Glipizidas slopina prostatos vėžio progresavimą tramplinės modelyje, slopindamas angiogenezę | mokslinės ataskaitos

Glipizidas slopina prostatos vėžio progresavimą tramplinės modelyje, slopindamas angiogenezę | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Didelio našumo atranka
  • Naviko angiogenezė

Anotacija

Nevėžinių vaistų pakartotinis pakeitimas vaistais yra patrauklus požiūris kuriant naują vėžio terapiją. Naudojant TRAMP transgeninio pelės modelį, buvo nustatyta, kad glipizidas, plačiai naudojamas vaistas nuo 2 tipo cukrinio diabeto, slopina prostatos vėžio (PC) augimą ir metastazes. Angiogenezė yra glaudžiai susijusi su įvairiais žmogaus vėžio pokyčiais. Įdomu tai, kad glipizidas smarkiai sumažina mikrodumblių tankį PC naviko audiniuose, tuo pačiu nesustabdydamas prostatos vėžio ląstelių dauginimosi MTT tyrimo ir tėkmės citometrijos tyrimais. Be to, reguliuodamas HMGIY / Angiopoietin-1 signalizacijos kelią, glipizidas slopina kanalėlių struktūros formavimąsi žmogaus virkštelės venų endotelio ląstelėse. Visi šie rezultatai rodo, kad glipizidas gali būti panaudotas kaip veiksmingas terapinis AK gydymas nukreipiant naviko sukeltą angiogenezę.

Įvadas

Prostatos vėžys (PC) yra dažniausiai diagnozuojamas piktybinis navikas vyrams, kurio dažnis didėja, ir yra viena iš pagrindinių su vėžiu susijusių mirčių priežasčių 1, 2 . Kompiuteris eina keliais etapais, įskaitant inicijavimą, paaukštinimą ir progresą 3 . Pradinėse stadijose pacientų, sergančių PC, prognozė yra gana patenkinta gavus chirurginę rezekciją ir (arba) radiacijos terapiją. Deja, pažengusiame etape pacientų rezultatai net ir gydant yra gana prasti 4 . Nepaisant didelio PC paplitimo, labai mažai vaistų yra skirti PC progresavimui slopinti. Taigi, reikia skubiai nustatyti veiksmingus agentus, galinčius reikšmingai slopinti prostatos kancerogenezę.

Glipizidas yra antidiabetinis vaistas, kuris nuo 1950 m. Buvo naudojamas II tipo cukrinio diabeto (T2DM) gydymui, stimuliuojant insulino sekreciją iš β ląstelių 5 . Įrodyta, kad vėžys T2DM sergantiems pacientams yra didesnis nei bendrojoje populiacijoje 6 . Įdomu tai, kad naujausi farmakoepidemiologiniai tyrimai parodė, kad ilgalaikis vaistų nuo diabeto vartojimas gali būti susijęs su mažesne vėžio rizika T2DM sergantiems pacientams. Pavyzdžiui, gliclazido ir glibenklamido, artimų glipizido analogų, vartojimas gali sumažinti vėžio riziką priklausomai nuo dozės 6 . Įdomu tai, kad mes apžiūrėjome FDA patvirtintą vaistų biblioteką ir nustatėme, kad glipizidas reikšmingai slopina kraujagyslių formavimąsi 7 . Tolesni tyrimai taip pat parodė, kad glipizidas slopino krūties vėžio augimą ir metastazę 4T1 persodintų navikų ir spontaninio krūties vėžio atvejais MMTV-PyMT transgeninėse pelėse, slopindamas angiogenezę iš anksto reguliuodamas natriuretinio peptido receptorius A7. Tačiau ar glipizidas slopina PC naviko augimą ir metastazės niekada nebuvo ištirtos, o jo vaidmuo slopinant prostatos vėžio progresavimą vis dar nėra aiškus.

Angiopoietinas-1 (ANGPT1), kurį gamina pericitai ir kraujagysles palaikančios ląstelės, yra angiopoetinų šeimos, į kurią įeina angiopoietinas-1, angiopoietinas-2 ir angiopoietinas-4, narys. Buvo pranešta, kad ANGPT1 reikalingas subrendusių kraujagyslių stabilumui palaikyti pericitui įdarbinant ir formuojant nesandarius indus 9 . ANGPT1 taip pat vaidina svarbų vaidmenį palaikant ir stabilizuojant naviko kraujagysles. ANGPT1 ekspresuoja ne tik sienelių ląstelės ir fibroblastai, bet ir normalios ne kraujagyslinės ląstelės bei navikinės ląstelės, įskaitant 10 gaubtinės žarnos karcinomą, šlapimo pūslės vėžį 11 ir PC 12 . Tyrimai parodė, kad padidėjusi ANGPT2 ekspresija, palyginti su ANGPT1 augliais, yra susijusi su prasta įvairių vėžio rūšių prognozėmis, o ANGPT1 vaidina esminį vaidmenį naviko angiogenezėje 13, 14 . Be to, ANGPT1 promotoriuose yra didelio mobilumo grupės IY (HMGIY) rišamosios vietos, o HMGIY gali kontroliuoti ANGPT1 ekspresiją endotelio ląstelėse 15 . HMGIY baltymas priklauso A šeimai, kurią sudaro trys pagrindiniai DNR surišantys domenai (vadinamieji AT kabliukai) ir apima keturis narius, koduotus HMGIY, ir didelio judrumo grupės IC (HMGIC) genus 16 . Be to, HMGIY yra neįprastai sureikšmintas daugelyje piktybinių navikų, tokių kaip gimdos kaklelio, storosios žarnos, prostatos ar trečiojo tipo vėžys, ir yra glaudžiai susijęs su naviko progresavimu. Tačiau kol kas neaišku, ar glipizidas slopina angiogenezę, reguliuodamas HMGIY / ANGPT1 signalizacijos kelią.

Šiame tyrime, norėdami įvertinti slopinantį glipizido poveikį AK, mes panaudojome transgenines TRAMP peles, kurioms spontaniškai išsivysto prostatos adenokarcinoma 20 . TRAMP pelės modelis pagrįstas SV40 didelio T antigeno (T Ag) ekspresija prostatos epitelyje 21 . T Ag ekspresija efektyviai panaikina p53 baltymo ir retinoblastomos funkcijas ir tarnauja kaip onkoproteinas. Dėl to TRAMP pelėms spontaniškai išsivysto prostatos adenokarcinoma nuo sunkios hiperplazijos 12 savaičių amžiaus dėl blogai diferencijuotų ir invazinių adenokarcinomų 24 savaičių amžiuje, kurios galiausiai tampa tolimąja metastaze 22, 23, 24 . Be to, norint nustatyti glipizido poveikį kompiuteriui, TRAMP pelės, turinčios C57BL / 6 foną, buvo sukryžiuotos su FVB pelėmis, kad būtų gautos [C57BL / 6 × FVB] F1 TRAMP pelės. [C57BL / 6 × FVB] F1 TRAMP pelės kuria sparčiau progresuojantį kompiuterį ir turi daugiau kraujagyslių nei TRAMP pelės, kurių fonas C57BL / 6. Palyginti su C57BL / 6 TRAMP pelėmis, [C57BL / 6 × FVB] F1 TRAMP pelės yra naudingesnės naviko angiogenezei tirti.

Nevėžinių vaistų pakartotinis pateikimas yra patrauklus požiūris kuriant naują vėžio terapiją, atsižvelgiant į tai, kad tai gali žymiai sutrumpinti tyrimo laiką ir sąnaudas nuo suoliuko iki lovos. Čia pateikiame glipizido poveikį kompiuteriui, naudojant TRAMP peles, švirkščiant vaistą į pilvo ertmę, ir tai rodo, kad glipizidas nepaprastai stipriai slopina PC progresavimą. Tolesni tyrimai atskleidė, kad glipizidas slopina naviko sukeltą angiogenezę per žemai reguliuojančius HMGIY / ANGPT1 signalus, bet ne vėžinių ląstelių proliferaciją, tokiu būdu slopindamas PC naviko augimą ir metastazes. Šie duomenys rodo, kad glipizidas gali būti atnaujintas kaip veiksminga terapija, kuri gali būti naudinga AK pacientams.

Rezultatai

Glipizidas slopina prostatos vėžio augimą TRAMP pelėms

Norėdami nustatyti, ar glipizidas slopina PC augimą, mes panaudojome spontaninį prostatos adenokarcinomos pelių modelį. Glipizidas (5 mg / kg) buvo įšvirkščiamas į 16 savaičių TRAMP pelių, turinčių [C57BL / 6 × FVB] F1 foną, kas tris dienas. Urogenitalinio (GU) trakto svoris buvo išmatuotas po 8 savaičių glipizido ar kontrolinio gydymo. Glipizidu gydytų TRAMP pelių santykinis GU trakto svoris buvo žymiai mažesnis nei kontrolinių pelių (1 pav., B).

Image

Patinėlėms [C57BL / 6 × FVB] F1 TRAMP pelėms (16 savaičių) buvo leista savaime išsivystyti AK ir joms švirkščiama glipizidas (5 mg / kg) arba DMSO (kontrolinis) kartą per tris dienas 8 savaites. Po paaukojimo pelės buvo surenkamos ir pasveriamos. ( A ) Paveikslėliai rodo reprezentatyvų bendrą TR trampo pelių, apdorotų glipizidu ir DMSO, GU traktatų išvaizdą. ( B ) Yra reikšmingas skirtumas tarp glipizido ar DMSO gydytų navikų santykinio GU svorio. ( C ) Tipiniai DP audinių H&E vaizdai iš TRAMP pelių, apdorotų DMSO ir glipizidu. ( D ) kiekvienos DMSO ir glipizidu gydytos TRAMP pelės prostatos skilties pažeidimas. ( E ) DMSO ir glipizidu gydytų TRAMP pelių atskirų prostatos skilčių pažeidimas. * p < 0, 05; ** p < 0, 01 .

Visas dydis

Atsižvelgiant į tai, kad glipizidas gali slopinti TRAMP pelių santykinį GU svorį, spėliojome, kad glipizidas taip pat gali paveikti pažeidimo laipsnį ir patologinį laipsnį. Šiuo tikslu įvertinome abiejų grupių patologines charakteristikas pagal TRAMP specifinį klasifikavimo balą ir patologinę klasifikaciją. Reprezentatyvūs hematoksilino ir eozino (H&E) dažymo vaizdai parodė morfologinius skirtumus tarp pelių, gydytų glipizidu ir DMSO, (1 pav. C, papildomas S1 pav.). Morfologiniu lygiu glipizidas sumažino pažeidimo sunkumą ir pagal TRAMP specifinę klasifikavimo schemą 25 reikšmingai sumažėjo nugaros prostatos (DP), veninės prostatos (VP) ir šoninės prostatos (LP) skilties pažeidimai. TRAMP pelės, apdorotos glipizidu. Įdomu tai, kad glipizidas nepadarė įtakos TRAMP pelių priekinių (AP) prostatos skilties pažeidimų balams (1 pav. D). Kaip aprašyta anksčiau, TRAMP pelių prostatos buvo klasifikuojamos kaip normali / hiperplazija (NL / Hyp), prostatos intraepitelinė neoplazija (PIN), gerai diferencijuota (WD) adenokarcinoma, vidutiniškai diferencijuota (MD) adenokarcinoma arba silpnai diferencijuota (PD) adenokarcinoma. 26 Palyginti su TRMS pelėmis, apdorotomis DMSO, bendrosios prostatos patologijos metu TRIP pelės, gydomos glipizidu, parodė didesnį NL / Hyp audinių procentą (75% palyginti su 53, 6% AP, 29% ir 21% DP), 49, 5% vs 34, 6% VP, 49% vs 26% LP; 1E pav.). Be to, TRAMP pelėms, apdorotoms glipizidu, taip pat buvo didesnis PIN audinių procentas (29% vs 10, 83% AP, 14% vs 10% DP, 23% vs 22, 4% VP, 38% vs 29%) LP) (1E pav.). Tačiau TRIP pelių, gydomų glipizidu, PC klasifikacijose buvo mažesnis prostatos audinių procentas nei TRAMP pelių, gydytų DMSO, kaip WD adenokarcinomos atveju (12, 3% palyginti su 13% DP, 3% ir 5). % VP) ir PD adenokarcinoma (10% vs 17, 7% DP, 0% vs 5% VP; 1E pav.). TRAMP pelėse, apdorotose tiek DMSO, tiek glipizidu, nebuvo nei MD, nei PD audinių.

Glipizidas slopina prostatos vėžio metastazes TRAMP pelėms

Atsižvelgiant į tai, kad glipizidas gali slopinti PC augimą, glipizidas gali atlikti svarbų vaidmenį PC metastazėse. Kaip ir tikėtasi, palyginti su DMSO grupe, glipizidas reikšmingai slopino metastazes plaučiuose ir kepenyse. Metastazavusių židinių nebuvo rasta kituose organuose, tokiuose kaip inkstai, smegenys ir blužnis. TRAMP pelių, gydytų glipizidu, plaučių ir kepenų metastazavusių židinių skaičius buvo mažesnis nei pelių, gydytų DMSO (2A, B, D, E pav.). Be to, buvo nustatyta, kad visoms TRAMP pelėms, gydomoms DMSO arba glipizidu, išsivysto metastazės plaučiuose (2 pav. C). Nors visoms TRAMP pelėms, gydomoms DMSO, išsivystė metastazės kepenyse, glipizidu gydytoms TRAMP pelėms nebuvo (2 pav. F). Tuo tarpu glipizidas reikšmingai sumažino TRAMP pelių gliukozės kiekį po valgio po valgio, tačiau neturėjo įtakos TRAMP pelių kūno svoriui ir lipidų kiekiui kraujyje (papildoma S1 lentelė ir papildoma S3 pav.). Siekiant nustatyti, ar glipizidas paveikė transgeno raišką, buvo imunohistocheminis dažymas T-antigeno antikūnais. Rezultatai parodė, kad glipizidas neturėjo įtakos transgeno išraiškai (papildomas S4 pav.). Rezultatai rodo, kad glipizidas slopino PC metastazes plaučiuose ir kepenyse TRAMP pelėms.

Image

( A ) Reprezentatyvūs plaučių audinių H&E vaizdai rodo, kad TRAMP pelių, gydomų glipizidu ir DMSO, plaučiuose yra metastazavusių navikų. Didesnis metastazavusių navikų padidinimas parodytas juodais taškiniais kvadratais. ( B ) Glipizidu gydytos TRAMP pelės sukuria mažiau metastazavusių židinių nei DMSO apdorotos pelės. ( C ) Visoms TRAMP pelėms, gydomoms glipizidu ar DMSO, išsivysto PC metastazės plaučiuose. ( D ) Kepenų audinių pjūvių dažymas H&E rodo, kad DMSO apdorotose TRAMP pelėse yra kepenų metastazavusių kompiuterio židinių, bet ne glipizidu gydytų TRAMP pelių. Didesnis metastazavusių navikų padidinimas parodytas juodais taškiniais kvadratais. ( E ) Kepenų metastazės, kaupiamos TRAMP pelėse po gydymo glipizidu ir DMSO. ( F ) Glipizidu arba DMSO gydytų TRAMP pelių, turinčių metastazes kepenyse, dažnis. Strypas, 20 μm. * p < 0, 05 .

Visas dydis

Glipizidas slopina naviko sukeltą angiogenezę, tačiau nedaro įtakos prostatos vėžio ląstelių dauginimuisi

Atsižvelgiant į mūsų ankstesnį pranešimą, kad glipizidas nedarė jokio poveikio krūties vėžio ląstelių proliferacijai, slopindamas krūties vėžio augimą ir metastazes, slopindamas angiogenezę 7, mes ištyrėme glipizido vaidmenį angiogenezėje PC. PC31 sekcijose buvo atliktas imunohistocheminis dažymas (IHC) CD31. Palyginti su kontrole, glipizidu gydytų prostatos navikų mikrovelenų tankis DP, VP, LP ir AP buvo žymiai sumažėjęs (3A, B pav., Papildomas S2 pav.). Šie rezultatai rodo, kad glipizidas slopino PC augimą, slopindamas naviko sukeltą angiogenezę in vivo .

Image

( A, B ) Imunohistologinis kraujagyslių dažymas CD31 buvo atliktas prostatos DP, VP, LP ir AP skiltimis. Palyginti su DMSO grupe, dažymas rodo, kad pelių, gydytų glipizidu, mikrovaskulinis tankis yra ženkliai sumažėjęs. ( C, D ) Imunohistologinis dažymas prieš BrdU buvo atliktas prostatos DP, VP, LP ir AP skiltimis. Dažymas rodo, kad glipizidas neturi reikšmingo poveikio PC ląstelių dauginimuisi. Strypas, 50 μm. * p < 0, 05 , ** p < 0, 01 .

Visas dydis

Parodžius, kad glipizidas gali slopinti PC augimą pelėse TRAMP, manoma, kad būtina ištirti, ar glipizidas gali slopinti PC ląstelių dauginimąsi. Imunohistologinis BrdU dažymas buvo atliktas siekiant nustatyti glipizido poveikį navikinių ląstelių dauginimuisi. Šie rezultatai rodo, kad glipizidas neturi reikšmingo poveikio PC ląstelių dauginimuisi (3C pav., D, papildomas S2 pav.).

Glipizidas slopina mikrovelenų susidarymą

Anksčiau pranešėme, kad glipizidas gali slopinti angiogenezę CAM ir YSM 7 kraujagyslių rezginyje. Norint toliau nustatyti antiangiogenines glipizido savybes, buvo atlikti Matrigel kamščių ir žiurkių aortos žiedo tyrimai. In vivo Matrigel kamščio angiogenezės tyrimams Matrigels, sumaišytas su FGF-2, heparinu ar glipizidu, buvo švirkščiami į poodį Balb / c pelėms. Po septynių dienų „Matrigel“ kištukai buvo pašalinti. Kaip parodyta 4A pav., Kontrolinės grupės kamščiai (be FGF-2 ir glipizido) pasirodė balti. Matrigel kaiščiai, kuriuose yra FGF-2 ir DMSO, pasirodė ryškiai raudoni, parodydami, kad Matrigel kamščiuose susiformavo funkciniai indai. Tačiau kištukai, kuriuose yra glipizido (25 μg vienam kištukui) ir FGF-2, dramatiškai pasirodė šviesiai raudonai, tai rodo, kad susiformavo labai mažai kraujagyslių (4A pav.). Tada mes nustatėme hemoglobino kiekį kamščiuose. Kaip ir tikėtasi, gliutizidu gydomų kamščių hemoglobino kiekis buvo žymiai mažesnis nei DMSO turinčių kamščių (4B pav.). Be to, funkcinių kraujagyslių, gautų iš Matrigel kamščių, imunofluorescencinis dažymas parodė, kad glipizidas slopina angiogenezę (4C pav., D).

Image

Matrigel buvo sumaišytas su DMSO ir FGF-2, arba su glipizidu ir FGF-2, ir švirkščiamas į poodį į Balb / c peles. Po 7 dienų „Matrigel“ kištukai buvo atskirti ir pašalinti, tada buvo paimti „Matrigel“ kamščių vaizdai. ( A ) Kontroliniai vaizdai (be glipizido ir FGF-2), DMSO, kuriame yra FGF-2, glipizidas, kuriame yra FGF-2. ( B ) bendras hemoglobino kiekis kamščiuose. Kaiščiai, apdoroti DMSO ir glipizidu, buvo lizuojami, o hemoglobino lygis buvo nustatytas ELISA metodu. ( C ) Kaiščiai buvo išpjaustyti, po to atliktas imuninis dažymas CD31 antikūnams. ( D ) CD31 teigiamos srities procentinė dalis. ( E ) Aorta buvo išskirta iš Sprague-Dawley žiurkių ir buvo supjaustyta į 1–2 mm ilgio žiedus. Žiedai buvo sudėti į „Matrigel“ dengtą plokštelę ir apdoroti DMSO arba glipizidu. Reprezentacinės nuotraukos iš aortos žiedų daigų. ( F ) Mikrovelenų užaugimas buvo kiekybiškai įvertintas. ** p < 0, 01 , *** p < 0, 001 .

Visas dydis

Be in vivo Matrigel kamščio tyrimo, buvo atliktas ex vivo žiurkės aortos žiedo tyrimas. Ex vivo žiurkės aortos žiede glipizidas reikšmingai slopino mikrovelenėlių daigumą, apie tai byloja sumažėjęs mikrovelenų užaugimo procentas (4E pav., F).

Glipizidas nedaro įtakos PC-3, 22Rv1 ir DU145 prostatos vėžio ląstelių proliferacijai

Norėdami ištirti, ar glipizidas tiesiogiai slopina PC ląstelių proliferaciją in vitro , mes ištyrėme glipizido poveikį PC-3, 22Rv1 ir DU145 PC ląstelių proliferacijai, naudodami MTT testą. Po to, kai šios ląstelės buvo apdorotos 50–200 μM glipizidu 48 arba 72 valandas, buvo atliktas MTT tyrimas ląstelių gyvybingumui nustatyti. Nustatyta, kad glipizidas neturėjo reikšmingo poveikio PC ląstelių dauginimuisi visomis patikrintomis koncentracijomis, svyruojančiomis nuo 50 μM iki 200 μM (5A – C pav.). Norėdami išsamiau ištirti glipizido poveikį PC ląstelių proliferacijai, 48 valandas mes apdorojome PC ląsteles 200 μM glipizidu ir, naudodami srauto citometriją, nustatėme ląstelių ciklo pasiskirstymą. Ląstelių ciklo analizė srauto citometrija parodė, kad glipizidas iš esmės nepaveikė PC ląstelių proliferacijos (5D – F pav.).

Image

( A - C ) PC ląstelės, įskaitant PC-3, 22Rv1 ir DU145 ląsteles, 48 ​​valandas arba 72 valandas buvo gydomos 50–200 μM glipizidu. Toliau buvo atliktas MTT tyrimas. Rezultatai nerodo jokio poveikio ląstelių dauginimuisi ir gyvybingumui. ( D - F ) PC-3, 22Rv1 ir DU145 ląstelės 48 valandas buvo apdorotos 200 μM glipizidu, o PC ląstelių ciklas buvo analizuojamas srauto citometrija. Srauto citometrijos rezultatai rodo, kad glipizidas nedaro įtakos ląstelių ciklo pasiskirstymui PC-3, 22Rv1 ar DU145 ląstelėse.

Visas dydis

Glipizidas slopina angiogenezę sumažindamas kraujagyslių ANGPT1 ekspresiją

Su angiogeneze susijusių genų analizei buvo atliktas qRT-PGR masyvas, ir nustatyta, kad ANGPT1 raiška yra žymiai sumažinta (6A pav.). Norint toliau nustatyti, ar ANGPT1 ekspresija buvo nepakankamai sureguliuota HUVEC, gydomiems glipizidu, buvo atlikti qRT-PGR ir Western blot tyrimai. Mes nustatėme, kad ANGPT1 išraiška sumažėjo HUVEC, gydomiems glipizidu (6B pav., C). Tada mes nustatėme ANGPT1 ekspresiją TRAMP pelių, gydomų glipizidu ir DMSO, kraujagyslėse. Mes nustatėme, kad, palyginti su TRMS pelėmis, apdorotomis DMSO, ANGPT1 ekspresija buvo žemai sureguliuota TRAMP pelių, gydomų glipizidu, kraujagyslėse (6 pav., E). Be to, ex vivo žiurkės aortos žiede ANGPT1 reikšmingai sukėlė mikrovešelių sudygimą ir po 7 dienų inkubacijos suformavo kraujagyslių tinklą aplink aortos žiedus (papildomas S5A pav.). Glipizidas reikšmingai antagonizavo ANGPT1 stimuliuojamą daigumą (papildomas 5B pav.). Taip pat įvertinome ANGPT1 reikšmę angiogenezėje, ištyrę, ar ANGPT1 nutildymas gali slopinti HUVEC vamzdelio susidarymą. Nutildžius ANGPT1, HUVEC vamzdelio formavimasis sumažėjo ir glipizidas tam įtakos neturėjo (6F pav.).

Image

( A ) ANGPT1 ekspresija yra nepakankamai sureguliuota HUVEC, gydomiems glipizidu, atliekant qRT-PGR matricos analizę. ( B, C ) Norint dar labiau nustatyti qRT-PCR masyvo rezultatus, buvo atlikti qRT-PCR ( B ) ir Western blotting ( C ). ( D, E ) Imunofluorescencinis dažymas rodo, kad ANGPT1 ekspresijos lygis yra didelis DMSO gydomų TRAMP pelių naviko audinių kraujagyslėse. Tačiau ANGPT1 ekspresija žymiai sumažėja glipizidu gydytų TRAMP pelių naviko audinių kraujagyslėse. ( F ) ANGPT1 nutildymas ir glipizidas reikšmingai slopina HUVEC vamzdelių susidarymą. Be to, glipizidas nedaro įtakos HUVEC gebėjimui formuoti vamzdines struktūras po to, kai nutildytas ANGPT1. Mastelio juostos, 20 μm E ir 50 μm F. * P < 0, 05 , ** p < 0, 01 , *** p < 0, 001 .

Visas dydis

HMGIY / ANGPT1 signalizacijos kelias yra pagrindinis glipizido taikinys

Įrodėme, kad glipizidas gali slopinti angiogenezę žemyn reguliuodamas ANGPT-1 ekspresiją. Ankstesni tyrimai parodė, kad HMGIY gali kontroliuoti ANGPT1 raišką endotelio ląstelėse 15 . Norėdami išsamiau ištirti, kaip glipizidas slopina ANGPT1, pirmiausia ištyrėme HMGIY ir ANGPT1 raišką HUVEC, gydomuose DMSO arba glipizidu. Kaip parodyta 7A pav., Glipizidas slopino HMGIY ir ANGPT1 baltymų ekspresiją HUVEC. Kaip ir tikėtasi, HMGIY nutildymas slopino ANGPT1 išraišką, tačiau HMGIY išraiška nepasikeitė po to, kai nutildyta ANGPT1 (7B pav., C). Tolesni tyrimai taip pat parodė, kad nutildžius HMGIY, glipizidas neturėjo įtakos HMGIY ir ANGPT1 ekspresijai (7 pav., E). Šie rezultatai rodo, kad HMGIY ir ANGPT1 gali būti vienas iš svarbiausių glipizido taikinių.

Image

( A ) Glipizidas reikšmingai slopina HMGIY ir ANGPT1 baltymų ekspresiją. ( B ) HMGIY nutildymas slopina ANGPT-1 baltymų ekspresiją. ( C ) ANGPT1 trūkumas neturi įtakos HMGIY raiškai. ( D, E ) Glipizidas nekeičia HMGIY ir ANGPT1 išraiškos nutildytuose HUVEC. ** p < 0, 01 , *** p < 0, 001 .

Visas dydis

Norėdami toliau nustatyti ANGPT1 reguliuojamas signalines molekules prieš srovę, mes ištyrėme, ar glipizidas turi įtakos HUVEC ląstelėms su konstituciškai aktyvuotu ANGPT1 receptoriumi. Buvo nustatyta, kad glipizidas žymiai padidino Tie2 ir p-Tie2 baltymų ekspresiją HUVEC (papildoma S5C pav., D). Mes taip pat ištyrėme, ar glipizidas turėjo įtakos HMGIY nutildytų HUVEC vamzdelių susidarymui, stimuliuojamiems egzogeninio ANGPT1. Rezultatai parodė, kad nutildžius HMGIY, HUVEC vamzdelio formavimui įtakos išorinis ANGPT1 nepadarė (papildomas S5E pav., F). Šios išvados patvirtino, kad HMGIY buvo ANGPT1 paskesnis signalas. Be to, 1H BMR buvo atliktas norint ištirti, ar glipizidas jungiasi su HMGIY ar ANGPT1 baltymais. Šie rezultatai rodo, kad glipizido dozė tiesiogiai neprisijungia nei prie HMGIY, nei ANGPT1 baltymų (papildomas S6 pav.), Parodydami, kad HMGIY nėra tiesioginis glipizido taikinys.

Diskusija

Šiame tyrime mes pranešame apie svarbų atradimą, kad glipizidas, antidiabetinis vaistas, plačiai naudojamas T2DM, reikšmingai slopina PC naviko augimą ir metastazes, slopindamas naviko sukeltą angiogenezę. Įdomu tai, kad glipizidas sumažina mikrovelenų tankį spontaniškose PC TRAMP pelėse, taip užkertant kelią PC augimui ir metastazėms.

PC yra vienas iš labiausiai diagnozuotų vėžio susirgimų Jungtinėse Valstijose, o sergamumas dar didesnis JAV nei Kinijoje. Sparčiai didėjanti tendencija yra 27, 28 . Nepaisant to, kad visame pasaulyje vyrams dažnai pasitaiko AK, veiksmingam gydymui yra prieinama labai nedaug vaistų. Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad kai kurių antidiabetinių vaistų vartojimas yra susijęs su mažesne T2DM 6 vėžio rizika. Taip pat buvo pranešta, kad glipizidas kartu su metforminu susijęs su mažesniu vėžio dažniu 6 . Buvo pranešta apie metformino augimą ir metastazes slopinantį kepenų, plaučių, krūties, skrandžio ir tiesiosios žarnos vėžį. Stebimi tyrimai ir klinikinių tyrimų duomenys parodė, kad metformino vartojimas yra glaudžiai susijęs su kepenų, kolorektalinio, kasos ir kolorektalinio vėžio išsivystymo rizikos sumažėjimu 31 . Nepaisant to, glipizido vaidmuo progresuojant vėžį niekada nebuvo specialiai ištirtas, kol mūsų komanda nepadarė tokių pastangų. Anksčiau mes dokumentavome, kad glipizidas slopina krūties vėžio augimą ir metastazes, naudodamas ksenografinių pelių modelius su krūties karcinomos 4T1 ląstelėmis ir spontanišką krūties karcinomos MMTV-PyMT pelėmis 7 . Tačiau ar glipizidas gali slopinti PC augimą ir metastazės, kol kas nežinoma. Mūsų rezultatai rodo, kad glipizidas reikšmingai slopina PC augimą ir metastazes TRAMP pelių modeliuose, kai pelėms spontaniškai išsivysto prostatos adenokarcinoma 21 . Šie duomenys patvirtina, kad glipizidas gali būti panaudotas kaip veiksminga terapinė priemonė gydant AK. Be to, ankstesni mūsų tyrimai parodė, kad gydymas glipizidu dėl auglių augimo slopinimo pirmiausia buvo susijęs su silpnesne angiogeneze, o ne su hipoglikemija 7 .

Mūsų grupė taip pat pranešė, kad glipizidas slopina kraujagyslių formavimąsi ir vystymąsi embriono chorioallantoinės membranos ir trynio maišelio membranos modeliuose 7 . Be to, slopindamas naviko sukeltą angiogenezę, glipizidas slopina krūties vėžio augimą ir metastazes 7 . Be to, glipizidas slopina mikrovelenų susidarymą in vivo Matrigel kamščio tyrime ir ex vivo žiurkės aortos žiedo tyrime. Be to, imunohistochemija su CD31 antikūnais buvo atlikta siekiant nustatyti, ar glipizidas slopina PC augimą ir metastazes, ribodamas naviko sukeltą angiogenezę. IHC rezultatai rodo, kad glipizidas slopina naviko sukeltą angiogenezę, taip paveikdamas PC augimą ir metastazes. Mūsų MTT tyrimas ir srauto citometrijos tyrimas rodo, kad glipizidas nedaro reikšmingos įtakos PC ląstelių proliferacijai. Yra žinoma, kad angiogenezė yra būtinas naviko augimo ir metastazių etapas. Be antidiabetinio poveikio, gydymui kompiuteriu gali būti pritaikytos ir antia angiogeninės glipizido savybės. Vienas iš tokių sėkmingų pavyzdžių yra talidomidas, pasižymintis keliomis funkcijomis, kaip antiandrogeniniu vaistu 32 . Talidomidas iš pradžių buvo naudojamas rytiniam susirgimui gydyti. Šis gydymas vėliau buvo nutrauktas, nes tai sukėlė kūdikių anomalijas. Tačiau dabar talidomidas yra pakeistas vėžio gydymui, nes turi puikų antiangiogeninį poveikį.

Norėdami ištirti, kaip glipizidas slopina angiogenezę, atlikome qRT-PGR analizę, naudodami glipizidu gydomus HUVEC su angiogeneze susijusiems genams. Mes nustatėme, kad glipizidas slopina angiogenezę sumažindamas ANGPT1 ekspresiją kraujagyslių endotelio ląstelėse. Buvo pranešta, kad ANGPT1 raiška yra sureguliuota įvairių rūšių vėžiui, pavyzdžiui, gliomai ir plazminių ląstelių navikams 33, 34 . Be to, aukščiau reguliuojama ANGPT1 ekspresija daugelyje navikų skatina naviko augimą. Neseniai įrodyta, kad ANGPT1 plečia kraujagysles ir skatina sieninių ląstelių kaupimąsi anti-VEGF-A terapijos metu, taip ribodamas naviko hipoksiją 35 . Mūsų eksperimentai taip pat patvirtina, kad glipizidas žemyn reguliuoja ANGPT1 raišką HUVEC ir negali paveikti vamzdelio susidarymo, kai ANGPT1 yra nutildytas (6 pav.). Be to, glipizidas reikšmingai slopina ANGPT1 stimuliuojamą daigumą ex vivo žiurkės aortos žiede (papildomas 5 pav.). Įrodyta, kad HMGIY gali būti angiogeninio proceso reguliatorius 15 . Be to, ANGPT1 / HMGIY signalizacija yra susijusi su endotelio ląstelių išgyvenimu žiurkių smegenų mikrovaskulinėse endotelio ląstelėse ir skatina smegenų išemiją 15 . Per didelis HMGIY ekspresija gali skatinti naviko augimą ir metastazes 29 . Be to, HMGIY / ANGPT1 signalizacijos kelias vaidina svarbų vaidmenį naviko angiogenezėje. Taigi HMGIY / ANGPT1 ženklinimo blokada glipizidu pateikia veiksmingą terapinę strategiją, užkertančią kelią naviko angiogenezei. Mes taip pat nustatėme, kad glipizidas tiesiogiai neprisijungė nei prie HMGIY, nei ANGPT1 baltymų pagal 1 H BMR, kas rodo, kad HMGIY nėra tiesioginis glipizido taikinys (papildomas 6 pav.). Įdomu tai, kad tai pranešė CL Zhang ir kt . kad cAMP jutiklis EPAC2 yra tiesioginis antidiabetinių sulfonilkarbamidų taikinys 36 . Be to, HMGIY išmuštos pelės gali sukurti II tipo diabeto fenotipą, nes ląstelių paviršiuje yra mažiau insulino receptorių. Svarbu tai, kad cAMP kelias gali suaktyvinti HMGIY ir RBP4, o cAMP-HMGA1-RBP4 sistemos aktyvinimas daro svarbų poveikį gliukozės homeostazei 37 . Taigi sukaupti įrodymai rodo, kad glipizidas gali nukreipti į cAMP / EPAC2 / HMGIY / ANGPT1 signalizacijos kelią HUVEC.

Apibendrinant, kaip vienas svarbus šio tyrimo radinys, nustatyta, kad glipizidas gali slopinti kompiuterio augimą ir metastazes TRAMP transgeninio pelės modelyje. Jo terapinis veiksmingumas daugiausia susijęs su gebėjimu slopinti naviko sukeltą angiogenezę, o ne PC ląstelių proliferaciją. Be to, HMGIY / ANGPT1 signalizacijos reguliavimas yra vienas iš dominuojančių anti-angiogeninio glipizido veikimo taikinių. Kadangi angiogenezė yra būtina auglių augimui ir metastazėms, glipizidas gali būti pakartotinai paskirstytas, kad būtų veiksmingai gydomi AK pacientai.

Medžiagos ir metodai

Etikos pareiškimas

Visus šio tyrimo eksperimentus su gyvūnais patvirtino Guangdongo farmacijos universiteto medicinos tyrimų gyvūnų etikos komitetas. Visus protokolus patvirtino Guangdongo farmacijos universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas ir jie vykdė pagal patvirtintas gaires.

Reagentai ir ląstelių linijos

Glipizidas buvo įsigytas iš „Sigma-Aldrich“ (kat. Nr. G117, „Sigma-Aldrich“, Sent Luisas, MO, JAV) ir ištirpintas DMSO, kad gautų 50 mg / ml pradinius tirpalus. Žmogaus PC-3, 22Rv1 ir DU145 ląstelių linijas padovanojo docentas Bo Wei (trečioji dukterinė ligoninė, Sun Yat-sen universitetas).

TRAMP transgeninės pelės

TRAMP transgeninės pelės, kurių fonas C57BL / 6, buvo įsigytos iš Džeksono memorialinės laboratorijos (Bar Harbor, Meinas, JAV). TRAMP pelių genotipai buvo nustatyti PCR metodu, naudojant pradmenis, būdingus TRAMP pelėms. [C57BL / 6 × FVB] F1 TRAMP pelės buvo sukurtos ir prižiūrimos, kaip buvo pranešta anksčiau 38 . Procedūras patvirtino Guangdongo farmacijos universiteto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

Eksperimentinis dizainas

Šešiolikos savaičių [C57BL / 6 × FVB] F1 TRAMP pelės, kurioms savaime išsivystė PC, 8 savaites kas tris dienas buvo gydomos intraperitoniniu būdu DMSO arba glipizidu (5 mg / kg). Mūsų vartojamo vaisto dozė buvo apskaičiuota pagal dozę pacientams (30 mg / pacientui), naudojant gyvūno ir žmogaus kūno svorio perskaičiavimo formulę: glipizido dozė kiekvienai pelei = perskaičiavimo koeficientas (9, 01) × dozė kiekvienam pacientui (0, 55 mg / kg). Po 8 savaičių pelės buvo paaukotos, o GU traktas, susidedantis iš šlapimo pūslės, prostatos, sėklinių pūslelių ir šlaplės, buvo pašalintas ir pasvertas. DP, LP, VP ir AP skiltys buvo išpjaustytos po apverstą mikroskopą, kiekvienos užšaldytos poros po vieną skiltį dedant į skystą azotą, o kitą - į 10% formalino.

Histopatologija

Atskiros TRAMP pelių prostatos skiltys per naktį buvo fiksuotos 10% formalino. Tada fiksuoti audiniai buvo įterpti į parafiną ir išpjaustyti 3 μM storio. Skyriai buvo dažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E) pagal standartinius protokolus. Remiantis TRAMP specifine klasifikavimo schema, kaip anksčiau aprašė Suttie ir kt . 25, prostatos proliferaciniams pažeidimams buvo priskiriamas pusiau kiekybinis balas. Duomenys iš prostatos skaidrių buvo surinkti naudojant dvigubai aklą protokolą ir du stebėtojai buvo įvertinti atskirai.

Naviko metastazių įvertinimas

Pelių, gydytų glipizidu ar DMSO, plaučiai, kepenys, inkstai, blužniai, smegenys ir žarnos buvo įmerkti į parafiną ir padalijami nuosekliai. Skyriai buvo dažyti H&E. Norint įvertinti metastazių ir mikrometastazių židinių skaičių bei metastazių dažnį, H&E dažyti skyriai buvo mikroskopiškai ištirti dviejų patyrusių patologų, kurie buvo apakinti prie audinių šaltinio. Buvo suskaičiuoti metastaziniai židiniai serijos skyriuose. Metastazių židinių skaičius kiekvienoje pelėje buvo apskaičiuotas pagal šią lygtį: skaičius = visų kiekvienos pelės pjūvių židinių skaičius / pjūvio numeris.

Žiurkių aortos žiedo tyrimas

Žiurkių aortos žiedo tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau, su nedidelėmis modifikacijomis 39 . 7–9 savaičių amžiaus „Sprague-Dawley“ žiurkių patinai buvo gauti iš Guangdongo farmacijos universiteto eksperimentinių gyvūnų centro. Iš Sprague-Dawley žiurkių išskirta aorta buvo supjaustyta į 1–2 mm ilgio žiedus ir tris kartus išplauta lediniu fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS). Žiedai buvo sudėti į 100 μL „Matrigel“ dengtas 48 šulinėlių plokšteles ir inkubuojami 30–45 minutes 37 ° C temperatūroje su 5% CO2. EGM terpė (kat. Nr. CC-2935, LONZA, Walkersville, MD, JAV), turinti glipizidą (25 μg / ml), ANGPT1 baltymą arba DMSO, buvo dedama į šulinėlius ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 7 dienos. Inkubacijai pasibaigus, aortos žiedai, suformavę mikrodumblių sudygimą, buvo paimti apverstu mikroskopu. Kraujagyslių išbėrimas buvo kiekybiškai įvertintas suskaičiavus mikrodumblių skaičių, atsirandantį iš aortos žiedų 39 .

In vivo Matrigel kamščio tyrimas

Moteriškos „Balb / c“ pelės (5–6 savaičių) buvo įsigytos iš Guangdongo medicinos laboratorijos gyvūnų centro (Guangdžou, Kinija). Matrigel plug testai buvo atlikti kaip aprašyta anksčiau 40 . Pelėms po oda buvo sušvirkšta 500 μL Matrigel (kat. Nr. 356230, BD Biosciences, Becton Dickinson, San Chosė, CA), turinčių FGF-2 (150 ng / ml, kat. Nr. 3139-FB / CF, R&D)., Mineapolis, MN, JAV), heparinas (60 vienetų, „Cisen“ farmacijos įmonė, Shandong, Kinija) ir arba glipizidas (50 μg / ml), arba DMSO. Po septynių dienų pelės buvo išnaikintos atlikus gimdos kaklelio išnirimą, o Matrigel kaiščiai buvo išskirti ir pašalinti. „Matrigel“ kištukų vaizdai buvo padaryti naudojant „Canon Power shot G10“ skaitmeninį fotoaparatą. Angiogenezė buvo analizuojama išmatuojant hemoglobino kiekį ir imunofluorescenciją CD31.

Imunohistologinis ir imunofluorescencinis dažymas

Imunohistologinis ir imunofluorescencinis dažymas buvo naudojamas 3 ir 6 μm pjūviuose. Prieš aukojant TRAMP peles, transgeninėms pelėms buvo sušvirkšta 100 mg / kg 5-brom-2′-deoksiuridino (BrdU; kat. Nr. B5002, Sigma). Skyriai buvo inkubuojami su anti-CD31 (1: 100 skiedimas, kat. Nr. Sc-1506, Santa Cruz, CA, JAV), anti-BrdU (1: 100 skiedimas, kat. Nr. Sc-32323, Santa Cruz, CA, JAV) arba ANGPT1 (kat. Nr. Ab8451, Abcam, Kembridžas, CB, JK) antikūnai per naktį 4 ° C temperatūroje. Tada į dalis buvo įpilti HRP - konjuguoti arba su DyLight 488 konjuguoti arba su DyLight 555 konjuguoti antriniai antikūnai ir dažyti DAB ir hematoksilinu arba 4′-6-diamidino-2-fenilindoliu (DAPI). Norint nustatyti mikrovelenų tankį ir BrdU kiekį, CD31 + indai buvo suskaičiuoti 200 × 41 lauke, o BrdU + ląstelių skaičius buvo suskaičiuotas 400 × lauke ir išreiškiamas procentine dalimi nuo visų ląstelių, esančių 42 lauke, procentine dalimi. Imunofluorescencinio dažymo vaizdai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant vaizdų analizės programą IPP 6.0 („Image Pro-Plus“, 6.0 versija, „Media Cybernetics“).

MTT tyrimas

Buvo atliktas MTT tyrimas, siekiant įvertinti glipizido poveikį PC ląstelių proliferacijai. Trumpai tariant, ląstelės buvo dedamos į 96 šulinėlių plokšteles ir 48–72 valandas apdorotos glipizidu (50–200 μM) ir DMSO. Tada MTT reagentas buvo įpiltas į kiekvieną šulinėlį, o supernatantai buvo pašalinti po 4 valandų. Ištirpinti gautus formazano kristalus buvo panaudoti 150 μL DMSO (Sigma-Aldrich). Absorbcija buvo nuskaityta esant 570 nm, naudojant spektrofotometrą.

Srauto citometrija

Norint toliau nustatyti, ar glipizidas daro įtaką naviko ląstelių proliferacijai, buvo atlikta srauto citometrijos analizė, kaip aprašyta anksčiau 43 . Ląstelės 48 valandas buvo apdorotos 200 μM glipizidu arba DMSO. Po keturiasdešimt aštuonių valandų ląstelės buvo resuspenduotos PBS ir per naktį pritvirtintos ledo šaltu 70% etanoliu 4 ° C temperatūroje. Vėliau ląstelės buvo dažytos PI tirpalu 4 ° C temperatūroje 30 min., Po to ląstelės buvo du kartus plaunamos PBS. Tada PC ląstelės (1 × 10 / ml) buvo veikiamos fluorescenciniu ląstelių rūšiavimo srauto citometru (Cytomics ™ FC 500; Beckman Coulter, Majamis, FL, JAV) ir ląstelių procentinė dalis skirtingose ​​ląstelių ciklo fazėse. buvo kiekybiškai įvertinti naudojant „Modfit“ programinę įrangą.

Kiekybinis realaus laiko PGR

Visa RNR buvo išskirta iš glipizidu arba DMSO apdorotų HUVEC. Tada su angiogeneze susijusio geno analizei buvo naudojamas qRT-PCR matricos rinkinys. Visi qRT-PCR tyrimai buvo atlikti naudojant „ABI PRISM 7000HT Sequence Detection System“ („Applied Biosystems“).

Vakarų pūtimas

Baltymas buvo ekstrahuotas po to, kai HUVEC buvo apdoroti glipizidu (5 μg / ml) ir DMSO arba transfekuoti siRNR. Visi baltymai buvo atskirti ir perkelti į nitroceliuliozės membranas. Membranos buvo inkubuotos su ANGPT1 antikūnais (Abcam) per naktį 4 ° C temperatūroje, po to su krienų peroksidaze sujungtu IgG. Juostoms aptikti buvo naudojamas „Odyssey Infrared Imager“ („LICOR Bioscience“, Linkolnas, NE, JAV).

Statistinė analizė

Duomenims analizuoti ir statistinėms diagramoms sudaryti buvo naudojamas „GraphPad Prism 5“ programinės įrangos paketas („GraphPad Software, CA“). Patenkinus išankstinius reikalavimus (nepriklausomumas ir normalus pasiskirstymas), buvo naudojamas dvipusis Studento t-testas, kuris patvirtino, ar tam tikri atsakai, apimantys IHC rezultatus, GU trakto svorius, mikroskopinius pažeidimų balus ir pasiskirstymą bei MTT rezultatus glipizido skyrimas. Skirtumai tarp grupių buvo laikomi reikšmingais, kai p < 0, 05 .

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Qi, C. et al . Glipizidas slopina prostatos vėžio progresavimą TRAMP modelyje, slopindamas angiogenezę. Mokslas. Rep. 6, 27819; „doi“: 10.1038 / srep27819 (2016).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.