Su golgi susijusi lc3 lipidacija reikalauja v-atpase esant nekanoninei autofagijai | ląstelių mirtis ir liga

Su golgi susijusi lc3 lipidacija reikalauja v-atpase esant nekanoninei autofagijai | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Autofagija
  • Ląstelių signalizavimas
  • Golgi
  • Membraniniai baltymai

Anotacija

Autofagija yra evoliuciškai išsaugotas katabolinis procesas, kurio metu ląstelės skaido tarpląstelinius baltymus ir lizosomų organelius. Kanoninei autofagijai reikalingi visi autofagijos baltymai (ATG), tuo tarpu nekanoninę autofagiją suaktyvina įvairūs agentai, kurių metu kai kurie būtini autofagijos baltymai yra būtini. Kaip nekanoninė autofagija yra sukelta ir (arba) slopinama, vis dar neaišku. Šiame tyrime mes parodėme, kad AMDE-1, neseniai identifikuota cheminė medžiaga, galinti sukelti kanoninę autofagiją, galėjo iššaukti nekanoninę autofagiją, nepriklausomą nuo ULK1 (unc-51 tipo kinazės 1) komplekso ir Beclin1 komplekso. AMDE-1 sukeltą nekanoninę autofagiją galėjo specialiai slopinti įvairūs V-ATPazės (vakuolinio tipo H + -ATPazės) inhibitoriai, bet ne sutrikdyti lizosomų funkciją ar tarpląstelinio jonų persiskirstymą. Panašūs atradimai buvo taikomi įvairioms stimulų grupėms, kurios gali sukelti nekanoninę autofagiją nepriklausomai nuo FIP200. AMDE-1 sukeltas LC3 lipidavimas buvo kolokalizuotas su Golgi kompleksu, ir jį slopino Golgi komplekso sutrikimas. Golgi komplekso vientisumas taip pat buvo reikalingas daugeliui kitų agentų, norint stimuliuoti nekanoninę LC3 lipidaciją. Šie rezultatai rodo, kad Golgi kompleksas gali būti membranos platforma nekanoninei autofagijai, kur V-ATPazė yra pagrindinis veikėjas. V-ATPazės inhibitoriai gali būti naudingi įrankiai tiriant nekanoninę autofagiją.

Pagrindinis

Makroautofagija (toliau - autofagija) yra evoliuciškai konservuotas procesas, kuris skaido pažeistus organelius ar ilgaamžius baltymus ir pasikliauja lizosomų sistema, kad aprūpintų maistinėmis medžiagomis metabolinio streso sąlygomis. Autofagijos sutrikimas nustatytas įvairioms žmonių ligoms, tokioms kaip neurodegeneracinė liga, infekcinė liga ir vėžys. 1, 2

Autofagiją gali skatinti daugybė baltymų, užkoduotų su autofagija susijusių genų (Atgs). Pagrindinės ATG molekulės dalyvauja keturiose skirtingose ​​autofagosomų formavimo ir brendimo stadijose, tai yra, branduolyje, pailgėjime, brendime ir suliejime. 3 Branduolį dažnai inicijuoja ULK1 (į unc-51 panašios kinazės 1) kompleksas, kuris apima ULK1, FIP200 ir ATG13, ir autofagijai specifinis Beclin1 kompleksas, kuris apima Beclin1, ATG14 ir III klasės fosfatidilinozitol-3 kinazę. (PI3KC3). Šie kompleksai yra aktyvuojami arba slopinami pasroviui kylančių signalų, tokių kaip tie, kuriuos perduoda mTORC1 ir AMPK keliai. Pradinės autofagosominės membranos gali būti gaunamos iš daugybės skirtingų šaltinių, kurių branduoliai sudaro fagoforą suaktyvinus aukščiau išvardintus du kompleksus. 5 Autofagosomų membranų pailgėjimas ir brendimas priklauso nuo konjugacijos sistemų, apimančių ATG7, ATG12, ATG5, ATG16, ATG10 ir ATG3, ir galiausiai gaunamas fosfatidil-etanolaminu konjuguotas LC3 ir kiti ATG8 šeimos nariai. Galiausiai subrendusi autofagosoma susilieja su lizosoma, kad suirtų kroviniai. Žinoma, kad šie žingsniai yra būtini kanoninei autofagijai.

Nekanoninė autofagija (NCA) paprastai vadinama procesu, kuris gali apeiti ULK1 ir (arba) Beclin1 komplekso įsitraukimą. 6, 7, 8, nors pranešta apie nuo ATG7 / ATG5 nepriklausomą kelią. 9, 10 NCA paprastai klasifikuojamas kaip procesas, priklausomas nuo konjugacijos sistemos, ir jam būdinga LC3 lipidacija. NCA buvo nustatyta įvairiose aplinkose. Pirmiausia buvo nustatyta, kad NCA yra nepriklausoma nuo „Beclin1“ komplekso. 6, 8, 11 Visai neseniai nustatyta, kad proapoptotiniai junginiai, tokie kaip MK801, gosipolis ir proteasomų inhibitoriai MG132 ir bortezomibas, sukelia nuo Beclin1 nepriklausomą autofagiją. Buvo pranešta apie autofagijos atsaką, nepriklausomą nuo ULK1 komplekso, reaguojant į amoniaką, 13 cis nesočiųjų riebiųjų rūgščių 14 ir gliukozės trūkumą. 13, 15

NCA gali atstovauti daugybę skirtingų LC3 teigiamų struktūrų, įskaitant dvigubos membranos autofagosomas (pagal EM), į autofagosomas panašias struktūras (tik pagal GFP-LC3 taškus), nekanoninę LC3 lipidaciją (tik naudojant Western blot analizę) ir LAP (LC3 - susijusi fagocitozė pagal GFP-LC3 taškus). 16, 17 LAP gali būti speciali NCA forma, tačiau ji susijusi su šeimininko autofaginėmis reakcijomis, susijusiomis su mikrobų infekcija. 16 NCA struktūrų, turinčių vieną arba dvigubą membraną, atlieka tą pačią funkciją kaip ir kanoninė autofagija sekvesterizuodamos citoplazmą ir suskirstydamos įsibrovimo patogenus, kurie galiausiai yra suskaidomi lizosomų skyriuje. 7

NCA funkcija ne visais atvejais yra labai aiški. Tačiau kai kurie procesai, tokie kaip entozė ir LAP, buvo gerai ištirti ( 18, 19, 20), kurie rodo, kad ATG molekulių nekanoninės funkcijos turi svarbių fiziologinių funkcijų. Gyvų ar negyvų ląstelių ar patogenų fagocitozę gali palengvinti LC3 teigiamas skyrius. 20, 21 Be to, pranešta, kad cheminės indukuotos NCA arba nekanoninės LC3 lipidacijos teigiamai koreliuoja su žmogaus naviko ląstelių mirtimi 8, 22 ir atsparumu patogenams. 23 Gali būti, kad ląstelės, neturinčios ULK1 ar Beclin1 aktyvumo arba turinčios mažai galimybių pradėti autofagiją, gali išsivystyti ir naudoti NCA kaip būdą atsispirti patogeno invazijai arba išgyventi nepalankiose aplinkose. NCA gali būti arba svarbus papildomas mechanizmas, arba lygiagreti patofiziologinių procesų sąrašo reguliavimo sistema.

Tai, kaip suaktyvinama NCA, daugeliu atvejų nėra gerai suprantama, o tai trukdo suprasti NCA funkcijas ir jos ryšį su kanonine autofagija. AMDE-1 yra nauja cheminė medžiaga, galinti sukelti kanoninę autofagiją. 24 Šiame tyrime mes parodėme, kad AMDE-1 taip pat gali sukelti NCA, tai priklauso nuo vakuolinio tipo H + -ATPazės (V-ATPazės) ir integruoto Golgi komplekso. Be to, mes parodėme, kad šie reikalavimai paprastai buvo reikalingi kelių kitų agentų sukeltoms NCA, tokiu būdu atskleidžiant galimą bendrąjį įvairių NCA dirgiklių rinkinių mechanizmą.

Rezultatai

AMDE-1 suaktyvinta autofagija nepriklauso nuo ULK1 komplekso, bet priklauso nuo į ubikvitiną panašių konjugacijos sistemų

AMDE-1 buvo rastas atliekant didelio turinio atranką naudojant GFP-LC3. 24 Tai yra naujas autofaginis moduliatorius, kuris, slopindamas mTORC1, gali inicijuoti kanoninę autofagiją ankstyvoje stadijoje. Norėdami ištirti ULK1 komplekso įtaką AMDE-1 sukeltai autofagijai, mes panaudojome MEF, turinčius FIP200 arba ULK1. Keista, bet AMDE-1 vis dar sukėlė LC3-II formavimąsi FIP200KO-MEF ir ULK1KO-MEF (1a pav.). AMDE-1 sukeltos LC3-II susidarymo kinetika FIP200KO-MEF buvo tokia pati kaip WT-MEF (1b pav.). GFP-LC3 puncta skaičius FIP200KO-MEF ir ULK1KO-MEF sumažėjo, tačiau išliko reikšmingas po AMDE-1 stimuliacijos (1c ir d paveikslai). Kai buvo pritaikytas GFP-LC3 G120A, kuris yra nepakankamas LC3 lipidavimui, po apdorojimo nebuvo akivaizdi GFP puncta (1e pav.), Kas rodo, kad AMDE-1 sukeltas GFP puncta FIP200KO-MEF apima GFP-LC3 lipidavimą.

Image

AMDE-1 gali sukelti NCA, kuri nepriklauso nuo FIP200 ir ULK1, bet priklauso nuo konjugacijos sistemos. a ) Laukinio tipo MEF (WT), FIP200KO-MEF (FIP), ULK1KO-MEF (ULK) ir Atg5KO-MEF (Atg5) 6 valandas buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ) arba 2 metus EBSS. h, o po to analizuojamas imunoblotu. b ) WT-MEF ir FIP200KO-MEF, apdorotų AMDE-1 (10 μM ) skirtingais laiko momentais, imunoblotų analizė. c ) WT-MEF, FIP200KO-MEF, ULK1KO-MEF ir Atg5KO-MEF, išreiškiantys GFP-LC3, buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ) arba be jos 6 h, arba EBSS 2 h, o po to vertinami kaip LC3 punkcija. formavimas (žalias). ( d ) GFP-LC3 puncta kvalifikacija c punkte. ( e ) FIP200KO-MEF, išreiškiantys GFP-LC3 G120A, 6 valandas buvo gydomi AMDE -1 (10 μM ) arba be jo, o po to vertinami dėl LC3 puncta susidarymo (žalia). *** P <0, 001; NS, nereikšminga. Strypas = 25 μm

Visas dydis

Nepaisant to, AMDE-1 sukeltai LC3 lipidacijai reikėjo kanoninių konjugacijos sistemų. Taigi, apdorojant AMDE-1, Atg5KO-MEF nebuvo nei LC3-II (1a paveikslas), nei GFP-LC3 puncta (1c ir d paveikslai). Nuosekliai „Atg7“, „Atg4B“ ir „Atg3“ buvo reikalingi AMDE-1 sukeltai LC3 lipidacijai (papildomas paveikslas S1). Visi šie duomenys parodė, kad AMDE-1 galėjo suaktyvinti NCA FIP200KO ir ULK1KO ląstelėse, priklausančiose nuo ubikvitino tipo konjugacijos sistemų.

AMDE-1 sukeltai autofagijai nereikia „Beclin1“ komplekso

Norėdami įvertinti, ar stebėta LC3 lipidacija nebuvo inicijuota per „Beclin1“ kompleksą, mes panaudojome PI3KC3 inhibitorius 3-metiladeniną (3-MA) ​​ir wortmanniną (WM) ir nustatėme, kad šie kanoniniai autofagijos inhibitoriai negalėjo slopinti LC3 lipidacijos (2a pav.). Toliau mes patikrinome Atg16 puncta susidarymą - kritinį įvykį, kuris įvyksta anksčiau nei LC3 lipidacija. Kaip parodyta 2b paveiksle, rapamicinas sukėlė stiprias Atg16 skyrybas, kurias visiškai slopino PI3KC3 inhibitorius 3-MA, tuo tarpu AMDE-1 sukeltas Atg16 puncta negalėjo slopinti 3-MA. Atg14 yra svarbus komponentas, jungiantis Beclin1 ir Vps34, kad susidarytų Beclin1 kompleksas. 25 Panašus į PI3KC3 slopinimo modelį, Atg14 numušimas (KD) negalėjo pakenkti LCDE-II susidarymui, kurį sukelia AMDE-1 (2c paveikslas). Galiausiai mes nustatėme, kad tarp laukinio tipo U251 ląstelių ir U251 ląstelių su konstituciniu Beclin1 KD nesiskyrė LC3-II konversija ir GFP-LC3 puncta formavimasis (2d ir e pav.). Šie duomenys leido manyti, kad Beclin1 komplekso nereikia AMDE-1 sukeltai NCA.

Image

AMDE-1 sukeltai NCA nereikia kanoninės autofagijai būdingos III klasės PI-3 kinazės. ( a ) WT-MEF 6 valandas buvo apdorojamos AMDE-1 (10 μM ) su 3-MA (10 mM) arba be jo arba WM (1 μM ) ir po to analizuojamos imunoblotu. ( b ) A549 ląstelės buvo apdorotos kaip nurodyta (Rap, 1 μM ; AMDE-1, 10 μM ; 3-MA, 10 mM) 6 valandas, po to atliktas imuninis dažymas anti-ATG16L1 antikūnu. Rodyklės rodo teigiamus ATG16 taškus. c ) Atg14-siRNR 48 valandas buvo transfekuota į laukinio tipo MEF, po to apdorota AMDE-1 arba EBSS. ( d ir e ) Laukinio tipo ir Beclin1 KD U251 ląstelės, ekspresuojančios GFP-LC3, 6 valandas buvo gydomos AMDE-1 (10 μM ) arba be jo, arba 2 valandas EBSS, o po to įvertintos LC3-II susidarymui atliekant imunoblotus ( d ) arba imuninį dažymą ( e ). Strypas = 25 μm

Visas dydis

AMDE-1 nesamdo WIPI2, tačiau įdarbina Atg16 ir Atg12

Buvo stebimas WIPI2, fosfoinositidų sąveikaujantis baltymas su WD pakartotiniu domenu, ir DFCP1, dvigubai FYVE turintis baltymas 1, siekiant patvirtinti autofagijos pradžią. WIPI2 sudaro kompleksą su ATG2 ir funkcionuoja autofagosomų formavime priklausomai nuo fosfatidilinozitol-3-fosfato (PI3P), galbūt įdarbinant ATG16 LC3 lipidavimui. 26 Nesant FIP200, nebuvo nei WIPI2 punkto, susiformavusio po gydymo nei rapamicinu, nei AMDE-1 (3a paveikslas), taip pat nebuvo DFCP1 teigiamų struktūrų (papildomas paveikslas S2), kas rodo, kad WIPI2 ir DFCP1 buvo griežtai reglamentuojamos. iš ULK1 komplekso ir buvo įdarbintas AMDE-1. Duomenys taip pat rodo, kad WIPI2 ir DFCP1 gali būti nepakeičiami AMDE-1 sukeltoje NCA.

Image

AMDE-1 sukeltas NCA nesamdo WIPI2, bet Atg16 ir Atg12. ( a ) WT-MEF ir FIP200KO-MEF 6 valandas buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ) arba rapamicinu (ar 1 μM ) arba be jo, o po to buvo įvertinti, ar WIPI2 nenustato citozolyje (raudona). ( b ir c ) WT-MEF ir FIP200KO-MEF buvo apdorojami taip, kaip nurodyta (Rap, 1 μM ; AMDE-1, 10 μM ; 3-MA, 10 mM) 6 valandas, po to imant ATG16 ( b ). ir ATG12 ( c ). Rodyklės rodo WIPI2, ATG12 ir ATG16 teigiamų taškų pavyzdžius. ( d ) ATG12 (žalios spalvos) ir ATG16 (raudonos) spalvos padengimas FIP200KO-MEF po gydymo AMDE-1 6 valandas. Rodyklių galvutės nurodo kolokalizuotų ATG12 ir ATG16 taškų pavyzdžius. Strypas = 25 μm

Visas dydis

Laukinio tipo MEF, priešingai, tiek rapamicinas, tiek AMDE-1 sukėlė ATG16 puncta, tačiau tokią puncta FIP200KO-MEF gali sukelti tik AMDE-1 (3b pav.). Dažymas ATG12 teigiamoms struktūroms parodė, kad dažymo schema buvo panaši į ATG16 (3c paveikslas). 3-MA neslopino ATG12 teigiamų taškų FIP200KO-MEF. Po to palyginome ATG12 ir ATG16 teigiamų taškų pasiskirstymą ir ATG5 – ATG12 konjugaciją po gydymo AMDE-1. Beveik 100% ATG12 taškų buvo colocalized su ATG16 taškais (3d pav.). Tai neturėjo įtakos ATG12 – ATG5 konjugacijai (papildomas paveikslas S3), kas rodo, kad gydant AMDE-1 išliko ATG5–12 / 16 komplekso vientisumas. Šie duomenys rodo, kad AMDE-1 galėtų įdarbinti ATG5–12 / 16 kompleksą į NCA membranos platformą per mechanizmą, nepriklausomą nuo WIPI2 ir (arba) DFCP1.

Bafilomicinas blokuoja AMDE-1 sukeltą NCA

Mes nustatėme, kad dažniausiai naudojamas autofagijos skilimo inhibitorius, bafilomicinas A 1 (Baf), galėjo slopinti AMDE-1 sukeltą LC3 lipidaciją FIP200KO-MEF (4a ir b paveikslai). Laukinio tipo MEF, vien Baf sugebėjo sumažinti AMDE-1 sukeltą LC3-II susidarymą (4c paveikslas). Pažymėtina, kad 3-MA ir Baf derinys laukinio tipo MEF beveik visiškai atmetė LC3-II susidarymą (4d paveikslas) ir GFP-LC3 puncta (4e paveikslas). Šie duomenys parodė, kad AMDE-1 sukeltą autofagiją laukinio tipo MEF gali sukelti du skirtingi mechanizmai: vienas buvo skirtas kanoninei autofagijai, kurią slopino 3-MA, o kitas - NCA, kurią slopino Bafas.

Image

AMDE-1 sukeltą NCA gali slopinti Baf. a ) FIP200KO MEF 6 valandas buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ), Rap (1 μM ) ir (arba) Baf (0, 5 μM ) arba be jų, po to analizuojami implantų tyrimais. ( b ) FIP200KO MEF, išreiškiantys GFP-LC3, buvo gydomi kaip nurodyta (AMDE-1, 10 μM ; Baf, 0, 5 μM ) 6 valandas, o po to vertinami dėl LC3 punkto susidarymo. ( c ir d ) Laukinio tipo MEF buvo apdorotos kaip nurodyta (AMDE-1, 10 μM ; Repas, 1 μM ; 3-MA, 10 mM; Baf, 0, 5 μM ) 6 valandas, tada analizuojamos imunobotologiniu būdu. . Buvo apskaičiuotas LC3-II / tubulino santykis, palyginti su kontroline terpe (CM). ( e ) Laukinio tipo MEF, išreiškiantys GFP-LC3, 6 valandas buvo gydomi kaip nurodyta (AMDE-1, 10 μM ; 3-MA, 10 mM; Baf, 0, 5 μM ), o po to įvertinti LC3 puncta susidarymo atžvilgiu. ( f ) FIP200KO-MEF, išreiškiantys GFP-LC3, 6 valandas buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ) su Baf arba be jo (0, 5 μM ), po to imant imuninį dažymą SQSTM1. Rodyklės rodo GFP-LC3 ir SQSTM1 colocalized puncta pavyzdžius. Strypas = 25 μm . ** P <0, 01; *** P <0, 001

Visas dydis

SQSTM1 / p62 yra daugiafunkcinis baltymas adapteris, kuris renka visur esančius baltymų substratus į LC3, kad būtų skaidoma autofagiškai. 27 SQSTM1 punkcija pastebimai padidėjo reaguojant į AMDE-1 FIP200KO-MEF, kuriame SQSTM1 beveik visiškai sutapo su LC3 (4f pav.). Atsižvelgiant į LC3 puncta likimą, Baf panaikino ir sukauptą SQSTM1 puncta (4f paveikslas). Tokia AMDE-1 sukelta kolokalizacija taip pat įvyko HeLa ląstelėse, net esant 3-MA (papildomas paveikslas S4). Norėdami ištirti, ar SQSTM1 dalyvavo LC3 lipidavime, mes jį nugriovėme ir nustatėme, kad SQSTM1 sumažinimas negalėjo sumažinti bendro LC3 punkto skaičiaus, o AMDE-1 sukeltas LC3-II lygis, nepaisant 3-MA buvimo ( Papildomas S4 paveikslas). Šie duomenys taip parodė, kad SQSTM1 nebuvo reikalingas AMDE-1 sukeltai LC3 lipidacijai.

V-ATPazės inhibitoriai vietoj lizosomų inhibitorių ir jonoforai blokuoja LC3 lipidaciją

Panašus į Baf, konkanamicinas A (ConA) yra gerai ištirtas V-ATPazės inhibitorius. Salicilahalamidas A (SalA) yra kitas žinduoliams būdingas V-ATPazės inhibitorius, tačiau jis turi aiškų surišimo modelį, palyginti su Baf ir ConA. 28 Panašiai kaip Baf, tiek ConA, tiek SalA stipriai slopino AMDE-1 sukeltą LC3-II FIP200KO-MEF dozėje nuo 1 iki 100 nM (5a – c pav.), O tai rodo, kad V-ATPazė yra kritinė NCA molekulė. ir Baf slopinantis NCA poveikis iš tikrųjų buvo nukreiptas į šią molekulę.

Image

AMDE-1 sukelta NCA apima V-ATPazę, bet ne lizosomų aktyvumą ar tarpląstelinių jonų perskirstymą. ( a - c ) FIP200KO-MEF 6 valandas buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ), esant arba neturint Baf, ConA ar SalA, po to atlikta LC3 imunoblotologinė analizė. ( d - g ) FIP200KO-MEF buvo apdoroti kaip nurodyta 6 valandas, po to atlikta imunoblotologinė analizė ( d, f ir g ) ir ATG12 imuninis dažymas ( e ). AMDE-1 (10 μM ), Baf (0, 5 μM ), kintamasis (20 mM), CQ (40 μM ), E64d (25 μM ) ir pepstatinas A (50 μM ), monesinas (pirmadienis, 10 μM) M), nigarecinas (Nig, 1, 5 μM ), gramicidinas A (Gra, 5 μM ), valinomicinas (Val, 10 μM ), ConA (0, 2 μM ), jonomicinas (jono, 2 μM ) ir A23187 (2). μ M). Strypas = 25 μm

Visas dydis

V-ATPazė yra žymiai lizosominėje membranoje ir yra atsakinga už rūgštinę lizosomos aplinką. Tiesą sakant, „Baf“ dažnai naudojamas autofaginiam ir neautofaginiam lizosomų skilimui nutraukti, slopinant lizosomų V-ATPazę. 29 Norėdami nustatyti, ar reikalinga lizosomų rūgštinė ar proteolitinė aplinka AMDE-1 sukeltai NCA, mes įvertinome kitus žinomus lizosomų inhibitorius, įskaitant chlorokiną (CQ), amoniako chloridą ir proteazės inhibitorius E64d ir pepstatiną A. Mes nustatėme, kad nė vienas šių cheminių medžiagų gali slopinti AMDE-1 sukeltą NCA, remdamasi LC3-II imunoblotų rezultatais (5d pav.) ir ATG12 puncta imuniniu dažymu (5e pav.). Šie stebėjimai rodo, kad Baf, ConA ar SalA gali paveikti lizosomų V-ATPazę, tačiau lizosomų funkciniai pokyčiai gali būti ne priežastis, dėl kurios NCA gydomi AMDE-1.

Be to, buvo pranešta, kad Baf veikia kaip K + jonoforas. 30 Norėdami nustatyti, ar tarpląstelinių jonų perskirstymas daro bendrą poveikį AMDE-1 sukeltai NCA, įvertinome kelių jonoforų, įskaitant monenziną (Na + ), nigericiną (K + ), valinomiciną (K + ), poveikį, gramicidinas A (monovalentiniams katijonams), jonomicinas (Ca 2+ ) ir A23187 (Ca 2+ ). Rezultatai parodė, kad šios cheminės medžiagos neužkerta kelio AMDE-1 sukeltai LC3 lipidacijai (5f – g pav.).

Funkcinė V-ATPazė reikalinga nekanoninei LC3 lipidacijai

NCA gali sukelti įvairios cheminės medžiagos. Neseniai buvo pranešta, kad cheminės medžiagos, tokios kaip proteasomų inhibitoriai (MG132, bortezomibo ir laktacistino), amoniakas, gosipolis ir CQ, skatina LC3 lipidavimą nepriklausomu nuo ULK1 ar nuo Beclin1. 12, 31 Ar šios cheminės medžiagos turėjo bendrų savybių reguliuojant nekanoninius LC3 lipidacijos procesus, nežinoma. Mes nustatėme, kad Baf sutrikusi šių cheminių medžiagų sukelta LC3 lipidacija (6a – f pav.). Be to, buvo pranešta, kad nesočiosios riebalų rūgštys, gliukozės trūkumas ir osmosinis disbalansas sukelia NCA. 13, 14, 31. Mes nustatėme, kad Baf slopina LC3 lipidaciją FIP200KO ląstelėse, auginamose su solio oleatu, mažai gliukozės turinčioje terpėje arba hipotoninėje terpėje (6g – i pav.). Šie duomenys leido manyti, kad V-ATPazė gali būti tarpininkaujanti daugeliui skirtingų dirgiklių veikiančiam NCA mechanizmui.

Image

Baf gali slopinti daugelio veiksnių sukeltą NCA. FIP200KO-MEF, apdorotų MG132 (5 μM ) 12 h (MG, a ), bortezomibo (30 nM) 12 h (BZ, b ), laktacilistino (5 μM ) 12 h (Lac, c ), gossipolis (20 μM ) 12 h (GO, d ), amoniako chloridas (10 mM) 24 h (AC, e ), CQ (100 μM ) 6 h (CQ, f ), natrio oleatas ( 500 μM 6 h (Ole, g ), gliukozės trūkumas 24 h (NG, h ) arba hipotoninis buferis 1 h (Hypo, i ) su Baf arba be jo (0, 5 μM )

Visas dydis

V-ATPazėje teigiamas Golgi kompleksas dalyvauja LC3 lipidavime

Kadangi atrodė, kad Baf ir kiti V-ATPazės inhibitoriai neveikia lizosomos, norėdami slopinti NCA, jų poveikis NCA gali būti susijęs su kitomis ląstelių membranos skyriais, kur yra V-ATPazė. Norėdami nustatyti galimą šių skyrių indėlį į AMDE-1 sukeltą NCA, pirmiausia įvertinome, ar AMDE-1 sukeltas LC3 puncta bus kolokalizuotas su šiais subceluliariniais organeliais FIP200KO-MEF. Kaip parodyta 7a paveiksle, AMDE-1 sukeltos LC3 teigiamos struktūros nepersidengė su mitochondrijų žymekliu Tom20, lizosomų žymekliu LAMP1 ir ER žymekliu ERtracker, bet buvo sulygintos su ER į Golgi tarpinio skyriaus žymeklį ERGIC-53. Įdomu tai, kad didžioji LC3 punkto dalis buvo žymiai persidengusi su cis- Golgi matricos žymekliu GM130 ir trans- Golgi membranos žymeniu β -1, 4-galaktozililtransferaze (GALT), ir iš dalies kolokalizuoti trans- Golgi tinklo žymeniu TGN38 (7b pav. ), teigdamas, kad Golgi kompleksas gali būti pagrindinė membranos platforma AMDE-1 sukeltai LC3 lipidacijai. Laikinas per didelis V-ATPazės V0 komplekso subvieneto C, ATP6V0c, specifinio Baf ir ConA taikinio, ekspresija paskatino V-ATPazės su LC3 ir V-ATPazės su GM130 kolokalizaciją po gydymo AMDE-1 (7c paveikslas). Nuosekliai atrodo, kad lizosomų inhibitoriai, E64D / pepstatinas A (7d paveikslas) arba CQ (papildomas S5 paveikslas), neturėjo įtakos AMDE-1 sukeltos LC3 puncta pasiskirstymui Golgi komplekse. E64D / pepstatinas A nesukėlė GFP-LC3 puncta, o derinys neslopino AMDE-1 sukeltos LC3 puncta (7d paveikslas).

Image
Image

AMDE-1 sukeltas NCA apima Golgi kompleksą. ( a ) FIP200KO-MEF su GFP-LC3 arba be jo ekspresijos buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ) ir po to imuniniu dažymu LC3, Tom20, ERtracker, LAMP1 arba ERGIC-53. Taškiniai apskritimai rodo greta esančius LC3 ir ERGIC-53 signalus. ( b ir c ) FIP200KO-MEF su mCherry-GALT, GFP-ATP6V0c ir CFP-TGN38 arba be jų ekspresijos buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ), po to imuniniu dažymu LC3 arba GM130. Rodyklės rodo LC3 kolokalizaciją su GM130, GALT ir TGN38 ( b ) arba ATP6V0c su LC3 arba GM130 ( c ). ( d ir e ) FIP200KO-MEF 6 valandas buvo apdorojami AMDE-1 (10 μM ) su arba be Baf (0, 5 μM ) arba E64D (25 μM ) ir pepstatinu A (50 μM ), po to imuninis dažymas LC3 ir GM130. Rodyklės rodo LC3 kolokalizaciją su GM130 ( d ). Ląstelės taip pat buvo analizuojamos perdavimo elektronų mikroskopu ( e ). AL, autolizosoma; G, Golgi kompleksas; M, mitochondrijos. Strypas = 25 μm

Visas dydis

Palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, kuriose Golgi kompleksas dažniausiai buvo židinio vienetas, esantis šalia branduolio, gydymas AMDE-1 išsklaidė Golgi kompleksą (7b – d pav.). Elektroninė mikroskopinė analizė parodė, kad padaugėjo klasikinių autofagosomų ir autolizosomų struktūrų (papildomas S6 paveikslas) ir ypač patinęs Golgi kompleksas, kurį riboja viena membrana AMDE-1 apdorotose ląstelėse (7e paveikslas). Be to, neatrodė, kad Bafas galėtų pakeisti išskaidytą Golgi komplekso modelį (7d paveikslas) ar Golgi komplekso patinimą (7e paveikslas) AMDE-1 apdorotose ląstelėse. Taigi V-ATPazė greičiausiai nedalyvavo struktūriniame Golgi komplekso pakeitime, tačiau greičiausiai dalyvavo atskirame LC3 įdarbinimo Golgi membranose etape.

Integruotas Golgi kompleksas reikalingas AMDE-1 sukeltai LC3 lipidacijai

Gali būti, kad AMDE-1 sukelti nekanoninę LC3 lipidaciją gali prireikti integruoto Golgi komplekso. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes panaudojome du gerai žinomus Golgi toksinus - brefeldiną A (BFA) ir golgicidą A (GCA). Yra žinoma, kad abu šie vaistai slopina prekybą Golgi vezikulėmis ir suskaido Golgi kompleksą. 32 Mes nustatėme, kad BFA ir GCA ne tik susilpnino Golgi komplekso dažymo signalą (8a pav.), Bet ir panaikino AMDE-1 sukeltą LC3 puncta ir LC3-II susidarymą (8a – c paveikslai). Nuosekliai, SQSTM1, kurį įdarbino LC3 po gydymo AMDE-1 (4 paveikslas ir papildomas S4 paveikslas), nesikaupė esant BFA (8d paveikslas), kas rodo, kad Golgi kompleksas buvo svarbi AMDE-1- platforma. indukuota LC3 lipidacija ir SQSTM1 įdarbinimas.

Image

AMDE-1 sukeltą NCA gali blokuoti Golgi toksinai. ( a ) FIP200KO-MEF 6 valandas buvo apdorojami AMDE-1 (10 μM ) su BFA arba be jo (5 μg / ml), po to atliktas imuninis dažymas LC3 ir GM130. Rodyklės rodo LC3 kolokalizaciją su GM130. ( b ). FIP200KO-MEF, išreiškiantys GFP-LC3, 6 valandas buvo gydomi AMDE-1 (10 μM ) su BFA arba be jo (5 μg / ml), po to imant imuninį dažymą SQSTM1. Rodyklės rodo GFP-LC3 kolokalizaciją su SQSTM1. ( c ir d ) FIP200KO-MEF 6 valandas buvo apdorojami AMDE-1 (10 μM ) su BFA (5 μg / ml) arba be jo (6 μg / ml) arba GCA (20 μM ), po to atlikta imunoblotologinė analizė. ( e - k ) FIP200KO-MEF, apdorotų CQ (100 μM , 6 h, e ), Ole (500 μM , 6 h, f ), AC (10 mM, 24 h, g ), hipotoniniu buferiu, imunoblotų analizė. (Hipo, 1 h, h ), BZ (30 nM, 12 h, i ), MG132 (MG, 5 μM , 12 h, j ) ir GO (20 μM , 12 h, k ) su GCA arba be (20 μM ). Strypas = 25 μm

Visas dydis

Tada mes paklausėme, ar Golgi toksinas gali slopinti kitų stimulų sukeltą NCA. Iš tiesų GCA slopino LC3-II formavimąsi FIP200KO ląstelėse, kurias sukėlė CQ, natrio oleatas, AC, hipotoninis buferis ir trys proteasomų inhibitoriai (MG132, bortezomibas ir gosipolis) (8e – k paveikslai). Visi šie stebėjimai parodė, kad norint skatinti nekanoninę LC3 lipidaciją, daugeliui NCA dirgiklių reikėjo integruoto Golgi komplekso.

Diskusija

Čia mes parodėme, kad AMDE-1 galėjo sukelti NCA, nesant ULK1 komplekso ar Beclin1 / Atg14 komplekso. Buvo pranešta apie nuo Atg7 arba nuo Atg5 nepriklausomą NCA formą, kurioje LC3 lipidacija neįvyko. 9 Tačiau daugumai NCA rūšių, įskaitant LAP, vis dar reikalinga konjugacijos sistema ir jas galima aptikti atliekant LC3 lipidacijos testą. AMDE-1 sukeltai NCA reikalinga LC3 konjugacijos sistema. SQSTM1 yra adapterio molekulė, jungianti autofagosomines membranas su visur esančiais taikiniais, kad būtų lengviau skaidyti taikinius. Mūsų tyrime sukauptas LC3 sutapo su SQSTM1, tačiau nuo pastarojo nepriklausė. Dviejų molekulių kolokalizavimas rodo, kad SQSTM1 vis dar gali veikti kaip adapterio molekulė AMDE-1 sukeltoje NCA tiksliniam klirensui pasiekti.

Kanoninėje autofagijoje reikia ULK1 komplekso arba Beclin1 / Atg14 komplekso, kad būtų galima susieti kanoninius autofagijos dirgiklius, tokius kaip aminorūgščių trūkumas, PI3P generavimui ant specifinių membranų, kur vėliau gali įvykti LC3 lipidacija. NCA aktyvinimas gali būti susijęs su ULK1 komplekso apvedimu, kad būtų aktyvuota Beclin1 / Atg14, arba gali būti susijęs su LC3 lipidacijos nepriklausomumu nuo PI3P. Neseniai nustatyta, kad PI5P reguliuoja autofagiją ir palaiko NCA PI3P ardytose ląstelėse. PI3P ar PI5P generavimo svarba autofagijoje gali priklausyti nuo dirgiklių tipo ar specifinių membranų, kur vyksta LC3 lipidacija. AMDE-1 sukeltas NCA gali atsirasti nesant ULK1 komplekso ar Beclin1 / Atg14 komplekso, kas rodo, kad gali prireikti PI3P generavimo. AMDE-1 gali naudoti alternatyvius mechanizmus, kad suaktyvintų dvi į ubikvitiną panašias konjugacijos sistemas, kad inicijuotų NCA. Ši hipotezė taip pat susijusi su skirtinga ATG12 ir ATG16 puncta morfologija. Kai rapamicinas buvo dedamas į laukinio tipo ląsteles, ATG12 taškai buvo maži, bet ryškūs. Priešingai, AMDE-1 sukelti ATG12 taškai atrodė didesni, bet mažiau intensyvūs FIP200KO ląstelėse (3 paveikslas).

Kadangi NCA atspindi skirtingus procesus, membraniniai šaltiniai arba LC3 teigiamų struktūrų biogenezė gali skirtis nuo kanoninės autofagijos. Kanoninėje autofagijoje ER membrana, kurioje gauta DFCP1 teigiama omegasoma, sukelianti autofagosomas, atrodo, yra pagrindinis membranos šaltinis. Tačiau Golgi kompleksas, mitochondrijos-ER kontaktinės vietos ir endocitinės organelės iš plazmos membranų taip pat gali prisidėti prie autofagosomų biogenezės. Membranų, ant kurių vyksta LC3 lipidacija, šaltinis taip pat gali būti įvairus NCA, dėl ko gali atsirasti dvigubos arba vienos membranos pūslelės. 7

Tarp įvairių membranų struktūrų, Golgi kompleksas nusipelno ypatingo dėmesio, nes jis galėtų tarnauti kaip bendra kanoninės autofagijos ir NCA platforma. Golgi komplekso sutrikimas dėl α SNAP genetinės intervencijos sukelia Beclin1 nepriklausomą autofagiją. Nepažeistas Golgi kompleksas taip pat reikalingas nesočiųjų riebalų rūgščių sukeltai NCA. BFA sukeltas Golgi komplekso struktūros žlugimas slopina cis nesočiųjų riebiųjų rūgščių sukeltą autofagiją. BFA ir GCA taip pat panaikina AMDE-1 sukeltą NCA. Be to, AMDE-1 sukeltas LC3 puncta yra kolokalizuotas su Golgi kompleksu, bet ne su kitais subceluliariniais organeliais. AMDE-1 galėjo sukelti Golgi komplekso patinimą. Visi šie duomenys patvirtina, kad AMDE-1 gali būti nukreiptas į Golgi kompleksą, kuriame sužadinama LC3 lipidacija (9 paveikslas). Nors anksčiau buvo nustatyta, kad BFA sukelia kanoninę autofagiją laukinio tipo ląstelėse dėl ER streso, 37 mes nepastebėjome jokio LC3 lipidavimo FIP200KO ląstelėse, apdorotose BFA ar GCA (duomenys nepateikti). Taigi šie agentai sukelia skirtingą poveikį kanoninėje autofagijoje ir NCA.

Image

Darbinis AMDE-1 sukeltos kanoninės ir nekanoninės LC3 lipidacijos modelis. AMDE-1 geba sukelti tiek kanoninę autofagiją, tiek NCA. ULK1 kompleksas ir Beclin1 – Atg14 kompleksas būtini kanoniniame kelyje, bet ne nekanoniniame kelyje. Tačiau LC3 konjugacijos sistema reikalinga abiem būdais. Nors fagoforas suteikia membranos platformą LC3 lipidacijai kanoninėje autofagijoje, Golgi kompleksas greičiausiai yra membranos platforma nekanoninei LC3 lipidacijai. Pabrėžtina, kad V-ATPazė gali vaidinti svarbų vaidmenį veikdama Golgi komplekse, nors tikslus molekulinis mechanizmas dar nėra nustatytas. Taigi, V-ATPazės inhibitoriai, tokie kaip Baf, gali sukelti LC3-II kaupimąsi dėl autolizosomų skilimo blokavimo kanoninėje autofagijoje, tačiau gali sukelti LC3-II sumažėjimą dėl Golgi signalizacijos slopinimo ankstyvoje stadijoje NCA. Taigi skirtingi agentai gali paveikti kanoninius ir nekanoninius kelius, kurie moduliuoja galutinius rezultatus ląstelėms, apdorotoms dvejopo pajėgumo chemikalais, tokiais kaip AMDE-1.

Visas dydis

Lizosomos gali būti svarbi organelė, reklamuojanti NCA ir kur vyksta nekanoninė LC3 lipidacija. 13, 14, 31 Tačiau įvairios lizosomų inhibitorių grupės su skirtingais mechanizmais nepadarė įtakos AMDE-1 sukeltai nekanoninei LC3-II formacijai (5d pav.), GFP-LC3 punkcijai (7d paveikslas ir papildomas S5 paveikslas) bei Atg12 puncta formavimui. (5e pav.). Nors vien tik CQ gali sukelti NCA 13, 14, 31 (6f paveikslai ir papildomas S5 paveikslas), tai gali nerodyti, kad lizosomų funkcijos sutrikimas buvo pakankamas sukelti NCA, nes E64D / pepstatinas A negalėjo sukelti NCA (7d pav.). Pažymėtina, kad CQ (papildomas S5 pav.) Arba E64D / pepstatinas A (7d paveikslas) negalėjo slopinti AMDE-1 sukeltos LC3 puncta ir jų kolokazės su Golgi kompleksu. Priešingai, atrodė, kad CQ sukeltas nekanoninis LC3 puncta yra kolokalizuotas su Golgi žymekliu (papildomas paveikslas S5). Apskritai, nors negalima atmesti lizosomų ir kitų membranų dalyvavimo AMDE-1 sukeltoje NCA, dabartiniai mūsų duomenys bent rodo, kad vien lizosomų funkcijos slopinimo gali nepakakti AMDE-1 sukeltos NCA slopinimui, tuo tarpu Golgi Kompleksas galėtų būti bendra nekanoninio LC3 lipidavimo platforma įvairiomis sąlygomis.

Ankstesniame tyrime buvo pranešta apie V-ATPazės dalyvavimą NCA. 13, 14, 31 Čia mes pranešame, kad trys skirtingi V-ATPazės inhibitoriai, Baf, ConA ir SalA, slopina AMDE-1 sukeltą NCA ir keletą kitų agentų, kurie, kaip nebuvo žinoma, priklausys nuo V-ATPazės jų NCA aktyvumui . Mes taip pat nustatėme, kad nors V-ATPazė yra skirtinguose endosominiuose skyriuose, 38 slopinimas greičiausiai nėra susijęs su lizosomos disfunkcija ar tarpląstelinių jonų perskirstymu, nes chemikalai, tiesiogiai trikdantys šias funkcijas, neturi jokio poveikio AMDE-1 sukeltai NCA. (5 pav., 7d pav. Ir papildomas S5 paveikslas). Vietoj to, mūsų tyrimai rodo, kad slopinantis Baf poveikis greičiausiai susijęs su Golgi esančioje V-ATPazėje, atsižvelgiant į Golgi komplekso dalyvavimą ankstyvoje AMDE-1 sukeltos NCA stadijoje. Taigi, AMDE-1 gali veikti Golgi kompleksą, kuris tada įjungia V-ATPazę, kad suaktyvintų LC3 konjugacijos sistemą, ir dėl to LC3 lipiduotųsi ant Golgi membranų (9 paveikslas).

Yra nedaug žinomų NCA inhibitorių. V-ATPazės inhibitorių identifikavimas kaip NCA inhibitoriai įvairių dirgiklių grupei galėtų palengvinti mechanizmo supratimą. Reikia pabrėžti, kad V-ATPazės inhibitoriai, tokie kaip Baf, gali slopinti tiek kanoninę autofagiją vėlyvoje stadijoje, tiek NCA ankstyvoje stadijoje. Tačiau LC3-II ir LC3 puncta nustatymui poveikis yra skirtingas. Nors NCA mažina LC3-II ir LC3 puncta, šie inhibitoriai, tokie kaip tradiciniai lizosomų inhibitoriai, sukelia LC3-II ir LC3 puncta kaupimąsi, nes blokuoja lizosomų skilimą. 1, 39 Taigi V-ATPazės inhibitoriai gali būti svarbūs skirstant signalizacijos mechanizmus per arba apeinant raktų „Atgs“ dirgiklius, tokius kaip AMDE-1, kurie tose pačiose ląstelėse gali sukelti tiek kanoninę autofagiją, tiek NCA. Šiems dirgikliams reikės slopinti abu būdus, kad būtų visiškai slopinama LC3 lipidacija (4 ir 9 pav.).

Apibendrinant, mes apibrėžėme naują AMDE-1 poveikį NCA, nesant ULK1 komplekso ar Beclin1 komplekso. AMDE-1 suaktyvinta NCA reikalauja veikiančios V-ATPazės ir integruoto „Golgi“ komplekso. Atrodo, kad tai yra įprastas daugelio skirtingų NCA dirgiklių mechanizmas. Mūsų išvados gali suteikti svarbios informacijos apie NCA membranos šaltinį ir jo inicijavimo mechanizmą.

Medžiagos ir metodai

Cheminės medžiagos ir antikūnai

AMDE-1 buvo įsigytas iš „Key Organics“ (Bedfordas, MA, JAV). A23187, amoniako chloridas, BFA, CQ, ConA, 3-MA, gramicidinas, monenzinas, valinomicinas, nigericinas ir HgCl2 buvo iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV). „Baf“, bortezomibo ir WM buvo iš „LC Laboratories“ (Woburn, MA, JAV). Rapamicinas, E64D ir pepstatinas A buvo iš „AG Scientific“ (San Diegas, CA, JAV). MG132, GCA buvo iš Selleckchem (Hiustonas, TX, JAV). Natrio oleatas buvo iš Sangono (Šanchajus, Kinija). Laktacistinas buvo iš Kaimanų (Ann Arbor, MI, JAV). Gossipolis buvo iš Meilunbio (Dalianas, Kinija). „Lipofectamine 2000“ buvo iš „Invitrogen“ (Carlsbad, CA, JAV). „SalA“ buvo Dr. De Brabanderio (UT Southwestern, Dalasas, TX, JAV) dovana. Žmogaus SQSTM1 / p62 (5′-GCATTGAAGTTGATATCGATTT-3 ′) siRNR ir iššifruota kontrolė (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ′) buvo gautos iš Ruibo (Guangdžou, Kinija).

Antikūnai su „ERGIC-53“ (Nr. Sc-398777), GFP (Nr. Sc-9996) ir „Tom20“ (Nr. Sc-11415) buvo iš Santa Kruso (Santa Krusas, Kalifornija, JAV); antikūnai prieš β- aktiną (Nr. 3700), ATG3 (Nr. 3415), ATG12 (Nr. 2011S), ATG7 (Nr. 8558), kalnezininas (Nr. 2679) buvo iš ląstelių signalizacijos technologijos (Danvers, MA, JAV). ; antikūnai prieš SQSTM1 (Nr. PM045), MAP1LC3B (Nr. PM036), ATG4B (Nr. M134) ir ATG16L1 (Nr. M150) buvo iš MBL International (Woburn, MA, JAV); antikūnai prieš ATG5 (Nr. A0731), LC3B (Nr. L7543), α -tubulinas (Nr. T6074) buvo iš Sigma (Sent Luisas, MO, JAV); antikūnas prieš WIPI2 (nr. ab105459) buvo iš „Abcam“ (Kembridžas, JK); antikūnas prieš GM130 (Nr. BD-610822) buvo iš „BD Bioscience“ (San Chosė, CA, JAV); antikūnas prieš TGN46 (Nr. AHP500GT) buvo iš „AbDSerotec“ (Oksfordas, JK). Antriniai antikūnai, konjuguoti su „Alexa Fluor-488“, „Alexa Fluor-594“ arba krienų peroksidaze (Nr. 7074), buvo gauti atitinkamai iš „Invitrogen“ ir „Cell Signaling Technology“.

Ląstelių kultūra ir transfekcija

Laukinio tipo ir ATG5- ATG3-, ATG7-, ATG4b-, ULK1-, FIP200-deficito MEF, A549, U251 ir Beclin1 KD U251 ląstelės buvo aprašytos anksčiau. 40, 41 ląstelės buvo kultivuojamos 37 ° C temperatūroje drėgno oro atmosferoje su 5% (v / v) CO 2 . DMEM su arba be gliukozės („Thermo Scientific“, Rokfordas, IL, JAV) buvo papildytas 10% (v / v) galvijų vaisiaus serumo (Gibico, Grand Island, NY), JAV ir kitais standartiniais papildais. Kaip badavimo terpė buvo naudojama EBSS (Thermo Scientific) be serumo ir kitų papildų. Hipotoninis buferis buvo paruoštas praskiedžiant DMEM vandeniu (vanduo / DMEM: 3: 1).

Norėdami gauti trumpalaikę ekspresiją, ląstelės buvo kultivuojamos 24 šulinėlių plokštelėse ir buvo transfekuotos DNR konstruktais naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ir išanalizuotos po 24–48 val. KD genui siRNR (120 nM) buvo transfekuota į 1 × 106 ląsteles, naudojant oligofektaminą (Invitrogen) 48–72 valandas prieš analizę.

Imunoblotų tyrimai

Ląstelių lizatai buvo paruošti RIPA buferiu su proteazės ir fosfatazės inhibitoriaus kokteiliu („Thermo Scientific“). Dvidešimt iki trisdešimt mikrogramų bendro baltymo buvo atskirtas SDS-PAGE ir perkeltas į PVDF membranas (Millipore, Billerica, MA, JAV). Specifiniai baltymai buvo aptikti naudojant specifinius pirminius antikūnus ir krienų peroksidaze konjuguotus antrinius antikūnus kartu su sustiprintu chemiliuminescenciją kuriančiu agentu (Millipore). Vaizdai buvo skaitmeniniu būdu įgyti naudojant „Kodak Image Station 4000“ („Carestream Health Inc.“, Ročesteris, NY, JAV) arba „ImageQuant LAS 4000mini“ (GE, Upsala, Švedija) ir papildomąja programine įranga. LC3-II tankis pirmiausia buvo normalizuotas pagal įkrovos kontrolę - tubuliną. Tada LC3-II / tubulino santykis paverčiamas skaičiais, lyginant su kontroliniu gydymu.

Imunofluorescencinis dažymas

Ląstelės buvo auginamos ant 3 cm Petri lėkštelės ir 15 min buvo fiksuotos 4% paraformaldehide. Ląstelės buvo du kartus plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS), permeabilizuotos 0, 1% Triton X-100 15 minučių, po to dar kartą plaunamos PBS ir blokuojamos PBS, turinčioje 5% galvijų serumo albumino (BSA), 1 valandą. Pirminiai ir antriniai antikūnai PBS, kurių sudėtyje yra 5% BSA, buvo dedami per naktį atitinkamai 4 ° C ir 1 valandą kambario temperatūroje. Branduoliai buvo aprūpinti 1 μg / ml Hoechst 33342. Fluorescenciniai vaizdai buvo paimti naudojant Nikon Eclipse TE200 epifluorescencinį mikroskopą su NIS-Elements AR3.2 programine įranga arba EVOS FL Auto (Life Technologies, Bothell, WA, JAV). Norėdami rankiniu būdu įvertinti punkto susidarymą, buvo išanalizuoti bent trys optiniai laukai su ne mažiau kaip 50 ląstelių kiekvienoje eksperimento sąlygoje. Pakartotinių eksperimentų duomenys buvo statistiškai analizuojami.

Elektronų mikroskopija

Elektronų mikroskopija buvo atlikta, kaip aprašyta. 42 Trumpai tariant, ląstelės 6 šulinėlių plokštelėse 2 valandas buvo fiksuotos 2, 5% gliutaraldehide (Sigma) 0, 1 M fosfato buferyje (pH 7, 4), po to dehidratuojamos rūšiuotoje etanolio serijoje ir įterpiamos. Itin plonos sekcijos buvo sumontuotos ant varinių grotelių. Mėginiai buvo nudažyti ir vizualizuoti naudojant 120 kV Jeol elektronų mikroskopą (JEM-1400, Peabody, WA, JAV) esant 80 kV įtampai. Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant „Gatan-832“ skaitmeninę kamerą (Pleasanton, CA, JAV).

Statistika

All experiments were performed at least in triplicate and data are presented as mean±SD The statistical significance of data was verified by the Student's t -test wherever required. P -value <0.05 was considered as being significant.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

Žodynas

Atgs

autophagy genes

ATGs

autophagy proteins

Baf

bafilomycin A 1

BFA

brefeldinas A

ConA

concanamycin A

CQ

chloroquine

DFCP1

double FYVE-containing protein 1

GCA

golgicide A

LAP

LC3-associated phagocytosis

3-MA

3-methyladenine

NCA

noncanonical autophagy

PBS

fosfatiniu buferiniu tirpalu

PI3KC3

class III phosphatidylinositol-3 kinase

SalA

salicylihalamide A

ULK1

unc-51-like kinase 1

WIPI2

phosphoinositide-interacting protein 2 with WD repeat domain

WM

wortmannin

Papildoma informacija pridedama prie šio pranešimo ląstelių mirties ir ligų svetainėje (//www.nature.com/cddis)