Telkiant genomo metodą, spata5 nustatomas kaip naujas alopecijos areata jautrumo lokusas. | europos žmogaus genetikos žurnalas

Telkiant genomo metodą, spata5 nustatomas kaip naujas alopecijos areata jautrumo lokusas. | europos žmogaus genetikos žurnalas

Anonim

Anotacija

Alopecija areata (AA) yra dažnas plaukų slinkimo sutrikimas, kuris, kaip manoma, yra audinių specifinė autoimuninė liga. Ankstesni tyrimai nustatė keletą AA jautrumo genų, iš kurių dauguma yra susiję su autoimunumu. Norėdami nustatyti naujus genetinius variantus ir toliau išaiškinti genetinį AA pagrindą, atlikome viso genomo asociacijos tyrimą, naudodamiesi sujungto DNR genotipo nustatymo strategija (729 atvejai, 656 kontroliniai). Stipriausia asociacija buvo tarp variantų HLA regione, o tai patvirtina sutelkimo strategijos pagrįstumą. Atrinkti 61 geriausio vieno nukleotido polimorfizmai (SNP) buvo analizuojami nepriklausomo replikacijos pavyzdyje (454 atvejai, 1364 kontroliniai). Tik vienas SNP už HLA regiono ribų (rs304650) parodė reikšmingą ryšį. Tada šis SNP buvo išanalizuotas antrame nepriklausomo replikacijos pavyzdyje (537 atvejai, 657 kontroliniai). Išvada nebuvo pakartota reikšmingu lygiu, tačiau parodė tą pačią tendenciją. Tada buvo atlikta jungtinė dviejų replikacijos mėginių analizė, o SNP rs304650 parodė reikšmingą ryšį su P = 3, 43 × 10 −4 (OR = 1, 24 (1, 10–1, 39)). Šis SNP susieja su 4 chromosomos SPATA5 (su spermatogeneze susijęs baltymas 5) geno intronine sritimi. Todėl gauti rezultatai rodo, kad SPATA5 lokusas yra naujas AA jautrumo lokusas.

Įvadas

Alopecija areata (AA) yra dažnas plaukų slinkimo sutrikimas, kuris pasireiškia maždaug 1–2% visų gyventojų. Tai pasireiškia tiek lytims, tiek visoms amžiaus grupėms. 1 Paveikti asmenys patiria netvarkingą, tiksliai apibrėžtą plaukų slinkimą, kuris prasideda staiga ir pasikartoja. Galvos oda yra dažniausiai pažeidžiama, nors tai gali būti susijusi su visais plaukus dengiančiomis odos vietomis. Plaukų slinkimo epizodai paprastai prasideda nuo atskirų pleistrų be plaukų. Jie tęsiasi išcentriškai ir gali susilieti. AA skirstoma į tris pagrindinius klinikinius tipus, atsižvelgiant į plaukų slinkimo laipsnį ir paveiktas vietas: i) nevienoda AA; (ii) AA totalis, paveikiantis visą galvos odą; ir iii) AA universalis, turintis įtakos visam kūnui. Asmenims, sergantiems AA, gali pasireikšti visiška remisija, lėtinė eiga arba progresuoti link AA totalizmo ar AA universalo. Taip pat pasitaiko šeimos AA, paveiktų asmenų vaikams yra 5–6% pasikartojimo rizika. 2, 3 Šeimyniškumo modelis ir ribotas dvynių tyrimas, kuriame nurodoma, kad monozigotinių dvynių atitikimo dažnis yra 55% 3 rodo, kad AA patologijoje yra daug genetinių ir aplinkos veiksnių. Nepaisant to, AA etiopatogenezė vis dar menkai suprantama. Viena hipotezė yra, kad AA yra audinių specifinė autoimuninė plaukų folikulo liga. 4 Tai patvirtina pranešimai apie ryšį tarp AA ir specifinių HLA alelių. Taip pat buvo pranešta apie 5, 6, 7, 8 ryšį tarp AA ir PTPN22 geno W620 varianto (baltymo tirozino fosfatazės, 22 tipo nereceptinis), kuris susijęs su keliais autoimuniniais sutrikimais. 9, 10 Iki šiol žmonėms buvo atliktas tik vienas sistemingas AA susiejimo tyrimas. Tai nustatė keturis jautrumo lokusus atitinkamai 6, 10, 16 ir 18 chromosomose. 11 Šeimyniškumo modelis ir ribotas dvynių tyrimas, kuriame nurodoma, kad monocigotinių dvynių atitiktis yra 55%.

Norėdami nustatyti naujus genetinius variantus ir taip dar labiau išsiaiškinti AA genetinį pagrindą, atlikome viso genomo asociacijos (GWA) tyrimą 729 AA atvejais ir 656 kontrolėse, naudodami sujungtos DNR genotipo strategiją. Pradiniame sutelkimo metodo pavyzdyje buvo patvirtintas 61 geriausio vieno nukleotido polimorfizmas (SNP), skirtas individualiam genotipizavimui. Toliau išanalizavome šiuos SNP nepriklausomoje replikacijos imtyje. Geriausias asociacijos radinys buvo išanalizuotas antrame nepriklausomos replikacijos pavyzdyje. Stipriausia asociacija nustatyta variantams ŽLA regione. Taigi šie rezultatai patvirtina telkimo metodo pagrįstumą DNR genotipizavimu. SPATA5 (su spermatogeneze susijęs baltymas 5) geno ribinė reikšmė buvo rasta rs304650, todėl tai gali būti naujas AA jautrumo geno lokusas.

Paskutiniuose šio tyrimo etapuose Petukhova ir kt. Paskelbė JAV AA mėginio GWA tyrimą . Tai nustatė aštuonis AA geno lokusus, kurių dauguma yra susiję su autoimunitetu. Nors SPATA5 nebuvo tarp šių lokusų, buvo pranešta, kad SPATA5 yra šeši SNP, iš kurių visi rodo ryšį tarp pusiausvyros su rs304650, ir kurių P vertė <10 −4 .

medžiagos ir metodai

DNR pavyzdžiai

Analizėse dalyvavo 1720 asmenų, sergančių AA (atvejai), ir 2677 kontroliniai asmenys. Kai kuriais atvejais įtraukimo kriterijus buvo dermatologo paskirta AA diagnozė. Pacientai, sergantys Dauno ar Turnerio sindromu, nebuvo įtraukti. Atvejai buvo įdarbinti iš: i) ambulatorijų Belgijoje (Antverpeno ir Gento universitetinės ligoninės) ir Vokietijoje (Miuncheno, Miunsterio, Diuseldorfo, Berlyno, Bonos, Gieseno, Hamburgo ir Manheimo universitetinės ligoninės); ii) privati ​​dermatologijos praktika (Wesseling, Vokietija); ir iii) AA savipagalbos grupės (Vokietija, Nyderlandai). Visų atvejų buvo klausiama, ar jie turėjo teigiamą AA šeimos istoriją. Tai buvo apibrėžta kaip bent vieno pirmojo ar antrojo laipsnio giminaičio anamnezė su bet kokia sutrikimo forma. Kontrolė buvo paimta iš visų gyventojų, todėl nebuvo specialiai tikrinama, ar nėra AA. Jie buvo sveiki nesusiję donorai iš Bonos universitetinės ligoninės ( n = 1313) arba vieno iš trijų populiacijos epidemiologinių tyrimų dalyviai: (1) „PopGen 13“ ( n = 490); (2) KORA 14 ( n = 490); ir (3) HNR15 ( n = 384). Visi atvejai ir kontrolė buvo kilę iš Vidurio Europos. Etinis patvirtinimas buvo gautas iš atitinkamų etikos komitetų, o visi dalyviai prieš imdami kraujo mėginius pateikė rašytinį sutikimą. Iš periferinio kraujo leukocitų buvo paimta pacientų ir kraujo donorų DNR. Tai buvo pasiekta sūdant druskos būdu prisotintu NaCl tirpalu pagal standartinius metodus arba naudojant chemaginį magnetinio atskyrimo modulį I (Chemagen, Baesweiler, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Iki naudojimo DNR buvo laikoma skystame azote. Trijų populiacijos epidemiologinių tyrimų kontrolei genotipai buvo paimti iš anksčiau sukurtų GWA duomenų rinkinių. „PopGen“ ir „KORA“ duomenų rinkiniai buvo sukurti Vokietijos nacionaliniame genomo tyrimų tinkle ir naudojami kaip nacionalinis tyrimų šaltinis. HNR duomenų rinkinys buvo sugeneruotas bendradarbiaujant generuojant universalių genetinių tyrimų kontrolinių priemonių rinkinį.

DNR kaupimas

Atsitiktinai buvo atrinkti 729 AA atvejų ir 656 kraujo donorų DNR mėginiai. Šie mėginiai buvo naudojami generuoti kontrolinį baseiną ir du AA atvejo telkinius. Pirmąjį AA atvejų grupę sudarė visų 729 AA atvejų DNR (įskaitant 224 AA atvejus, kurių šeimos istorija teigiama). Antrąjį AA atvejų grupę sudarė tik „teigiamos šeimos istorijos“ AA sergančių pacientų DNR ( n = 224). Siekiant užtikrinti vienodą DNR kiekį kiekviename telkinyje, kiekvienas atskiras DNR mėginys buvo tiriamas keliomis praskiedimo stadijomis (virš 100 ng / μl iki 20 ng / μl, o po to galutine koncentracija 10 ng / μl). Kiekvienas DNR mėginys buvo dvigubai įvertintas naudojant „NanoDrop“ prietaisą (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Vokietija) ir sureguliuotas iki ± 10% reikiamos koncentracijos. 10 ng / μl skiedimui buvo naudojamas platesnis diapazonas nuo –60 iki + 80%, kad būtų atspindėta „NanoDrop“ prietaiso matavimo paklaida esant žemai DNR koncentracijai. Kiekvieno DNR mėginio ekvivalentiniai kiekiai (100 ng) buvo rankiniu būdu pipete įpilami į didelį mėgintuvėlį, kad susidarytų baseinas. Tada kiekvienas baseinas buvo sukoncentruotas iki 60 ng / μl naudojant „Microcon YM-100“ išcentrinio filtro įrenginį („Millipore GmbH“, Schwalbach, Vokietija), o tada pakartotinai patikrintas naudojant „NanoDrop“ prietaisą.

Bendros DNR genotipas ir duomenų analizė

Buvo naudojami „Illumina Sentrix HumanHap550v3“ genotipai „BeadChips“. Juose yra daugiau nei 550 000 etikečių SNP („Illumina Inc.“, San Diegas, CA, JAV). Siekiant išvengti skirtingų eksperimentų, kiekvienam baseinui buvo atliktas genotipas ant penkių lustų pagal gamintojo rekomendacijas atskiriems mėginiams. SNP alelių dažnis buvo įvertintas naudojant „BeadArray Reader“ vaizdavimo („Illumina Inc.“) duomenis ir „Illumina“ genotipo programinės įrangos „Bead Studio 2.0“ („Illumina Inc.“) duomenis. Remiantis alelių dažnio įverčiais, gautais atlikus genotipo eksperimentą, buvo atliktos trys analizės: i) 729 atvejai, palyginti su 656 kontrolinėmis; ii) 224 atvejai, turintys teigiamą šeimos istoriją, palyginti su 656 kontrolinėmis ligomis; ir iii) slankiojančio lango analizę, naudojant duomenų rinkinį apie 729 atvejus, palyginti su 656 kontrolėmis, laikantis kitur aprašytų rekomendacijų. 16

Kiekvienam pakartojimui, remiantis pirminiais duomenimis, buvo atliktas toks alelių dažnio apytikslis derinimas atvejais ir kontrolėse: f i = Xraw / (Xraw + Yraw), kur Xraw ir Yraw yra dviejų dažų (Cy5 ir Cy3) intensyvumas. ), naudojamas SNP genotipui „Illumina“ platformoje, ir i yra pakartojamas numeris. Tada gautas alelio dažnis buvo suskaičiuotas pagal kiekvieno baseino pakartojimų skaičių f = (f 1 +

.

+ f M ) / M (kur M yra pakartojimų skaičius) ir pataisytas nelygiam amplifikavimui, naudojant formulę f pataisyta = f / ( f + k · (1- f )). 17 Kiekvienam SNP pataisos koeficientas k buvo įvertintas naudojant „HapMap CEPH“ duomenis (//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) ir formulę k = ( f c on - f con · f CEPH ) / ( f _ CEPH - f con · f CEPH ), kur f cont yra alelių dažnis kontrolėse, gautose iš sujungimo eksperimento, ir f CEPH yra alelių dažnis, apskaičiuotas pagal HapMap CEPH duomenis.

Korekcijos koeficientas k buvo naudojamas kaip kokybės kontrolės priemonė, nes jis parodo, koks artimas apskaičiuotas alelių dažnis kontrolėse yra CEPH duomenų dažnis. SNP nebuvo įtraukta į tolesnę analizę, kai k buvo> 4 arba <0, 25.

Variacijos koeficientas taip pat buvo naudojamas kaip kiekvieno SNP kiekvieno baseino kokybės kontrolės priemonė. Tai buvo apskaičiuota naudojant formulę sqrt (var e ) / f , kur var e yra eksperimentinis dispersija, apskaičiuota pagal replikacijų duomenis. Tai rodo, koks artimas SNP yra replikatams, kartu atsižvelgiant į alelių dažnį ir pakartojimų skaičių viename baseine. SNP nebuvo įtraukta į tolesnę analizę, kai variacijos koeficientas buvo> 1 (viršutinė 95% pasikliovimo intervalo riba) bent viename iš trijų grupių (ty atvejai, kontrolė, šeimos atvejai).

Likusiems 487 932 SNP buvo atlikta asociacijų analizė, siekiant palyginti 729 atvejus ir 224 šeimos atvejus su 656 kontrolinėmis grupėmis. Buvo naudojama modifikuota Z- statistika, kaip aprašė Abraham et al. 18 Juose atsižvelgiama ir į eksperimentinį dispersiją (žr. Aukščiau), ir į imties dispersiją.

Atvejo ir kontrolės asociacijos analizės rezultatams aiškinti buvo naudojama signalo apdorojimo analizės technika. Tai leidžia aptikti genetinį ryšį su liga, atsižvelgiant į kelių paskesnių genetinių žymenų reikšmę slenkamame lange. Moskvina ir kt. 17 aprašė teorinį metodą, pagal kurį apskaičiuojama tikimybė, kad bent vienas klaidingas pavojaus signalas bus pažymėtas aptikimo statistika pagal Null hipotezę, kad nėra signalo (ryšio). 14 Tai prilygsta I tipo klaidos tikimybei, kai atsižvelgiama į palyginimų skaičių lange, taigi gaunamas „genomo masto lango pagrįstas“ reikšmingumo lygis. 19

SNP pasirinkimas, rezultatų telkimo patvirtinimas ir nepriklausoma replikacija

Buvo patvirtinta keletas SNP, kad būtų patvirtinti sujungimo rezultatai individualiu genotipo lygiu. Replikacijos žingsnis buvo atliktas dviem nepriklausomais atvejo ir kontrolės mėginiais (apžvalgą žr. 1 paveiksle). Iš trijų sutelktinių analizių buvo pasirinkti šie SNP: i) 50 geriausių SNP iš analizės „729 atvejai palyginti su 656 kontrolėmis“; ii) 20 svarbiausių SNP iš analizės „224 atvejai, kurių šeimos istorija teigiama, palyginti su 656 kontrolinėmis ligomis“; ir (iii) 35 populiariausių SNP iš „stumdomų langų analizės“. Visų atrinktų SNP P vertės buvo <1 × 10 −4 atitinkamoje kaupimo analizėje. Kadangi SNP iš anksčiau žinomo HLA regiono buvo atstovaujama per daug, visi šie SNP, išskyrus tris, buvo pašalinti. Buvo pasirinkti trys likę HLA SNP, rs3115553 (chr. 6: 32 353 805 bp), rs9275141 (chr. 6: 32 759 095 bp) ir rs9275572 (chr. 6: 32 786 977 bp), nes jie buvo geriausi. išvados ŽLA regione atliekant „stumdomo lango analizę“. Vėlesnėse analizėse jie buvo naudojami kaip teigiama kontrolė. Deja, rs9275141 žlugo atliekant „Sequenom iPlex“ reakcijos tyrimo projektą („Sequenom GmbH“, Hamburgas, Vokietija). Todėl jį pakeitė kitas geriausias SNP HLA regione iš „stumdomų langų analizės“, rs9268528 (chr. 6: 32 491 086 bp). Išskyrus kitus SNP iš HLA regiono ir SNP, rodomus daugiau nei vienoje analizėje (dvigubai ir trigubai), buvo įmanoma sumažinti SNP, nustatytą patvirtinimo ir replikacijos etapui (2 žingsnis), nuo 105 iki 61 SNP. Individualus genotipas buvo atliktas „Illumina“ platformoje. DNR mėginiams iš HNR, KORA ir Popgen kontrolių ( n = 1364) buvo naudojami „HumanHap550v3“ genotipai „BeadChips“ („Illumina Inc.“). Visiems kitiems DNR mėginiams buvo naudojama „Sequenom“ kompaktiška „MALDI-ToF Mass Array“ sistema ir „iPLEX Gold“ reagentai („Sequenom GmbH“) daugialypėse reakcijose. Grunto sekos ir standartinės „Sequenom“ tyrimo sąlygos pateikiamos paprašius. Visi pradmenys buvo patikrinti MALDI-ToF. Dėl kokybės priežasčių visiems analizuojamiems SNP reikėjo bent 95% sėkmės lygio. Kiekvienam mėginiui, naudojamam patvirtinimo ir pakartojimo etapuose, reikėjo 95% skambučio normos. Patvirtinimo etape (2 žingsnis) DNR mėginiai iš aštuonių AA atvejų ir 11 kontrolinių testų neatitiko kokybės kriterijų ir buvo pašalinti iš analizės, todėl 721 AA atvejis ir 645 kontrolė liko analizėms. Nepriklausomo replikacijos etapo metu (2 žingsnis) keturi DNR atvejų pavyzdžiai neatitiko kokybės kriterijų, todėl analizei liko 450 atvejų ir 1 364 kontroliniai pavyzdžiai. Iš 61 pasirinktų SNP šeši SNP (rs12493901, rs30117, rs41515, rs4777450, rs7246435 ir rs9520256) buvo techniniai gedimai, o penki SNP (rs10123149, 11098149, rs6700586, rs7099812 ir rs724841, o rs724841 ir rs724841 nebuvo). reikalingas ≥95% skambučio dažnis viename ar keliuose patvirtinimo ir (arba) replikacijos pavyzdžiuose. Šių mėginių SNP rs7334982 nebuvo biallelinis, todėl buvo pašalintas iš tolesnės analizės. Taigi 49 SNP rinkinys liko tolesnei analizei.

Image

Bendra darbo eiga. Tyrimas buvo atliktas trimis etapais: a ) sutelktine analize, naudojant tris skirtingus metodus (I) visi atvejai palyginti su visais kontroliniais tyrimais, (II) atvejų „teigiama šeimos istorija“ palyginti su visais kontroliniais tyrimais ir (III) slankiosios analizės analizė; b ) atrinktų geriausių rezultatų, gautų kaupiant duomenis, patvirtinimas atliekant individualius genotipus anksčiau sujungtuose atvejų ir kontroliniuose mėginiuose; c ) nepriklausomas pakartojimas ir tolesnė analizė papildomuose atvejų ir kontrolės pavyzdžiuose.

Visas dydis

Individualių genotipo duomenų statistinė analizė

Asociacijai ir haplotipų analizei buvo naudojamas FAMHAP programinės įrangos paketas 20 . Vieno žymens analizei buvo naudojamas Armitage tendencijos testas. 21 Visi SNP atitiko šiuos kokybės kriterijus: nedidelis alelių dažnis> 1%, P HWE > 0, 001 ir P HWE kontrolėse> 0, 05. Gautos P vertės buvo pataisytos daugybiniam testavimui pagal sėkmingai ištirtų SNP skaičių individualiu genotipo lygiu ( n = 49).

Išraiškos analizė

SPATA5 ekspresijos žmonių plaukų folikuluose ir odos mėginiuose analizei panaudojome priekinį gruntą 5′-CCTTCAAACCGACGCATACT-3 ′ ir atvirkštinį gruntą 5′-GCAGCCCACTCTTCTCTTGA-3 ′ (numatomas produkto dydis: 197 bp). Kadangi buvo įrodyta, kad SPATA5 ekspresija yra žmogaus inkstuose ir plaučiuose (//www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SPATA5&search=SPATA5), šie audiniai buvo įtraukti kaip teigiami kontroliniai mėginiai. Visa RNR buvo išgaunama iš žmogaus plaukų folikulų ir odos naudojant „RNeasy Micro Kit“ (Qiagen, Hilden, Vokietija), o vienos grandinės cDNR buvo susintetinta iš viso 400 ng RNR, naudojant „Super Script III“ pirmosios krypties sintezės sistemą (Invitrogen, Karlsruhe)., Vokietija). Vienos grandinės cDNR iš inksto ir plaučių buvo gauta iš žmogaus kelių audinių cDNR I grupės (LOT Nr. 6060248; Clontech, Takara Bio Europe / Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Prancūzija). Neigiama atvirkštinės transkripcijos reakcija (be fermento) buvo įtraukta kaip neigiama kontrolė (2 paveikslas).

Image

SPATA5 mRNR raiškos analizė. Buvo nustatyta, kad SPATA5 yra ekspresuojamas žmogaus plaukų folikuluose, odoje, inkstuose ir plaučiuose (mėginiai rodomi iš kairės į dešinę). Paskutinė juosta rodo neigiamą kontrolę.

Visas dydis

Rezultatai

1 žingsnis: sutelkimu pagrįstas požiūris

Genomo mastu pagrįstas baseino metodas apėmė tris DNR junginius: (1) 729 AA atvejai (įskaitant 224 atvejus, kurių šeimos istorija teigiama), (2) 224 AA atvejai, turintys teigiamą šeimos istoriją, ir (3) 656 kontroliniai atvejai. . Kiekviename baseine buvo atliktas genotipas penkiems „Illumina Sentrix HumanHap550v3“ genotipo „BeadChip“ pakartojimams. 1 baseinas buvo sėkmingai išanalizuotas visuose penkiuose pakartojimuose. 2 baseinas buvo sėkmingai išanalizuotas keturiais pakartojimais. Du iš penkių kontrolinių lustų buvo pašalinti iš kokybės kontrolės filtravimo.

Visoms 504 931 SNP buvo įvertintos kokybės kontrolės priemonės ir alelių dažnis. Taikytos kokybės kontrolės priemonės buvo šios: i) kiekvieno SNP variacijos koeficientas kiekviename baseine, kuris atspindėjo, kiek SNP buvo panašus į replikas, atsižvelgiant į alelių dažnį ir pakartojimų skaičių kiekviename baseine; ir (ii) pataisos koeficientas k, kaip rodiklis, rodantis, kad kontroliniame baseine esantys alelių dažnio įverčiai yra artimi alelių dažniui CEPH mėginyje iš „HapMap“ (daugiau informacijos rasite skyriuje „Medžiagos ir metodai“).

Žymekliai buvo neįtraukti, jei variacijos koeficientas buvo> 1 bent viename iš trijų DNR grupių arba jei pataisos koeficientas k buvo> 4 arba <0, 25. Likę 487 932 SNP buvo pataisyti k , o SNP, kurių kontrolinis kontrolinis kontrolinis režimas turėjo mažesnį kaip 5% alelių dažnį, buvo išfiltruoti. Likę 468 389 SNP buvo patikrinti, ar jie nėra sujungti naudojant modifikuotą Z statistiką. 18 Atskiri palyginimai su kontrole buvo atlikti atvejai ir šeimos atvejai. Atvejo ir kontrolės palyginimo rezultatai buvo toliau analizuojami slenkamame lange. Replikacijai buvo atrinkti geriausi žymekliai iš viršutinių regionų, nustatytų stumdomo lango analizėje 19 . Taigi buvo atliktos trys skirtingos analizės: (I) 729 AA atvejai, palyginti su 656 kontrolinėmis; (II) 224 AA atvejai, turintys teigiamą šeimos istoriją, palyginti su 656 kontrolinėmis ligomis; ir (III) slankiojančio lango analizė (1 paveikslas). Ši analizė nustatė 31 SNP, kurių P vertės <5 × 10 −7 (1 papildoma lentelė), ir gauta 18 SNP, atmetus dublikatus ir trigubus egzempliorius. Iš šių 18 SNP 8 SNP buvo lokalizuoti HLA regione, o 10 SNP buvo lokalizuota kitoje genomo vietoje. Geriausias SNP iš visų trijų analizių buvo rs9952976 (chr. 18: 42 561 717 bp), kurio P vertė 6, 48 × 10 −14 I ir III analizėse (1 papildoma lentelė). Geriausias SNP II analizėje buvo rs9275572, lokalizuotas HLA regione ( P = 1, 87 × 10 −8 ). Šis SNP taip pat buvo geriausias HLA – SNP atliekant analizę I ( P = 1, 00 × 10 –11 ) ir III ( P = 5, 67 × 10 –12 ; 1 papildoma lentelė). Kai buvo įvertinti geriausi kiekvienos analizės SNP (žr. Atrankos kriterijus skyriuje Medžiagos ir metodai), trys SNP (rs9275141 (chr. 6: 32 759 095 bp); rs9275572 (chr. 6: 32 786 977 bp) ir rs9952976 ( chr. 18: 42 561 717 bp)) pasirodė visose trijose analizėse. Du iš šių SNP (rs9275141 ir rs9275572) yra lokalizuoti HLA regione (1 papildoma lentelė).

2 žingsnis: Individualus patvirtinimas ir savarankiškas pakartojimas

50 geriausių SNP iš I analizės, 20 populiariausių SNP iš II analizės ir 35 geriausi SNP iš III analizės buvo atrinkti tolesnei analizei (1 paveikslas). Pašalinus dublikatus ir trigubus egzempliorius, iš viso atsirado 61 SNP (žr. Skyrių „Medžiagos ir metodai“ ir 1 papildomą lentelę). Norėdami patvirtinti 61 pasirinktų SNP asociacijos išvadas taikant telkimo metodą, individualus genotipas buvo atliktas anksčiau sujungtame atradimo pavyzdyje, kuriame buvo 729 AA atvejai ir 656 kontrolinės grupės. Nepriklausomame replikacijos etape dalyvavo 454 AA atvejai ir 1364 kontrolinės priemonės. Atlikus kokybės kontrolę, analizei liko 49 SNP (žr. Skyrių „Medžiagos ir metodai“). Ši analizė, išskyrus penkis SNP, patvirtino jungimo rezultatus esant nominaliam reikšmingumo lygiui ir taip parodė DNR telkimo metodo pagrįstumą. Stipriausia asociacija nustatyta tarp trijų HLA – SNP (rs3115553, rs9268528 ir rs9275572). SNP rs9275572 parodė stipriausią ryšį su P = 2, 50 × 10 –10 (OR = 1, 65 (1, 41–1, 94); 1 lentelė). Tai buvo vieninteliai SNP, kurie atlaikė pataisą keliems bandymams, naudojant anksčiau pasiūlytą ribą P = 5 × 10 –7 . Likę SNP nesugebėjo parodyti tvirtos asociacijos. Geriausias asociacijos radinys už HLA regiono ribų buvo rs2110597 (chr. 12: 12 832 280 bp), kai P = 1, 42 × 10 −5 (OR = 1, 44 (1, 22–1, 68)). Geriausias baseine atliktos analizės radinys rs9952976 (chr. 18: 42 561 717 bp) parodė tik ribinę reikšmę atskirų genotipų lygmenyje, kai P = 0, 034 (OR = 1, 20 (1, 01–1, 43)). Tai buvo vienas iš silpniausių asociacijos radinių šiame patvirtinimo etape (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Nepriklausomo replikacijos etape vėl buvo nustatyta stipriausia trijų HLA SNP asociacija. SNP rs9275572 buvo stipriausiai susijęs SNP ( P = 7, 94 × 10 −11 ; OR = 1, 71 (1, 46–2, 01)). Dvidešimt septyni SNP parodė tuos pačius rizikos alelius kaip ir atradimo mėginyje. Tik vienas SNP už HLA regiono ribų (rs304650; chr. 4: 124 303 368 bp) parodė reikšmingą ryšį ( P vertė 0, 001; OR = 1, 31 (1, 12–1, 53)). Atlikus Bonferroni pataisą patikrintų SNP skaičiui ( n = 49), reikšmingi liko tik trys HLA SNP ir rs304650 ( P = 0, 049) (1 lentelė).

3 žingsnis: Tolesnė svarbiausių išvadų analizė

Tada buvo panaudotas antrasis nepriklausomas 537 atvejų ir 657 kontrolinių mėginių pavyzdys, norint toliau tirti rs304650 asociacijos išvadą (1 paveikslas). Rs304650 geno nustatymas nepavyko vienu ir dviem atvejais, taigi liko 536 atvejai ir 655 kontroliniai atvejai. Šioje analizėje rs304650 negalėjo būti pakartotas reikšmingu lygiu ( P = 0, 127; 2 lentelė). Tačiau rizikos alelis išliko tas pats. Todėl buvo atlikta bendra analizė, naudojant visus AA atvejus ir kontrolę iš nepriklausomų replikacijos ir tolesnių veiksmų (iš viso 985 atvejai ir 2014 m. Kontrolė buvo sėkmingai identifikuoti šiam SNP; duomenys nepateikti). Rs304650 parodė stipresnį ryšį, kai P = 3, 43 × 10 −4 (OR = 1, 24 (1, 10–1, 39)). Sujungę visus atvejus ir kontrolę, gavome P vertę 1, 58 × 10 −5 ; ARBA = 1, 23 (1, 12–1, 35). Įdomu tai, kad SPATA5 ekspresija buvo stebima plaukų folikuluose ir odoje, o tai patvirtina šio geno svarbą plaukų biologijoje (2 pav.).

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Šis AA GWA tyrimas yra pirmasis, kuriame panaudota sujungta DNR. Analizė buvo atlikta keliais etapais, kad būtų išvengta didelių GWA tyrimo atlikimo didelių atskirų mėginių sąnaudų. DNR telkinių genotipas buvo atliktas 15 „Illumina HumanHap550“ pacientų ir kontrolinių grupių. Apibendrinimas jungiamųjų tyrimų metu, palyginti su atskirais genotipo nustatymo būdais, yra tas, kad alelių dažnis yra įverčiai, gaunami iš DNR telkinių, kurie iš esmės yra netikslūs. Atsižvelgiant į tai ir į tai, kad visuotinai naudojamos kokybės kontrolės priemonės negali būti taikomos, atradimo etapu buvo naudojamas sutelkimu pagrįstas metodas (1 žingsnis; 1 paveikslas). Antrame etape viršutiniai SNP buvo patvirtinti naudojant individualų anksčiau sujungto atvejo ir kontrolinių mėginių genotipą ir pakartoti atliekant individualų genotipą nepriklausomame atvejų ir kontroliniame pavyzdyje (2 žingsnis; 1 paveikslas). Trečiajame etape geriausias SNP buvo stebimas kitame nepriklausomame replikacijos pavyzdyje (1 paveikslas).

Pagrindinis AA rizikos lokusas buvo nustatytas pagrindiniame 6p21.3 chromosomos histo suderinamumo komplekse. Ankstesni mūsų ir kitų grupių tyrimai nustatė įvairius HLA alelių jautrumą AA. Geriausiai pakartoti DRB1 ir DQB1 lokalių aleliai. 5, 6, 8, 23, 24 Dabartiniai labai reikšmingi variantai HLA regione rodo, kad kaupimu paremta strategija yra tinkama alternatyva individualiam genotipo nustatymui esant sudėtingiems sutrikimams. 25 Nors HLA lokuso kaupimo pagrindu gauti rezultatai nebuvo sistemingai stebimi (1 žingsnis), geriausi trys trys slankiojančio lango analizės variantai buvo genotipuojami atradime ir nepriklausomuose replikacijos pavyzdžiuose, kad būtų patvirtinti pradiniai kaupimo pagrindu gauti rezultatai (2 žingsnis). ). Kaip ir tikėtasi, visi trys variantai buvo patvirtinti individualiu genotipo lygiu ir pasiekė genomo reikšmingas P vertes. Taip buvo ir nepriklausomo replikacijos etapo metu. Tai rodo, kad DNR telkimo metodas gali patikimai aptikti SNP, kurie asociacijų tyrimuose parodė reikšmingumą visame genome. Be to, telkimas nustato labai reikšmingus rezultatus, todėl labai mažai tikėtina, kad kokie nors genai, esantys už HLA srities ribų, yra reikšmingesni. Tačiau mūsų strategijoje yra klaidingų neigiamų išvadų rizika, jei genetinis poveikis mažesnis. DNR telkimas prideda papildomos eksperimentinės klaidos (pvz., Pipetavimas baseino statybai) alelio dažnio matavimui, kuris daro tiesioginę įtaką galiai aptikti mažus efektų dydžius. 26 Be to, tik 61 populiariausias GWA tyrimo etapas buvo atliktas atskiruose mėginiuose, o didžioji dauguma nominaliai reikšmingai susijusių žymenų buvo pašalinti iš vėlesnių analizių. Tai yra du greičiausiai paaiškinimai, kodėl šiame tyrime galėjo būti praleisti anksčiau pranešti asociacijos duomenys. 12 Taigi norint patikimai nustatyti mažesnio efekto genus, reikia didesnių mėginių ir individualių genotipų nustatymo.

Vienintelis kitas SNP, pasiekęs viso eksperimento reikšmę atliekant kombinuotą analizę, buvo SPATA5 geno rs304650, esantis 4q27-q28 chromosomoje. Atlikus 2 ir 3 žingsniuose naudojamų replikacijos mėginių bendrą analizę, apimančią 985 atvejus ir 2014 m. Kontrolę, kuriems buvo sėkmingai atliktas šio SNP genotipas, nustatyta reikšminga šio varianto ir AA sąsaja su P verte 3, 43 × 10–4 (ARBA = 1, 24 (1, 10–1, 39)). Bendra visų tirtų mėginių analizė parodė reikšmingą šio varianto ir AA ryšį su P verte 1, 58 × 10 −5 (OR = 1, 23 (1, 12–1, 35)). SNP rs304650 susieja su vidine SPATA5 nuorašo sritimi . Rašymo metu šio baltymo funkciniai aspektai nežinomi. Tačiau viename tyrime nustatyta, kad SPATA2 , kitas su spermatogeneze susijusios baltymų šeimos narys, yra jautrumo autoimuninių sutrikimų psoriazei genas. 27

Įdomu tai, kad nors SPATA5 nebuvo tarp aštuonių lokomų , turinčių reikšmės genomo mastu, apie kuriuos pranešė Petukhova ir kt. , 12 autoriai pranešė apie šešis SNP SPATA5 , kurių P vertė <10 −4 jų papildomoje medžiagoje. Nors ir nėra labai stiprus, yra duomenų apie LD tarp rs304650 ir Petukova et al 12 SNP (svyruoja tarp r2 = 0, 29 rs11735364 ir r 2 = 0, 46 rs2201997). Nors tai gali būti vertinama kaip patvirtinamieji įrodymai, norint atlikti aiškesnes išvadas, reikia atlikti išsamesnį regiono tyrimą su labai didelėmis imtimis. Įdomu ir tai, kad SPATA5 genas yra tik 320 kb atstumu nuo rs7682241, reikšmingo genomo žymeklio Petukhova et al tyrime 12, kuris labai rodo IL2 / IL21 geno lokuso tyrimą . Tačiau duomenys iš „CEU HapMap“ mėginio rodo, kad rs304650 nėra LD, kai nėra geriausių IL2 / IL21 geno lokusų variantų. Taigi du lokusai tikriausiai prisiima savo riziką nepriklausomai vienas nuo kito. Vis dėlto teoriškai įmanoma, kad tikrasis priežastinis AA variantas gali būti funkcinis variantas, kurio LD yra vidutinio sunkumo, palyginti su variantais, nurodytais abiejose analizėse, kuris yra tarp IL2 / IL21 ir SPATA5 regionų.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento Europos žmogaus genetikos tinklalapyje (//www.nature.com/ejhg)