Augimo sukeltas stresas pagerina epitelio-mezenchiminį perėjimą, kurį sukelia il-6, skaidraus ląstelių inksto ląstelių karcinoma per akt / gsk-3β / β-katenino signalizacijos kelią | onkogenezė

Augimo sukeltas stresas pagerina epitelio-mezenchiminį perėjimą, kurį sukelia il-6, skaidraus ląstelių inksto ląstelių karcinoma per akt / gsk-3β / β-katenino signalizacijos kelią | onkogenezė

Anonim

Dalykai

  • Vėžinė mikroaplinka
  • Inkstų ląstelių karcinoma

Anotacija

Stromos ląstelių populiacijos naviko mikroaplinkoje (TME) vaidina lemiamą vaidmenį inkstų ląstelių karcinomos onkogenezėje ir metastazėse. Šiame tyrime mes nustatėme, kad skaidraus ląstelių inkstų ląstelių karcinomos (ccRCC) audinių stromoje yra α lygiųjų raumenų aktino teigiamų (α-SMA (+)) ląstelių, o jų skaičius reikšmingai susijęs su prastu išgyvenimu ccRCC sergantiems pacientams. . Interleukinas 6 (IL-6) yra kritinis naras, kuris indukuoja α-SMA (+) ląsteles ccRCC audiniuose skatindamas epitelio į mezenchiminį perėjimą (EMT) ir skatina migraciją bei invaziją į ccRCC. Pilvaplėvės CD4 + T ląstelės yra pagrindinis IL-6 šaltinis ccRCC audiniuose. Be biocheminių veiksnių, navikų ląstelių elgseną veikia ir mechaninis suspaudimas navikuose. Uždaroje erdvėje užaugę navikai patiria intratumoralinį gniuždymo stresą ir, esant pakankamai slėgiui, sukelia streso sukeltą vėžio ląstelių migraciją. Be to, CD4 + T ląstelių išskiriamas IL-6 derinys su augimo sukeltu kietu stresu dar labiau prisideda prie vėžio ląstelių morfogenezės, EMT reguliavimo ir kamienų fenotipo įgijimo. Kombinuotosios grupės poveikį lėmė Akt / GSK-3β / β-katenino signalizacijos kelias, o β-katenino ekspresijos reguliavimo panaikinimas numatė blogą rezultatą ccRCC sergantiems pacientams. Visų pirma, vėžinių kamieninių ląstelių žymens CD44 išraiška buvo koreliuojama su T stadija, aukštu Fuhrmano laipsniu ir metastazėmis ccRCC. Šie duomenys pateikia įrodymų apie naujas streso mažinimo ir IL-6 taikymo strategijas vėžio terapijoje.

Įvadas

Inksto ląstelių inkstų ląstelių karcinoma (ccRCC) yra labiausiai paplitusi inkstų vėžio forma ir apima daugiau kaip 75% šių piktybinių navikų. 1 ccRCC yra labai radioaktyvus ir chemoterapinis vėžys, pasižymintis ląstelių heterogeniškumu ir hipervaskuliarumu. 2

Neseniai naviko mikroaplinkos (TME) vaidmuo sulaukė vis didesnio tyrėjų dėmesio. 3, 4 stromos ląstelės supančioje mikroaplinkoje yra pritraukiamos į navikus ir jos ne tik pagreitina augimą pirminėje vietoje, bet ir palengvina jos metastazę į tolimus organus. 5 Keli TME elementai skatina adaptyvią pabėgimo sistemą, vadinamą epiteliniu-mezenchiminiu perėjimu (EMT). EMT yra reguliuojama programa, leidžianti epitelio ląstelėms prarasti savo ląstelių ir ląstelių bei tarpląstelinės matricos (ECM) sąveiką ir atlikti citoskeleto pertvarkymą ir genetinį perprogramavimą, kad įgytų mezenchiminių ląstelių morfologines ir funkcines savybes. 6, 7, 8

Visai neseniai nustatyta, kad ccRCC turi EMT fenotipą. Su EMT susijusių veiksnių lygiai E-kadherinas, vimentinas ir β-kateninas buvo siejami su neigiamomis patologijomis, padidėjusiu pasikartojimu ir sumažėjusiu išgyvenamumu. 9, 10 Padidėjęs citokinų, chemokinų ir augimo faktorių, įskaitant TGF-β, IL-6 ir FGF, lygis vaidina lemiamą vaidmenį kaip EMT tarpininkas vėžio ląstelėse. Be to, EMT lemia dramatiškus ląstelių mechaninių savybių pokyčius, todėl keli tyrimai sutelkė dėmesį į tai, kaip mechaniniai veiksniai veikia EMT, pvz., Skysčio šlyties įtempis ir ECM standumas. 11, 12, 13 Neseniai buvo nustatytas augimo sukelto kieto streso vaidmuo naviko patogenezėje. Kietieji įtempiai yra suskirstyti į dvi kategorijas: išorinis įtempis, kuris atsiranda mechaniškai sąveikaujant tarp augančio naviko ir aplinkinių audinių; ir augimo sukeltas stresas, kuris išsivysto, kai daugėjančios vėžio ląstelės įtempia aplinkinius struktūrinius elementus. 14 Anksčiau Tse ir kt. 15 teigė, kad kompresinis stresas gali pagerinti vėžio ląstelių migraciją. Įdomu tai, kad perėjimas nuo epitelio prie mezenchiminio fenotipo taip pat skatina ląstelių judėjimą. Todėl mes ištyrėme, kaip kietos įtampos yra susijusios su EMT ccRCC.

Šiame tyrime pirmiausia atlikome „naviko mikroaplinkos PGR matricą“ iš įvairių Fuhrmano klasių ccRCC mėginių ir nustatėme, kad į miofibroblastus panašias ląsteles (nurodomas α-SMA buvimas) ir CD4 + T ląstelių padaugėjo Fuhrman III – IV. ccRCC mėginiai. Tada mes parodėme, kad IL-6, kurį išskiria CD4 + T ląstelės, gali sukelti EMT ccRCC, kuris gali būti α-SMA (+) ląstelių šaltinis, taip pat sustiprino metastazavusius navikinių ląstelių gebėjimus. Be to, atlikome eksperimentus, siekdami nustatyti augimo sukelto kieto streso poveikį navikų progresavimui. Todėl mes sujungėme IL-6 su augimo sukeltu naviko ląstelių stresu ir nustatėme, kad kietas stresas sustiprino EMT ir kamienines panašias savybes, kurias sukelia ccRCC IL-6 per Akt / GSK-3β / β-katenino signalizacijos kelią.

Rezultatai

Mikroaplinkos komponentai skiriasi ccRCC ir normaliuose inkstų audiniuose

Norėdami įvertinti galimą TME ląstelių populiacijos vaidmenį ccRCC, atrinkome 84 genus, kurie laikomi stromos ląstelių, ECM, EMT ir ląstelių mechanikų žymenimis, kad būtų galima atlikti „TME PCR matricą“ paciento mėginiams (patologinės charakteristikos parodytos 1 lentelėje). ). Kaip parodyta 1a paveiksle, PCR matricos profilis atpažino 27 diferencijuotai išreikštus genus (raukšlės pokytis> 1, 5) tarp ccRCC ir normalių inkstų audinių. Palyginti su normaliu inkstu, ccRCC sergančių pacientų ECM komponentai ir su mechanika susiję genai (nuo PLOD2 iki ICAM1) naviko audiniuose buvo žymiai padidėję (1b pav.). Be to, palyginti su neumoriniais audiniais, daugiau su EMT susijusių genų ( CXCR4 , VIM ir ACTA2 ) buvo sureguliuoti ccRCC sergantiems pacientams (1b pav.). Be to, palyginti su normaliu inkstu, ccRCC sergantiems pacientams, ypač CD4, buvo nustatytas stromos ląstelių žymenų padidėjimas (1b pav.).

Pilno dydžio lentelė

Image

Stromos populiacijos skiriasi tarp ccRCC ir normalių inkstų audinių. a ) Normalių ir piktybinių audinių PGR masės skirtingai reguliuojamų genų šilumos žemėlapis. ( b ) Su TME susijusios mRNR lygio pokyčiai inkstų vėžio audiniuose, palyginti su navikiniais audiniais, buvo analizuojami SuperArray realaus laiko PGR metodu. Duomenys buvo pagrįsti trimis nepriklausomais eksperimentais. Stromos komponentų pavadinimai mėlynai atitinka atitinkamus genus.

Visas dydis

Taigi „TME PCR masyvas“ nustatė ECM rekonstravimą, EMT ir mechaninius faktorius ccRCC. Be to, palyginti su normaliais inkstų audiniais, stromos populiacija (nuo FCGR3A iki CSF1R) pastebimai padidėjo, tai rodo, kad stromos populiacijos gali reguliuoti naviko progresavimą.

Α-SMA (+) ląstelių kaupimasis ccRCC sergančių pacientų stromoje skatina ligos progresavimą ir prognozuoja prastą išgyvenimą

Remdamiesi „TME PCR Array“ duomenimis, mes numatėme, kad stromos komponentai padidins ccRCC progresą. Šiuo tikslu 55 ccRCC pacientai buvo ištirti imunohistocheminiu dažymu α-SMA 16 (mezenchiminių ląstelių specifiniai žymenys) parafino įterptuose audiniuose. Kaip parodyta 2a paveiksle, α-SMA (+) ląstelių skaičius tiek Fuhrman I audiniuose, tiek Fuhrman III – IV mėginiuose žymiai padidėjo, palyginti su normaliais inkstų audiniais. α-SMA (+) ląstelės buvo visame audinyje Fuhrman III – IV audiniuose, palyginti su Fuhrman I mėginiais (atitinkamai 2a paveikslas, atitinkamai 44, 74 ± 5, 7 ir 18, 91 ± 4, 3 ląstelės / laukas; P <0, 0001).

Image

Α-SMA raiškos lygiai yra teigiamai susiję su CD4, o neigiami - su kolagenu I. ( a ) α-SMA, kolageno I ir CD4 raiška 55 žmogaus ccRCC audiniuose ir normaliuose inkstų audiniuose buvo analizuojama IHC. Svarstyklės, 100 μm. Langelių ir ūsų brėžiniai rodo vidutines vertes horizontaliomis linijomis, 75% reikšmių - dėžutėmis ir 95% diapazono - ūsus. Duomenys buvo pagrįsti trimis nepriklausomais eksperimentais. ( b ) Koreliacija tarp α-SMA ir kolageno, įvertinta Spearmano koreliacija. c ) α-SMA ir CD4 koreliacija, įvertinta Spearmano koreliacija. ( d ) koreliacija tarp α-SMA raiškos ir išgyvenimo lygių naudojant „SurvExpress“. Mėlyna ir raudona kreivės rodo paciento mirtį žemos ir aukštos α-SMA raiškos grupėse. e ) Pacientų, sergančių ccRCC, klinikiniai ir patologiniai požymiai pagal α-SMA raišką. Laikoma, kad klaidų juostos yra vidurkis ± se, Studento dvipusis t- testas, P <0, 05 rodo statistiškai reikšmingą skirtumą.

Visas dydis

Paprastai α-SMA naudojamas apibrėžti miofibroblastus TME. Šie „aktyvuoti“ fibroblastai naviko stromoje yra svarbūs naviko augimo ir progresavimo skatintojai. 17, 18 buvo pasiūlyta, kad miofibroblastai yra ramūs fibroblastai, kurie keičiasi dėl sąlyčio su vėžio ląstelėmis, miofibroblastai gamina ECM, todėl atsiranda 19, 20 patologinė fibrozė (kolageno nusėdimas ir sukryžiavimas); todėl, norint ištirti miofibroblastų kilmę, ccRCC sergantiems pacientams buvo išmatuota kolageno I raiška. Įdomu tai, kad, palyginti su Fuhrman I, Fuhrman III – IV pacientams buvo nustatytas žemas I kolageno kiekis (2a pav.). Be to, I kolageno išraiška neigiamai koreliavo su α-SMA raiška 55 pacientams, sergantiems ccRCC (2b paveikslas), o tai parodė, kad normalūs fibroblastai gali būti ne pagrindinis miofibroblastų šaltinis. Epitelinės kilmės ląstelės taip pat yra miofibroblastų kilmės ląstelės. Pavyzdžiui, krūties vėžio ląstelės, turinčios patvirtintą epitelio kilmę, buvo ištirtos EMT ir išreiškė aukštą α-SMA kiekį. 21, 22, 23 Be to, remiantis PGR masyvo rezultatais, CD4 buvo analizuojamas imunohistochemiškai. Atsižvelgiant į α-SMA raišką naviko mėginiuose, CD4 + T ląstelės daugiausia buvo rastos Fuhrman III – IV stromoje, palyginti su Fuhrman I mėginiais (2a pav.), Ir CD4 raiška buvo teigiamai koreliuojama su α-SMA raiška pacientų (2c pav.).

Pažymėtina, kad pagal α-SMA tankio naviko stromos mediana reikšmę pacientai buvo suskirstyti į dvi grupes. Pastebėtas reikšmingas atvirkštinis ryšys tarp α-SMA (+) ląstelių skaičiaus stromoje ir bendro išgyvenamumo (OS) ( P <0, 01; 2d pav.). Be to, stromos α-SMA (+) ląstelių tankis buvo koreliuojamas su T stadija ( P = 0, 033, 2e pav.) Ir branduolinio laipsnio ( P = 0, 01, 2 e paveikslas). Bendrai šie duomenys parodė, kad c-SMA (+) ląstelės ccRCC pacientų stromoje skatina ligos progresavimą, prognozuoja prastą išgyvenimą ir yra susijusios su vėžinių ląstelių EMT.

CD4 + T ląstelių išskiriamas IL-6 sukelia inkstų vėžio ląstelių EMT ir padidina migraciją bei invaziją skaidraus ląstelių inkstų ląstelių karcinomos metu

TME kaupiamos CD4 + T ląstelės ne tik dalyvauja imunologinėse funkcijose, bet ir prisideda prie naviko ląstelių metastazių. 24, 25 radome, kad CD4 + T ląstelės buvo praturtintos Fuhrman III – IV paciento audiniuose ir teigiamai koreliavo su α-SMA raiška ccRCC. Kitame etape mes ištyrėme ryšį tarp CD4 + T ląstelių ir α-SMA + ląstelių ccRCC. Iš sveikų donorų in vitro suaktyvinome CD4 + T ląsteles ir paskui apibūdinome T ląstelių pogrupius srauto citometrija, patvirtindami jų fenotipą, kaip anksčiau buvo pranešta 26, 27 (3a ir b paveikslai). Tada CD4 + T ląstelės buvo kultivuojamos kartu su ccRCC ląstelėmis dviejų kamerų sistemoje (3b pav.).

Image

CD4 + T ląstelių išskiriamas IL-6 skatina EMT, migraciją ir invaziją į ccRCC. ( a ) PBMC magnetiniu būdu buvo atskirti į CD3 + ir CD4 + T ląsteles. ( b ) RCC ląstelės, 786-O, A498 ir ACHN, 48 valandas buvo kultivuojamos kartu su T ląstelėmis transvero sistemoje. ( c ) IL-6, TNF-α ir TGF-β baltymų koncentracijos vėžio ląstelių linijose ir bendros kultūros terpėje buvo nustatytos ELISA metodu. ( d ) Kontrolinės arba IL-6 apdorotos 786-O ląstelės arba A498 ląstelės buvo tiriamos atliekant konfokalinės mikroskopijos analizę E-kadherinu, α-SMA, Cortactin ir Vimentin. Svarstyklės, 100 μm. Vaizdai, pagrįsti trim nepriklausomais tyrimais. e ) epitelio (E-kadherino) ir mezenchiminių (Vimentin, α-SMA ir N-kadherino) žymenų baltymų kiekis. Trijų nepriklausomų tyrimų vaizdai. ( f ) Susiformavę ląstelių viengubai sluoksniai buvo suvynioti 100 μl pipetės galiuku, o po to ląstelės 16 valandų buvo gydomos IL-6 arba be jo (50 ng / ml). g ) Ląstelių migracija (kairėje) ir invazija (dešinėje) buvo tiriamos transvertiniuose įdėkluose arba „Matrigel“ dengtose kamerose su IL-6 arba be jo apatinėje kameroje. Kiekvienoje grupėje po filtrą buvo suskaičiuoti penki laukai. h ) Su migracija ir invazijomis susiję genai buvo įvertinti genų profilio analizėmis. Klaidų juostos yra vidurkis ± se, studento dvipusis t- testas, * P <0, 05 ir ** P <0, 01.

Visas dydis

Tada buvo matuojamas tirpių mediatorių, gaminamų vėžio ląstelių linijomis, ir CD4 + T limfocitų, auginamų kartu su naviko ląstelėmis, gamyba. Po 48 val. Buvo surinkti vėžinių ląstelių linijų ir bendros kultūros sistemos supernatantai, citokinų lygis buvo įvertintas trimis tirpiais mediatoriais, susijusiais su ccRCC prognoze ir T-ląstelių aktyvacija. Kaip parodyta 3c paveiksle, daugiau citokinų buvo pagaminta iš kultūrų sistemų, o ne iš inkstų vėžio ląstelių. Tarp šių citokinų didžiausia koncentracija buvo IL-6, rodanti, kad CD4 + T ląstelių išskiriamas IL-6 gali atlikti sąveiką su navikinėmis ląstelėmis.

Norint toliau tirti α-SMA (+) ląstelių šaltinį ir tai, kokiu mastu IL-6 skatina naviko progresavimą, į kultūros sistemą buvo pridėta 50 ng / ml IL-6. Po to, kai vėžinės ląstelės 24 valandas buvo veikiamos IL-6, buvo pastebėta verpstės formos morfologija ir beveik visiškai netekę epitelio bruožų, įskaitant E-kadheriną, padidėjo vimentino, α-SMA ir N-kadherino ekspresija. aptiktas. Be to, su invadopodija susijęs baltymo kortaktinas, jungiantis su aktinais, buvo aptiktas imuniniu dažymu kaip papildomu EMT žymeniu (3d ir e paveikslai).

Tada mes ištyrėme, ar IL-6 apdorotos naviko ląstelės parodė padidėjusią migraciją ir invaziją. Šiuo tikslu atlikome žaizdų gijimo (3f pav.) Ir transvero kameros tyrimus (3g paveikslas, kairė). Rezultatai parodė, kad IL-6 padidino navikinių ląstelių judrumą. Be to, IL-6 grupė parodė padidėjusią Matrigel dengtų transwell'ų invaziją, palyginti su kontroline grupe (3g paveikslas, dešinė). Be to, genų ekspresijos mikrotraumai buvo naudojami migracijos pokyčiams ir su invazija susijusių genų pokyčiams tarp kontrolinės grupės ir IL-6 gydomos grupės identifikuoti (3h ir i pav., Kartų pokytis> 2 ir FDR <0, 075). Visi šie duomenys parodė, kad CD4 + T ląstelių išskiriamas IL-6 sukelia EMT fenotipą ir pagerina ccRCC ląstelių migracijos ir invazinius gebėjimus.

Augimo sukeltas stresas skatina inkstų vėžio ląstelių migraciją ir sustiprina IL-6 sukeltą EMT

Iš pacientų paėmus šviežio audinio mėginius, mes atlikome dalinį skrodimą per naviko centrinę liniją ir nustatėme, kad naviko anga pamažu tapo didesnė ir deformuota, o navikinių audinių angos liko beveik uždarytos (4a paveikslas). . Remiantis nustatytais naviko mėginiais, ccRCC sergantiems pacientams buvo sureguliuotos ECM sudedamosios dalys ir su mechanika susiję genai (nuo PLOD2 iki ICAM1), kaip parodyta „TME PCR Array“. Šis reiškinys apibūdinamas kaip augimo sukeltas kietas stresas. Kietos įtampos prisideda prie naviko progresavimo, 15, 28, tačiau kaip mechaniniai veiksniai veikia ccRCC ir TME, nebuvo aprašyta. Šiuo tikslu mes toliau tyrėme šias problemas ccRCC.

Image

Augimo sukeltas kompresinis stresas palengvina inksto vėžio ląstelių migraciją ir sustiprina IL-6 sukeltą EMT. a ) buvo išpjaustyta naujai pašalinta inkstų ląstelių karcinoma ir šalia esantys normalūs inkstų audiniai. Dalinis išpjovimas per normaliųjų ir navikinių audinių išilginę ašį (50–80% skersmens) atlaisvino įtempius, o audiniai buvo deformuoti skirtingais būdais. Po pjovimo auglyje suspaudimas buvo paleistas, o naviko vidus išsipūtė, o normalus audinys neišmatuojamas. b ) Suspaudimo įtaisas, suprojektuotas Tse ir kt. leidžiama taikyti kontroliuojamą gniuždantį stresą vienkartinėms vėžio ląstelių, kurios buvo kultivuojamos ar tiriamos dėl navikinių ląstelių migracinio aktyvumo, sluoksniui. 1% agarozės diskas sąlygojo minkštą sąlytį su ląstelių monosluoksniais. Ląstelėms auginti buvo naudojamos transveliosios membranos, turinčios 0, 4 μm poras, o migracijos tyrimui - 8 μm poras. Kontroliniams mėginiams agarozės diskas buvo uždėtas be svorio. c ) Viršutinis, didesnis išorinis stresas (nuo 0 iki 4 mmHg) padidino vėžio ląstelių monosluoksnių migracinį aktyvumą ir sumažėjo nuo 4 iki 5 mmHg. Ląstelės buvo suspaustos 16 val. Rožinis rombas žymi migruojančių navikinių ląstelių skaičių, o mėlyna juosta - penkių nepriklausomų eksperimentų vidutines vertes. Apatiniame skydelyje parodytas CCK8 lygis ląstelėse, apdorotose 0–5 mmHg 16 val. Sugertis esant 450 nm bangos ilgiui buvo parodyta kaip 786-O ir A498 ląstelių, veiktų nuo 0 iki 4 mmHg, gniuždomosios jėgos, citoskeleto dažymas (aktino gijų faloidinas). Esant 4 mm Hg naviko ląstelėms buvo nustatyti pailgi aktino siūlai ir verpstės formos mezenchiminis fenotipas. Svarstyklės, 100 μm. e ) genų, susijusių su migracija, invazija ir angiogeneze, diferencinės raiškos ccRCC atvejais šilumos žemėlapiai. Be to, profilyje taip pat padidėjo genai, koduojantys mechaninius ir ECM komponentus. f ) GO gniuždomosios grupės analizė; kairė rodo molekulinę funkciją, o dešinė rodo biologinį procesą. ( g ) Skirtingai sureguliuotų genų šilumos žemėlapis IL-6 apdorotų ląstelių grupėje ir derinio grupėje. Viršutinis skydelis nurodo genus, susijusius su mechanika ir ECM, o apatinis skydelis - su EMT susijusius genus. h ) GO produkto savybių, įskaitant biologinį procesą, ląstelinį komponentą ir molekulinę funkciją, analizė tarp IL-6 apdorotos grupės ir derinio grupės.

Visas dydis

Mes mėgdžiojome suspaudimo sąlygas naudodamiesi prietaisu, kurį suprojektavo Tse ir kt. su keliomis modifikacijomis (4b paveikslas). Remiantis ankstesniais tyrimais, streso lygis svyravo nuo 0 iki 5 mmHg, o suspaudimo laikas buvo 16 val. 14, 15 Norėdami įvertinti kieto streso įtaką ląstelių judrumui, vėžinių ląstelių monosluoksniams taikėme kontroliuojamus svorius. Šiais lygiais slėgio įtempis nuo 0 iki 4, 25 padidino RCC 786-0 ląstelių judrumą. Didžiausia migracija buvo 4 mmHg, o tada migracija sumažėjo padidėjus streso lygiui (4c paveikslas, viršutinė plokštė). Tuo tarpu mes išmatuojome ląstelių gyvybingumą kontroliuojamomis sąlygomis per 16 h ir nustebome, kad padidėjęs stresas lėmė panašų linijinį ląstelių gyvybingumo sumažėjimą nuo 0 iki 4 mmHg, o virš 4 mmHg, ląstelių išgyvenamumas smarkiai sumažėjo (4c paveikslas, apačia). . Norint toliau įvertinti streso funkcinį vaidmenį ląstelių judrume, 786–0 ir A498 ląstelėse buvo stebimi kompresijos stimuliuojami citoskeleto struktūros pokyčiai. Suspaudimas palaipsniui skatino citoskeleto deformaciją pertvarkant žievės aktiną, ypač esant 4 mmHg (4d pav.), O stresas nuo 4, 25 iki 5 mmHg, atitinkantis 4c paveikslą, didžioji dalis ląstelių struktūrų buvo neįsiterpusios, o daugelis ląstelių plyšo (duomenys). nerodyta). Šie rezultatai parodė, kad vidutinis kompresinio streso lygis padidina ląstelių judrumą ir sužadina į mezenchiminius fenotipus, o per didelis stresas sukelia ląstelių mirtį.

Norint nustatyti, ar pakitusiose ląstelėse nepakito genų ekspresija, apdorotoms ląstelėms (4 mmHg suspaudimas 16 val.) Buvo atlikta genų ekspresijos masyvo analizė. Genai, kurių suslėgtose ląstelėse yra daugiau nei dvigubai reguliuojama, yra išvardyti 4e paveiksle. Duomenys parodė, kad labai padaugėjo proliferacinių, progresavimo ir proinvazinių citokinų. Be to, su ECM ir mechanika susiję genai buvo žymiai iš naujo sureguliuoti. Visi šie rezultatai parodė, kad gniuždantis stresas daro didelę įtaką naviko augimui ir vystymuisi. Keista, bet nė vienas EMT žymeklio genas neparodė pokyčių jų ekspresijos profilyje, o tai rodo, kad kietas stresas padidina ląstelių migraciją, bet neinicijuoja EMT ccRCC.

Buvo atlikta visų diferencijuotai išreikštų mRNR genų ontologijos (GO) analizė, siekiant nustatyti galimas koduotų nuorašų pokyčių funkcines pasekmes. Mes nustatėme, kad reikšmingai diferencijuoti transkriptai tarp suspaustų ir kontrolinių grupių buvo daugiausia koreliuojami su reakcija į išorinį stimulą (GO: 0009605), ląstelių proliferacijos reguliavimu (GO: 0042127), augimo faktoriaus aktyvumu (GO: 0008083), citokinų receptorių prisijungimu ( GO: 0005126) ir chemoterapinių medžiagų aktyvumas (GO: 0042056). Išsamūs rezultatai pateikti 4f paveiksle.

Norėdami išsamiau ištirti mechaninių veiksnių ir biocheminės mikroaplinkos sąveiką, mes sujungėme gydymą IL-6 su nuolatiniu suspaudimu, kad atliktume genų ekspresijos analizę. Palyginti tik su IL-6 grupe, genai, susieti su ECM komponentais ir mechaniniais veiksniais, buvo reikšmingai padidėję kombinuotoje grupėje. Be to, nors kompresinis įtempis nebuvo pakankamas EMT sukelti, IL-6 kartu su suspaudimu sukėlė visišką EMT, tai parodo su EMT susijusių genų ekspresijos lygio padidėjimas (4g paveikslas). Svarbu tai, kad mes nustatėme, kad teigiamas imuninio atsako reguliavimas (GO: 0006955, biologinis procesas, raudonas), atsakas į išorinius stimulus (GO: 0009605, biologinis procesas, raudona), tarpląstelinė matrica (GO: 0031012, ląstelinis komponentas, raudona) ir tarpląstelinė erdvė (GO: 0005615, ląstelinis komponentas, raudona) buvo akivaizdžiai praturtinta (4h paveikslas). Be to, atliekant molekulinės funkcijos analizę, genai, susieti su augimo faktoriu, chemokino ir citokinų aktyvumu (GO: 0008083, 0008009, 0042379, 0005126, 0005125, molekulinė funkcija, raudona), buvo akivaizdžiai praturtinti (4h paveikslas), kuris leido manyti, kad mechaninis veiksniai dar labiau sustiprino piktybinį naviko ląstelių fenotipą, net kai jie jau buvo stimuliuoti IL-6. Šie duomenys kartu parodė esminį augimo sukelto kieto streso vaidmenį didinant ccRCC progresavimą, bet ne inicijuojant EMT.

IL-6 kartu su augimo sukeltu stresu skatina branduolinį β-katenino transliaciją, o β-kateninas yra koreliuojamas su pažengusiais ccRCC etapais

Toliau siekėme ištirti, kaip stiprus stresas padidina IL-6 sukeltą EMT. Pirmiausia mes nustatėme EMT žymenų baltymų lygį kontrolėse, IL-6 gydytoje grupėje, suspaudimo grupėje ir derinio grupėje. Remiantis genų ekspresijos profilio duomenimis, derinio grupė sukėlė visą EMT (5a pav.). Ankstesnis darbas nustatė, kad β-kateninas yra EMT taikinys, kurį indukuoja IL-6, be to, yra mechaninio virsmo, kurį sukelia augimas, sukeliamas stresas 12, 28, 29, variklis (5b paveikslas). Keista, bet imuninis dažymas parodė, kad β-kateninas daugiausia buvo lokalizuotas plazmos membranoje tarp ląstelių – ląstelių jungčių kontrolinėje, IL-6 ir suspaudimo grupėse, kol jis persikėlė į branduolį kombinuotoje grupėje (5c pav.). Be to, ląstelių frakcionavimo analizė parodė, kad dalis β-katenino persiskirsto į branduolinį skyrių ląstelėse kombinuotoje grupėje (5d pav.).

Image

IL-6 derinys su gniuždomuoju stresu skatina branduolinį β-katenino translokaciją. a ) Su EMT susijusių baltymų ekspresija keturiose grupėse buvo nustatyta naudojant Western blot metodą. Reprezentatyvūs trijų nepriklausomų tyrimų vaizdai. ( b ) β-kateninas buvo ne tik susijęs su EMT, bet ir vaidino svarbų vaidmenį mechaninių signalų keliuose. ( c ) Imunofluorescencija atskleidė, kad IL-6 derinys su kompresiniu stresu skatino β-katenino translokaciją į branduolį 786-O ląstelėse. Mastelio juosta, 50 μm. ( d ) Ląstelių frakcionavimo tyrimai atskleidė, kad IL-6 derinys su gniuždymo įtempiu padidino branduolinio β-katenino kaupimąsi 786-O ląstelėse. CE, citoplazmos ekstraktas; NE, branduolinis ekstraktas. Derinys, IL-6 + suspaudimas. e ) Nurodytuose ccRCC paciento mėginiuose buvo imunohistocheminis β-katenino dažymas, o ccRCC sergantiems pacientams buvo rastas skirtingas tarpląstelinio β-catenino kiekis. Kairiajame skydelyje vyrauja membranos išraiška, o dešinėje - citoplazminė / branduolinė išraiška. Mastelio juosta, 20 μm. f ) tarpląstelinio β-katenino ekspresijos lygio ir klinikinės svarbos koreliacija. Ligonių, kuriems būdingi klinikiniai parametrai: naviko invazija (LVI, VT ir metastazės), limfovaskulinė invazija, venų trombai, tolimų organų metastazės, atsižvelgiant į skirtingus tarpląstelinio β-katenino procentus, procentas. Iš viso 20 ccRCC mėginių buvo ištirti imunohistochemija.

Visas dydis

Norėdami įvertinti ryšį tarp klinikinių patologinių parametrų ir β-katenino aktyvacijos ccRCC, pirmiausia ištyrėme β-katenino raišką naviko audiniuose iš pirminio ccRCC ir invazinių ccRCC pacientų (invazinė ccRCC apėmė tolimą organų metastazę, venų trombą ir limfovaskulinę invaziją). (LVI); išsamios charakteristikos pateiktos 2 lentelėje). Kaip prognozuota, imunohistocheminis dažymas parodė, kad β-katenino ekspresijos lokalizacija buvo skirtinga (5e pav.). Β-katenino citoplazminė / branduolinė lokalizacija buvo visose invazinėse grupėse (100%), o pirminėje grupėje 73% atvejų pasireiškė membranos išraiška (5f paveikslas, kairysis viršuje). Be to, β-katenino citoplazminė / branduolinė lokalizacija buvo aiškiai susijusi su venų trombu, LVI ir tolima metastaze (5f pav.).

Pilno dydžio lentelė

Augimo sukeltas stresas padidina EMT ir kamieną, kurį sukelia IL-6 per Akt / GSK-3β / β-katenino signalizacijos kelią

Norėdami ištirti, kurį signalizacijos kelią reguliavo derinio grupė, atlikome kelio analizę, naudodamiesi Kioto genų ir genomų enciklopedijos (KEGG) duomenų rinkiniais genų masyvo analizėje. Kelio analizė parodė, kad chemokinų signalizacijos kelias buvo žymiai praturtintas IL-6 gydytoje grupėje (6a pav., Raudona). Svarbu tai, kad kombinuotoje grupėje PI3K-Akt kelio praturtėjimas buvo reikšmingas (6b paveikslas, raudonas). Kaip ir tikėtasi, ląstelių adhezijos molekulės ir ECM-receptorių sąveika, susijusi su mechaniniais veiksniais, buvo žymiai praturtinti kombinuotoje grupėje (6b pav., Raudona). Įdomu tai, kad signalizacijos keliuose, reguliuojančiuose kamieninių ląstelių pluripotencialą, praturtėjo (6b pav., Raudona). Lin et al. 9 pranešė, kad naviko ląstelės įgyja kamienio fenotipą aktyvindamos PI3K / Akt / β-katenino signalizacijos kelią. Todėl mūsų duomenys rodo, kad kombinuotas gydymas su IL-6 ir suspaudimas gali reguliuoti ccRCC ląstelių kamieną paveikdami PI3K-Akt kelią. Norėdami išsamiau ištirti šį reiškinį, mes nustatėme genus įvairiose kategorijose, įskaitant savaiminio atsinaujinimo žymenis ir CSC žymenis, kurie daugiausia buvo reguliuojami derinant grupę (6c paveikslas). Be to, naudojant srauto citometrijos analizę, derinyje buvo nustatytas didesnis ląstelių skaičius CD133 + ir CXCR4 + pogrupyje, palyginti su kitomis trimis grupėmis (6d pav.). Toliau mes ištyrėme Akt ir GSK-3β baltymų ir su CSC susijusių genų lygius keturiose grupėse ir tai parodė, kad fosforilintų Akt ir GSK-3β lygis iš esmės padidėjo tik kombinuotoje grupėje (6d pav.). Oct4 yra pagrindinis transkripcijos veiksnys, susijęs su ląstelių perprogramavimu, ir subalansuoja daugybinės ir diferencijuotos būsenos kamieninių ląstelių ir vėžio vystymesi. 30 Sox2 yra labai svarbus palaikant savarankišką ESC atsinaujinimą. 31 CD44 yra puikus CSC žymeklis, kuris yra per daug ekspresuojamas įvairių rūšių vėžio kamieninėse ląstelėse. 32 Mes nustatėme, kad šie genai taip pat reikšmingai padidėjo kombinuotoje grupėje (6e pav.). Tuo tarpu keturių grupių ląstelių gydymas Akt inhibitoriumi MK-2206 parodė, kad slopinant AKT ekspresiją signalo perdavimo kelią sutrinka (6e pav.).

Image

Augimo sukeltas stresas padidina EMT ir kamieniškumą, kurį sukelia IL-6 per Akt / GSK-β / β-katenino signalizacijos kelią. a ) Skirtingai reguliuojami baltymai IL-6 grupėje buvo įvertinti atliekant KEGG kelio analizę. Keliai, rodantys reikšmingus pokyčius, pateikiami kartu su atitinkamu praturtėjimo balu. IL-6 grupėje buvo pabrėžtas chemokinų signalizacijos kelias. ( b ) Skirtingai reguliuojami baltymai kombinuotoje grupėje buvo įvertinti atliekant KEGG kelio analizę, o PI3K-Akt signalizacijos kelias pakeistas kombinuotoje grupėje. Pažymėtina, kad jungtinėje grupėje pokyčiai atsirado ir ląstelių adhezijoje, ECM receptoriuose ir pluripotencinių kamieninių ląstelių reguliavime. c ) Aukščiau sureguliuotų genų, susijusių su kontrolinės grupės ir derinio grupės, susijusių su savaiminio atsinaujinimo žymenimis ir vėžio kamieninių ląstelių žymenimis, šilumos žemėlapis. ( d ) Derinių grupę sudaro didesnis CD133 + / CXCR4 + pogrupis, palyginti su kitomis trim grupėmis. e ) Bendrojo ir fosforilinto Akt, suminio ir fosforilintojo GSK-3β, Sox2, Oct4 ir CD44 baltymų kiekis 786-O ląstelėse, neapdorotose ar neapdorotomis Akt inhibitoriumi MK-2206, skirtingais atvejais. ( f ) Skirtingi CD44 raiškos lygiai: (-) žymi neigiamą išraišką, (+) žymi silpną išraišką, (++) žymi tarpinę išraišką ir (+++) žymi stiprią išraišką. ( g ) CD44 ekspresija reikšmingai pakito skirtingose ​​ccRCC audinių stadijose ir Fuhrmano laipsniuose (viršuje, P <0, 01). CD44 lygis metastazavusiuose audiniuose taip pat reikšmingai padidėjo, palyginti su necastaziais audiniais iš žmogaus ccRCC (kairysis dugnas, P <0, 01). Tačiau CD44 nebuvo koreliuojamas su LVI (dešinė, apačia, P = 0, 678).

Visas dydis

Šie kolektyviniai duomenys rodo, kad IL-6 kartu su augimo sukeltu stresu gali veiksmingai suaktyvinti PI3K / AKT signalizaciją ccRCC. Norėdami toliau tirti CSC žymenų prognostinę vertę ccRCC, mes pasirinkome CD44 kaip taikinį, nes įrodymai parodė, kad CD44 dalyvavo naviko progresavime ccRCC. Kaip parodyta 6f paveiksle, naviko mėginiuose stebėjome skirtingą imuninio dažymo intensyvumą. CD44 ekspresija buvo didesnė III – IV stadijos ccRCC (6g paveikslas, viršuje kairėje, P = 0, 001). Be to, aukšta CD44 raiška buvo koreliuojama su Fuhrman laipsnio (atitinkamai 6 g paveikslas, dešinėje viršuje, atitinkamai P = 0, 002) ir metastazėmis ccRCC audiniuose (6 g paveikslas, apačia kairėje, P = 0, 003). Šie rezultatai rodo, kad kompresinis stresas padidina EMT ir kamieną, kurį sukelia IL-6 per Akt / GSK-3β / β-katenino signalizacijos kelią, o CD44 yra pažengusios stadijos žymeklis ccRCC sergantiems pacientams.

Diskusija

Naviko ląstelių sąveika ir su ja susijusi stroma daro įtaką ligos inicijavimui, progresavimui ir paciento prognozėms. 35 Remdamiesi mūsų pačių sukurtu „TME PCR masyvu“ ir imunohistochemija, mes nustatėme, kad aukšto Fuhrmano laipsnio ccRCC stromoje yra daugiau α-SMA (+) ląstelių, palyginti su žemo Fuhrmano laipsnio ccRCC, ir jos yra koreliuojamos su progresija ir išgyvenimas ccRCC sergantiems pacientams. Priešingai nei imuninę sistemą slopinantis mikromilius daugumoje intratumoralinių sričių, ccRCC stromoje yra nemažas skaičius infiltruojančių CD4 + leukocitų, turinčių prouždegiminių savybių. Remdamiesi klinikinių mėginių analize ir eksperimentiniais tyrimais, mes nustatėme, kad stromoje susikaupusios CD4 + ląstelės yra pagrindinis IL-6 šaltinis, o tai savo ruožtu sukelia naviko ląstelių EMT, sukeliančias naviko ląstelių mezenchiminį fenotipą. Šis rezultatas atitinka tyrimus, kurie rodo, kad didelis IL-6 koncentracija serume yra veiksminga prognozė blogai inkstų ląstelių karcinomos ir kitų vėžio atvejų prognozėms. 36, 37

Biocheminiai veiksniai yra svarbūs naviko aplinkos komponentai, tačiau galimas biomechaninių veiksnių vaidmuo žmogaus navikuose vis dar nežinomas. Nekontroliuojamas vėžinių ląstelių dauginimasis sukelia mechaninius, gniuždomuosius įtempius. 14, 15 Atsižvelgiant į naviko mikroaplinkos vientisumą, svarbu gilinti savo žinias apie tai, kaip fizinė jėga veikia IL-6 onkogeninę veiklą kuriant ir progresuojant ccRCC. Šiuo tikslu pirmą kartą parodėme, kad gniuždantis įtempis žymiai padidina IL-6 sukeltą EMT. Be to, remdamiesi genų ekspresijos profiliais, mes nustatėme citokinų anomalijas, kurios, kaip pranešama, padidina naviko susidarymą ir progresavimą (pavyzdžiui, CCL5, CXCL8 ir CXCL12). Įdomu tai, kad IL-6 taip pat yra iš naujo sureguliuotas (kartų pokytis 7.317) kombinuotoje grupėje. Mes nustatėme, kad IL-6 kartu su padidėjusia gniuždymo jėga sustiprino teigiamą grįžtamąjį ryšį, kontroliuojantį EMT ir naviko progresavimą per Akt / GSK-3β / β-katenino signalizacijos kelias. Remdamiesi Tse ir kolegų rezultatais , parodome, kad didelis gniuždomasis stresas taip pat skatina ląstelių mirtį. 38 Be to, net esant 4 mmHg slėgiui, ląstelių gyvybingumas taip pat sumažėjo, palyginti su kontroline grupe. Mes tikime, kad šį sudėtingą reiškinį galima geriau parodyti ekologiniu požiūriu; 39 ekosistemoje rūšys retai egzistuoja atskirai. Be to, CD4 + T ląstelių išskiriamas IL-6 sukelia inkstų vėžio ląstelių EMT. Tuo tarpu IL-6 kartu su mechaniniu suspaudimu pagerina naviko progresavimą ir suaktyvina vėžinių ląstelių pogrupį, kad jis baigtųsi EMT ir įgytų kamieną, o kitos ląstelės, kurioms trukdoma sparti evoliucija, žūva šiame procese. Šis natūralios atrankos procesas leidžia ląstelėms įveikti natūralius auglius slopinančius mechanizmus ir išgyventi naujoje aplinkoje.

Kaupiami įrodymai rodo, kad branduolinis β-katenino kaupimasis skatina EMT ir mechaninį transdukciją sergant įvairiomis vėžinėmis ligomis, įskaitant inkstų ląstelių karcinomą. 9, 40, 41 Kliniškai mes nustatėme, kad β-katenino ekspresija yra vertinga prognozuojant ccRCC prognozę. Mes toliau ištyrėme, kaip IL-6 kartu su suspaudimu aktyvina β-kateniną. Vienas iš patikimų paaiškinimų, kodėl IL-6 gydomos vėžio ląstelės reaguoja į suspaudimą, yra tas, kad, suspaudus, jis suaktyvina mechanosensorių, pavyzdžiui, su integrinu susijusią židinio adhezijos kinazę (FAK), reaguodamas į mechaninį stresą. 42, 43 Panašiai, mūsų tyrimas rodo, kad ITGA6, ITGB2 ir ITGA2 ekspresija žymiai padidėja suspaudimo grupėje, palyginti su kontroliniais (4e pav.). Jėgos sukelti baltymų konformacijos pokyčiai ir baltymų struktūriniai motyvai perduoda fizinius signalus 44, todėl suspaudimas kartu su IL-6 suaktyvina Akt / GSK / β-katenino signalizacijos kelią ir pagerina ccRCC progresą.

Kombinuotoje grupėje mes parodėme, kad PI3K / Akt tarpininkaujantis GSK-3β fosforilinimas sukelia β-katenino kaupimąsi branduolyje, kur jis sąveikauja su Oct4 ir Sox2, kad galėtų reguliuoti kamieninių ląstelių atsinaujinimą. Be to, CD44, kuris taip pat yra Wnt / GSK-3 / β-katenino signalizacijos kelio taikinys, 45 yra reikšmingai padidintas derinyje. Be to, CD44 ekspresija buvo stipriai susijusi su klinikine stadija, Fuhrmano laipsniu ir metastazėmis, rodančia CD44 ekspresijos ccRCC prognostinę vertę.

Apibendrinant, mūsų tyrimas pateikia naują perspektyvą į mechanizmus, kuriais grindžiamas Akt / GSK / β-katenino signalizavimas ccRCC. Mūsų išvados rodo, kad augimo sukeltas kietas stresas padidina EMT ir stiebo savybes, kurias sukelia IL-6. Be to, β-kateninas ir CD44 yra galingi prognostiniai biologiniai žymenys, skirti klinikiniam pacientų, sergančių ccRCC, gydymui.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūros

Žmogaus ccRCC ląstelių linijos 786-O, A498 ir ACHN buvo gautos iš ATCC (Manassas, VA, JAV). Dabartiniame tyrime mes gaivinome šias ląstelių linijas iš atsargų eksperimentui ir panaudojome mažiau nei 6 mėnesius po gaivinimo. Visos ląstelės buvo tiriamos reguliariai ir buvo neigiamos mikoplazmos atžvilgiu. 786-O buvo palaikomi kaip monokristalinės kultūros RPMI 1640 terpėje (Gibco, Carlsbad, CA, JAV) su 10% FBS, A498, ACHN ir buvo auginamos minimalioje būtinosios terpės (MEM) terpėje (Gibco, Carlsbad, CA, JAV) su 10 % FBS. Visos ląstelės buvo inkubuotos 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2 . Ląstelės, apdorotos 50 ng / ml IL-6 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, JAV). Akt inhibitorius MK-2206 (Selleck Chemicals, Hiustonas, Teksasas, JAV) buvo ištirpintas kaip 10 mM pradinis tirpalas DMSO ir laikomas -20 ° C.

Imunohistochemija

Trumpai tariant, audinių dalys buvo rehidratuotos ir panardintos į 0, 3% H2O2, po to apdorotos citrato buferiu (10 mM, pH 6, 0). Po to skyriai buvo gydomi pirminiais antikūnais taip: α-SMA (kat.ab5694, 1: 200 skiedimas, Abcam), Kolagenas I (kat.ab138492, skiedimas santykiu 1: 500, Abcam), CD4 (kat.ab133616, 1: 500 skiedimas, Abcam), β-kateninas (kat. 51067-2-AP, skiedimas santykiu 1: 100, Proteintech), CD44 (kat. Ab51037, 1:50 skiedimas, Abcam) per naktį 4 ° C temperatūroje, paskui antriniai antikūnai ir 20 min. Inkubacija su avidin-biotino kompleksu kambario temperatūroje. Skyriai buvo vizualizuoti diaminobenzidino tetrahidrochlorilo substratu ir hematoksilino kontrastine danga. Vaizdai buvo gauti naudojant „Leica“ mikroskopą (DM4000B), padidinant × 200 arba × 400.

Pacientai ir stebėjimas

PCR matricai ccRC ir šalia esantys vėžiniai audiniai buvo paimti iš 10 pacientų iš Dalianų medicinos universiteto (Kinija) pirmosios dukterinės ligoninės. Visų audinių pobūdis buvo patvirtintas Daliano medicinos universiteto Pirmosios dukterinės ligoninės Patologijos skyriuje. Švieži navikų ir neoplastinių gretimų inkstų audiniai buvo surinkti operacijos metu ir užšaldyti skystu azotu. Šiame tyrime naudojami naviko prigludę inkstų audiniai buvo daugiau kaip 3 cm atstumu nuo naviko pakraščio. Visi dalyviai pateikė rašytinį informuotą sutikimą pagal protokolą, patvirtintą Kinijos klinikinių tyrimų registre (registracijos numeris: ChiCTR-POC-15006412), ir pažymėta klinikinė informacija (1 lentelė). Pacientai, kuriems buvo atlikta ccRCC rezekcija, buvo surinkti penkiasdešimt penkiose navikinėse dalyse ir suporuotose gretimose atkarpose. Nuo 2009 m. Iki 2010 m. Stebėjimo duomenys buvo renkami kas 6 mėnesius, atliekant ambulatorinius apsilankymus, telefono skambučius ar vizitus biure. Paskesnių tyrimų duomenys buvo cenzūruoti 2016 m. Gruodžio mėn. Objektiniai stiklai buvo paimti iš pacientų, kuriems atlikta ccRCC (metastazių, veninio trombo ar LVI) rezekcija su suderintu pirminiu naviko audiniu, prieinamu nuo 2013 iki 2016 m. Duomenys, įskaitant klinikinę informaciją, patologines charakteristikas ir AJCC stadijas. buvo surinkti ir parodyti 2 lentelėje.

T ląstelių pogrupių išskyrimas

Blood was collected from healthy donors. All the donors wrote informed consent under a protocol approved by the Chinese Clinical Trial Registry (Registration number: ChiCTR-POC-15006412). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected by Ficoll (Biochrom AG)–based density gradient centrifugation at 1400 rpm for 25 min. Buffy coats were taken off and washed twice in PBS 2 mmol/l EDTA. For lymphocyte subpopulations, naive CD4+ T lymphocytes were isolated by magnetic sorting using an AutoMACS Separator (Miltenyi Biotec). The T-cell isolation procedure yielded cells that were >90% positive for CD3 and CD4 as defined by immunocytometry.

Co-culture assay

According to the manufacturer's instructions (ebioscience), the isolated CD4+ T cells were directly stimulated by anti-CD3/anti-CD28 antibody-coated beads and IL-2 (150 U/ml) overnight. Tumor lines at 2 × 10 5 cells per well were added to 24-well plates with 2 × 10 6 PBMC in the top plates of inserts, and for 48 h at 37 °C. Supernatants were then collected for further analysis.

ELISA

The concentrations of IL-6 (cat. DY206; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α, cat. WA126; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) and transforming growth factor-beta (TGF-β, cat. DY240; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) in cell culture supernatants were examined according to the manufacturers' instructions.

Imunofluorescencija

After serum starvation (1% FBS) for 24 h, RCC cells (5 × 10 4 /ml) were incubated with or without IL-6 and/or compression (50 ng/ml, 4 mmHg) for 24 h. Primary antibody (E-cadherin, cat. ab40772, 1:200 dilution; α-SMA, cat. ab196919, 1:200 dilution; Vimentin, cat. ab92547, 1:200 dilution; Cortactin, cat. ab81208, 1:200 dilution; CytoPainter Phalloidin, cat. ab176756; Abcam) was incubated overnight at 4 °C. Rhodamine-labeled secondary antibodies were from Invitrogen. After washing with PBS, DAPI was applied for 5 min at room temperature. Images were taken using the fluorescence microscope (Leica, TCS SP8).

Vakarų dėmė

Protein was extracted in RIPA Lysis buffer and protease inhibitor (Thermo). Thirty micrograms of protein from each sample were separated on 10% SDS-polyacrylamide gel. GAPDH tarnavo kaip pakrovimo valdymas. Details are listed in Supplementary Table 1.

Migracijos ir invazijos testai

Migration and invasion assays were evaluated by Transwell assays (Corning Life Sciences, Bedford, MA, USA) and Matrigel (BD Biosciences). Cells were stained and counted in four random fields per transwell. Mean values of migratory or invasive cells were set as percentages relative to control. Data were based on three independent experiments.

'Tumor Microenvironment' PCR Array

Expression of 'Tumor Microenvironment'-related genes from the 10 specimens of primary clear cell renal cell carcinoma and nearby normal kidney after resection was determined by the 'Designed PCR Array' (SuperArray Inc.) designed by our research group and obtained from Kangchen Genechip, Shanghai, China.

Microarray analysis of cell samples

RNA was extracted from cells treated under different conditions following the manufacturer's protocol and repurified by an RNAeasy Mini-spin column (Qiagen). Differentially expressed genes were further analyzed with GO and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) for their functions and related pathways.

Ląstelių gyvybingumo tyrimai

Cell survival rate was assessed using a CCK8 colorimetric assay (Beyotime, Hangzhou, China) as previously described. Briefly, compressed cells (0–5 mmHg for 16 h) were plated in 96-well plates (2 × 10 3 cells/well) at 37 °C with 5% CO 2, and the absorbance was recorded at 450 nm using a micro-plate reader (BIOTEK, Vermont, USA).

Srauto citometrijos analizė

Cells were washed twice in ice-cold PBS and stained with CD133/1-PE (Miltenyi Biotec, CA, USA), and APC-conjugated anti-CXCR4 antibody (BD Biosciences, 560936, San Diego, CA, USA). The stained cells were analyzed using a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson).

Mimicking the compression in vitro

After establishing the physical model of compressive stress. RCC cells were seeded in the top chambers of 0.4 μm or 8 μm (Corning) six well inserts. One milliliter and 1.5 ml medium were added to the top and bottom chambers, respectively. After adhering to the transwell membrane, we added a calculated weight to an agarose disk on top of the cells. For controls the agarose disk was applied without the calculated weight. The calculated weight was 10.6 g, and the area of the piston was 201 mm 2 (16 mm diameter).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

ccRCC

aiški ląstelių inkstų ląstelių karcinoma

CSC

vėžio kamieninės ląstelės

ECM

tarpląstelinė matrica

EMT

epithelial-mesenchymal transition

LVI

lymphovascular invasion

TME

tumor microenvironment.

Publisher's note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Oncogenesis“ svetainėje (//www.nature.com/oncsis).