H5n1 gripo virusui būdingas mirnos tipo mažas rna padidina citokinų gamybą ir pelių mirtingumą, nes nukreiptas į poli (rc) surišantį baltymą 2 | ląstelių tyrimai

H5n1 gripo virusui būdingas mirnos tipo mažas rna padidina citokinų gamybą ir pelių mirtingumą, nes nukreiptas į poli (rc) surišantį baltymą 2 | ląstelių tyrimai

Anonim

Dalykai

  • Gripo virusas
  • RNR jungiantys baltymai
  • Mažos RNR
  • Virusinio kompiuterio atsakas

Anotacija

Užkrėtimas H5N1 gripo virusu sukelia didžiausią mirtingumą tarp visų gripo virusų. Nepilnai suprantami tokio didelio viruso patogeniškumo mechanizmai. Čia mes pranešame, kad H5N1 gripo virusas koduoja į mikroRNR panašią mažą RNR, miR-HA-3p, kuri yra apdorojama iš Argonaute 2 kamieno kilpos turinčio viruso RNR pirmtako, ir vaidina svarbų vaidmenį didinant citokinų gamybą H5N1 infekcijos metu. . Mechanistinis tyrimas rodo, kad miR-HA-3p nukreipia poli (rC) surišantį baltymą 2 (PCBP2) ir slopina jo raišką. Kadangi PCBP2 yra svarbus neigiamas RIG-I / MAVS tarpininkaujamo įgimto imuniteto reguliatorius, miR-HA-3p slopindamas PCBP2 raišką, jis skatina citokinų gamybą žmogaus makrofaguose ir pelėse, užkrėstose H5N1 virusu. Darome išvadą, kad miR-HA-3p yra pirmasis identifikuotas į gripo virusą koduotas mikroRNR panašus funkcinis RNR fragmentas ir naujas virulentiškumo faktorius, prisidedantis prie H5N1 sukeltos „citokinų audros“ ir mirtingumo.

Įvadas

Atsitiktinis labai patogeniško H5N1 paukščių gripo viruso plitimas iš naminių paukščių daugelyje šalių pabrėžia grėsmę visuomenės sveikatai. Nuo 2003 m. 15 tautų buvo pranešta apie daugiau kaip 600 laboratoriškai patvirtintų H5N1 infekcijų, kurių mirtingumas viršija 50% 1 . Žmonių ligoms, atsirandančioms dėl H5N1 viruso infekcijos, gali būti būdingi daugybiniai organų sutrikimai, neurologinės ligos ir virusinė pneumonija su ūmaus kvėpavimo distreso sindromu (ARDS) 2 . Tarp visų ligų, kurias sukelia H5N1 viruso infekcija, ARDS yra pagrindinė H5N1 žmonių mirtingumo priežastis. Vienas plačiai priimtas ARDS patogenezės modelis yra tas, kad H5N1 infekcija sukelia šeimininko įgimto imuninio atsako disreguliaciją, sukeldama netinkamą chemokinų ir proinflammatorinių citokinų išsiskyrimą 3, 4, 5 . Dėl citokinų audros didelis uždegiminių ląstelių antplūdis patenka į kvėpavimo takus, todėl plaučių audinys gali būti „papildomas“ ir pažeistas deguonies pokytis alveolėse 6 . Tačiau per didelis chemokinų ir uždegimą sukeliančių citokinų 7 išsiskyrimas neslopina H5N1 viruso replikacijos, taigi nenutrūkstamas viruso dauginimasis ir didėjantis uždegimas sukeliantis citokinų išsiskyrimą sudaro užburtą ciklą. Todėl paciento išgyvenimui yra būtina rasti būdą, kaip efektyviai kontroliuoti su H5N1 infekcija susijusią „citokinų audrą“. Ankstesnės ataskaitos parodė, kad virusiniai baltymai (tokie kaip NS1 ir PB1-F2) gali paveikti labai patogeniškų H5N1 virusų virulentiškumą, moduliuodami šeimininko ląstelės įgimtus imuninius atsakus 8, 9, 10, 11 . Tačiau mechanizmai, reguliuojantys H5N1 sukeltą uždegimą sukeliančių citokinų ir chemokinų išsiskyrimą, išlieka neaiškūs.

MikroRNR (miRNR) priklauso vienos grandinės mažų (19–25 nukleotidų) RNR, galinčių slopinti specifinių mRNR ekspresiją jungiantis prie komplementarių sekų, esančių tikslinėse mRNR 12, 13, 14, kategorijoje . Iki šiol buvo nustatyta per 250 virusinių miRNR ir beveik visi jie yra koduojami DNR virusų arba retrovirusinių RNR virusų 15, 16, 17, 18 . Taigi, nesant RNR viruso užkoduotų virusinių miRNR, daugelis padarė išvadą, kad normalūs virusai, turintys RNR genomus, negali būti naudojami miRNR keliu, nes perdirbant plaukų segtuką būtų sugadintas viruso RNR genomas ir mRNR 17 . Tačiau gripo A virusai, skirtingai nuo daugelio RNR virusų, kurie transkriptuoja ir atkartoja jų genomą užkrėstų ląstelių citoplazmoje, užbaigia šiuos procesus užkrėstų ląstelių branduolyje 19 . Be to, gripo A virusų genomą sudaro aštuoni neigiamo pojūčio viengrandiai RNR segmentai (vRNR), kurie naudojami kaip virusų mRNR ir komplementariųjų RNR (cRNR) transkripcijos šablonai 19 . VRNR ir cRNR gali padėti išvengti skilimo, nes jie gali sudaryti ribonukleoproteinų kompleksus (vRNP) jungdamiesi su viruso polimeraze ir nukleoproteinų (NP) 19 monomeru. Viengrandės mRNR molekulės taip pat gali apsisaugoti nuo skilimo, sudarydamos antrines struktūras per sąveiką per papildomus segmentus 20 . Neseniai buvo pranešta, kad į miRNR panašias mažas RNR gamina RNR virusai, tokie kaip Vakarų Nilo virusas ir Dengue virusas 21, 22 . Visa tai paskatino mus kelti hipotezę, kad H5N1 gripo virusas, kaip RNR virusas, gali užkoduoti į miRNR panašius mažus RNR fragmentus, kurie savo ruožtu gali prisidėti prie mirtinų H5N1 infekcijų panašiai, kaip tam tikri egzogeniniai miRNR, pranešti moduliuojant ląstelės-šeimininkės funkcijos 23, 24 .

Šiame tyrime, naudojant „Solexa“ sekos nustatymą, šiaurinį blotą ir kiekybinius RT-PGR tyrimus, mes patvirtinome, kad H5N1 gripo virusas koduoja į miRNR panašią mažą RNR, miR-HA-3p. Mechanistinis tyrimas rodo, kad miR-HA-3p prisideda prie „citokinų audros“ H5N1 infekcijos metu, nukreipdamas į poli (rC) surišantį baltymą 2 (PCBP2), svarbų neigiamą RIG-I / MAVS tarpininkaujamo antivirusinio imuniteto reguliatorių. Rezultatai, gauti iš viruso užkrėsto žmogaus pirminio makrofago ir pelės modelio, rodo, kad miR-HA-3p yra svarbus virulentiškumo faktorius, prisidedantis prie H5N1 sukeltų makrofagų uždegiminių reakcijų ir pelių mirtingumo.

Rezultatai

H5N1 gripo virusas koduoja į miRNR panašią mažą RNR, miR-HA-3p

Norint nustatyti, ar H5N1 gripo virusas gali užkoduoti mažas, į RNR panašias RNR, mažas RNR (<30 nt), išgautas iš A549 ląstelių, užkrėstų H5N1 gripo virusu (A / Jiangsu / 1/2007 (H5N1), MOI = 1) 48 h buvo sekuota „Solexa“ giluminio sekvenavimo technologija. Rezultatai parodė, kad H5N1 užkrėstose A549 ląstelėse yra iš H5N1 gautų mažų RNR fragmentų (GEO prisijungimo numeris: GSE67222). Iš viso iš 10 374 143 skaitymų buvo gauta 9 303 skaitymai iš 466 skirtingų H5N1 išvestų mažų RNR (1A pav.). Šešios iš H5N1 gautos mažos RNR parodo daugiau nei 200 skaitymų (1B paveikslas). Tarp šių H5N1 išvestų mažų RNR didžiausias kopijų skaičius buvo FLU-vsRNR-1, kuris buvo panašiame funkcinių endogeninių miR-25-3p ir miR-31-5p diapazone (1B paveikslas). Norint dar labiau patvirtinti H5N1 koduojamų mažų RNR egzistavimą, buvo atlikta kamieninės kilpos atvirkštinė transkripcija, po kurios sekė kiekybinė RT-PGR (qRT-PGR) visoms šešioms mažoms RNR (1C pav.), Naudojant RNR, gautus iš HEK293A, HEK293T, A549 ir MDCK ląstelės, užkrėstos A / Jiangsu / 1/2007 (H5N1) (MOI = 1) 48 valandas. Virusinių mažų RNR ekspresijos lygis buvo normalizuotas iki U6 snRNR lygio ir buvo pateiktos vertės, palyginti su RNR, gautais iš maketų užkrėstų ląstelių. Keturios mažos RNR, turinčios santykinai didesnį skaitymo skaičių, buvo lengvai aptiktos visose ląstelėse praėjus 48 valandoms po užkrėtimo, o kitos dvi virusinės mažos RNR buvo ekspresuojamos labai žemu lygiu (1C paveikslas). Mes taip pat patvirtinome FLU-vsRNR-1 raišką visose RNR, išskirtose iš HEK293A, HEK293T, MDCK ir A549 ląstelių, užkrėstų A / Jiangsu / 1/2007 (H5N1), atlikdami šiaurinių blot analizę (1 pav. D).

Image

Į mikroRNR panašius mažus RNR fragmentus, užkoduotus H5N1 gripo virusu. (A) Iš H5N1 gaunamų mažų RNR pasiskirstymas pagal dydį H5N1 virusu užkrėstose A549 ląstelėse (MOI = 1), aptiktas Solexa seka. (B) H5N1 gautų mažų RNR sekos ir skaitiniai duomenys, nustatyti H5N1 užkrėstose A549 ląstelėse, aptikti atliekant „Solexa“ seką. (C) Šešių H5N1 koduotų mažų RNR lygiai H5N1 užkrėstose ląstelėse, aptikti kiekybine RT-PGR (qRT-PGR). Visos vertės buvo palyginti su užkrėstomis ląstelėmis ir normalizuotos iki U6. (D) Visų RNR, išskirtų iš H5N1 arba Mock užkrėstų ląstelių, Northern blot analizė. Buvo naudojamas DIG pažymėtas LNA zondas, papildantis FLU-vsRNR-1 seką. Ląstelinė maža RNR U6 taip pat buvo tiriama kiekviename taške kaip įkrovos kontrolė. (E) H5N1 užkoduoto pre-miR-HA-3p genomo padėtys ir numatoma kamieninės kilpos antrinė struktūra. Raudona: 5 ′ seka; žalia: kilpos seka; mėlyna: 3 ′ seka. (F) Numatomo miR-HA-3p išsaugojimas 455 labai patogeniškose H5N1 padermėse.

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar H5N1 užkoduota FLU-vsRNR-1 yra į miRNR panašus mažas RNR fragmentas, sukūrėme kompiuterinį algoritmą, pagrįstą struktūrinėmis ypatybėmis ir panašumu į žinomus miRNR pirmtakus, kad būtų galima atrasti tipinę į plaukų smeigtukus panašią kamieninės kilpos struktūrą. miRNR pirmtakai. Antrinės kandidatų miRNR struktūros buvo numatytos naudojant Mfold algoritmą 25 . Pritaikę algoritmą pamatinėms genomo sekoms, gautoms iš Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro (NCBI) duomenų bazės, mes numatėme vieną FLU-vsRNR-1 pirmtaką 3p grupėje ir tokiu būdu pervadinome FLU-vsRNR-1 kaip miR-HA -3p (1E pav.), Atsižvelgiant į tai, kad numatomas pirmtakas yra gautas iš virusinį HA segmentą koduojančios srities. Dėl didelio gripo viruso genomo mutacijų greičio mes ištyrėme viruso išgauto miR-HA-3p evoliucinį išsaugojimą, suderindami miR-HA-3p seką su šiuo metu skelbiamomis pilno ilgio HA sekomis iš 455 labai patogeniškų H5N1 padermių., ir nustatė, kad prognozuojama miRNR buvo labai konservuota tarp 455 H5N1 padermių (1F pav.). Taigi miR-HA-3p neapsiribojo konkrečiu izoliatu, bet buvo labai konservuotas tarp labai patogeniškų H5N1 gripo virusų.

MiR-HA-3p biogenezė priklauso nuo unikalios viruso pre-miRNR ir Ago2 plaukų segtuko struktūros

Norėdami toliau parodyti, kad miR-HA-3p yra generuojamas iš specifinio viruso pre-miRNR, bet ne atsitiktinio viruso genomo skilimo produkto, mes klonavome išankstinį miR-HA-3p seką į vektorių pcDNA6.2, gautą tirpalą transfekavome plazmidę į A549 ląsteles ir analizuodami ląstelių RNR atlikdami šiaurinį blotą, naudodami tris specifinius užrakinto nukleorūgšties (LNR) modifikuotus oligonukleotidinius zondus: 5 ′ zondą, 3 ′ zondą ir kilpos zondą, kurie papildo seką, gautą iš 5 Pre-miRNR stiebas, 3 ′ stiebas ir galinė kilpa atitinkamai (2A pav.). Kaip parodyta 2A paveiksle, naudojant 3 ′ zondą, buvo aiškiai aptiktas 22-nt miR-HA-3p, patvirtinantis, kad miR-HA-3p iš tiesų gaminamas iš specifinės pre-miRNR sekos, o ne atsitiktinio viruso skilimo produkto. genomas. Norėdami toliau ištirti, ar „Solexa“ aptiktos miRNR ir qRT-PGR iš tikrųjų gaminamos H5N1 užkrėstose ląstelėse, A549 ląstelės buvo užkrėstos A / Jiangsu / 1/2007 (H5N1). Bendros RNR, išskirtos iš užkrėstų ląstelių, buvo tiriamos šiauriniame blot'e naudojant tris skirtingus aukščiau paminėtus zondus. „MiR-HA-3p“ iš 22 nt, taip pat, kaip spėjama, iki – MiR-HA-3p, apie 70 nt, buvo aiškiai aptikti naudojant 3 ′ zondą, tuo tarpu naudojant tik vieną iš jų, nebuvo aptikta tik didesnių RNR, bet nebuvo 22-nt RNR. 5 ′ zondas arba kilpos zondas (2B paveikslas). Tai, kad ši 22-nt maža RNR turi atskirą sekos kompoziciją, aiškiai rodo, kad tai nėra didesnių RNR skilimo produktas, bet miRNR, perdirbta iš specifinės pre-miRNR. Be to, A549 ląstelės, užkrėstos kitu H5N1 gripo viruso izoliatu A / Anhui / 2/2005, taip pat gamino miR-HA-3p (Papildoma informacija, S1 pav.), Patvirtindamos, kad miR-HA-3p susidaro šeimininku infekuotame ląstelės yra dažnas įvairių H5N1 gripo viruso izoliatų reiškinys. Tada mes išbandėme, ar viruso miR-HA-3p generacija dalijasi žinduolių miRNR biogenezės keliu. Atsižvelgiant į tai, kad „Dicer“ ir „Drosha“ vaidina svarbų vaidmenį miRNR 26, 27, 28, 28 biogenezėje, o „Ago2“ taip pat dalyvauja kelių netipinių miRNR subrandinime skaidydami ikimRNR 29, mes numušėme atitinkamai „Dicer“, „Drosha“ arba „Ago2“ A549 ląstelėse., naudojant RNR trukdžių (RNR) metodą. Tada ląstelės su „Dicer“, „Drosha“ ar „Ago2“ numušimu arba be jų buvo užkrėstos A / Jiangsu / 1/2007 (H5N1). Ląstelinio „Dicer“, „Drosha“ ar „Ago2“ numušimo efektyvumas buvo patvirtintas atliekant „Western blot“ analizę (papildoma informacija, S2A-S2C paveikslas). Mes nustatėme, kad miR-HA-3p gamyba žymiai sumažėjo „Ago2“ nutildytose ląstelėse, palyginti su ląstelėmis, perkeltomis su kontroline siRNR, tuo tarpu skirtumų tarp „Dicer“ ar „Drosha“ numuštų ląstelių nenustatyta (2C pav.). Norėdami patvirtinti, kad „Ago2“ vaidina pagrindinį vaidmenį miR-HA-3p biogenezėje, mes toliau išmušėme „Ago2“ A549 ląstelėse, naudodami CRISPR-Cas9 metodiką 30, ir tada ląsteles užkrėtėme A / Jiangsu / 1/2007 (H5N1). „Ago2“ nokautas buvo patvirtintas Western blot analize (papildoma informacija, S2D pav.). Vėliau miR-HA-3p lygiai buvo analizuojami naudojant šiaurinį blotą. Rezultatas parodė, kad Ago2 išmušimo ląstelėse nebuvo aptiktas subrendęs miR-HA-3p, tuo tarpu ikimR-HA-3p signalas buvo padidėjęs (2D paveikslas). Šis rezultatas dar rodo Ago2 vaidmenį miR-HA-3p biogenezėje. Tie patys rezultatai buvo gauti, kai „Ago2“ buvo nutildyti A549 ląstelėse prieš jas transfekuojant pcDNA6.2-pre-miR-HA-3p (2E pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad viruso miR-HA-3p brendimas vyksta ne klasikiniu, nuo Ago2 priklausomu, bet nuo Dicer ir Drosha nepriklausomu keliu.

Image

MiR-HA-3p biogenezė priklauso nuo viruso pre-miRNR ir Ago2 plaukų segtuko struktūros. (A) Visų RNR, išskirtų iš A549 ląstelių, perkeltų pcDNA6.2-pre-miR-HA-3p arba tuščio vektoriaus, 48 ​​h po transfekavimo, bendrojo RNR analizė. Buvo naudojami DIG žymėti LNA 5 ′, zondo ir 3 ′ zondai, kurie papildo seką, gautą iš pre-miRNR 5 'kamieno, galinės kilpos ir 3' kamieno. (B) „ miR-HA-3p“ Northern blot analizė H5N1 arba modelio užkrėstose A549 ląstelėse su trimis skirtingais aukščiau paminėtais zondais, paminėtais 48 valandas po užkrėtimo. (C) Visų RNR, išskirtų iš A549 ląstelių, perkeltų Dicer siRNR (siDicer), Drosha siRNR (siDrosha), Ago2 siRNR (siAgo2) arba kontrolinės siRNR (siNC), prieš H5N1 viruso užkrėtimą, Northern blot analizė. Buvo naudojamas DIG pažymėtas LNA zondas, papildantis miR-HA-3p seką. (D) „ miR-HA-3p“ lygio „Northern blot“ analizė A549 ląstelėse ir „H2N1“ virusu užkrėstose A549 ląstelėse „Ago2-no-out“ per 48 valandas po užkrėtimo. Buvo naudojamas DIG pažymėtas LNA zondas, papildantis miR-HA-3p seką. (E) Visų RNR, išskirtų iš A549 ląstelių, transfekuotų siAgo2 arba siNC, prieš transfekuojant pcDNA6.2-pre-miR-HA-3p, Northern blot analizė. Buvo naudojamas DIG pažymėtas LNA zondas, papildantis miR-HA-3p seką. EV, tuščias vektorius; CV, kodavimo vektorius.

Visas dydis

„MiR-HA-3p“ nukreipia į šeimininko ląstelių poli (rC) surišimo baltymą 2

Paprastai laikoma, kad gripo virusas yra atpažįstamas iš įgimtos šeimininkų imuninės sistemos per tris pagrindinius atpažinimo receptorius (PRR), į Toll panašius receptorius, retinoinės rūgšties indukuojamą I geną (RIG-I-) ir į NOD panašius receptorių šeimą. 31 Šie PRR ir jų atitinkami signalizacijos pasroviui vaidina esminį vaidmenį skatinant priešuždegiminių citokinų ir I tipo interferonų ekspresiją. Norėdami ištirti miR-HA-3p funkciją moduliuodami H5N1 infekcijos sukeltą citokinų audrą, atlikome tikslinio geno analizę, naudodami Targetscan ir RNAhybrid algoritmus 32, 33 . MiR-HA-3p turi iš viso 16 galimų taikinių genų žmogaus genome (3A pav.). Naudodamiesi genų ontologijos (GO) analize 34, mes suklasifikavome identifikuotus genus į grupes pagal jų biologinius procesus. Į šias grupes buvo įtraukti baltymai, kurie dalyvauja neigiamame gynybinio atsako reguliavime (GO: 0031348), imuninio efektoriaus proceso reguliavime (GO: 0002697), gynybinio atsako į virusą reguliavime (GO: 0050688), atsako į stimulą reguliavime (GO: 0048583), neigiamas imuninio efektoriaus proceso reguliavimas (GO: 0002698), reagavimo į stresą reguliavimas (GO: 0080134) ir imuninio efektoriaus proceso (GO: 0002252) (3B paveikslas). Atsižvelgiant į tai, kad identifikuoti genai daugiausia dalyvauja reguliuojant šeimininkų ląstelių gynybos reakciją į virusą, mes tokiu būdu sutelkėme dėmesį į skirtingai išreikštus baltymus.

Image

„MiR-HA-3p“ sumažina PCBP2 ekspresiją nukreipdamas į PCBP2 mRNR 3 ′ UTR. (A) „MiR-HA-3p“ galimų taikinių genų, išanalizuotų naudojant „Targetscan“ ir „RNAhybrid“ algoritmus, sąrašas. (B) Numatomi miR-HA-3p genai, klasifikuojami GO duomenų bazėse remiantis biologiniu procesu. (C) Numatoma miR-HA-3p jungimosi vieta PCBP2 3 ′ UTR. 3 ′ UTR mutante pakeistas nukleotidas (raudonas) buvo pažymėtas rodyklėmis. (D, E) Liuciferazės aktyvumas HEK293T ląstelėse, transfekuotose plazmidėmis, koduojančiomis laukinio tipo (WT) arba mutavusiomis (MUT) 3 ′ UTR žmogaus (D) ar pelių (E) PCBP2 ir kontroliniu agomiru, agomiro-HA-3p arba mutantu. agomir-HA-3p. (F, G) PCBP2 baltymo (F) ir mRNR ( G) lygiai A549 ląstelėse, perkeltose kontroliniu agomiru, agomir-HA-3p, mutantu agomir-HA-3p arba PCBP2 siRNR. GAPDH išraiška buvo analizuojama kaip kontrolė. (H) PCBP2 mRNR lygis imunoprecipifikuotuose kompleksuose iš A549 ląstelių, perkeltų kontroliniu agomiru, agomir-HA-3p arba mutantu agomir-HA-3p, naudojant anti-Ago2 antikūnus arba kontrolinį IgG; Aukščiausias, vakarinis „Ago2“ baltymo dėmė A549 ląstelėse (įvesties kontrolė). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM ( n = 3). ** P <0, 01.

Visas dydis

Kaip PCBP2, hNRNP E šeimos RNR rišančių baltymų, sąveikaujančių su vienos grandinės poli (C) traktų sekos specifiniu motyvu, narys, dalyvauja ir gynybinio atsako į virusą reguliavime, ir neigiamame imuninio efektoriaus proceso reguliavime, mes pasirinktinai išbandėme, ar PCBP2 tarnavo kaip tikslinis miR-HA-3p genas H5N1 sukeltoje nekontroliuojamoje imuninėje reakcijoje. PCBP2, ne tik reguliuojantis mRNR vertimą ir palaikantis mRNR stabilumą 35, yra būtinas siekiant užkirsti kelią per dideliam imuniniam atsakui, nes jis yra pagrindinis neigiamas reguliatorius MAVS signalizacijos kelyje 36 . MAVS tarpininkaujantis antivirusinis signalizavimas buvo gerai žinomas kaip pagrindinis šeimininko ląstelių gynybos mechanizmas nuo virusų, ypač H5N1, 37, 38 . Kaip neigiamas reguliatorius, PCBP2 gali sąveikauti su MAVS, dėl to jis blogėja 36 . Todėl per didelis PCBP2 ekspresija ar numušimas atitinkamai slopins arba paskatins ląstelių uždegiminį atsaką į virusinę infekciją. Tokiu atveju H5N1 užkoduotas miR-HA-3p gali sustiprinti MAVS tarpininkaujantį antivirusinį signalą, nutildydamas neigiamą reguliatorių PCBP2, sukeldamas per didelį imuninį atsaką ar citokinų audrą H5N1 infekcijos metu. Numatoma miR-HA-3p sąveika su PCBP2 taikinių vietomis buvo parodyta 3C paveiksle. Hibridizacijos minimali laisvoji energinė vertė buvo −25 kcal / mol, o ši vertė tiksliai atitiko tikrų miRNR ir taikinių porų diapazoną. Be to, pelėms buvo atlikta miR-HA-3p tikslinė analizė ir gauti panašūs rezultatai. Norėdami patikrinti, ar H5N1 gautas miR-HA-3p reguliuoja PCBP2 raišką, visas žmogaus ar pelės PCBP2 3′-UTR buvo įterptas į ekspresijos vektorių, tiesiai šalia židinio pelenų luciferazės atvirojo skaitymo rėmo. Be to, mes sukūrėme konstruktus su dviem nukleotidų mutacijomis PCBP2 3′-UTR „sėjimo“ sekoje (3C pav.). Kaip parodyta 3D ir 3E paveiksle, mes pastebėjome, kad miR-HA-3p agonistas (agomir-HA-3p) reikšmingai sumažino žvirblinės luciferazės, sulietos su PCBP2 laukinio tipo 3′-UTR, raišką, o mutavusį miR-HA-3p agonistas (agomir-HA-3p (M)) to nepadarė. Atliekant abipusį eksperimentą, kuriame HEK293T ląstelės buvo transfekuotos žvirblinio luciferazės vektoriu, sulietu su mutavusiu PCBP2 3′-UTR, nei agomir-HA-3p, nei agomir-HA-3p (M) įtakos luciferazės aktyvumui neturėjo (pav. 3D ir 3E). Šie rezultatai parodė, kad miR-HA-3p gali tiesiogiai nukreipti sekas į PCBP2 mRNR 3′-UTR.

Norėdami patikrinti, ar miR-HA-3p pakanka norint sureguliuoti PCBP2 baltymo ekspresiją, mes ištyrėme PCBP2 baltymo lygį, kai A549 ląstelėse yra miR-HA-3p. Kaip kontrolė, buvo naudojamas RNAi konstruktas, specifinis PCBP2, kuris gali iš esmės sumažinti PCBP2 ekspresiją. Po agomir-HA-3p transfekcijos į A549 ląsteles, PCBP2 ekspresija buvo reikšmingai slopinta, kaip nustatyta atliekant Western blot analizę, tačiau agomir-HA-3p (M) negalėjo paveikti PCBP2 baltymų ekspresijos (3F pav.). „MiR-HA-3p“ sugebėjimas sumažinti PCBP2 baltymų ekspresijos reguliavimą buvo toks pat efektyvus kaip ir siPCBP2. Priešingai, tarp ląstelių, gydomų agomir-HA-3p ir kontrolinio agomiro, PCBP2 mRNR transkripto lygio skirtumų nepastebėta (3G paveikslas), kas rodo, kad miR-HA-3p vaidina reikšmę transliacijos represijose, bet ne mRNR degradacijoje. Norint gauti tiesioginį įrodymą, kad miR-HA-3p nukreipė PCBP2, buvo atliktas RNR surišančio baltymo imunoprecipitacijos eksperimentas, siekiant aptikti PCBP2 mRNR ryšį su Ago2, svarbiu funkcinio RNR sukelto triukšmo slopinimo komplekso (RISC) komponentu. Kaip parodyta 3H paveiksle, A549 ląstelėse, perkeltose su agomir-HA-3p, buvo padaryta ∼ 20 kartų praturtinta su Ago2 surišta PCBP2 mRNR, kas rodo, kad miR-HA-3p fiziškai sąveikauja su PCBP2 mRNR RISC ir tokiu būdu reguliuoja PCBP2 baltymų lygis po transkripcijos. Kaip ir tikėtasi, kai buvo išreikštas agomir-HA-3p (M), su Ago2 surišta PCBP2 mRNR nebuvo praturtinta (3H pav.).

MiR-HA-3p padidina priešuždegiminių citokinų gamybą žmogaus makrofaguose, užkrėstuose H5N1

Apskritai H5N1 viruso neigiamos prasmės ssRNR genomą RIG-I gali atpažinti per savo adapterio baltymą MAVS 38 . Tada RIG-I / MAVS suaktyvina signalines molekules pasroviui, kad būtų sukurti uždegimą sukeliantys citokinai ir I tipo interferonai 6 . Atsižvelgiant į tai, kad H5N1 infekuoti pacientai paprastai turi žymiai aukštesnį citokinų ir chemokinų kiekį, palyginti su pacientais, sergančiais sezoninio gripo viruso infekcija, mes tarėme, kad H5N1 gautas miR-HA-3p gali būti svarbus citokinų ir chemokinų gaminimo skatinimas H5N1 infekcijos metu. RIG-I signalizacijos kelio reguliavimas. Kadangi PCBP2 yra pagrindinis neigiamas RIG-I / MAVS tarpininkaujamos signalizacijos reguliatorius, miR-HA-3p gali moduliuoti RIG-I / MAVS tarpininkaujamą signalizavimą nukreipdamas PCBP2. Makrofagai yra pagrindinis citokinų gamybos šaltinis H5N1 gripo viruso 2 infekcijos metu, todėl žmogaus monocitų gauti makrofagai (MDM) buvo naudojami tiriant miR-HA-3p poveikį citokinų gamybai. Eksperimente elektroporame žmogaus MDM su atitinkamai kontroliuojamuoju agomiru, agomiru-HA-3p arba mutantu agomiru-HA-3p (M). Praėjus 24 val. Po transfekcijos, tarpląstelinis miR-HA-3p lygis buvo reikšmingai padidintas naudojant gydymą agomir-HA-3p, tuo tarpu MDR, gydytais kontroliniu agomiru arba agomir-HA-3p (M), intraląsteliniai miR-HA-3p lygiai nepakito ( Papildoma informacija, S3A paveikslas). Agomir-HA-3p, palyginti su gydymu kontroliniu agomiru arba agomir-HA-3p (M), PCBP2 baltymų lygį labai sumažino (papildoma informacija, S3B paveikslas), o PCBP2 mRNR lygiui šis gydymas reikšmingos įtakos neturėjo ( Papildoma informacija, S3C paveikslas). Norėdami nustatyti miR-HA-3p įtakos specifinių baltymų ekspresijai virusinės infekcijos kontekste specifiškumą, atlikome atvirkštinę genetiką, kad sugeneruotume A / Jiangsu / 1/2007 (H5N1) mutantą su keturiomis sėklos mutacijomis. 'nukleotidai (2, 5, 6 ir 8 nukleotidai brandžios miRNR 5' gale) nepakeisdami aminorūgščių sekos (4A paveikslas). Norėdami įvertinti mutacijos poveikį viruso replikacijai in vitro , mes užkrėtėme makrofagus virusais, kurių MOI yra du. Užkrėstų ląstelių supernatantai buvo surinkti praėjus 3, 6, 12, 24 ir 48 valandoms po užkrėtimo ir buvo titruoti. Nebuvo pastebėta jokių reikšmingų infekcinių laukinio tipo ir mutantinių virusų titrų skirtumų (papildoma informacija, S4 pav.). Tada mes nustatėme miR-HA-3p raiškos modelį H5N1 gripo virusu užkrėstose MDM. Kaip parodyta 4A paveiksle, qRT-PCR analizė patvirtino sėkmingą miR-HA-3p ekspresijos sutrikimą. Laukinio tipo H5N1 gripo virusu užkrėsti MDM pradėjo reikštis santykinai dideliu miR-HA-3p kiekiu praėjus 24 val. Po užsikrėtimo, tuo tarpu MDM, kurie buvo užkrėsti mutavusiu H5N1 virusu, išliko žemas. MiR-HA-3p ekspresijos sutrikimas buvo patvirtintas atliekant šiaurinio blot analizę (4B pav.).

Image

MiR-HA-3p slopinimas sumažina citokinų gamybą pirminiuose makrofaguose H5N1 viruso infekcijos metu. (A) miR-HA-3p lygiai pirminiuose makrofaguose, užkrėstuose H5N1 arba mutantu H5N1 virusu, skirtingais laiko momentais. Aukštyn: scheminis H5N1 mutanto mutacijos vietos aprašymas. Žemyn: pradinis miR-HA-3p lygio pokytis pirminiuose makrofaguose, aptiktas kiekybine RT-PGR (qRT-PGR). (B) „ miR-HA-3p“ Northern blot analizė, naudojant visas RNR, išgautas iš pirminių makrofagų, užkrėstų H5N1 arba mutantiniu H5N1 virusu, praėjus 48 valandoms po užsikrėtimo. Buvo naudojamas DIG pažymėtas LNA zondas, papildantis miR-HA-3p seką. (C) PCBP2 baltymo lygis pirminiuose makrofaguose, elektroporuotuose kontroliniu antagomiru arba miR-HA-3p antagomiru, prieš užkrėtimą H5N1 arba mutantais H5N1 virusais skirtingais laiko momentais. (D) Virusiniai H5N1 arba mutantinių H5N1 virusų titrai virusais užkrėstuose pirminiuose makrofaguose, nustatomi TCID 50 tyrimu, naudojant MDCK ląsteles. (EG) TNF-α (E), IL-6 (F) ir IFN-β (G ) lygiai makrofagų, užkrėstų H5N1 arba mutantų H5N1 virusais, supernatantuose ir skirtingais būdais. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM ( n = 3). * P <0, 05. ** P <0, 01.

Visas dydis

Norėdami ištirti miR-HA-3p vaidmenį reguliuojant H5N1 sukeltą citokinų sekreciją, prieš viruso infekciją elektroporuodavome MDM su miR-HA-3p antagonistu (antagomir-HA-3p) arba kontroliniu antagomiru. Kaip parodyta 4C paveiksle, PCBP2 baltymų kiekį reikšmingai padidino antagomir-HA-3p, palyginti su gydymu kontroliniu antagomiru 24 ir 48 valandas po užsikrėtimo. Kaip ir buvo galima tikėtis, antagomir-HA-3p neturėjo jokio poveikio PCBP2 baltymo lygiui, kai buvo užkrėstas mutantu H5N1 virusu. Siekiant atmesti elektroporacijos, padarytos netaikant tikslinės įtakos viruso replikacijai, galimybę, infekcinio viruso titrai negydytuose MDM arba tie, kurie buvo gydyti antagomiro-HA-3p ar kontroliniu antagomiru, buvo įvertinti titruojant MDCK ląstelėse. Infekcinio viruso titrų skirtumų nenustatyta (4D paveikslas). Norėdami paneigti šalutinį kontrolinio antagomiro poveikį, mes ištyrėme įvairių antagomirų poveikį. Šiam eksperimentui buvo susintetinti trys antagonistai, nukreipti į dvi atsitiktinai parinktas RNR sekas prieš miR-HA-3 prieš srovę ir pasroviui, ir viena miR-HA-3p seka su keturiomis mutacijomis. Makrofagai buvo transfekuoti antagomiro-HA-3p arba įvairiais kontroliniais antagonistais, naudojant elektroporaciją, po to H5N1 infekcija ir viruso titras buvo aptikti praėjus 3, 6, 12, 24 ir 48 valandoms po užkrėtimo. Kaip parodyta papildomos informacijos paveiksle S5, kontrolinis antagomir-1, nei kontrolinis antagomir-2, antagomir-HA-3p (MUT) ir antagomir-HA-3p nepadarė viruso titrų H5N1 užkrėstuose makrofaguose, palyginti su „tuščia“ elektroporacija (buferis). tik)), rodo, kad kontroliniai antagonistai ir antagomir-HA-3p neturi įtakos viruso replikacijai. TNF-α, gerai dokumentuoto citokino, susijusio su H5N1 gripo viruso infekcija, mRNR lygis buvo matuojamas įvairiais laiko momentais po užsikrėtimo. Skirtingai nuo kontrolinio antagomiro, MDM, gydomi antagomiru-HA-3p, parodė sumažintą TNF-α transkripciją per 12, 24 ir 48 valandas po infekcijos (papildoma informacija, S6 pav.). Kadangi IL-6 yra dalis citokinų kaskados, kurią sukėlė TNF-α, IL-6 mRNR taip pat buvo kiekybiškai įvertinta. Praėjus 24 val. Po užsikrėtimo, MDM, gydomiems antagomiro-HA-3p, IL-6 mRNR lygis buvo tik 60% to, kuris aptinkamas ląstelėse, apdorotose kontroliniu antagomiru (papildoma informacija, S6 pav.). Stebėjome panašius kitų citokinų, įskaitant β interferoną (IFN-β) ir interleukiną 1β (IL-1β), rezultatus (papildoma informacija, S6 pav.). Tuo pačiu metu, naudojant ELISA, buvo nustatyta citokinų koncentracija užkrėstų makrofagų supernatantuose. Supernatantai iš kultivuotų makrofagų, gydomų antagomiru-HA-3p, turėjo mažesnę TNF-α, IL-6 ir IFN-β koncentraciją nei tie, kurie buvo gydomi kontroliniu antagomiru 24 ir 48 valandas po užkrėtimo (4E-4G paveikslas). Tiesą sakant, TNF-α, IL-6 ir IFN-β lygiai supernatantuose iš antagomiro-HA-3p gydytų MDM buvo panašūs kaip MDM, užkrėstų mutantu H5N1 virusu. Be to, mes įvertinome TNF-α ir IL-6 lygius, išskiriamus iš H5N1 užkrėstų makrofagų įvairiais laikotarpiais po gydymo kontroliniu antagomir-1, kontroliniu antagomir-2, antagomir-HA-3p (MUT) arba antagomiru. -HA-3p. Rezultatai parodė, kad TNF-α ir IL-6 koncentraciją makrofaguose sumažino tik antagomir-HA-3p, bet ne kontroliniai antagonistai (papildoma informacija, S7 pav.).

MiR-HA-3p prisideda prie H5N1 infekcijos sukelto „citokinų audros“ ir pelių mirtingumo

Norėdami ištirti miR-HA-3p vaidmenį H5N1 sukeltoje citokinų disreguliacijoje in vivo , mes panaudojome nustatytą H5N1 infekcijos pelių modelį. Moterų BALB / c pelių (6 savaičių) grupės buvo intralizuotos į intraną su mirtina H5N1 ar mutavusių H5N1 virusų doze (10 3 EID 50 ) ir sergamumu (matuojant svorio kritimą), mirtingumu, viruso replikacija ir citokinų koncentracija. buvo pasiryžę. Po 8 valandų virusinės infekcijos pelėms į veną buvo švirkščiama 25 mg / kg fiziologinio tirpalo receptūros antagomiro-HA-3p arba kontrolinio antagomiro 5 dienas iš eilės. Kaip parodyta 5 paveiksle, pelių užkrėtimas H5N1 sukelia 100% mirtingumą (5A paveikslas) ir> 20% kūno svorio praradimą 7 dieną po inokuliacijos (5C paveikslas). Kontrolinis antagomiras neturėjo įtakos H5N1 sukeltam pelių mirtingumui ir kūno svorio praradimui. Tačiau kai H5N1 užkrėstos pelės buvo gydomos antagomiru-HA-3p, visos pelės išgyveno 9-tą dieną po inokuliacijos, nors pelės vis tiek smarkiai prarado kūno svorį. Šie rezultatai rodo, kad miR-HA-3p išeikvojimas H5N1 infekuotose pelėse antagomiro-HA-3p dėka gali žymiai sumažinti pelių mirtingumą. Ši miR-HA-3p, kaip mirtino H5N1 virulentiškumo faktoriaus, išvada taip pat buvo patvirtinta mūsų eksperimente, naudojant mutavusį H5N1 virusą. Kaip ir buvo galima tikėtis, pelėms, inokuliuotoms H5N1 (MUT), buvo ilgesnis išgyvenimas (5B paveikslas) ir lėčiau prarasta kūno masė (5D paveikslas), palyginti su H5N1 infekuotomis pelėmis (5A ir 5C paveikslai). Tačiau kai H5N1 (MUT) užkrėstos pelės buvo papildomai gydomos agomir-HA-3p, pelių išgyvenamumas (5B paveikslas) pastebimai sumažėjo, o pelių kūno masės sumažėjimas padidėjo (5D paveikslas). Kaip ir tikėtasi, gydymas kontroliniu agomiru neturėjo įtakos pelių išgyvenamumui ir kūno svorio sumažėjimui, kurį sukėlė H5N1 (MUT) infekcija. Norint nustatyti, ar miR-HA-3p paveikė citokinų gamybą H5N1 gripo viruso infekcijos metu, TNF-α, IFN-β, IL-1β ir IL-6 koncentracijos visų grupių pelių plaučiuose buvo matuojamos skirtingu laiku taškai po infekcijos. Palyginus grupes paaiškėjo, kad H5N1 užkrėstose pelėse buvo didesnis TNF-α, IFN-β, IL-1β ir IL-6 lygis nei H5N1 (MUT) užkrėstose pelėse ar pelėse, užkrėstose H5N1, bet gydomose antagomiro-HA. -3p (5E-5H paveikslas). We further compared the virus titers in mouse lung homogenates after inoculation with H5N1 or H5N1(MUT) and found no substantial differences between the virus titers in H5N1-infected mice and H5N1(MUT)-infected mice (Supplementary information, Figure S8). However, on day 4 post-infection, lungs of mice infected with H5N1 virus had a significantly lower level of PCBP2 protein compared to that of mice infected with H5N1 virus but at the same time treated with antagomir-HA-3p or mice infected with mutant H5N1 virus (Figure 6A). Elevated of miR-HA-3p level was also detected in lung tissues and serum from mice inoculated with H5N1 but not H5N1(MUT) (Supplementary information, Figure S9). Histological examination revealed that depleting miR-HA-3p by antagomir-HA-3p protected mouse lungs from inflammatory damage, as shown in Figure 6B. There was significant and extensive inflammation and necrosis of the bronchial and bronchiolar epithelium that was often accompanied by a sloughing of the epithelium in the lungs of H5N1-infected mice. In contrast, the lungs of mice inoculated with H5N1 but treated with antagomir-HA-3p showed a moderate focal inflammation in the large airways on day 4 post-infection, a condition that was similar to the lungs of mice infected with H5N1(MUT). Therefore, removal of the miR-HA-3p resulted in a virus that caused mild inflammation that was confined to the large airways in the lungs and less severe lung pathology than caused by the wild-type H5N1 virus. These observations were consistent with the results derived from the primary macrophages, indicating that miR-HA-3p promoted cytokine production during H5N1 infection by suppressing PCBP2.

Image

Inhibition of miR-HA-3p increased mouse resistance to H5N1 virus infection. (A) Survival rate of mice with different treatments following intranasal inoculation with 10 3 EID 50 of H5N1 virus ( n = 8). (B) Survival rate of mice with different treatments following intranasal inoculation with 10 3 EID 50 of mutant H5N1 virus ( n = 8). (C) Body weight of mice with different treatments after inoculation with 10 3 EID 50 of H5N1 virus ( n = 8). (D) Body weight of mice with different treatments after inoculation with 10 3 EID 50 of mutant H5N1 virus ( n = 8). (EH) Levels of TNF-α (E), IFN-β (F), IL-1β (G) and IL-6 (H) in mouse lungs following intranasal inoculations with H5N1 or mutant H5N1 viruses plus different treatments. Data are presented as the mean ± SEM ( n = 3). * P <0, 05. ** P <0, 01.

Visas dydis

Image

PCBP2 protein levels and histopathological effect on mouse lung tissues following H5N1 virus infection and different treatments. (A) Upper panel: representative western blot image of PCBP2 protein levels in mouse lungs on day 4 post-infection with H5N1 virus. (A) Lower panel: the quantitative analysis of the PCBP2 protein level in upper panel. Data are presented as the mean ± SEM ( n = 3). ** P <0, 01. (B) Representative images of histopathological effect of H5N1 infection on mouse lungs. Formalin-fixed, paraffin-embedded lung tissue sections from mice on day 4 post-infection were stained with hematoxylin and eosin. Note that lungs from H5N1-infected mice and H5N1-infected mice treated with control antagomir display acute neutrophil infiltration and necrosis of the bronchial and bronchiolar epithelium with considerable sloughing and disruption of the bronchial lining epithelium. In contrast, lungs from H5N1 virus-infected mice treated with antagomir-HA-3p or mutant H5N1 virus-infected mice are less severely damaged and display a mild to moderate neutrophil infiltration across the bronchial epithelium. Svarstyklės, 500 μm.

Visas dydis

Diskusija

In the present study, we have identified a miRNA-like small RNA unique for H5N1 virus, miR-HA-3p. Through reducing PCBP2 expression in the infected host cells such as macrophages, miR-HA-3p inhibits the negative regulation of the RIG-I/MAVS pathway, leading to an exacerbation of cytokine production and inflammatory response of host cells. To our knowledge, this is the first finding on the influenza virus-encoded miRNA-like small RNA and its biological function during viral infection.

Our results demonstrated that upon virus infection, the biogenesis of miR-HA-3p in the host cells followed an atypical miRNA biogenesis pathway. Although miR-HA-3p is derived from the coding region of viral HA segment, its maturation is independent of Dicer and Drosha. Northern blot analysis of various pre-miR-HA-3p mutants indicated that the biogenesis of miR-HA-3p is dependent on the unique hairpin structure of pre-miR-HA-3p. Like Dengue virus-encoded miRNA-like DENV-vsRNA-5 recently reported by Mazhar and Sassan 22, the maturation process from pre-miR-HA-3p to miR-HA-3p in the host cells is not due to RNA random degradation but is dependent on Ago2. The biogenesis of miR-HA-3p in the infected host cells reveals a novel pathway for producing miRNA: with a unique hairpin structure, a pre-miRNA can be generated from viral genome by an unknown mechanism; once a pre-miRNA is produced, it can be rapidly cleaved by host Ago2 to form mature miRNA.

Structural analysis and functional study further identified miR-HA-3p as a miRNA-like small RNA. First, Solexa sequencing and northern blot using various probes indicated that miR-HA-3p is an intact miRNA. In H5N1-infected A549 cells, both miR-HA-3p of 22-nt and pre-miR-HA-3p of ∼ 70-nt were detected using the 3′ probe, while no 22-nt RNA but larger RNAs were detected using either the 5′ probe or the loop probe (Figure 2B), strongly arguing that miR-HA-3p is not a degradation product from larger RNAs but a miRNA product processed from the specific pre-miRNA. Second, like a typical miRNA, multiple potential targets have been predicted for miR-HA-3p. One of these targets, PCBP2, is selected because it has been shown to be involved in both regulation of host defense response to virus and negative regulation of host immune effector process. Specifically, PCBP2 can interact with MAVS, leading to proteasomal degradation of MAVS 36, thus functioning as an important negative regulator of RIG-I/MAVS-mediated antiviral innate immunity 31 . Bioinformatics analysis and experimental validation have confirmed PCBP2 as a conserved target of H5N1-encoded miR-HA-3p and reduction of PCBP2 by miR-HA-3p plays a key role in cytokine overproduction in H5N1-infected cells. Finally, miR-HA-3p executes its function in a traditional miRNA manner. As shown in Figure 3H, miR-HA-3p is directly associated with Ago2, indicating that miR-HA-3p targets PCBP2 through its association with Ago2, a crucial component of functional RNA-induced silencing complex. In addition, although miR-HA-3p is as effective as PCBP2-specific siRNA (siPCBP2) in downregulating PCBP2 protein expression, it plays a role in translational repression but not mRNA degradation (Figure 3G).

Given the unprecedented severity of H5N1 disease and its continued threat to public health, H5N1 infection has been extensively studied and various factors are found to be involved in the pathogenesis of H5N1 influenza 2 . Here, we report a viral miRNA-like small RNA, miR-HA-3p, as a new player in modulating host immune responses induced by H5N1 infection. Different from other influenza viruses such as H1N1 and H3N2, H5N1 contains unique sequences that can form a hairpin structure and is able to be processed to pre-miR-HA-3p and miR-HA-3p, consequently. Genomic analysis shows that miR-HA-3p is relatively conserved, suggesting that production of miR-HA-3p is a common mechanism which plays an essential role in cytokine storm and mortality induced by various highly pathogenic H5N1 subtypes. Moreover, mice treated with antagomir-HA-3p show a considerable resistance to H5N1 infection with significantly less weight loss and longer survival time. As miR-HA-3p is conserved across various H5N1 strains, miR-HA-3p may serve as a key factor in promoting excessive cytokine production in various H5N1 infections. More importantly, antagomir-HA-3p treatment would be an effective strategy to attenuate and control the overboard inflammatory responses induced by infection with various highly pathogenic H5N1 strains. In summary, our study demonstrates for the first time that the highly pathogenic H5N1 influenza virus can encode a viral miRNA-like small RNA, miR-HA-3p, which plays a critical role in promoting the 'cytokine storm' during H5N1 infection via suppressing PCBP2. This finding also provides a potentially efficient, antagomir-HA-3p-based, therapeutic strategy to treat H5N1 infection.

Autoriaus įnašai

XL, HL, YW, ZF, XQ, MD, XS, YH, HG, LL and XC performed the experiments. XL and ZZ analyzed data. JW, DL and ZZ performed the computational prediction. XL, FL, KZ and CZ wrote the manuscript. XC, QZ, FY, HW, KZ and CZ designed the experiments and revised the manuscript.

Konkurencingi finansiniai interesai

Autoriai nedeklaruoja jokių konkuruojančių finansinių interesų.

Prisijungimai

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE67222

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija, S1 pav

    Northern blot analysis of miR-HA-3p using total RNA derived from A549 cells infected with H5N1 virus (A/Anhui/2/2005) at 48 h post-infection.

  2. 2.

    Papildoma informacija, S2 pav

    Western blot analysis of protein levels of Dicer ( A ), Drosha ( B ) and Ago2 ( C ) aftertransfection of A549 cells with control or three different synthetic siRNAs at 48 h post-transfection.

  3. 3.

    Papildoma informacija, S3 pav

    Downregulation of PCBP2 expression in primary macrophages by miR-HA-3p.

  4. 4.

    Papildoma informacija, S4 pav

    The effect of mutations on viral replication in vitro .

  5. 5.

    Papildoma informacija, S5 pav

    No effect of antagomir-HA-3p and various control antagomirs on viral replication.

  6. 6.

    Papildoma informacija, S6 pav

    Quantitative RT-PCR assay of TNF-α, IFN-β, IL-1β or IL-6 mRNA levels in human primary macrophages infected with H5N1 or mutant H5N1 viruses plus different treatments.

  7. 7

    Papildoma informacija, S7 pav

    No effect of antagomir-HA-3p and various control antagomirs on cytokines secretion in H5N1-infected macrophages.

  8. 8.

    Papildoma informacija, S8 pav

    Viral titers in mouse lungs after H5N1 or mutant H5N1 infection plus different treatments were determined by TCID 50 assay using MDCK cells at different time points after infection.

  9. 9.

    Papildoma informacija, S9 pav

    The levels of miR-HA-3p detected by quantitative RT-PCR in lung and serum samples of mice infected with H5N1 or mutant H5N1 viruses on day 2 and day 4 post-infection.

    ( Papildoma informacija yra susieta su internetine straipsnio versija ląstelių tyrimų svetainėje.)