Grk5 trūkumas lemia selektyvų bazinių priekinių smegenų cholinerginį neuronų pažeidžiamumą mokslinės ataskaitos

Grk5 trūkumas lemia selektyvų bazinių priekinių smegenų cholinerginį neuronų pažeidžiamumą mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Demencija
  • Eksperimentiniai ligos modeliai

Anotacija

Kodėl tam tikros ligos pirmiausia veikia vieną, o ne kitą specifinį potipį, yra galvosūkis, kurio sprendimas grindžiamas specifinių gydymo būdų kūrimu. Atrankinė bazinio smegenų cholinerginio (BFC) neurodegeneracija dalyvauja kognityviniuose sutrikimuose sergant Alzheimerio liga (AD), tačiau pagrindinis mechanizmas išlieka sunkus. Čia pateikiame pirmąjį atrankinio BFC neuronų netekimo, būdingo žmogaus AD, pakartojimą kartu su pelių modeliu, vadinamu GAP. Mes sukūrėme GAP peles sukryžiuodami Tg2576 peles, kurios per daug ekspresuoja Švedijos mutantų β-amiloido pirmtako baltymo geną su G baltymu sujungto receptoriaus kinazės-5 (GRK5) nokauto pelėmis. Ši pelė, turinti du kartus trūkumus, parodė reikšmingą BFC neuronų netekimą 18 mėnesių amžiaus, o tai nebuvo pastebėta nei vienoje iš trūkumų turinčioje tėvo padermėje, nei laukiniame tipe. Kartu su kitais patvirtinamaisiais įrodymais mes siūlome, kad GRK5 trūkumas pasirinktinai padidintų BFC neuronų pažeidžiamumą degeneracijos atžvilgiu.

Įvadas

Kognityvinis sutrikimas sergant Alzheimerio liga (AD) ir kitais susijusiais sutrikimais yra didelis visuomenės sveikatos iššūkis dėl didelio jo paplitimo ir neproporcingai didelių priežiūros išlaidų bei dėl ligą modifikuojančių gydymo būdų trūkumo 1 . Milžiniškos AD tyrėjų pastangos žymiai pagerino supratimą apie šią ligą; tačiau konkretus neuronų pogrupis, atsakingas už laipsnišką atminties praradimą AD, išlieka neaiškus.

Tarp daugelio hipotezių, susijusių su AD patogeneze, cholinerginė hipotezė yra vienintelė hipotezė, siejanti atminties praradimą su tam tikru neuronų pogrupiu, nors ji, kaip ir visos kitos hipotezės, susiduria su iššūkiais. Cholinerginė hipotezė susintetino biocheminius, elektrofiziologinius ir farmakologinius įrodymus, sukauptus per dešimtmetį, ir paskelbė ryšį tarp reikšmingų cholinerginių disfunkcijų ir atminties praradimo pagyvenusioje ir dementuojamoje centrinėje nervų sistemoje 2 .

Vienas iš cholinerginės hipotezės iššūkių yra tas, kodėl bazinių priekinių smegenų cholinerginiai (BFC) neuronai yra labiau pažeidžiami nei kiti neuronai. Buvo pasiūlyta daugybė paaiškinimų, įskaitant skirtingą intra-BFC (priešingai nei ne cholinerginiams) neurofibrilinių paakių, β-amiloido (Aβ) protofibrilių, neuronų azoto oksido sintazės, kalcio disfunkcijos ir nervų augimo faktoriaus signalizacijos defektų lygius 3, 4, 5, 6, 7 . Be intriguojančių įrodymų, pagrindžiančių kiekvieną paaiškinimą, visi šie tyrimai turi keletą svarbių apribojimų. Pavyzdžiui, nė vienas iš šių tyrimų neįrodė, ar šie diferencijuoti degeneraciniai BFC neuronų pokyčiai yra BFC neurodegeneracijos priežastis ar pasekmė, taip pat nė vienas iš jų nebuvo pakartotas gyvūnų modelyje in vivo .

Šiuo atžvilgiu mūsų pastangos iš pradžių nebuvo nukreiptos į BFC neuronų pažeidžiamumo paaiškinimą. Bandydami suprasti, kodėl Aβ apdorotos ląstelės tampa hiperaktyvios, mes nustatėme G baltymų sujungtų receptorių kinazių (GRK) disfunkciją AD, įskaitant GRK5 trūkumą 8 . Vėliau atlikus GRK5 išmušimo (GRK5KO) modelių tyrimus, paaiškėjo, kad GRK5 trūkumas pagreitina AD patogenezę 9, 10, 11 . Tačiau atitinkamais mechanistiniais tyrimais nepavyko nustatyti jokio GRK5 trūkumo poveikio kai kurių įtariamų su G baltymu sujungtų receptorių (GPCR) funkcijai in vivo 12, išskyrus muskarininius cholinerginius receptorius, apie kuriuos iš pradžių pranešta 1999 m. 13 . Pastariesiems mes dar labiau susiaurinome paveiktus receptorius iki slopinamųjų G i sujungtų M2 / M4 receptorių 14 . Atsižvelgdami į unikalų ryšį tarp AD, GRK5 trūkumo ir cholinerginės disfunkcijos, atlikome nešališką BFC neuronų kiekybinį nustatymą GRK5 deficito turinčiose Švedijos β-amiloido pirmtako baltymo (APP) transgeninėse (Tg2576) pelėse, kurias GAP pelėmis pavadinome 10, 11., 12 . Mūsų rezultatai buvo labai nuoseklūs ir leido manyti, kad GRK5 trūkumas lemia selektyvų BFC neuronų pažeidžiamumą.

Rezultatai

BFC neuronų netekimas pagyvenusioms GAP pelėms

Norėdami kiekybiškai ištirti BFC neuronų nuostolius, taikėme du lygiagrečius metodus. Pirma, mes panaudojome dvigubą imunofluorescencinį (IF) dažymą prieš cholino acetiltransferazę (ChAT) ir aktyviąją kaspazę-3 (AC3), kad sistemiškai nustatytume, ar GAP pelių bazinėse priekinėse smegenyse yra daugiau AC3 + / ChAT + dvigubai teigiamų neuronų. Mes nustatėme, kad visi keturi laukinio tipo (WT, G + / + A - / - ) kamienai, GRK5KO (KO, G +/− A - / - ), APP (G + / + A +/− ) ir GAP (G +/− A +/− ), buvo rodomi AC3 + / ChAT + dvigubai teigiami neuronai, nors 18 mėnesių amžiaus GAP pelių moterų skaičius buvo 7–10 kartų didesnis nei moterų, sergančių WT, moterų, KO arba APP pelės (1A – D, M pav.). Norėdami patvirtinti šią išvadą, panaudojome nešališką stereologijos metodą ir kiekybiškai įvertinome cholinerginį (ChAT + / NeuN + ) ir necholinerginį (ChAT - / NeuN + ) neuronų skaičių šių pelių bazinėse priekinėse vietose. Mes nustatėme, kad, palyginti su WT pelėmis, GAP pelės prarado 44, 5% savo BFC neuronų, tuo tarpu WT, KO ir APP pelių cholinerginių neuronų skaičius reikšmingai nesiskyrė (1 pav. E – H, N). Be to, necholinerginių (NeuN + / ChAT - ) neuronų skaičius bazinėse priekinėse smegenyse nė vienam iš keturių kamienų reikšmingai nesiskyrė (1I – L, P pav.). Pakitęs cholinerginių, bet ne necholinerginių, neuronų skaičius GAP pelėse aiškiai rodo, kad šis neuronų praradimas selektyviai ribojamas cholinerginiais neuronais. Pažymėtina, kad reikšmingas BFC neuronų sumažėjimas GAP pelėse buvo pastebėtas tik 18 mėnesių patelėms GAP pelėms. Kai tie patys eksperimentai buvo atlikti su 12 mėnesių amžiaus pelių moterimis, reikšmingų BFC neuronų nuostolių nepastebėta nei GAP pelėms, nei bet kuriai kitai padermei (1 pav. O). Kartu atlikus šiuos kiekybinius tyrimus buvo nustatytas reikšmingas BFC neuronų netekimas pagyvenusioms GAP pelių patelėms, bet ne lygioms patelėms GRK5KO ar APP pelėms.

Image

GAP pelės buvo sužalotos 12 arba 18 mėnesių amžiaus, kaip nurodyta, ir smegenys buvo surinktos ir įterptos į daugelio smegenų blokus, naudojantis „NeuroScience Associates“ paslaugomis, kaip aprašyta anksčiau 9 . Kriosekcijos buvo nudažytos nurodytais antikūnais. ChAT = žalia ( A - D ) arba ruda ( E - H ); AC3 = raudona; DAPI = mėlyna. Plokštėse ( A - D ) pateikiami AC3 + / ChAT + neuronų (rodyklių) pavyzdžiai vertikalioje Brokos (VDB) įstrižainės juostos galūnėje 18 mėnesių amžiaus WT ( n = 5), KO ( n = 4)., APP ( n = 6) ir GAP ( n = 6) pelėms. Mažas rėmas kiekviename skydelyje ( A - D ) yra padidintas atitinkamame įdėkle. Apoptozinių BFC neuronų (( M ), išreikštų kiekiu, kaip aprašyta anksčiau, 54 ) reikšmingai padidėjo pelių GAP, bet ne KO ar APP pelių. ** p <0, 01 ir *** p <0, 001, palyginti su nurodytomis grupėmis. Plokštėse ( E - H ) pateikiami reprezentatyvūs ChAT + neuronų atvaizdai esant mažam padidinimui (10x) medialinio pertvaros (MS) / VDB regionuose, kurių amžius yra 18 mėnesių WT ( n = 6), KO ( n = 6)., APP ( n = 6) ir GAP ( n = 6) pelėms. Skydelyje ( N ) pateikiami visų ChAT + neuronų stereologiniai duomenys visame baziniame priekiniame smegenyse, kurie parodo reikšmingą bendro BFC neuronų skaičiaus sumažėjimą GAP pelėse (55, 5% WT, *** p = 0, 0007, palyginti su WT)., ** p = 0, 006, palyginti su APP, ir * p = 0, 011, palyginti su KO), bet ne KO ar APP pelėse. Plokštėse ( I - L ) pateikiami dvigubo NeuN (raudonos) / ChAT (rudos) dažymo pavyzdžiai NBM 18 mėnesių WT ( n = 5), KO ( n = 4), APP ( n = 5) NBM. ir GAP ( n = 4) pelės. Stereologiškai apskaičiuojant ChAT - / NeuN + necholinerginius neuronus (skydelis ( P )), nenustatyta skirtumų tarp šių pelių NBM, nonCPu ar CPU subregionuose. ( O ) skydelyje parodytas visų ChAT + neuronų stereologinis skaičiavimas visame baziniame 12 mėnesių amžiaus WT ( n = 6), KO ( n = 7), APP ( n = 7) ir GAP ( n = 7) pelės, kurios neparodė jokio reikšmingo skirtumo tarp grupių.

Visas dydis

Perdėta BFC aksonopatija GAP pelėms

Be BFC neuronų netekimo, mes taip pat įvertinome cholinerginių aksonų patinimų (CAS) ir cholinerginių skaidulų tankio (CFD) pokyčius šiems gyvūnams. 18 mėnesių pelėms, turinčioms reikšmingą BFC neuronų netekimą, GRK5KO, APP ir GAP grupėse reikšmingai sumažėjo CFD ir padidėjo CAS, nors GAP pelės parodė didžiausius pokyčius (2A – E pav., G – I). Be to, nors 12 mėnesių amžiaus moterų nepastebėjome reikšmingų BFC neuronų nuostolių, CFD reikšmingai sumažėjo daugelyje hipokampo subregionų ir GAP pelių priekinės žievės 2–3 sluoksniuose (2 pav. F). Kiek mažiau, 12 mėnesių APP pelėms taip pat pastebimas reikšmingas CFD sumažėjimas hipokampinės CA1 srities stratum orientacijose ir priekinės žievės 2–3 sluoksniuose, tuo tarpu 12 mėnesių GRK5KO pelėms buvo reikšmingas CFD sumažėjimas tik hipokampo CA1 regiono pakopose. Mes dar nepastebėjome jokio reikšmingo CFD sumažėjimo jaunesniems nei 12 mėnesių gyvūnams. Tačiau reikšmingas CAS padidėjimas Meynert (NBM) branduolio bazalyje buvo nustatytas keturių mėnesių amžiaus APP ir GAP pelėms, nors 4 mėnesių amžiaus GRK5KO neparodė jokio CAS pokyčio (2 pav. J). Be to, CAS padidėjimas GAP pelėms buvo daug didesnis nei APP pelėms. Todėl, atsižvelgiant į BFC neuronų netekimą, GAP pelėms pasireiškė žymiai sunkesnė ir ankstesnė cholinerginė aksonopatija nei pirminėms padermėms. Taip pat buvo nustatyta statistiškai reikšminga (p <0, 01) sąveika tiek su CAS, tiek su CFD, kurie rodo, kad GRK5 trūkumas sinergiškai sąveikauja su Švedijos mutantu APP GAP pelėse ir skatina BFC neurodegeneraciją.

Image

CFD ir CAS GAP pelėse buvo kiekybiškai įvertinti sistemingai arba stereologiškai, kaip nurodyta. Skydeliai ( A - D ) rodo tipiškus ChAT + pluoštus hipokampo srities CA3 sluoksnių orientacijose atitinkamai 18 mėnesių amžiaus WT, KO, APP ir GAP pelėms. ( E ) skydelyje pateikiami sistemingi CFD kiekybinio įvertinimo rezultatai hipokampos srities CA3 sluoksnio kryptyse 18 mėnesių amžiaus pelėms. F skiltyje pateikiami sistemingi CFD kiekybinio įvertinimo rezultatai subregionuose, kaip nurodyta 12 mėnesių amžiaus pelėms. Ct L2-3 = priekinis žievės sluoksnis II-III; CA1 arba = hipokampinio CA1 sluoksnio kryptys; DG Gran = dentuotas gyrus granuliuotas sluoksnis. Skydeliai ( G, H ) pateikia normalių cholinerginių aksonų variacijos ar išsiplėtimo (skersmuo 3 μm, smailios strėlės) pavyzdžius atitinkamai WT ir GAP pelėms. Mastelio juostos plokštėse ( G, H ) yra 10 μm. ( I ) skydelyje pateikiami sistemingi kiekybiniai CAS atvejai 18 mėnesių amžiaus mėginio CA3 srityje. Skydelyje ( J ) pateikiami stereotipiniai CAS atvejų rezultatai 4 mėnesių amžiaus pelių NBM. * p <0, 05, ** p <0, 01 ir *** p <0, 001 nurodytais palyginimais.

Visas dydis

Ankstesnis GAP pelių pažinimo sutrikimas

Elgesio lygmeniu tiek GAP, tiek APP pelėms buvo kognityvinis sutrikimas 12 ir 18 mėnesių amžiaus, nenustatomas skirtumas tarp padermių, tuo tarpu heterozigotinėms GRK5KO pelėms kognityviniai sutrikimai nebuvo būdingi nei viename, nei kitame amžiuje. Tačiau 7 mėnesių amžiaus GAP pelėms buvo nustatytas kognityvinis sutrikimas atliekant Y-labirinto kaitaliojimo testą ir atliekant Morrio vandens labirinto (MWM) užduotį, tuo tarpu nė vienas iš tėvų kamienų šiame amžiuje nepasižymėjo pažinimo sutrikimais (3 pav.). Be to, radialinio rankos vandens labirinto užduotis taip pat parodė GAP pelių pažintinio nuosmukio tendenciją, nors ji nebuvo statistiškai reikšminga, nes WT grupė turėjo gana didelį standartinį nuokrypį (neparodyta). Verta paminėti, kad atliekant plaukimo patikrinimo užduotį dvi GAP pelės nebuvo įtrauktos į elgesio užduotis, nes šios dvi pelės judėjo toliau, o ne maudėsi vandenyje. Be to, nė vienai iš šių pelių nebuvo nustatyta sensomotorinės disfunkcijos. Apibendrinant, elgesio vertinimai atskleidė, kad GAP pelėms yra pažinimo sutrikimas anksčiau nei APP pelėms, o tai sutinka su patologiniais stebėjimais. Nepaisant to, reikšminga cholinerginė aksonopatija su CAS gali atsirasti dar ilgai, kol nebus nustatytas kognityvinis sutrikimas.

Image

Šešių mėnesių patelė WT ( n = 14), KO ( n = 16), APP ( n = 14) ir GAP ( n = 10, ši grupė prasidėjo nuo 12 pelių, su dviem pelėmis, neįtrauktomis į plaukimo atranką Pelės buvo elgesio įvertintos atliekant daugybę užduočių, kaip išsamiai aprašyta metoduose. KO ir APP pelių elgesio trūkumų nenustatyta, tačiau nustatyta, kad šiame amžiuje (7 mėn., Kai buvo atliktos pažinimo užduotys) GAP pelėms buvo kognityvinis sutrikimas, kaip parodė Y labirinto pakaitos ( A ) ir MWM ( B ) užduotys. ** p <0, 01 ir *** p <0, 001, kaip parodyta skydelyje ( A ), ir * p <0, 05, palyginti su WT pelėmis skydelyje ( B ).

Visas dydis

Pažymėtina, kad vien GRK5 nepakankamumas sukelia lengvą pažinimo sutrikimą homozigotinėms pelėms po 18 mėnesių 9, bet ne heterozigotinėms pelėms to paties amžiaus 12 metų . Tačiau net jei GRK5 trūkumo stiprumas nėra pakankamas, kad sukeltų pažinimo sutrikimus, pakanka, kad gyvūnai būtų labiau pažeidžiami pažinimo sutrikimų dėl papildomų įžeidimų, pavyzdžiui, dėl per daug išreikšto švedų APP GAP pelėse. Šiuo tikslu mūsų tyrimai taip pat atskleidė, kad GRK5 trūkumo pakanka, kad gyvūnai būtų jautresni protarpiniam hipoksijos sukeltam pažinimo sutrikimui 15 . Todėl šie patologiniai ir elgesio duomenys kartu leidžia manyti, kad GRK5 trūkumas palengvina pažintinį ir BFC neuronų pažeidžiamumą.

Supresuota neuronų gynyba ir cAMP signalizavimas GRK5 turinčiose HT22 ląstelėse

Norėdami suprasti, kaip GRK5 trūkumas lemia cholinerginį neuronų pažeidžiamumą, panaudojome anksčiau sukurtą in vitro GRK5 trūkumo modelį. HT22 ląstelės yra įamžintos pelių hipokampo neuronų ląstelės 16, kurios ekspresuoja ChAT, išskiria acetilcholiną (ACh) ir pasižymi cholinerginėmis neuronų savybėmis po diferenciacijos 14, 17 . Norėdami sukurti GRK5 deficito cholinerginį neuronų modelį, mes stabiliai kartu išreiškėme dominuojančio neigiamo GRK5 ir humanizuoto žalios fluorescencijos baltymo (GFP) sintezės konstrukciją (dnGRK5GFP) ir žmogaus muskarininio receptoriaus-2 (M2) HT22 ląstelėse, kad nustatytume dnGRK5GFP / M2. / HT22 ir kontroliuoja GFP / M2 / HT22 ląstelių linijas. Stebint GRK5 turinčius HT22 cholinerginius neuronus, paaiškėjo, kad jie padidino jautrumą savaiminei degeneracijai (4 pav. A) ir Aβ toksiškumui (4 pav. B). Be to, padidėjęs GRK5 turinčių HT22 neuronų pažeidžiamumas buvo reikšmingai ištaisytas tiesiogiai gydant ląsteles cAMP (dibutiril-cAMP) pralaidžiu analogu ląstelėms arba selektyviais fosfodiesterazės 4 (PDE4) inhibitoriais (rolipramu ir roflumilastu). Priešingai, reikšmingos sąveikos tarp GRK5 trūkumo ir gydymo selektyviu PDE7 inhibitoriumi BRL-50481, PTEN (fosfatazės ir tenzino homologo) inhibitoriumi SF1670, mTOR (rapamicino taikinys žinduoliams) aktyvatoriaus MHY1485 ar neuroprotekcinio peptido nebuvo nustatyta. STAT3 (signalo keitiklis ir 3 transkripcijos aktyvatorius) aktyvatorius kolivelinas, nors SF1670 ir MHY1485 šiek tiek padidino ląstelių gyvybingumą tiek GRK5 turinčioms, tiek kontrolinėms HT22 ląstelėms (4 pav. C). Todėl šie rezultatai aiškiai rodo, kad slopinamas cAMP signalizavimas gali būti tarpininkavimas dėl padidėjusio pažeidžiamumo, susijusio su GRK5 trūkumu.

Image

HT22 ląstelės, stabiliai ekspresuojančios dnGRK5GFP / M2 (DN) ir GFP / M2 (GFP), 48 valandas buvo dedamos į diferenciacijos terpę. ( A ) Ląstelės buvo kultivuojamos be jokio gydymo ar vidutinio atnaujinimo, norint įvertinti spontanišką degeneraciją. Ląstelės buvo periodiškai fotografuojamos (15 atsitiktinių laukų / duobutėje arba mažiausiai 300 ląstelių / duobutėje), kad būtų galima apskaičiuoti ląstelių apvalinimo greitį. * p <0, 05 ir ** p <0, 001, palyginti su GFP. ( B ) Ląstelės 24 valandas buvo veikiamos padidintos šviežiai ištirpinto rekombinantinio žmogaus Aβ 1–42 koncentracijos (100–800 nM), kad būtų galima įvertinti neurotoksiškumą, išskiriant LDH. Citotoksiškumas išreiškiamas kaip LDH išsiskyrimo procentas, palyginti su LDH iš terpės ir GFP kontroliuojančių ląstelių lizato sumos. * p <0, 05 ir ** p <0, 01, priklausomai nuo dozės, nurodytuose ląstelėse, kaip parodyta atliekant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA). Daugybinė variacijos analizė (MANOVA) atskleidė reikšmingą (p <0, 05) sąveiką tarp DN ir Aβ. ( C ) Ląstelės buvo auginamos nurodytais vaistais dar 48 valandas, kad būtų galima nustatyti, ar kuris nors iš gydymo būdų užkerta kelią spontaniniam GRK5 turinčių HT22 neuronų degeneracijai. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant MTS testą. Apdorojimo būdai buvo DcAMP (dibutiril-cAMP, 250 μM), Rol (ritipramas, 5 μM), Rof (roflumilast, 5 μM), BRL (BRL-50481, 20 μM), SF (SF1670, 10 μM), MHY (MHY1485, 5 μM) ir Col (kolivelinas, 1 pM). ** p <0, 01 sąveikos tarp DN ir nurodyto gydymo metu, analizuojant atskirais dvipusiais ANOVA.

Visas dydis

Norėdami patvirtinti, kad cAMP signalizacijos kelias iš tikrųjų yra slopinamas, mes tiesiogiai išmatuojome cAMP lygio pokyčius dnGRK5GFP / M2 / HT22 ląstelėse. Mes nustatėme, kad forskolino sukelta cAMP gamyba GFP / M2 kontrolinėse HT22 ląstelėse buvo slopinama tik keletą minučių po stimuliacijos M2 agonistu arecaidino propargilo esteriu (APE); tačiau šis cAMP gamybos slopinimas išliko daug ilgesnį laiką (valandas) GRK5 turinčiose HT22 ląstelėse (5A pav.). Atitinkamai mažindami cAMP, mes taip pat stebėjome fosforilinto cAMP atsako elementą rišančio baltymo (pCREB) ir bendro CREB (tCREB) lygio sumažėjimą GRK5 turinčiuose HT22 neuronuose (5 pav. B). Šie rezultatai visiškai atitinka neurotoksiškumo duomenis ir leidžia manyti, kad nuolatinis cAMP signalo slopinimas GRK5 turinčiuose HT22 cholinerginiuose neuronuose sukelia sutrikusią ląstelių apsaugą ir padidina neuronų pažeidžiamumą.

Image

( A ) dnGRK5GFP / M2 / HT22 (DN) ir GFP / M2 / HT22 (GFP) ląstelės buvo iš anksto apdorotos M2 agonistu APE (250 μM) nurodytą laiką, prieš tai veikiant 10 μM forskolino dar 10 min. . cAMP lygis buvo matuojamas naudojant „CatchPoint“ fluorescencinį cAMP tyrimo rinkinį. CAMP sumažėjimas, apskaičiuotas procentais nuo ne APE apdorotų kontrolinių medžiagų lygio procentais, nubraižomas taip, kaip parodyta. * p <0, 01 ir ** p <0, 001, palyginti su GFP kontrole. ( B ) Ląstelių lizatai buvo analizuojami lygiagrečiai pCREB ir tCREB lygiams atliekant Western blot analizę, o pCREB santykiai taip pat buvo nubraižyti ( n = 3) žemiau kiekvienos grupės, kaip nurodyta.

Visas dydis

Diskusija

Atminties trūkumas 2015 m. Paveikė 46, 8 mln. Žmonių visame pasaulyje. BFC projekcija į limbinę sistemą yra labai svarbi atminties funkcijai 18, 19 . Atmintinė BFC neurodegeneracija kritiškai veikia atminties trūkumą. Vienas svarbus klausimas yra tas, kuris labiau linkęs į atminties trūkumą? Mūsų tyrimo rezultatai rodo, kad GRK5 deficito subjektai yra jautresni, nes jų BFC neuronai yra pažeidžiami degeneracijos.

Neuronai natūraliai aprūpinti vidiniais gynybos mechanizmais. Neurodegeneracija atsiranda dėl vidinės gynybos ir išorinių įžeidimų pusiausvyros sutrikimo - gynybos sumažėjimo, padidėjusio įžeidimo ar abiejų pusių. CAMP / CREB signalizacijos kelias buvo naudojamas kontroliuojant neuronų ląstelių apsaugą 20, 21 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad GRK5 trūkumu pasižymintys HT22 neuronai nuolat slopina cAMP / CREB signalus, kurie galėjo sutrikdyti jų neuronų apsaugą, todėl GRK5 turinčios HT22 ląsteles jautresnės savaiminei degeneracijai ir Aβ sukeltam toksiškumui.

Nors vienintelis skirtumas tarp dnGRK5GFP / M2 / HT22 ir GFP / M2 / HT22 ląstelių yra per didelė dnGRK5 ekspresija, abi ląstelių linijos taip pat dirbtinai išreiškia M2 receptorius. Be to, kaip išsamiai aprašyta metoduose, visi ląstelių kultūros eksperimentai buvo atlikti terpėje, kurioje yra muskarininis agonistas APE arba oksotremorinas-M (Oxo-M), kad būtų galima suaktyvinti M2 receptorius. Šios sąlygos užtikrina, kad cAMP gamybos slopinimas atsiranda dėl su G i susietos adenilil ciklazių (AC) slopinimo per M2, kuris turi tik trumpą poveikį kontrolinėse ląstelėse, palyginti su nuolatiniu poveikiu ląstelėse, kuriose trūksta GRK5. Būtent nuolatinis cAMP signalo slopinimas iš tikrųjų slopina neuronų ląstelių gynybą, tuo tarpu šis patvarumas yra sutrikusios M2 receptorių desensibilizacijos rezultatas.

Suaktyvinus daugumą, jei ne visus, GPCR dezaktyvinami arba desensibilizuojami, o tai yra pagrindinė GRK 22, 23 funkcija. Tiesą sakant, skirtingi GRK nariai gali dalytis substratais, o tai leidžia abipusę kompensaciją, jei tam tikras GRK narys turi trūkumų. Tačiau ši kompensacija yra ribota, kaip in vivo paaiškėjo GRK nokauto pelėms. GRK5 atveju M2 / M4 receptorių desensibilizacijos sutrikimas yra vienintelis funkcinis praradimas, atrastas 13, 14 nuo šių išmuštų pelių 1999 m. 13 . Todėl atrodo, kad GRK5 trūkumas daro labai siaurą, bet labai selektyvų poveikį in vivo , būtent, cholinerginei sistemai. Konkrečiau, kadangi M2 / M4 receptoriai pirmiausia yra presinapsiniai autoreceptoriai atminties grandinėse 24, 25, jų sutrikęs desensibilizavimas sukelia ilgalaikį ar nuolatinį signalizavimą. Šis pratęstas signalizavimas pirmiausia sukelia ACh išsiskyrimo slopinimą, kaip mes jau įrodėme 14, tuo tarpu ilgalaikis poveikis atrodo nuolatinis ACs slopinimas 26, 27, kuris savo ruožtu slopina cAMP signalizaciją ir mažina cholinerginį neuronų apsaugą 20, 21 . Pastarasis poveikis paaiškina, kodėl BFC neuronai pelėse, kuriose trūksta GRK5, yra ypač pažeidžiami ir kodėl jie yra jautrūs pažinimo sutrikimams, kuriuos sukelia per didelis švedų APP ekspresas GAP pelėse arba protarpinė hipoksija 15, kaip minėta anksčiau.

Šiame tyrime pateikiami ne tik atskleisti reiškiniai ir mechanizmai, bet ir pirmasis transgeninio gyvūno modelis, kuris ne tik pakartoja BFC neuronų netekimą, būdingą žmogaus AD 2, bet ir puikiai papildo cholinerginę hipotezę. Nors yra daug transgeninių AD modelių gyvūnams, bendra problema yra ta, kad dauguma jų neparodo reikšmingų neuronų nuostolių, išskyrus kelis, kuriuose panaudotos agresyvios transgeninės priemonės, per daug išreiškiant daugybines šeimines AD (FAD) mutacijas arba kryžminant jas su transgeninėmis. linijos, turinčios genetinius defektus, neturinčios aiškaus ryšio su AD. Pavyzdžiui, 5xFAD pelėms (Tg6799) reikia penkių FAD mutacijų, o APP751SL / PS1KI pelėms reikia keturių FAD mutacijų kartu, kad būtų galima nustatyti neuronų praradimo fenotipą 28, 29 . Vis dėlto dar reikia išsiaiškinti, ar šie modeliai rodo BFC neuronų netekimą. Palyginimui, įtraukiant GRK5 trūkumą, kuris, kaip žinoma, yra su AD susijęs faktorius 8, 12, 30, jis pakartoja tipinį BFC neuronų praradimo AD pokytį, taip patvirtindamas cholinerginę hipotezę ir sudarydamas galimybę atlikti atitinkamus mechanistinius ir terapinius tyrimus.

Verta paminėti, kad AD dažnis yra didesnis moterims nei vyrams, ir ši lyties ypatybė buvo pakartota transgeniniuose modeliuose ir APP, ir GRK5KO pelėms 31, 32. Dėl šios priežasties lyties skirtumai buvo pašalinti iš eksperimentinio projekto, naudojant tik pateles, kaip minėta metoduose. Nepaisant to, mes palyginome BFC neuronų netekimo lygius tarp 18 mėnesių amžiaus vyrų ir moterų GAP pelių ir nustatėme, kad patelės turėjo žymiai mažesnį BFC neuronų skaičių nei vyrai. Todėl BFC neuronų netekimas GAP pelėms nėra staigmena, nes tai fenotipas, susijęs su lytimi.

Be mechanizmų ir gyvūnų modeliavimo, šis tyrimas patikrina GRK5 trūkumo svarbą sergant AD. Nors anksčiau mes parodėme, kad Aβ kaupimasis gali sukelti GRK5 funkcinį trūkumą in vitro 8, nebuvo atlikti jokie populiacijos tyrimai, siekiant nustatyti, ar visos AD pacientų populiacijos, ar bet kuri jų dalis, turi GRK5 trūkumą. Todėl šis tyrimas pateisina tokius žmonių populiacijos tyrimus, kurių tikslas - nustatyti, ar GRK5 nepakankamumas egzistuoja pažinimo sutrikimų turinčioms ar pažeidžiamoms populiacijoms, turinčioms ne tik lengvą pažinimo sutrikimą ir AD, bet ir kitoms, tokioms kaip OSA ir Parkinsono demencija.

Teoriniu lygmeniu šio tyrimo rezultatai papildo cholinerginę hipotezę ir siūlo įtraukti cholinerginę neurodegeneraciją prieš srovę kaip dalį terapinių tikslų, susijusių su pagrindine cholinerginės disfunkcijos priežastimi. Cholinerginė hipotezė turi be galo daug patvirtinančių įrodymų, tačiau ji taip pat susiduria su iššūkiais. Patologiniai duomenys, gauti iš labai vėlyvos stadijos AD pacientų autopsijos mėginių, patvirtina žymiai didesnį BFC neuronų praradimą nei kitų tipų neuronai, sergantys AD 33, 34 . Cholinerginė hipofunkcija ar sumažėjęs cholinerginis aktyvumas taip pat plačiai dokumentuojami vėlyvajame AD 2, 34, nes „Nun“ tyrime nenustatyta, kad cholinerginis fermento aktyvumas sumažėtų ankstyvame AD 35 . Eksperimentinis BFC neuronų abliacija per imunotoksiną į p75 NTR atkuria panašų atminties praradimą gyvūnams, o tai patvirtina cholinerginės sistemos vaidmenį atmintyje. 36, 37, 38, 39 . Farmakologinės manipuliacijos taip pat patvirtina kritinį cholinerginės sistemos vaidmenį atmintyje. Cholinerginės hipotezės pagrįsta cholinomimetinė strategija galiausiai lėmė 4 iš 5 FDA patvirtintų vaistų nuo 2, 42 AD. Tačiau šie cholinesterazės inhibitoriai (ChEI) palengvino tik kai kuriuos simptomus, nepakeisdami ligos proceso 43, dėl ko teko nusivilti cholinergine hipoteze ir suabejoti ja.

Cholinomimetiniai terapiniai metodai, tokie kaip ChEI, ilgesnį laiką gali išsaugoti tik į sinapsinį plyšį patekusį ACh, kompensuodami mažą cholinerginį aktyvumą postsinapsiniame lygmenyje. Šis požiūris nebuvo sukurtas siekiant užkirsti kelią pagrindinei cholinerginės hipofunkcijos priežastiai, būtent cholinerginei neurodegeneracijai. Žiūrint iš šios perspektyvos, cholinomimetiniai vaistai sėkmingai palengvino pacientų simptomus, ir nėra jokios priežasties tikėtis, kad jie pirmiausia sulėtins ligos progresavimą. Todėl mes teigiame, kad cholinomimetinio metodo nesėkmė modifikuojant ligą nėra pakankama, kad suabejotų cholinerginės hipotezės pagrįstumu. Be to, remdamiesi šio tyrimo išvadomis, mes dabar žinome, kas daro BFC neuronus pažeidžiamesnius, o terapinės strategijos, sutampančios su cholinergine hipoteze, turi apimti aukščiau esančią cholinerginę neurodegeneraciją kaip taikinių dalį. Tiksliau tariant, APE4 inhibitorių ir (arba) M2 antagonistų naudojimas kovojant su BFC pažeidžiamumu turėtų būti išbandytas asmenims, kuriems trūksta GRK5.

Be to, selektyvus tam tikro neuronų pogrupio degeneracija yra dažna daugelio neurodegeneracinių sutrikimų, tokių kaip pagrindiniai nigra dopaminerginiai neuronai, sergantys Parkinsono liga, stuburo smegenų motorinių (cholinerginių) neuronų, sergančių amiotrofine šonine skleroze, ir, žinoma, BFC neuronų, sergant AD, tema. 44 . Atrankinis poveikis vienai porcijai neuronų turi būti unikalaus patogeniško proceso rezultatas. Toks selektyvumas ne tik nulemia ligos fenotipą, bet ir reikalauja specifinių terapinių metodų siekiant pašalinti unikalų patogeno kelią. Tačiau paslaptis, kilusi dėl šių pasirinktinių pažeidžiamumų, glumino dešimtmečius.

Nepaisant to, iš šio tyrimo mes sužinojome naują būdą, kaip pasireikšti selektyvus neuronų pažeidžiamumas, tai yra pažeisti vidinę neuronų apsaugą dėl GRK5 trūkumo. Pastebėjome, kad egzistuoja ir kiti panašūs reiškiniai. Pavyzdžiui, labai selektyvus poveikis GRK6 trūkumui dopamino receptoriams 45 yra GRK2 trūkumas adrenerginiams receptoriams 46 ir GRK3 trūkumas kvapo receptoriams 47 . Bus įdomu pamatyti, ar panašūs mechanizmai vaidina kokį nors poveikį šių tam tikrų neuronų pogrupių pažeidžiamumui.

Apskritai, žinios apie GRK5 trūkumą lemia selektyvų BFC neuronų pažeidžiamumą, atvers naują horizontą, kad būtų galima dar labiau patvirtinti cholinerginę hipotezę ir nustatyti, ar cholinerginės neurodegeneracijos prieš srovę prevencija sulėtins ligos progresavimą.

Metodai

Gyvūnai

GRK5KO pelės, sugeneruotos tikslingai ištrynus grk5 geno 7 ir 8 egzonus, kaip anksčiau aprašyta 13, buvo kryžminamos su APP (Tg2576) pelėmis, kad būtų WT (GRK5 + / + / APPsw - / -, sutrumpintai G + / + / A - / - ), GRK5KO (G +/− / A - / - ), APP (G + / + / A +/− ) ir GAP (G +/− / A +/− ) pelės šiam tyrimui. Visos pelės buvo atgręžtos į C57 / BL6 foną mažiausiai 8 kartoms. Genotipas buvo atliktas naudojant uodegos DNR, kaip aprašyta anksčiau 10 . Visas šių gyvūnų naudojimo procedūras patvirtino Kanzaso miesto veteranų reikalų medicinos centro institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas, o eksperimentai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių.

Elgesio vertinimai

Visi elgesio testai buvo atlikti mūsų elgesio laboratorijos skyriuje, kuriame įrengta ANY-labirinto vaizdo stebėjimo sistema kartu su pelės elgsenos akumuliatorių elementais (Wood Dale, IL). Po to, kai pelės buvo perkeltos į elgesio skyrių, prieš bandymą pelės dvi savaites buvo pripratintos prie operatoriaus ir kambario aplinkos. Elgesio užduotis sudaro daugybė testų, kurių metu išsamiai analizuojamos sensorimotorinės funkcijos, nerimo sukeliamos tendencijos ir mnemoninės savybės. Procedūros buvo tokios pačios, kaip mes neseniai aprašėme 15 . Atlikdamas visus elgesio testus, operatorius aklai stebėjo eksperimentinius genotipo ir gydymo kintamuosius. Nurodytos eilės tvarka buvo įvertintos šios užduotys, įskaitant: 1) plaukimo atrankos testą, kad būtų pašalinti subjektai, netinkami atlikti užduotis, reikalaujančius plaukimo; 2) atviras laukas, skirtas įvertinti spontanišką veiklą ir tiriamąjį elgesį; (3) pusiausvyros spindulys vestibuliarinio ir bendrojo variklio pusiausvyrai įvertinti; (4) stygų judrumas, norint įvertinti judrumą ir sukibimo savybes; (5) padidėjęs pliusas labirintas nerimo lygiui įvertinti; (6) pakelta platforma įvertinti nerimo sukeliamos tendencijos lygį; (7) Y labirintas, norint įvertinti spontanišką kintamąjį elgesį ir erdvinę darbinę atmintį; (8) „Morris“ vandens labirinte vertinamas orientacinis (erdvinis) mokymasis ir atmintis; ir (9) radialinis rankos vandens labirintas, skirtas išmatuoti erdvinę atskaitos atmintį.

Audinių apdorojimas

Visi gyvūnai buvo anestezuojami įšvirkščiant į pilvaplėvės ertmę ketamino (285 mg / kg) ir ksilazino (10 mg / kg), perpūtus šaltu fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), po to 4% paraformaldehido. Jų smegenys buvo pašalintos ir per naktį fiksuotos 4% paraformaldehido. Smegenys buvo infiltruojamos su sacharozės tirpalu, kol jos visiškai nuskendo, o po to paviršius išdžiovinamas ir padengtas montavimo geliu, prieš tai jas konservuodamas –80 ° C. Kaip alternatyva, atsitiktinai parinktos smegenys iš kiekvienos grupės buvo gautos „NeuroScience Associates“, kad būtų galima įterpti ir pjauti smegenis. The brains were cut along the coronal plane at a thickness of 25 μm in a continuous series and collected into 24 series groups with options to select multiple intervals as necessary. The sections were preserved at −20 °C in cryopreservation solution (30% glycerol, 30% ethylene glycol in 0.1 M PBS) before staining.

Imunohistochemija (IHC)

The cryopreserved sections in each group were transferred to 0.1 M phosphate buffer (PB), free floating in 6-well plates, for IHC staining with a polyclonal antibody raised against human ChAT (1:1000 dilution, Millipore, CA, USA). The sections were washed in Tris-buffered saline (TBS) and then incubated in 0.3% H 2 O 2 in methanol for 30 min, rinsed 3 times in TBS, incubated for 30 min in TBS containing 0.25% Triton X-100 and 3% bovine serum, incubated with the primary antibody for 48 h (goat-anti-human ChAT diluted in TBS containing 1% Triton X-100 and 1% bovine serum), washed 3 times, incubated with biotinylated bovine anti-goat secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, TX, CA, 1:500) for 1 h, washed 3 times, incubated with the avidin-biotin–peroxidase complex (ABC Elite kit standard; Vector Laboratories, CA, USA) and finally developed using an enhanced ImmpactDAB substrate solution (ImmpactDAB kit, Vector Laboratories, CA, USA) according to the manufacturer's recommendations. For double staining with the neuronal marker NeuN, the ChAT-stained sections were further stained with a monoclonal anti-NeuN antibody (Santa Cruz Biotechnology, TX, USA), followed by the ImmPRESS alkaline phosphatase polymer-based reagent and VectorRed substrate kit according to the manufacturer's instructions (Vector Laboratories, CA, USA). This double-staining method resulted in a two-colored profile: brown for ChAT and red for NeuN. IF staining was performed as described previously 9 . For triple staining of NeuN/ChAT/AC3, we used mouse mAb-NeuN (1:500)/donkey pAb-Mouse-IgG-Alexa350 (1:600), goat pAb-ChAT (1:300)/donkey pAb-Goat-IgG-Alexa488 (1:800), and rabbit pAb-AC3 (1:300)/donkey pAb-Rabbit-IgG-Texas Red (1:600).

Unbiased stereology

We performed the stereology using a Leica AF6000 microscope (Buffalo Grove, IL) equipped with an x/y/z movement-sensitive stage and controlled by Stereologer software (Stereology Resource Center, Inc., St. Petersburg, FL). Stereologer contains most commonly used protocols, including the standard fractionator sampling, rare event, and Space Balls protocols that were used for this study. The unbiased stereological quantification is achieved by counting positive cells/structures in a known fraction of the sections that pass through a region of interest (ROI) 48, 49 . Because the largest variation in stereology comes from defining the boundaries of an ROI that has no clear boundary (ie, the medial septum), we divided the whole basal forebrain into two easily distinguishable areas, the caudate putamen (CPu) and rest of the nucleus basalis (nonCPu). An additional sub-region focus was the NBM. The corresponding sampling schemes are depicted in Fig. 6. To quantify the numbers of ChAT + and NeuN + neurons, a systematic random series of every 8 th (200-μm interval) section throughout the entire structure was taken for stereological counts. For each of the selected sections, the ROI was outlined at low magnification (4× objective), and the outlined region was measured at high magnification (63× dry) using a systematic random design with known dissector counting frames. The average section thickness was measured, and 2 μm guard heights at the top and bottom of each section were excluded. Optical counting rules were used to count the cells, and the examiners were blind to the identities of the samples. The counting criteria were ChAT + /NeuN + (cholinergic) or ChAT /NeuN + (non-cholinergic) immunoreactivity in the cell body with a neuronal phenotype. For rare events (ie, CASs in the NBM), every positive structure inside the frame was counted, rather than using fractionator sampling. Again, NBM was outlined at low magnification, and the CASs were identified at high magnification (63× dry) from the varicosities, based on whether their diameters were larger than 3 μm, as described previously 50 . For CFD quantification, we used either the method described by Aznavour 51 or the Space Ball dissector method in Stereologer and analyzed cholinergic fiber length per unit of volume according to the recommendations of the software. The ROI volume was analyzed using Cavalieri's principle. The cholinergic fiber density was calculated by dividing the total fiber length by the volume of the ROI. The sampling scheme was evaluated for the coefficients of error of the individual estimates and the cross-validation (group estimates of error), and the effects of interest (age, genotype, or treatment) were analyzed 52 .

Image

To quantify the total numbers of cholinergic neurons (ChAT + /NeuN + ) and non-cholinergic neurons (ChAT /NeuN + ), the basal forebrain was divided into two sub-regions, the CPu and the rest of the basal forebrain (nonCPu), as indicated ( A ). The neuronal counts were performed separately in the CPu and nonCPu regions to avoid potential variations due to defining boundaries of various sub-regions of the basal forebrain because the boundaries of the CPu are readily visible at low magnification (4×). The total number of neurons in the CPu and nonCPu together was used to represent the values for the entire basal forebrain. Nevertheless, to complement the potentially reduced specificity and/or sensitivity due to the inclusion of the rather large area of structures within the nonCPu, we quantified the neuronal numbers within the NBM as well ( B ). To analyze the CFD, the rostral somatosensory cortex up to bregma −1.70 mm was used to represent the cortex ( B ) in addition to the hippocampus, which is very easy to identify (not shown). The analysis of the CASs in 18-month-old mouse brains revealed very severe changes and inconsistency among various groups; therefore, we included the globus pallidus along with the NBM (labeled as NBMgp) to avoid variations due to possible differences in outlining the ROIs ( C ). Panel ( D ) depicts the sampling schemes for quantification of CFD within the cortex and hippocampus. Due to large variations among different layers of the structures, the quantification was performed in each layer of the ROIs. However, rather than sampling the entire structure, only three or four random square frames within each layer in each section were chosen to represent the average values for each of the particular structures.

Visas dydis

Cell culture and biochemical assays

The HT22 cells were a generous gift from Dr. David Schubert (The Salk Institute, La Jolla, CA) 16 . The sub-lines of dnGRK5GFP/M2/HT22 and GFP/M2/HT22 were established previously 14 . These cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and differentiated in NeuroBasal medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) containing 1× N2 supplement for 24–48 h before use, as described previously 53 . For spontaneous degeneration, the differentiated HT22 neurons were maintained in the original differentiation media for the entire course of the experiment without refreshing, though APE (250 μM) or Oxo-M (50 nM) was added to all of the cells at the beginning of the experiment (48 h or as indicated after differentiation). The cells were periodically photographed (15 random non-overlapping fields/well or a minimum of 300 cells/well) to calculate the rate of cell rounding. For the MTS and LDH assays, the relevant cell viability/cytotoxicity assay kits (Promega, Madison, WI) in a 96-well plate format were used, and the manufacturer's instructions were followed. Western blotting procedures were detailed previously 8, 53 . For the cAMP assay, the dnGRK5GFP/M2/HT22 and GFP/M2/HT22 cells were differentiated in 96-well plates for 48 h before being challenged with 250 μM APE for various times, as indicated in the experiment. The APE-treated cells were subjected to cAMP assays by following the manufacturer's protocol for adherent cells in the CatchPoint ® cAMP Fluorescent Assay Kit (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), modified by changing the forskolin stimulation from 20 μM for 15 min to 10 μM for 10 min.

Statistinė analizė

The quantitative data are expressed as the means ± SE and were analyzed by ANOVA using SPSS 11.0. Post-hoc comparisons of means were made using Scheffe's or Tukey's methods, where appropriate.

Papildoma informacija

How to cite this article : He, M. et al . GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Mokslas. Rep. 6, 26116; doi: 10.1038/srep26116 (2016).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.