patens streso gydymu, tyrimas. Neapdoroti „Illumina“ sekos skaitymo būdai buvo kokybiški ir adapteris sutrumpintas, kad iš viso būtų gauta 220 031 432 trumpi skaitymai, apimantys 22, 64 Gb sekos duomenis iš tyrimų. Sekos skaitymai buvo susieti su P. patens genomo anotacija V1.6, kurios dydis yra 480 Mb, su 32 272 baltymą koduojančiais lokusais ir 38 357 baltymą koduojančiais nuorašais, kurių anotacija yra 2 . Maždaug 198, 4 mln. Perskaitytų duomenų, 89, 79% visų perskaitytų atvejų, buvo puikiai suderinti su pamatiniu genomu, o 91% tų, kurie atitiko anotuotus genų regionus (papildoma S1 lentelė). Skaitymai, susieti su anotuotų genų regionais, buvo suskaičiuoti apskaičiuojant RPKM, kad būtų galima įvertinti geno ekspresiją 19 . Tarp suplanuotų skaitymų mes radome beveik 9, 5 ir 0, 11 milijono suporuotų skaitymų, esančių atitinkamai anotuotuose egzotiškuose regionuose ir visoje egzono-introno sankryžoje.

Globali genų ekspresijos analizė

Vienas iš pagrindinių RNR sekos nustatymo tikslų yra palyginti mėginių genų ekspresijos lygius. RNAseq duomenys buvo apdoroti RPKM vertėms apskaičiuoti - normalizuotam skaitymo tankio matui, kuris leidžia palyginti stenogramos lygius tiek mėginių viduje, tiek tarp jų. Mėginiuose buvo aptikti 23 971 genai. Jų raiška atliekant keturis abiotinius streso gydymo būdus su pasirinktais laiko momentais (0, 5 ir 4, 0 val.) Apibendrinta 1a pav. Venno diagramos rodo išreikštų genų pasiskirstymą iš abiotinių streso gydymo būdų (ABA, peršalimas, sausra ir druska) pasirinktais laiko taškais (0, 5 ir 4, 0 h), palyginti su kontroliniu mėginiu (1a pav., Papildomi duomenų rinkiniai 1–4). Tarp šių genų stresui būdingų genų skaičius buvo 531 (ABA 0, 5 h), 384 (ABA 4, 0 h), 273 (ABA 0, 5 / 4, 0 h), 499 (šaltas 0, 5 h), 487 (šaltas 4, 0 h), 468 (šalta 0, 5 / 4, 0 h), 448 (sausra 0, 5 h), 381 (sausra 4, 0 h), 362 (sausra 0, 5 / 4, 0 h), 662 (druska 0, 5 h), 401 (druska 4, 0 h) ir 435 (druska) 0, 5 / 4, 0 h). Nors tarp visų streso gydymo ir kontrolinių mėginių buvo išreikšta 17 381 genas, daugelis jų buvo kiekybiškai sureguliuoti (1b pav., 5 papildomas duomenų rinkinys); nors kai kurie iš šių genų turėjo mažai variacijų abiotinių streso gydymo būdų metu, tai rodo, kad jie vykdo namų tvarkymo funkcijas.

Image

Apdorojimo metu buvo palyginti paprastai ir unikaliai išreikšti genai, naudojant gautas RPKM reikšmes. Palyginimas buvo atliktas kontroliuojant ir lyginant su visais streso atvejais, įskaitant nurodytus du laiko taškus. a ) Venno diagramos, parodančios išreikštų genų sutapimą, palyginti su kontrole, tarp skirtingų P. patens abiotinių streso gydymo pogrupių. b ) Hierarchinė klasterių analizė ir genų ekspresijos šiluminė schema, pagrįsta log 2 santykio RPKM duomenimis, naudojant abiotinius streso gydymo būdus ir kontrolinį mėginį. Raudona spalva reiškia žemesnę išraišką, žalia spalva reiškia aukštesnę išraišką (išraiškos diapazonas nuo –5, 644 iki 12, 889). Šilumos žemėlapis pagrįstas 1 atstumo funkcija, koreliacija tarp kiekvieno bandymo statistikos apie kiekvieno geno išraišką, stulpeliai žymi atskirus eksperimentus, o eilutės - transkripcijos vienetus. Dendrograma viršuje rodo atskiro gydymo grupes.

Visas dydis

Hierarchinis grupavimas buvo atliktas naudojant Pearsono koreliacijos koeficientą kaip atstumo metrą ir naudojant vidutinio aglomeracijos metodą 23 . Genai buvo suskirstyti į grupes pagal bandinių ekspresijos profilį. Klasifikavimas rodo, kad ABA 4.0 h ir kontrolinio mėginio koreliacija yra aukšta - 0.91, rodanti, kad kintamieji yra teigiamai ir tiesiškai susiję tarp šių mėginių. Be to, kitų streso gydymo mėginių koreliacijos koeficientas yra 0, 73 su kontroline, o kintamieji buvo mažiau susiję su šiais gydymo būdais. Paprastai ankstyvojo ir vėlyvojo reakcijos laiko taškai nesuskilo, išskyrus gydymą šaltuoju metu, kai buvo nustatyta, kad tiek 0, 5, tiek 4 valandos laiko taškai susilieja (1 pav. 1b). Norėdami ištirti, ar ši konkrečios klasterizacijos strategijos pasekmė buvo naudojami skirtingi grupavimo metodai, pagrįsti arba koreliacija, arba Euklido atstumu su visišku ir vidutiniu ryšiu, dendrogramos parodo streso gydymo ir kontrolinės imties išraiškos profilių grupavimą (papildomas S1 pav.). Rezultatai rodo, kad kontrolė ir ABA 4, 0 h paprastai susilieja, o druska 4, 0 h ir sausra 4, 0 h paprastai susilieja kartu, o likusieji streso gydymo būdai yra sugrupuoti (papildomas S1 pav.). Be to, buvo atlikta pagrindinio komponento analizė (PCA), siekiant apibendrinti sistemingus duomenų variacijų modelius ir kiekvieno eksperimento mėginio išraiškos profilių grupavimą. Pritardamas klasterizacijos analizei, PCA parodo, kad kontrolinės ir ABA 4.0 h išraiškos profiliai glaudžiai susilieja, druska 4.0 h ir sausra 4.0 h taip pat turi panašius profilius, o šalto 0.5 h ir 4.0 h gydymo išraiškos profiliai linkę susikaupti su ABA 0.5. h, sausra 0, 5 h ir druska 0, 5 h (papildomas S2 pav.).

Skirtingų abiotinių stresų gydymo genų ekspresijos profilių pokyčiai

Skirtingai išreikšti genai (DEG) buvo identifikuoti, palyginti su kontroliniu mėginiu, išaugintu standartinėmis sąlygomis (žr. Metodus). Norėdami gauti reikšmingus genų ekspresijos skirtumus tarp abiotinio streso gydymo ir kontrolinio mėginio, mes palyginome RPKM gautą skaitymo skaičių, naudodamiesi Log 2 santykio skaičiavimu (log santykis 1 reiškia 2 kartus didesnį pokytį). Buvo apie 17 381 geną, išreikštą visomis streso sąlygomis, kai RPKM vertės buvo didesnės nei nulis. Norėdami sumažinti klaidingų teigiamų rezultatų, nustatėme santykinai konservatyvų RPKM vertės ≥10 slenkstį. Rezultatai parodė, kad rinkinys 7 921 (ABA 0, 5 h), 9 426 (ABA 4, 0 h), 8 524 (šaltas 0, 5 h), 8 084 (šaltas 4, 0 h), 7 285 (sausra 0, 5 h), 7791 (sausra 4, 0 h), 7 605 (druska 0, 5 val.), 8 407 (druska 4, 0 val.) ir 9668 genai visuose streso gydymuose be jokio pertekliaus buvo DEG virš RPKM 10 (2a pav., 6 papildomas duomenų rinkinys).

Image

Skirtingai išreikšti genai (DEG) buvo identifikuoti, palyginti su kontroliniu mėginiu, išaugintu standartinėmis sąlygomis. Genų ekspresijos skirtumai tarp abiotinio streso ir kontrolinio mėginio buvo gauti remiantis RPKM išvestų skaitymų skaičiumi, naudojant Log 2 santykio skaičiavimą. a ) Aukštyn reguliuojamų (žalių juostų) ir žemyn reguliuojamų (oranžinių juostų) genų skaičius parodomas kiekvienam streso gydymui valandomis. b ) Venno diagrama, rodanti DEG sutapimą tarp dviejų laiko taškų (0, 5 ir 4, 0 h). c) Venno diagramos, parodančios DEG sutapimą, atsižvelgiant į keturis tirtus abiotinius įtempius dviem laiko momentais (0, 5 ir 4, 0 h). Viršutinės diagramos nurodo aukščiau reguliuojamus genus, o apatinės - žemyn reguliuojamus genus. Nurodomas genų skaičius kiekviename diagramos regione. Venno diagramos parodo kiekvieno porinio palyginimo sutapimus.

Visas dydis

Norėdami nustatyti genus, rodančius reikšmingą išraiškos pokytį tarp dviejų laiko taškų (0, 5 ir 4, 0 h), mes palyginome visus DEG per visus streso gydymo būdus. Iš viso buvo reguliuojami 12 184 genai, o žemyn - 14 800 genų; DEG, vienareikšmiškai atsirandančių per 0, 5 h laiko taškų, skaičius buvo 4911 (aukštyn reguliuojamas) ir 6 702 (žemyn reguliuojamas), o 7 273 (aukštyn reguliuojamas) ir 8 098 (žemyn reguliuojamas) genas unikaliai pasirodė 4, 0 h laiko taške (2b pav., Papildomas duomenų rinkinys 7). Šie rezultatai rodo, kad išreikštų genų diferenciacija priklauso nuo ekspozicijos laiko ir jie yra labiau diferencijuoti, kai P. patens protonema audiniai yra veikiami streso terapijos 4, 0 val., Palyginti su 0, 5 val.

Atliekant visus porų palyginimus, daug DEG buvo būdingi tam tikram streso gydymui ir tam tikru laiko momentu (2c pav., Papildomi duomenų rinkiniai 8–11). Tarp visų streso gydymo DEG metu 0, 5 val. Buvo suaktyvinti 1 715 genų nuorašai, o 2640 buvo atkakliai represuojami (2c pav.). Palyginus visus DEG visose streso terapijose 4, 0 val., Paaiškėjo, kad buvo surašyti 776 genų nuorašai, ir 1, 529 buvo atkakliai slopinami tarp visų streso gydymo būdų (2c pav.). Visi žymiai indukuoti ir represuoti genai, gauti iš porų palyginimų, buvo lyginami tarpusavyje, Venno diagramos rodo kiekvieno porinio palyginimo sutapimus.

Genų ontologija ir genų rinkinių praturtinimo analizė DEG

Norint palengvinti daugiau genų ekspresijos analizę, visi numatomi P. patento stresiniai-DEG buvo priskiriami skirtingoms funkcinėms kategorijoms, naudojant „Blast2GO“. Anotacijos buvo patikrintos rankiniu būdu ir integruotos naudojant genų ontologijos (GO) klasifikaciją. Visiems DEG buvo analizuojami GO terminų komentarai; 8 383 iš 9668 DEG buvo pažymėti bent viena iš trijų GO kategorijų: ląstelinis komponentas, biologinis procesas arba molekulinė funkcija; kadangi 1 285 (13, 29%) DEG neturėjo GO anotacijos (papildomi duomenų rinkiniai 6, 12–14). Keli šimtai genų, susijusių su vertimu, oksidacijos-redukcijos procesu, transkripcijos reguliavimu, reakcija į stresą, prisijungimu prie baltymų ir ATP surišimu, buvo praturtinti tarp diferencijuotai išreikštų genų atliekant bet kokį streso gydymą (papildomas S3 pav.). Kai kurios iš šių funkcinių grupių buvo praturtintos daugybe genų; metabolinis procesas apėmė 3887 genus ir buvo dominuojanti grupė, pavyzdžiui, pagrindinėje biologinio proceso kategorijoje. Rišančiosios ir ląstelių funkcinės grupės sudarė 4121 ir 6 214 genus ir buvo dominuojančios atitinkamai pagrindinėse molekulinės funkcijos ir ląstelinio komponento kategorijose (papildomi duomenų rinkiniai 12–14). Taip pat aptikome daugybę genų ląstelinio proceso funkcinėse grupėse, turinčiose 3 825 genus, katalitiniame aktyvume - 3, 466 genuose, ir ląstelių dalyje, turinčioje 6213 genus.

„G: Profiler“ įrankis 24 buvo naudojamas klasifikuoti P. patens streso-DEG kiekvienos būklės (ABA, šaltis, sausra ir druska) genų rinkinio praturtinimo analizę (GSEA), remiantis aukštyn ir žemyn reguliuojamais genais, ir jie buvo suskirstyti į kategorijas Atitinkamai 710 ir 579 funkcinės grupės (papildomi duomenų rinkiniai 15 ir 16). Tarp šių grupių yra terminai, susiję su biologiniu procesu (GO: 0008150), metaboliniu procesu (GO: 0008152), ląsteliniu procesu (GO: 0009987), biosintetiniu procesu (GO: 0009058), genų ekspresija (GO: 0010467), vertimu ( GO: 0006412) ir atsakas į dirgiklį (GO: 0050896) vyravo visuose streso gydymuose. Dauguma šių grupių parodė statistiškai reikšmingus GSEA skirtumus, remiantis GO terminais (biologinis procesas) reguliuojamų genų aukštyn ir žemyn (3a, b pav.). Gydant sausrą 0, 5 val. Ir šaltį 4, 0 val., Aptikome didelę dalį reguliuojamų genų iš vieno organizmo proceso funkcinių grupių (GO: 0044699) ir aukštą reguliuojamų genų procentą iš ląstelių metabolinio proceso funkcinių grupių (GO: 0044237 ) naudojant ABA 4, 0 val. ir šaltą 4, 0 val. Be to, signalizacijos signalo funkcinių grupių (GO: 0023052) aukščiau reguliuojamų genų buvo ABA, šalčio ir sausros metu, bet ne gydant druska; žemyn reguliuojamų genų funkcinė grupė RNR ir metabolinis procesas (GO: 0016070) buvo nustatyta tik atliekant 4, 0 val. stresą. Įdomu tai, kad funkcinės grupės, susijusios su reakcija į druskos stresą (GO: 0009651) žemyn reguliuojamuose genuose, nebuvo druskos 0, 5 ir 4 valandas (3b pav.). Be to, buvo pastebėta, kad kai kuriose funkcinėse grupėse yra tam tikrų streso gydymo būdų aukščiau reguliuojamuose genuose, tačiau to paties gydymo, skirto žemyn reguliuojamiems, nėra, ir atvirkščiai. Pažymėtina, kad DEG GSEA buvo stebima skirtingoms funkcinėms grupėms, dalyvaujančioms skirtingais keliais, o tai rodo, kad tarp P. patento įtemptų DEG fiziologinių procesų yra didelių skirtumų.

Image

GO komentaras iš P. patens genomo anotacijos (v1.6) buvo išanalizuotas naudojant Blast2GO naudojant numatytuosius parametrus. „G: Profiler“ įrankis buvo naudojamas klasifikuoti P. patentų įtempių DEGs GSEA kiekvienai sąlygai, remiantis genų aukštyn ir žemyn reguliavimo būsenomis. a ) Pasirinktos aukščiau reguliuojamų genų funkcinės grupės. b) Pasirinktos žemyn reguliuojamų genų funkcinės grupės. Spalvų intensyvumas rodo kiekvieno GO termino praturtinimo balą. Praturtėjimo balas yra log 10 (genų skaičius). Pilnus sąrašus žr. Papildomuose 15 ir 16 duomenų rinkiniuose.

Visas dydis

Ankstyvieji streso genai

Ankstyvojo abiotinio streso atsako metu daugelis genų rodomi aukštyn arba žemyn (2b pav.). Identifikuoti P. patentų genus, kurie yra ankstyvieji streso reakcijų reguliatoriai, ir ABA signalizaciją, yra būtina norint išaiškinti abiotinius streso atsako mechanizmus.

Norėdami nustatyti ankstyvuosius genus, kuriuos stipriai sukelia streso gydymas, palyginome RPKM išvestų skaitymų skaičių, naudodamiesi Log 2 santykio skaičiavimu, kad nustatytume genus, atspindinčius didelį streso mėginių pokytį, palyginti su kontroliniu 0, 5 val. Laiko momentu. Buvo septyni genai, labai sureguliuoti visomis streso sąlygomis per 0, 5 val., Pasikeitus ≥ 50 kartų (4a pav.). Šie labai reguliuojami ankstyvojo streso genai turi aiškias funkcijas (papildoma S2 lentelė). Pavyzdžiui, Pp1s370_29V6.1 koduoja gausų baltymo LEA-3 embriogenezę. Dėl plataus tarpląstelinio LEA baltymų pasiskirstymo pabrėžiama, kad kiekviename ląstelių skyriuje reikia turėti apsauginius mechanizmus, kad būtų galima susidoroti su išsausėjimu ar šaltuoju stresu, be to, šis genas taip pat gali būti naudojamas sėklų brendimo ir išsausėjimo tolerancijai 25 . Šio nuorašo Arabidopsis homologas dalyvauja druskos streso kelyje 26 . Pp1s43_3V6.1 ir Pp1s55_253V6.1 yra AP2 / EREBP transkripcijos veiksnių šeimos nariai; atpažinti į sausrą reaguojančią aplinką (DRE) tikslinėse priemonėse 27 . Atrodo, kad visi šie genai yra per daug druskos ir sausros, kur abu šie gydymo būdai yra suskirstyti į grupes, ir mažiau reprezentuojami gydant šaltį ir ABA, kai yra dar vienas šių gydymo grupių (4a pav.). Taip pat buvo keturi genai, labai sureguliuoti visomis streso sąlygomis per 0, 5 val., Kai kinta 10 kartų (4b pav.), Ir jie koduoja skirtingas funkcijas (papildoma S3 lentelė), tokius kaip beta-ekstabinas 3 (Pp1s251_59V6.1), kuris turi buvo parodyta, kad jis reaguoja į vandens trūkumą 28, ir kitas ekspansijos stenograma (Pp1s11_29V6.1), susijęs su augalų tipo ląstelių sienelių organizavimu ir galbūt morfologine adaptacija.

Image

Ankstyvojo ABA ir į stresą reaguojančio geno ekspresijos modeliai P. patens tyrime buvo nagrinėjami tik genai, turintys didelį raukšlės pokytį. ( a, b ) Šilumos žemėlapiai - genų ekspresijos palyginimas tarp 0, 5 val. stresinio gydymo su dideliu kartos pokyčiu. Stulpeliai žymi atskiras procedūras, o eilutės - transkripcinius vienetus. a) Aukštyn reguliuojami genai b ) Žemyn reguliuojami genai. ( c ), ankstyvojo streso metu išreikštų genų grupė, jie yra vienodai žemos ir aukštos ekspresijos vertės.

Visas dydis

Buvo prognozuojama dar viena ankstyvojo streso atsako genų grupė, esant aukštai ir žemai ekspresijos lygiams, remiantis absoliučiomis RPKM reikšmėmis (4c pav., Papildoma S4 lentelė). Šie bendrai išreikšti ankstyvojo streso reagavimo genai gali gulėti tuo pačiu keliu. Pavyzdžiui, Pp1s100_117V6.1 koduoja ATP sintazės beta subvienetų baltymus, kurie reaguoja į oksidacinį stresą. Acil-CoA surišantis baltymas 6 (Pp1s36_294V6.1) reaguoja tiek į šalčio, tiek į druskos stresą 29, o sutikus su mūsų rezultatais, Pp1s36_294V6.1 išraiška padidėja tiek esant ankstyvam šalčio, tiek druskos stresui (4c pav.). Kiti genai: Pp1s143_71V6.1, Pp1s37_172V6.1, Pp1s60_311V6.1 ir Pp1s84_242V6.1 neturi GO anotacijos, tačiau jie turi tuos pačius išraiškos profilius su aukščiau pateiktais nuorašais. Įdomu tai, kad šie genai turi vienodą ekspresijos elgesį tarp visų streso gydymo būdų ir yra labiau išreiškiami sausros ir mažiau šalčio atvejais nei kiti gydymo būdai (4c pav.).

P. patentų genų ekspresijos modelių įteisinimas reaguojant į abiotinius stresus

Toliau patvirtinome genų ekspresijos rezultatų tikslumą ir atkuriamumą, naudodami kiekybinį realaus laiko PGR (qPCR) kaip ortogonalų genų ekspresijos analizės metodą. Dviejų etaloninių genų ir 10 DEG transkripcijos lygiai buvo nepriklausomai išanalizuoti qPCR (5 pav.). Remiantis RPKM rezultatais, du genai (Pp1s13_134V6.1 ir Pp1s56_240V6.1) yra konstituciškai išreikšti be reikšmingo skirtumo tarp visų streso gydymo ir kontrolinių mėginių (5a pav.), Ir jie koduoja 3-hidroksiizobutirilo koenzimą A ir riboflavino kinazę., atitinkamai. QPCR rezultatai taip pat parodė tuos pačius raiškos modelius, be skirtumų tarp tirtų mėginių raiškos (5a pav. Ir papildomas 4 pav.). Taigi šie du genai buvo laikomi endogeniniais kontroliniais elementais (etaloniniais genais) qPCR duomenų normalizavimui. Be to, mes sukūrėme pradmenų poras, skirtas specialiai aptikti 10 DEG (aukštyn ir žemyn reguliuojamų), kurie užkoduoja skirtingas funkcijas, nuorašo lygį (papildoma S5 lentelė). 10 DEG stenogramų lygiai buvo gauti qPCR tyrimais, normalizuoti su aukščiau nurodytais etaloniniais genais ir palyginti su RPKM išvestų skaitymų skaičiumi, naudojant Log 2 santykio skaičiavimą. Iš tikrųjų 10 atrinktų genų nuorašo lygiai buvo diferencijuotai reguliuojami esant streso sąlygoms, o raiškos modeliai parodė aukštą qPCR tyrimų ir RNAseq analizuotų duomenų atitikties laipsnį (5b pav.). Apibendrinant, šis nepriklausomas qPCR vertinimas patvirtina mūsų metodo, leidžiančio nustatyti RNAseq išvestus raiškos modelius, atkuriamumą ir pagrįstumą.

Image

Atrinkti ekspresijos genų profiliai buvo patvirtinti kiekybiniu realaus laiko PGR (qPCR). a ) Pp1s13_134V6.1 ir Pp1s56_240V6.1, kurie buvo naudojami kaip pamatiniai genai, qPCR patvirtinimas ir ekspresijos analizė. ( b ) qPCR patvirtinimas ir 10 DEG (aukštyn ir žemyn) išraiškos analizė esant skirtingoms streso sąlygoms ir jie užkoduoti skirtingas funkcijas. Mėlynos juostos rodo išraiškos lygį ir Log 2 (raukšlės pokyčiai), gautus iš qPCR, trims replikoms. Raudonos linijos rodo RNAseq duomenų analizės išraiškos lygį ir Log 2 (raukšlės pokytis). Klaidų juostos žymi standartinę vidurkio paklaidą.

Visas dydis

Evoliucinis streso kontroliuojamų genų išsaugojimas

Atsižvelgiant į filogenetinę P. patentų padėtį, šiame modeliniame augale galima ištirti specifinius prisitaikymus prie naujų aplinkos sąlygų, reikalingų pereiti nuo vandens gyvybės prie žemės paviršiaus 1 . Norėdami ištirti sausumos augalų reakcijų į stresą evoliucinį išsaugojimą, atlikome lyginamųjų vienaląsčių dumblių ( C. reinhardtii ), bryophytes ( P. patens ), lycophytes ( S. moellendorffii ) ir angiosperms ( A. thaliana ) įtempių DEG analizę. atskleisti pagrindinius procesų tinklus, kurie lėmė, kad egzistuojančių augalų reakcijos buvo įvairios. Gauti nereikalingi 9668 P. patento įtempiai-DEG (6 papildomas duomenų rinkinys) buvo analizuojami BLAST-P (17 papildomas duomenų rinkinys), o 512, 3 708 ir 106 genai buvo pasidalyti su A. thaliana , S. moellendorffii ir C atitinkamai Reinhardtii . Be to, buvo prognozuojama, kad 565 genai bus našlaičių genai (6a pav., Papildomos duomenų bazės 18–20). Genų rinkinio praturtinimo analizė kartu su ortologo analize buvo naudojama nustatyti ortologinių genų funkcinių kategorijų praturtėjimą, išsaugojimą ir sujungimą tarp P. patens ir A. thaliana , S. moellendorffii ir C. reinhardtii. Funkcinėms kategorijoms ištirti buvo naudojami visi ortologų rinkiniai, rasti tarp minėtų rūšių. Mes nustatėme daugybę GO praturtintų funkcinių kategorijų, kurios buvo išsaugotos ar varijavo tarp šių modelinių organizmų (6b pav. - e ir papildomos duomenų bazės 22–25). Mes taip pat palyginome GO praturtintų P. patens našlaičių genų kategorijas su P. patens / C. reinhardtii , P. patens / S. moellendorffii ir P. patens / A. thaliana genais. Įspūdinga, kad mes pastebėjome, kad jokioje funkcinėje grupėje tarp konservuotų ir našlaičių genų nėra bendro GO praturtinto termino (6b pav.). Palyginus GO praturtintų funkcinių kategorijų P. patentų / C. reinhardtii , P. patentų / S. moellendorffii ir P. patentų / A. thaliana genus, nustatyta, kad GO praturtinti genai, skirti GMP (guanozino monofosfatas) biosintetiniam ir GMP metabolizuojančiam genui. procesas tarp P. patens / C. reinhardtii grupės nėra susijęs su P. patens / S. moellendorffii ir P. patens / A. thaliana procesais (6d, e pav.). Kita vertus, GO terminai, praturtinti genų ekspresija, transliacija ir baltymų apykaitos procesu, yra pasiskirstę ir sujungti tarp P. patens / S. moellendorffii ir P. patens / A. thalina grupių (6b pav.). Palyginus P. patens streso reguliuojamus genus su vienaląsčiais dumbliais, kraujagysliniais ir žydinčiais augalais, paaiškėjo genomo pokyčiai, susiję su evoliuciniu judėjimu į žemę, įskaitant bendrą genų šeimos sudėtingumą ir genų, susijusių su skirtingomis funkcinėmis grupėmis, praradimą.

Image

a ) Venno schema, rodanti P. patens DEGs sutapimą tarp C. reinhardtii , S. moellendorffii ir A. thaliana, remiantis BLAST-P analize, taip pat P. patens našlaičių DEG. ( b ) GO praturtintų P. patens našlaičių DEG kategorijų diferencijavimas su P. patens / C. reinhardtii , P. patens / S. moellendorffii ir P. patens / A. thaliana genais (žalia reiškia našlaičius, o mėlyna - genai, konservuoti su kitais pavyzdiniais organizmais). c ) GO praturtintų P. patens / S. moellendorffii ir P. patens / A. thaliana grupių funkcinių kategorijų lyginamoji analizė (žalia rodo P. patens / A. thaliana praturtintas funkcines grupes, o mėlyna - P. patents / S moellendorffii praturtintos funkcinės grupės, rodyklės rodo bendras ir sujungtas GO praturtintas funkcines kategorijas tarp dviejų grupių. ( d ) GO praturtintų P. patens / C. reinhardtii ir P. patens / S. moellendorffii grupių funkcinė kategorijų lyginamoji analizė (žalia rodo P. patents / S. moellendorffii praturtintas funkcines grupes, o mėlyna - P. patens / C. reinhardtii praturtintos funkcinės grupės). e ) P. patento / C. reinhardtii ir P. patens / A. thaliana grupių funkcinių kategorijų GO praturtinta lyginamoji analizė (žalia reiškia P. patentus / A. thaliana praturtintas funkcines grupes, o mėlyna - P. patentų / C. reinhardtii praturtintos funkcinės grupės). „Cytoscape“ ir „Enrichment Map“ buvo naudojami vizualizuojant GSEA rezultatus iš „BiNGO“ papildinio. Mazgo dydis parodo genų skaičių P. patentuose . Spalva skiriasi priklausomai nuo „BiNGO“ p reikšmės reikšmės. Briaunos dydis parodo persidengiančių genų skaičių tarp dviejų sujungtų genų grupių.

Visas dydis

Abiotinių streso reakcijų našlaičiai

Genai, kurie neturi skirtingų rūšių panašumo (našlaičiai), atsiranda visuose sekvenuotuose genomuose. Keli našlaičiai turėjo prisidėti prie augalų reagavimo į aplinką ir pagal liniją būdingų bruožų; o kai kurie našlaičiai yra funkcionalūs, kai patenka į evoliuciškai tolimas rūšis 30 . Gerinant mūsų supratimą apie konkrečiai linijai būdingų genų kilmę, labai svarbu įgyti žinių apie tai, kaip gali atsirasti nauji genai ir įgyti įvairių linijų funkcionalumą 30 . Linijai būdingų genų buvimas buvo ryškus ir dominuojantis požymis, parodytas pakartotiniame P. patens genomo anotacijoje (v1.6) 2 . Iš viso 565 iš P. patens identifikuotų abiotinių į stresą reaguojančių genų neturėjo ortologų kituose Viridiplantae (6a, b pav.), Ir jų buvo ankstyvajame ir vėlyvajame streso atsakuose (papildomas duomenų rinkinys 18). Paprastai atrodė, kad jie yra skirtingai reguliuojami visuose streso gydymuose, tačiau kai kurie genai buvo skirtingai reguliuojami atliekant specifinį streso gydymą. Pavyzdžiui, „Pp1s120_56V6.1“ nėra prieinamos GO anotacijos, tačiau atrodo, kad ji reguliuojama tik „ABA 4.0 h“, o „Pp1s124_18V6.1“ koduoja antocianinų transkripcijos reguliatorių ir yra reguliuojama tik per 0, 5 valandos ABA (papildomas duomenų rinkinys 18). Atrodo, kad hipotetinis baltymas (Pp1s27_173V6.1) yra reguliuojamas tik gydant 0, 5 valandos druska ir sausrą (18 papildomas duomenų rinkinys).

Didelis GO terminų, kartu su skirtingai reguliuojamais našlaičių genais, atvaizdavimas visais streso atvejais buvo nustatytas naudojant biologinių tinklų genų ontologijos įrankį (BiNGO). Jie buvo suskirstyti į 82 funkcines grupes (22 papildomas duomenų rinkinys). Dauguma šių grupių rodė statistiškai reikšmingą GO vaizdavimą (7 pav. Ir papildomas S5 pav.). Tarp šių grupių reakcijos į šaltį (GO: 0009409), atsakas į abiotinį dirgiklį (GO: 0009628), atsakas į temperatūros stimulą (GO: 0009266) ir atsakas į dirgiklį (GO: 0050896) terminai parodė reikšmingą per didelę reprezentaciją. pagal gautas P vertes (papildomas S5 pav.). Pažymėtina, kad buvo pastebėtas per didelis GO terminų vaizdavimas P. patens našlaičių streso-DEGs skirtingose ​​funkcinėse grupėse, dalyvaujančiose skirtinguose morfologiniuose, fiziologiniuose ir metaboliniuose keliuose. Tai rodo, kad šių genų fiziologiniai procesai labai skiriasi.

Image

GN terminams, kurie statistiškai (hipergeometrinis testas) buvo per daug reprezentuojami iš P. patentų našlaičių DEG, vizualizuoti buvo naudojamas „BiNGO“, citoscape įskiepis. Reprezentatyvi šilumos schema klasifikuodama genų ekspresijos analizę remiantis RPKM log 2 santykiu. Spalvų skalė (nuo baltos, geltonos iki tamsiai oranžinės) pagrįsta (pataisyta) p verte (5% FDR, p = 0, 05). Tamsiai oranžinės kategorijos yra žymiai perreprezentuotos, balti mazgai nėra žymiai perreprezentuoti (NA); jie įtraukiami norint parodyti kitus mazgus GO hierarchijos kontekste. Mazgo plotas yra proporcingas genų skaičiui bandymo rinkinyje, pažymėtame atitinkama GO kategorija. Šilumos žemėlapiai buvo sukurti naudojant „R gplots“ paketą. RPKM buvo naudojami kaip įvestis hierarchiniame grupavime, naudojant Euklido matavimą, norint gauti atstumo matricą, pilną aglomeraciją ir dendogramas. Spalvų skalė (nuo baltos, raudonos iki žalios) pagrįsta log 2 kartų pokyčiu. Žalia reiškia aukščiau reguliuojamus genus; raudona spalva reiškia skirtingo streso gydymo priemones, reguliuojamas žemai. Balta spalva nerodo genų ekspresijos tam tikrame streso gydyme (NA), A: ABA, C: šaltis: D: sausra, S: druska.

Visas dydis

Diskusija

P. patentai yra svarbus pavyzdinis organizmas evo - devo tyrimams. Per 470 milijonų skirtingos evoliucijos metų išlikusios samanos ir sėkliniai augalai sukūrė skirtingas išgyvenimo strategijas, paskatindami vyraujančią gametofitinę ir sporofitinę evoliuciją, atitinkamai 1, 31 . Ar šių morfologinių pokyčių evoliuciją lydėjo pokyčiai ir naujovės naujose reakcijose į stresą? Vienas pagrindinių brefito, dumblių ir angipermedžių evoliucinio išsaugojimo analizės tikslų yra atskleisti pagrindinius procesų tinklus, kurie lėmė išlikusių augalų reakcijų įvairovę. Palyginus skirtingų rūšių evoliucijos pakopų genų funkcijos analizę, galima atskirti genų šeimas, kurios atsirado neseniai evoliucijos metu, ir konservuotas genų šeimas, koduojančias baltymus, turinčius pagrindines funkcijas 3 . Mūsų duomenys yra aptariami evoliucijos kontekste, siekiant išskaidyti augalų reagavimo į stresą strategijas, taip pat siekiant atskleisti streso sukeltą samanoms būdingų genų ekspresiją, o tai galbūt prisidėjo prie šių poikilohidrinių augalų evoliucijos sėkmės ir išlikimo.

Prisitaikant prie žemės, taip pat reikėjo baltymų, apsaugančių nuo stresų, evoliucijos. Vienas iš to pavyzdžių yra šilumos šoko baltymo 70 (HSP70) šeimos išplėtimas iki 13 citozolinių narių P. patentuose , tuo tarpu visi iki šiol sekvenguoti dumblių genomai koduoja vieną atskirą citozolinį HSP70. Mūsų rezultatai parodė, kad šie nariai yra ir išreiškiami tarp visų streso gydymo būdų, turinčių skirtingą išraiškos lygį. Kai kurios buvo išreikštos taip: Pp1s2_216V6.1, Pp1s351_21V6.1 ir Pp1s97_279V6.1, bet kitos, pavyzdžiui: Pp1s351_24V6.1, Pp1s262_62V6.1 ir Pp1s298_26V6.1, buvo išreikštos žemu lygiu (papildomi duomenys).

Sėklų dehidratacijos tolerancija priklauso nuo ABA, kad sukeltų specifinių sėklų genų, tokių kaip vėlyvas embriogenezė, kuriame gausu baltymų (LEA), baltymų, kurie kaupiasi dehidratacijos metu, ekspresiją. P. patentuose yra LEA genų ir kitų genų, išreikštų abiotinių streso reakcijų metu, ortologai. P. patens genome yra numanomi A. thaliana ABA receptorių homologai, tokie kaip transkripcijos faktorius ABI5, kuris reiškia jį reguliuojant ABA tarpininkaujamą genų ekspresiją.

Mūsų analizė nustatė, kad į ABA ir sausrą reaguojančius genus sudaro tie, kurie koduoja daugybę LEA baltymų ir į dehidrataciją reaguojančių elementų surišimo baltymų (DREB) transkripcijos faktorių. A. thaliana kai kurie į dehidrataciją reaguojantys genai yra suaktyvinami transkripcijos veiksniais, tarpininkaujančiais nuo ABA priklausančiu keliu, įskaitant bazinį leucino užtrauktuką (bZIPs), MYC / MYB ir ABI3 / VPI šeimas, atpažįstančias specifines surišimo vietas promotoriaus regionuose. šie genai 32 . Panašiai kaip ir P. patens, ABA specifinė indukcija veikia jungiantis bZIP transkripcijos faktorius prie ABRE 33 . Druskos sukelti genai buvo identifikuoti P. patentuose, koduojančiuose reguliuojančius baltymus, tokius kaip kalmoduliną jungiantys baltymai 34, Ca 2+ -ATPaz 35 ir AP2 / EREBP transkripcijos faktorius PpDBF1 36 . Sutikus su mūsų analize, buvo nustatytas didelis skaičius druskos specifiškai ekspresuotų genų ir didelis druskos DEG kiekis buvo išreikštas po 0, 5 ir 4, 0 val. Veikimo 350 mM NaCl, įskaitant jau minėtus genus. Augaluose, kai pirminiai jutikliai suvokia žemos temperatūros signalą, Ca 2+ kanalai suaktyvėja, o citozolinis Ca 2+ lygis padidėja, suaktyvindamas baltymus, užtikrinančius ląstelių apsaugą, pavyzdžiui, LEA šeimos genų aktyvaciją ir šalčio ekspresiją. reguliuojami genai (COR) 37 . Suaktyvinus susijusį signalo perdavimo kelią, kaupiasi osmoprotektantai, tokie kaip cukrus, aminai ir suderinamos tirpios medžiagos, kurie ilgainiui sąlygoja membranos stabilizavimąsi ir pakitusią genų ekspresiją, kad būtų užtikrinta apsauga visais lygiais38. Mūsų rezultatai parodė, kad į patentus reaguojantys ABA genai P. patentuose buvo suaktyvinti, kai buvo gydomi druska ir šaltis, o tai rodo šių genų dalyvavimą reaguojant į daugelį stresų. Tokį kryžminį ryšį gali tarpininkauti kalcis, antrasis pasiuntinys, kuris padidėja įvairių abiotinių stresų metu ir indukuoja signalizacijos kelią, taigi ir įvairių genų, turinčių reikšmę ląstelės homeostazei palaikyti, ekspresiją.

Našlaičiai gali būti apibrėžti kaip genai, kurių kodavimo seka yra visiškai unikali rūšiai; kitaip tariant, genai, kurie, kaip spėjama, gamina anksčiau naujus baltymus. Tačiau kiekvienoje evoliucinėje linijoje yra našlaičių genų, kuriems trūksta homologų kitose giminėse ir kurių evoliucinė kilmė yra menkai suprantama 30 . Atsižvelgiant į didelį našlaičių genų skaičių tarp nuolatinių įtempių DEG (6a, b ir 7 pav.), Darome išvadą apie svarbų rūšių ar linijų genų vaidmenį įgyjant samanų abiotinį atsparumą stresui. Specifiniai rūšims ar linijai būdingi genai taip pat gali būti atsakingi už poikilohidrinimą, nes šis reiškinys taip pat pastebimas daugelyje formų dumblių.

Kadangi dauguma šiuos procesus reprezentuojančių DEG turi ortologus kituose Viridiplantae, darome išvadą, kad pagrindiniai molekuliniai abiotinių streso reakcijų mechanizmai gali atsirasti samanų gametofitoje (vyraujanti forma vėžiuose) ir žydinčių augalų sporofituose (vyraujanti forma kraujagyslėse). augalai), ir tai praplės mūsų supratimą apie streso molekulinę biologiją ir suteiks pagrindą būsimiems P. patentų ir kitų augalų rūšių streso reguliavimo mechanizmų tyrimams. Be to, rūšys ar linijai būdingi streso reguliuojami genai, kurių nėra aukštesniuose augaluose, leidžia manyti, kad šie nežinomi ir neklasifikuoti nuorašai gali būti vertingi pasėlių augalų gerinimo tikslai keičiantis klimatui keičiant tikslinį geną.

Metodai

Augalinės medžiagos ir streso apdorojimas

P. patentų kultivavimas buvo atliktas skystoje mineralinėje terpėje [250 mg l −1 KH 2 PO 4, 250 mg l −1 MgSO 4, 7 H 2 O, 250 mgl −1 KCl, 1000 mg l −1 Ca (NO 3). ) 2, 4H 2 O, 12, 5 mg l- 1 FeSO 4, 7 H 2 O, pH 5, 8 su KOH] 39 . Šviežiai suardyta protonemata buvo subkultūruojama 5 dienas ir perkelta į šviežią terpę ir auginama per naktį Erlenmejerio kolbose ant purtyklių esant 125 aps./min. Gydant druska ir ABA, terpė buvo papildyta 350 mM NaCl, o apdorojant ABA, cis-trans ABA buvo pridėta iki galutinės koncentracijos 10–5 M. Sausumo gydymui protonematiniai audiniai iš Erlenmejerio kolbų buvo perkeliami tiesiai į plastiką. 9 cm Petri lėkštelių pagrindas. Indai (neuždengti) buvo dedami į skaidrias plastikines talpyklas, kuriose yra prisotinto NaCl tirpalo, kad būtų išlaikyta santykinės oro drėgmė 9 . Gydymas šaltuoju būdu buvo perkeltas į protonemato audinių Erlenmeyerio kolbas į šaldytuvą 4 ° C temperatūroje. Apdorojimo metu terpės temperatūra buvo 4 ° C. Kontroliniai augalai buvo auginami lygiagrečiai ir buvo nuimami tuo pačiu metu kaip ir su abiotiniu stresu apdoroti mėginiai. Po 0, 5 ir 4 valandų vieno kolbo samanų medžiaga iš vieno apdorojimo buvo surinkta, sujungta ir užšaldyta skystame azote.

RNAseq bibliotekų sudarymas ir sekų sudarymas

Visa RNR buvo išskirta iš protonemos audinių, naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. „ P. patens RNAseq“ bibliotekos buvo paruoštos naudojant „TruSeq“ RNR mėginių paruošimo rinkinį (Illumina, Inc.), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Trumpai tariant, „TruSeq“ RNR mėginių paruošimo rinkinys paverčia poli-A turinčią mRNR bendroje RNR į cDNR biblioteką, naudojant poli-T oligo-prijungtų magnetinių granulių atranką. Po mRNR gryninimo, RNR chemiškai suskaidoma prieš atvirkštinę transkripciją ir cDNR generavimą. Suskaidymo etapo metu gaunama „RNAseq“ biblioteka, kurioje yra intarpai, kurių dydis yra maždaug 100–400 bp. Vidutinis įdėklo dydis „Illumina TruSeq RNR“ sekos sudarymo bibliotekoje yra apytiksliai 200 bp. Tada cDNR fragmentai galutinai pataisomi, pridedant vieną „A“ bazę prie 3 ’galo ir tada sujungiant adapterius. Tada produktai išgryninami ir praturtinami PGR, kad būtų sukurtos galutinės dvigubos grandinės cDNR bibliotekos. Galiausiai bibliotekų kokybės kontrolė ir kiekybinis nustatymas buvo atlikti naudojant Bioanalyzer Chip DNA 1000 II seriją (Agilent) ir tiesiogiai seka, naudojant didelio pralaidumo „Illumina HiSeq“ sekų sudarymo sistemą (Illumina, Inc.). Neapdoroti kiekvienos bibliotekos skaitymai buvo dedami į NCBI „BioSample“ duomenų bazę ir prieinami per „Sequence Read Archive“ (SRA) prisijungimo numerį SRP050162.

Iliuminavimo suderinimas ir analizė atitinka P. patens etaloninį genomą

Suporuoti pabaigos (PE) duomenys iš kiekvienos bibliotekos (keturi abiotiniai streso gydymo būdai su pasirinktais laiko taškais 0, 5 ir 4, 0 valandos, be kontrolinio mėginio) buvo apdoroti naudojant CASAVA 1.8.2 versijos paketą „Fastq“ formatu. Trimmomatinis 40 paketas buvo naudojamas adapteriams pašalinti ir žemos kokybės bazėms filtruoti (<Q20), ir buvo išsaugoti tik tie, kurių kokybės balas buvo 20 ar aukštesnis. Filtruotos sekos gali būti susietos su P. patens genomu V1.6 2 („Cosmoss“ duomenų bazė; //cosmoss.org/; duomenis taip pat galima rasti JGI (Phytozome; //www.phytozome.net/physcomitrella.php) naudojant „CLCbio Genomics workbench 6.1“ (//www.clcbio.com). „CLCbio Genomics“ darbastalis naudojo nesuspaustą priesagų masyvą ir smith-waterman algoritmą nuorodų žemėlapiams sudaryti.

Visuotinė genų ekspresija ir diferencinė genų ekspresijos analizė

Procedūrų metu paprastai ir unikaliai išreikšti genai buvo palyginti naudojant internetinį įrankį „Venny 41“ . Palyginimas buvo atliktas kontroliuojant ir lyginant su visais streso atvejais, įskaitant du laiko taškus. Norėdami apskaičiuoti normalizuotas genų ekspresijos vertes, naudodamiesi RPKM metrika 19, skaitymai buvo susieti su etaloniniu P. patens (v1.6) 2 genomu. Norėdami išfiltruoti sekos sudarymo ir žemėlapių sudarymo artefaktus, kaip savo slenkstį pasirinkome RPKM reikšmes ≥10. Kiekvieno geno diferencialinė išraiška apskaičiuojama naudojant log 2- santykio skaičiavimą; skirtinga išraiška nurodoma kaip dviejų išreikštų verčių log 2 santykis. Vienodų kiekvieno geno išraiškos verčių log 2 santykis būtų lygus nuliui, tuo tarpu genų reguliavimas aukštyn būtų didesnis, jei šis santykis yra didesnis nei nulis, ir žemai reguliuojamas, jei santykis yra mažesnis už nulį, log santykis 1 reiškia 2 kartus. pakeisti 42 . Genų ekspresijos profiliavimas buvo atliktas naudojant „Tophat 43“, „Cufflinks 20“ ir „CummeRbund“ paketą (//compbio.mit.edu/cummeRbund/). Šilumos žemėlapiai ir dendrograma yra sugeneruoti naudojant R paketą (//www.r-project.org/), kad būtų galima palyginti transkripto išraiškos profiliavimą skirtinguose streso atvejais. Hierarchinis grupavimas buvo atliktas naudojant Pearsono koreliacijos koeficientą kaip atstumo metrą ir vidutinio aglomeracijos metodą 23 . Klasterinės dendrogramos buvo ištirtos žemiau 0, 15 aukščio slenksčio, leidžiant atidžiai patikrinti genus, suskirstytus į klasterio vidutinį koreliacijos koeficientą 0, 91 arba aukštesnį.

Kiekybinis realaus laiko PGR (qPCR)

Kiekybiškai įvertinti qPCR buvo naudojama cDNR, atitinkanti 50 ng visos RNR. Kiekybinės PGR reakcijos buvo atliktos taikomosiose Biosystems StepOnePlus instrumentų sistemose, naudojant KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR rinkinį (Kapa Biosystems, JAV) su genų specifiniais pradmenimis pagal gamintojo instrukcijas. Duomenys buvo normalizuoti, palyginti su Pp1s13_134V6.1 ir Pp1s56_240V6.1 genais, kurie turėjo santykinai stabilų ekspresijos lygį visuose abiotinių stresų gydymo ir kontroliniame mėginiuose. Produkto tiriamos lydymosi kreivės, siekiant nustatyti, ar tik vienas produktas buvo amplifikuotas be grunto dimerų ir kitų juostų; tirpimo kreivės analizė buvo atlikta kiekvienai pradmenų porai prieš tolimesnę analizę. Santykinė kiekybinė analizė buvo atlikta lyginamuoju kiekybiniu būdu naudojant „StepOne v2.3“ programinę įrangą. Visos reakcijos buvo vykdomos trimis egzemplioriais. Tolesnių qPCR reakcijų pradmenys yra išvardyti papildomoje S5 lentelėje.

Genų ontologija ir genų rinkinių praturtinimo analizė

DEG atveju GO 44 paskutinės P. patens genomo anotacijos (v1.6) 2 analizė buvo atlikta naudojant „Blast2GO“ (2.3.5 versija) (//www.blast2go.org/) su numatytaisiais parametrais 45 . Norėdami įvertinti GSEA 46 pagal mūsų nustatytus DEG, mes naudojome viešą žiniatinklio įrankį g: Profiler (//biit.cs.ut.ee/gprofiler) 24 genų sąrašų funkciniam apibūdinimui. g: Profilerį sudaro penki komponentai (g: GOSt - genų grupės funkciniam profiliavimui, g: kakava - kompaktiškam anotacijų palyginimui, g: konvertuoti genų ID konvertavimui, g: rūšiavimo pagal išraiškos panašumo paieškas ir g: Orto - ortologijos paieškoms). g: GOSt buvo naudojamas DEG sąrašų funkciniam apibūdinimui nustatyti. Pamatiniai „GO“ anotacijų rinkiniai yra paimti iš „Ensembl“ duomenų bazės (75 leidimas) ir „Ensembl“ genomų (22 leidimas) ir suskirstomi į tris komponentus: biologinį procesą, molekulinę funkciją ir ląstelinį komponentą. P-vertei apskaičiuoti buvo naudojamas Fišerio vienpusis testas (kumuliacinė hipergeometrinė tikimybė), o kelių bandymų pataisai buvo naudojamas Benjamini-Hochbergo klaidingo atradimo koeficientas, kurio ribinė vertė po pataisos <0, 05. GO terminai, kurių P vertės yra žemiau <0, 05 slenksčio, buvo laikomi statistiškai reikšmingais. Pasirinktų GO terminų lygio diagrama buvo atlikta naudojant „R suite“ programinę įrangą (//www.r-project.org/). g: „Profiler“ taip pat teikia ortologų žemėlapius (g: „Orth Ortholgoy“ paieška). Įvestų genų ID buvo automatiškai konvertuojami naudojant „Ensemble“ genų ID, naudojant „g: Convert“, o po to naudojami ortologų žemėlapiams pagrįsti, remiantis „Ensemble“ suderinimais.

Evoliucijos dinamikos ir našlaičių nuorašų analizė

Buvo atlikta išsami P. Patens DEG analizė prieš visus organizmus, priklausančius Viridiplantae taksonominei grupei, siekiant apibrėžti šių genų evoliucinį išsaugojimą šioje giminėje. Tuo tikslu iš „UniProt“ duomenų bazės (//www.uniprot.org/) buvo atsisiųstos visos turimos Viridiplantae baltymų sekos. Su šiomis sekomis buvo sukurta BLAST duomenų bazė. P. Patens baltymų sekos, išgautos iš P. Patens baltymų sekų („Cosmoss“ duomenų bazė; //cosmoss.org/), buvo panaudotos 9, 668 ° C, buvo naudojamos kaip užklausos prieš Viridiplantae BLAST duomenų bazę ir buvo ieškoma homologijos, kai E vertės yra 0, 01. ar žemesnė. Šio tyrimo tikslams mes panaudojome palyginamosios analizės baltymus C. reinhardtii , S. moellendorffii ir A. thalina ; Jei nė vienoje iš mūsų duomenų bazėje esančių Viridiplantae rūšių homologija nerasta, užklausą laikėme našlaičio genu.

GSEA buvo naudojama ortologų genų, turinčių bendrą protėvį tarp P. Patenso ir C. reinhardtii , S. moellendorffii ir A. thalina, praturtėjimui, išsaugojimui ar sujungimui . Didelis GO terminų atvaizdavimas genų rinkinyje buvo nustatytas naudojant biologinių tinklų genų ontologijos įrankį (BiNGO) 47 . „BiNGO“ surinko atitinkamą GO anotaciją, tada ištyrė jos reikšmingumą naudodamas hipergeometrinį testą ir pataisė kelis bandymus naudodamas Benjamini ir Hochberg klaidingų atradimų dažnio (FDR) pataisą. Jackarto koeficientas buvo naudojamas palyginimui tarp sodrinimo rinkinių A ir B. Jis buvo apibrėžtas kaip A ir B grupių susikirtimas, padalytas iš jų sąjungos, o tada „BiNGO“ rezultatai buvo vizualizuoti sodrinimo žemėlapyje. Norint vizualizuoti GSEA rezultatus iš „BiNGO“ papildinio, buvo naudojamas citoskopas ir sodrinimo žemėlapis.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Khraiwesh, B. et al. Genomo raiškos analizė suteikia naujų įžvalgų apie „ Physcomitrella patens“ reagavimo į stresą kilmę ir raidą. Mokslas. Rep. 5, 17434; „doi“: 10.1038 / srep17434 (2015).

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomos lentelės ir paveikslai

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildomos duomenų bazės 1–25

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.