Kepenų janus kinazės 2 delecija neutralizuoja pelių oksidacinį stresą mokslinės ataskaitos

Kepenų janus kinazės 2 delecija neutralizuoja pelių oksidacinį stresą mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Hepatotoksiškumas
  • Kepenų vėžys
  • Nealkoholinė riebalinių kepenų liga

Anotacija

Tirozinkinazės JAK2 arba pasroviui transkripcijos faktoriaus STAT5 genetinis ištrynimas kepenyse silpnina augimo hormono (GH) signalus ir taip skatina riebalų kepenų ligas. Kepenų STAT5 trūkumas pagreitina kepenų navikogenezę esant aukštam GH lygiui. Norėdami nustatyti, ar priešakinė kinazė JAK2 atlieka panašias funkcijas, mes sukryžiavome peles, turinčias specifinį JAK2 deleciją hepatocitams (JAK2 Δhep ), į transgenines GH peles (GH tg ) ir palyginome jas su GH tg STAT5 Δhep pelėmis. Panašiai kaip GH tg STAT5 Δhep pelėms, JAK2 trūkumas sukėlė sunkią steatozę GH tg fone. Tačiau, priešingai nei STAT5 trūkumas, JAK2 praradimas žymiai sulėtino kepenų augliogenezę. Tai buvo priskirta: (i) STAT3 aktyvavimui pelėms, kurioms trūko STAT5, kurioms buvo užkirstas kelias JAK2 trūkumui, ir (ii) padidėjo JAK2 turinčių kepenų detoksikacijos gebėjimai, dėl kurių sumažėjo oksidacinis pažeidimas, palyginti su GH tg STAT5 Δhep pelėmis, nepaisant. vienodai sunki steatozė ir reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamyba. Sumažėjęs kepenų oksidacinis pažeidimas JAK2 trūkumu buvo susijęs su padidėjusia glutationo S-transferazių (GST) ekspresija ir aktyvumu. Dėl Jak2 genetinio ištrynimo, Jak2 farmakologinis slopinimas ir siRNR sukeltas numušimas sąlygojo reikšmingą Gst izoformų reguliavimą ir sumažino kepenų oksidacinio DNR pažeidimą. Todėl užblokavus JAK2 funkciją, padidėja detoksikuojančių hepatocitų GST ir apsaugoma nuo oksidacinių kepenų pažeidimų.

Įvadas

Nealkoholinė riebiųjų kepenų liga (NAFLD) tampa dažniausia lėtine kepenų liga ir yra didžiulė visuomenės sveikatos problema. Negimdinių lipidų kaupimasis kepenyse yra NAFLD požymis. Jo histologinis spektras svyruoja nuo paprastos steatozės iki progresuojančios nealkoholinio steatohepatito (NASH) formos, kuri gali toliau progresuoti iki cirozės ir su ja susijusių komplikacijų, tokių kaip kepenų ląstelių karcinoma (HCC) 1, 2, 3 . Yra duomenų, kad NAFLD sergantiems pacientams HCC gali išsivystyti net be cirozės, ir tai rodo ryšį tarp nenormalių metabolinių procesų ir HCC 2, 4, 5, 6 . Padidėjusi reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) generacija nustatyta pacientams ir pelėms, kurių NAFLD yra 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Kai sutrinka pusiausvyra tarp ROS susidarymo ir antioksidantų gynybos, susidaręs oksidacinis stresas skatina kepenų pažeidimą, o tai padidina HCC išsivystymo riziką 7 .

Augimo hormonas (GH) daro įtaką viso kūno fiziologijai per plačiai išreikštą GH receptorių (GHR). Kepenyse GH aktyvina „Janus“ kinazės (JAK) 2 ir signalo keitiklį bei transkripcijos (STAT) 5 signalo perdavimo aktyvatorių, kad sureguliuotų taikinius genus, susijusius su gyvybinėmis kepenų funkcijomis 12 . Dėl GH trūkumo arba GH atsparios būsenos sukelia sutrikusią signalo perdavimą per GHR kepenyse ir tai koreliuoja su lėtine kepenų liga, įskaitant NAFLD 13, 14, 15, 16. Panašiai pelėms, kurių hepatocituose nėra GHR-JAK2-STAT5 ašies komponentų, išsivysto atsparumas kepenų GH ir steatozė 17, 18, 19, 20, 21 . Mes ir kiti nustatėme, kad kepenų STAT5 trūkumas yra susijęs su didesniu jautrumu kepenų vėžiui ( 20, 22, 23, 24), kurį lemia progresuojanti steatozė.

Čia apžvelgėme kepenų JAK2 trūkumo įtaką kepenų steatozės progresavimui. Be to, mes siekėme išsiaiškinti kepenų JAK2 ir STAT5 trūkumo indėlį į oksidacinį stresą, kuris gali sukelti HCC vystymąsi hiperaktyvaus GH signalo metu. Todėl mes sukryžiavome pelių, turinčių specifinį JAK2 arba STAT5 deleciją hepatocitams (JAK2 Δhep, STAT5 Δhep ; naudojant AlfpCre 24, 25 ) augimo hormono transgeninėms pelėms (GH tg ) 26 . GH tg pelėms yra aukštas sisteminis cirkuliuojantis GH lygis, kuris yra priežastimi susijęs su nuolatiniu hepatocitų apykaitos padidėjimu ir hiperplazija, po kurio vystosi kepenų ląstelių navikai 26 .

Remiantis ankstesniais duomenimis 18, 21, JAK2 trūkumas sukėlė kepenų steatozę, sukeldamas lipidų persiskirstymą kepenyse ir kepenų lipidų sintezę. Nepaisant gilios steatozės pelių GH tg JAK2 Δhep pelėse, kepenų navikogenezė buvo atidėta, palyginti su GH tg STAT5 Δhep . Kai pagreitinta STAT5 turinčių pelių augliogenezė buvo susijusi su abejotinu STAT3 aktyvinimu ir padidėjusiu oksidaciniu pažeidimu, vėluota kancerogenezė JAK2 deficito pelėms buvo susijusi su sumažėjusiu STAT3 signalizacijos ir ROS sukeltu oksidaciniu pažeidimu.

Rezultatai

JAK2 trūkumas skatina kepenų steatozę dėl negimdinio lipidų persiskirstymo ir de novo lipogenezės

Vien tik JAK2 trūkumas ir kartu su hiperaktyvuota GH signalizacija sukėlė sunkią kepenų steatozę ir kūno svorio sumažėjimą, o tai atitinka ankstesnes ataskaitas 18, 21 . Kūno svorio sumažėjimas išliko maždaug 20% ​​abiejose JAK2 stokojančiose linijose, palyginti su WT pelėmis 12 ir 40 savaičių amžiaus, tuo tarpu padidėjo GH tg pelių kūno svoris (1a pav.). Hepatomegalija jau buvo pastebima 12 savaičių amžiaus GH tg JAK2 Δhep gyvūnams. 40 savaičių amžiaus pelių GH tg JAK2 Δhep pelių kepenų svorio (LW) ir kūno svorio (BW) santykis padidėjo 15%, palyginti su WT pelių, o pelių GH tg ir JAK2 Δhep pelių LW / BW santykis padidėjo 10%. (1b pav.). Be to, palyginti su WT pelėmis, alanino aminotransferazės (ALT) ir aspartato aminotransferazės (AST) koncentracija serume buvo padidinta visuose genotipuose kaip kepenų pažeidimo rodikliai (1c pav.). Vėliau atlikta histopatologinė analizė patvirtino sunkią steatozę tiek GH tg JAK2 Δhep, tiek JAK2 Δhep pelėms, kuriai būdinga vidutinė ir makro bei mikrovesikulinė steatozė (1 pav. D), kurią lydėjo lengvas lobulinis uždegimas 40 savaičių amžiaus, palyginti su WT vadu. Papildomas S1a pav.). Ypač mikrovesikulinė steatozė buvo ryškesnė jaunų ir pagyvenusių GH tg JAK2 Δhep pelių kepenyse (1e pav., Papildoma S1a pav.). Elektronų mikroskopijos analizė atskleidė dideles ir išsipūtusias mitochondrijas GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep kepenyse (papildoma S1b pav.), Rodančias mitochondrijų disfunkciją ir riebalų degeneraciją kepenų ląstelėse.

Image

a ) Pelių kūno svoris 12 ir 40 savaičių amžiaus (n ≥ 4 / genotipas kiekvienam laiko taškui). b ) Mutantų ir WT pelių kepenų svorio (LW) ir kūno svorio (BW) santykis nurodytais laiko momentais ( n ≥ 4 / genotipas). c ) Kepenų pažeidimas buvo įvertintas išmatuojant kepenų fermentų ALT ir AST kiekį kraujo serume nurodytais laiko momentais (n ≥ 4 / genotipui). d ) Kepenų skyrių dažymas H&E nurodytais laiko momentais. e ) Histopatologinė analizė, vertinanti vidinę ir mikrovesikulinę steatozę (n ≥ 4 / genotipas). * p <0, 05, ** p <0, 01 ir *** p <0, 001.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme JAK2 trūkumo pasekmes lipidų apykaitai. Gyvūnams, turintiems GH tg JAK2 Hhep, didelis GH lygis lėmė masinį perigonadalinio baltojo riebalinio audinio (WAT) lizę, kuri nebuvo paveikta JAK2 Δhep pelėms (2a pav.). Lipolizė pasireiškė WAT / BW santykio sumažėjimu laikui bėgant ir cirkuliuojančių laisvųjų riebalų rūgščių (FFA) padidėjimu. Tai sutapo su labai padidėjusiu FA translokazės CD36 baltymų kiekiu JAK2 Δhep ir GH tg JAK2 Δhep kepenyse, tai rodo padidėjusį kepenų FFA įsisavinimo gebėjimą 18, 27 . Be to, JAK2 Δhep ir GH tg JAK2 Δhep pelėse buvo rastas žymiai padidėjęs trigliceridų (TG) kiekis serume (2a pav.), Rodantis hipertrigliceridemiją 28 . Kepenų steatozė, pastebėta abiejose JAK2 trūkumo linijose, buvo ne tik negimdinio FA įsisavinimo rezultatas, bet ir padidėjusi pagrindinių fermentų, dalyvaujančių de novo lipogenezėje, ekspresija. Lipogeniniai baltymai, tokie kaip riebiųjų rūgščių sintazė (FAS), stearoil-CoA desaturazė (SCD) 1 ir peroksisomų proliferatorių suaktyvinta gama gama (PPARγ), buvo žymiai iš naujo sureguliuoti, kaip patvirtinta atliekant Western blot kiekybinį įvertinimą abiejose JAK2 trūkumo linijose (2b, c pav.). ). PPAKα, pagrindinio FA katabolizmo reguliatoriaus, baltymų kiekis JAK2 turinčiose kepenyse nepakito (2b, c pav.). Be to, išsamus steatotinių kepenų profiliavimas 12 ir 40 savaičių metu parodė padidėjusį bendrą FA ir TG kiekį, kuriam būdingi žymiai padidėję nesočiųjų FA, pavyzdžiui, palmitoleino ir oleino rūgšties kiekiai (2d pav., E; papildoma S2a – c pav.). Panašūs rezultatai buvo aprašyti pelėms GH tg STAT5 Δhep, kai gilią steatozę sukėlė padidėjusi WAT mobilizacija ir kepenų de novo lipogenezės indukcija 24 . Visi šie duomenys rodo, kad padidėjusio WAT mobilizacijos ir kepenų de novo lipogenezės indukcijos derinys prisideda prie abiejų JAK2 trūkumą turinčių linijų stereotipinio fenotipo.

Image

a ) WAT / perigonadalinio riebalinio audinio kūno svorio santykis, nurodantis lipidų mobilizaciją nurodytais laiko momentais (n ≥ 4 / genotipas). Reprezentatyvi visų kepenų homogenatų „Western blot“ analizė ir 12 savaičių amžiaus gyvūnų CD36 kiekybinis įvertinimas „Western blot“ metodu. HSC70 rodomas kaip pakrovimo valdymas (n = 3 / genotipas). Plotų nuskaitymas pateiktas papildomame S8 pav. 12 savaičių amžiaus FFA koncentracija serume, kuri buvo nustatyta naudojant fermentinį testą, buvo padidėjusi visoms pelėms, kurioms trūko JAK2 (n ≥ 5 / genotipas). Serumo TG lygis buvo matuojamas 12 savaičių amžiaus (n ≥ 4 / genotipas). b ) Reprezentacinė Western blot analizė iš 12 savaičių amžiaus gyvūnų sveikų kepenų homogenatų. Kaip pakrovimo valdymas parodytas HSC70 (n = 3 / genotipas). c ) bendro FAS, SCD1, PPARγ ir PPARα nustatymas pagal Western blot metodą. Plotų nuskaitymas pateiktas papildomame S8 pav. d ) Bendras kepenų FA ir TG kiekis buvo matuojamas 12 savaičių amžiaus (n ≥ 6 / genotipas). Sočiųjų / nesočiųjų kepenų FA santykis 12 savaičių amžiaus (n ≥ 8 / genotipas). e ) Išsamus steatotinių kepenų profiliavimas naudojant dujų chromatografijos – masės spektrometriją (GC-MS) parodė, kad 12 savaičių amžiuje yra padidėjęs nesočiųjų FA (n ≥ 8 / genotipas). * p <0, 05, ** p <0, 01 ir *** p <0, 001.

Visas dydis

Kepenų navikogenezė vėluoja, kai netenkama JAK2 pelių GH tg

Aukštas sisteminis GH lygis žymiai sumažina GH tg pelių gyvenimo trukmę 24, 29, kuri ištaisoma dėl kepenų STAT5 24 ar JAK2 trūkumo (3a pav.). Mes ir kiti pranešė, kad kepenų STAT5 trūkumas skatina kepenų navikų vystymąsi ir progresavimą 22, 23, 24 . 28 savaičių amžiaus visi GH tg STAT5 Δhep gyvūnai pasidavė kepenų navikams, kuriems buvo būdingas kepenų ląstelių virvelių išsiplėtimas ir lobulinės plokštelės struktūros praradimas, ryškūs ląstelių pleomorfizmai ir tvirtas ar trabekulinis augimo modelis 24 . Priešingai, GH tg pelėms pirmieji navikai išsivystė po 12 savaičių, jų dažnis buvo 34% (3b pav., C). Šiuo metu 100% GH tg JAK2 hehep ir JAK2 Δhep kepenų liko be navikų (3b pav., C), nepaisant panašių kepenų ląstelių dauginimosi greičio (papildomas S3a pav.). Kepenų navikų atsiradimas pelėms GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep pelėms buvo pastebėtas atitinkamai po 5 mėnesių, pasireiškiant atitinkamai 76% ir 68%. Histopatologinė analizė atskleidė, kad ir GH tg JAK2 phep, ir JAK2 Δhep navikai parodė ląstelių polimorfizmą ir kepenų ląstelių piktybinių pakitimų žymenis, tokius kaip ovalo formos ląstelių frakcija, ir eozinofilinius inkliuzus (papildomas S3b pav.).

Image

a ) keturių skirtingų genotipų pelių patinų Kaplan-Meier grafikas per 60 savaičių (n ≥ 14 / genotipas). ( b ) GH tg STAT5 Δhep, GH tg, GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep kepenų auglių dažnis. 40 savaičių amžiaus GH tg pelėms išsivystė pirmieji kepenų navikai. Papildomas STAT5 ištrynimas iš hepatocitų sukėlė ankstesnius ir piktybinius navikus, tuo tarpu JAK2 išbraukimas lėmė vėlyvą naviko formavimąsi 60 savaičių amžiuje (n ≥ 4 / genotipas). c ) makroskopinė tumorogeninių kepenų išvaizda nurodytais laiko momentais. 40 savaičių GH tg STAT5 Δhep pelėse buvo dideli steatotiniai ir kieti navikai. Navikai parodė tvirtą ar trabekulinį augimo modelį (n ≥ 4 / genotipas). d ) Reprezentatyvi „Western blot“ onkogeninių signalų perdavimo būdų analizė sveikų kepenų homogenatuose 40 savaičių amžiaus. HSC70 rodomas kaip pakrovimo valdymas (n ≥ 2 / genotipas). Plotų nuskaitymas pateiktas papildomame S9 pav. e ) Tipinė STAT baltymų Western blot analizė. Kaip pakrovimo valdymas parodytas HSC70. WT ir JAK2 hehep gyvūnams buvo įšvirkšta į pilvaplėvės ertmę nešiklis arba 2 mg / kg hGH ir po to jie paaukoti 30 minučių (n = 3 / gydymas). Plotų nuskaitymas ir skirtingas pY-STAT5 ekspozicijos laikas pateikiami papildomame S9 pav. *** p <0, 001.

Visas dydis

Aberrantinis STH3 suaktyvinimas, veikiantis GH, prisideda prie pelių, turinčių STAT5, trūkumą 19, 20, 24, kurių buvo aiškiai užkirstas kelias JAK2 turinčioms kepenims, kepenų navikogenezę (3d pav.). Sutinkant, JAK2 Δhep pelių gydymas GH nesukėlė STAT1 / 3/5 aktyvavimo (3e pav.). Pažymėtina, kad ne visiems į GHR reaguojantiems signalizacijos keliams reikalingas JAK2 aktyvumas 30 ; tai apima nuo GH priklausomą SRC ir ERK1 / 2 aktyvavimą, kurie abu gali atlikti onkogenines funkcijas kepenyse. Tačiau nei SRC, nei ERK1 / 2 nebuvo suaktyvintos GH tg JAK2 Δhep ir GH tg STAT5 Δhep kepenų kepenyse (3d pav.), Kas rodo, kad šie signalizacijos keliai neprisideda prie kepenų tumourigenezės nė viename modelyje. Šie rezultatai rodo, kad kepenų JAK2 trūkumas, priešingai nei STAT5 delecija, atitolina naviko susidarymą transgeniniame GH fone.

Praradęs JAK2 apsaugo nuo ROS sukeltų oksidacinių pažeidimų

Oksidacinis stresas yra dažnas NAFLD požymis, o dėl jo atsirandantys ląstelių pažeidimai (ty lipidų peroksidacija, baltymų oksidacija ir DNR pažeidimai) 8 prisideda prie kepenų navikogenezės. Norėdami ištirti oksidacinio streso indėlį į steatozės progresavimą esant kepenų JAK2 ar STAT5 trūkumui, nustatėme ROS susidarymą hepatocituose 12 savaičių gyvūnams, naudojant skirtingus dažus, kurie yra jautrūs mitochondrijų membranos potencialui, mitochondrijų ar citoplazminėms ROS. Šiuo tikslu kepenų audiniai buvo šviežiai išgriebti, padalyti į dalis ir vėliau dažyti. Mitochondrijų membranos potencialas buvo panašus tarp genotipų, o mitochondrijų ir citoplazmų ROS padidėjo steatotinių GH tg STAT5 Δhep, GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep kepenų hepatocituose (4a pav., Papildoma S4a pav.). Citoplazminė ROS, esanti GH tg JAK2 Δhep, JAK2 Δhep ir GH tg STAT5 Δhep kepenyse, buvo pripažinta kaip maža tarpląstelinė struktūra, rodanti peroksisomos aktyvaciją. Keista, nors nepaisant panašiai padidėjusio ROS lygio, padidėjęs DNR pažeidimas (pH2AX), baltymų karbonilinimas (indikuojantis baltymų oksidacijai) ir malondialdehidas (MDA), šalutinis lipidų peroksidacijos produktas, tik žymiai padidėjo gyvūnams su GH tg STAT5 Δhep ir GH tg. 12 ir 40 savaičių amžiaus (4b pav., c; papildomas S4b, c pav.). Šie duomenys rodo, kad kepenų JAK2 trūkumas apsaugo nuo ROS sukelto DNR pažeidimo ir lipidų bei baltymų oksidacijos, o STAT5 trūkumas lemia pagreitintą oksidacinį pažeidimą.

Image

a ) Šviežiai supjaustytos kepenys buvo dažytos fluorescenciniais dažais, jautriais mitochondrijų ir citoplazminėms ROS. Vaizdai buvo atlikti apverstu konokaliniu mikroskopu (n ≥ 5 / genotipas). b ) Lipidų peroksidacija buvo įvertinta išmatuojant jo šalutinį produktą malondialdehidą (MDA) 12 savaičių amžiaus. Baltymų oksidacija buvo išmatuota kolorimetriniu tyrimu (n ≥ 5 / genotipas). c ) Reprezentatyvios 12 savaičių pelių kepenų dalys, dažytos antikūnais prieš fosforilintą H2AX, kad būtų galima nustatyti DNR pažeidimą. Teigiamų hepatocitų kiekybinis įvertinimas atvaizdo analize (n ≥ 5 / genotipas). * p <0, 05, ** p <0, 01 ir *** p <0, 001.

Visas dydis

Dėl JAK2 praradimo padidėja gliutationo S-transferazių detoksikacija

Apsauga nuo ROS sukelto oksidacinio pažeidimo vykdoma keliais gynybos mechanizmais, tokiais kaip ROS šalinimas ir detoksikacijos įrenginiai 9 . Dėl netinkamų gynybos mechanizmų ląstelės gali būti pažeistos ir dėl to padidėja piktybinės transformacijos rizika (5a pav.). Taigi, norėdami apibrėžti skirtingo laipsnio oksidacinio pažeidimo kepenų JAK2 ar STAT5 trūkumui mechanizmus, ištyrėme fermentų, dalyvaujančių ROS klirense ir detoksikacijoje, ekspresijos lygius. Visuotinė fermentų, reguliuojančių ROS klirensą, genų ekspresijos analizė atskleidė, kad superoksido dismutazės 3 ( Sod3 ), glutationo peroksidazės 2 ( Gpx2 ), Gpx3 ir Gpx7 ekspresija buvo labai sureguliuota GH tg gyvūnams 12 savaičių amžiaus (5b, c pav. ; Papildomas S5a pav.). SOD3, GPX2 ir GPX3 vykdo tarpląstelines funkcijas ir buvo įrodyta, kad jie turi priešuždegiminį poveikį 31, 32 . Tačiau steatotinių GH tg STAT5 Δhep, GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep kepenų ekspresijos lygiai nepakito, palyginti su WT vadų lydekais . Antrasis pagrindinis antioksidantų gynybos mechanizmas vykdomas glutation-S transferazėmis (GST), kurios tiesiogiai detoksikuoja oksiduotas makromolekules, kad būtų išvengta ląstelių pažeidimo (5a pav.). 12 ir 40 savaičių amžiaus, atliekant sveikų kepenų ekstraktų Affymetrix ir qRT-PGR analizę, buvo nustatytas stiprus Gsta1 , Gsta2 ir Gstm3 reguliavimas, ypač kepenų, turinčių JAK2, trūkumu (5c pav., D; papildomas S5b, c pav.). Be to, gliutationo sintetazės ( GSS ), būtinos glutationo biosintezei ir GST funkcionalumui, ekspresija buvo padidinta pelių GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep pelėse (5d pav.). Atitinkamai, GSTA1 / 2 ir GST aktyvumas buvo žymiai padidėjęs GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep kepenyse (5e pav., F; papildomas S5d pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad kepenų JAK2 praradimas sumažina ROS sukeltą oksidacinį pažeidimą padidėjus GST fermentų ekspresijai ir aktyvumui.

Image

a ) Antioksidacinės gynybos sistemos scheminė apžvalga. SOD, CAT ir GPX yra pagrindiniai antioksidantų fermentai, kurie inaktyvuoja ROS į tarpinius produktus. GST katalizuoja redukuotos GSH formos konjugaciją su oksiduotais produktais, kad detoksikuotų oksiduoti lipidai, baltymai ir DNR (H + : vandenilio jonas, SOD: superoksido dismutazė, CAT: katalazė, GPX: glutationo peroksidazė, GSSG: oksiduotas glutationas, GSH: glutationas), GSS: glutationo sintetazė, GSR: glutationo reduktazė, GST: glutationo S-transferazė). ( b ) Taikant qRT-PGR, kepenims 12 savaičių amžiaus buvo išmatuotos Sod3 , Gpx2 , Gpx3 ir Gpx7 mRNR koncentracijos, susijusios su antioksidaciniu atsaku (n = 6 / genotipas). Ct vertės buvo normalizuotos iki Gapdh ir Rpl12a . c ) 12 savaičių amžiaus genų, koduojančių fermentus, dalyvaujančius antioksidantų gynyboje, transkriptominė analizė. ( d ) Gsta1 , Gsta2, Gstm3 ir Gss mRNR ekspresijos lygiai 12 savaičių amžiaus (n = 6 / genotipas). Ct vertės buvo normalizuotos iki Gapdh . e ) Reprezentatyvi visų kepenų homogenatų Western blot analizė ir 12 savaičių amžiaus gyvūnų GSTA1 / 2 Western blot kiekybinis įvertinimas. Kaip pakrovimo valdymas parodytas HSC70 (n ≥ 2 / genotipas). Plotų nuskaitymas pateiktas papildomame S10 pav. f ) GST aktyvumas buvo įvertintas 12 savaičių amžiaus pelių kepenyse, naudojant kolorimetrinį tyrimą (n ≥ 6 / genotipas). * p <0, 05, ** p <0, 01 ir *** p <0, 001.

Visas dydis

Dėl Jak2 farmakologinio slopinimo ir siRNR sąlygojamo numušimo padidėja Gst izoformų ekspresija ir sumažėja DNR pažeidimas.

Norėdami patikrinti, ar JAK2 aktyvumo praradimas tiesiogiai sąlygojo Gst ekspresijos indukciją, WT pakratų draugus gydėme JAK inhibitoriumi ruksolitinibu 2 dienas. Gydymas ruksolitinibu sukėlė stiprią Gsta1 , Gsta2 ir Gstm3 ekspresiją , panašią į Jak2 išmetimą kepenyse . Ruxolitinibu gydytų pelių kepenų sekcijose buvo normali kepenų struktūra (6a pav.; Papildoma S6a pav.). Norėdami įvertinti, ar Gst išraiška buvo būdinga hepatocitams, mes panaudojome įamžintus pelės p19 ARF - / - hepatocitus 33, kuriems būdingi monosluoksnių susidarymai, morfologinių ypatybių išsaugojimas ir hepatocitams būdingų žymenų išraiška, patvirtinta Western blot ( Papildomas S6b pav. p19 ARF - / - hepatocitai reagavo į GH, kaip rodo STAT5 aktyvacija (6b pav.), ir JAK2-STAT5 signalizaciją galėjo visiškai slopinti gydymas ruksolitinibu (6c pav.). Svarbu tai, kad jau po 6 valandų JAK2 slopinimo p19 ARF - / - hepatocituose padidėjo Gsta1 , Gsta2 ir Gstm3 raiška (6d pav.).

Image

a ) Kontroliniai pakratai, kurie neišreiškė AlfpCre, buvo gydomi nešikliu arba 30 mg / kg ruksolitinibu du kartus per dieną 2 dienas per burną, vartojant per burną (n = 4 / gydymas). Gsta1 , Gsta2 ir Gstm3 mRNR ekspresijos lygis gydant ruksolitinibu. Ct vertės buvo normalizuotos iki Gapdh . ( b ) Reprezentatyvi Western blot analizė parodė STAT5 suaktyvinimą įamžintuose p19 ARF - / - hepatocituose stimuliuojant žmogaus GH (0, 5 μg / ml). Prieš stimuliaciją, hepatocitai buvo badomi 2 valandas (1% FCS ir be augimo faktorių). Kaip apkrovos kontrolė parodyta HSC70 (n = 3 savarankiški eksperimentai). Plotų nuskaitymas pateiktas papildomame S11 pav. c ) Po 24 val. gydymo 3 μM ruksolitinibu, p19 ARF - / - hepatocitai buvo stimuliuojami 0, 5 μg / ml žmogaus GH ir analizuojami atliekant Western blot analizę. Kaip apkrovos kontrolė parodyta HSC70 (n = 3 savarankiški eksperimentai). Plotų nuskaitymas pateiktas papildomame S11 pav. ( d ) p19 ARF - / - hepatocitai buvo gydomi 3 μM ruksolitinibu be hGH nurodytais laiko momentais. Buvo išmatuoti Gsta1 , Gsta2 ir Gstm3 mRNR raiškos lygiai. Rezultatai parodomi iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Ct vertės buvo normalizuotos iki Gapdh . e ) DAPI (mėlyna) ir fosforilinto H2AX (žalia) imunofluorescencinis dažymas. p19 ARF - / - hepatocitai buvo iš anksto apdoroti 24 valandas ruksolitinibu arba DMSO. Ląstelės dar 24 valandas buvo veikiamos 0, 3 mM palmitino rūgšties (PA), turinčios arba ruksolitinibą, arba DMSO. Fluorescencijos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas atvaizdo analize (n = 3 savarankiški eksperimentai). ( f ) p19 ARF - / - hepatocitai 48 valandas buvo transfekuoti netikslinė siRNR (si kontrolė ) arba siRNR prieš Jak2 (si Jak2 ). Reprezentacinė Western blot analizė ir mRNR raiškos lygiai parodė efektyvų p19 ARF - / - hepatocitų sunaikinimą. Kaip pakrovimo valdymas parodytas HSC70. Plotų nuskaitymas pateiktas papildomame S11 pav. ( g ) p19 ARF - / - hepatocitai buvo transfekuoti si Jak2 arba si Control 48 valandas. Buvo išmatuoti GST1 , Gsta2 ir Gstm3 mRNR raiškos lygiai, kai buvo sustabdytas siRNR. Ct vertės buvo normalizuotos iki Gapdh . h ) DAPI (mėlyna) ir fosforilinto H2AX (žalia) imunofluorescencinis dažymas. p19 ARF - / - hepatocitai buvo 48 valandas iš anksto apdoroti si Jak2 arba si Control . Ląstelės buvo veikiamos 0, 3 mM PA dar 24 valandas. Fluorescencijos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas atvaizdo analize (n = 2 savarankiški eksperimentai). * p <0, 05, ** p <0, 01 ir *** p <0, 001.

Visas dydis

Toliau mes siekėme funkciškai patikrinti, ar JAK2 slopinimas ruksolitinibu sumažins oksidacinį pažeidimą. Mes sukūrėme ROS sukeltus DNR pažeidimus p19 ARF - / - hepatocituose veikdami H 2 O 2 . Iš tikrųjų, išankstinis gydymas ruksolitinibu žymiai sumažino pH2AX išraišką hepatocituose (papildomas S6c pav.). Panašiai išankstinis p19 ARF - / - hepatocitų apdorojimas ruksolitinibu sąlygojo ryškų pH2AX raiškos sumažėjimą hepatocituose dėl palmitino rūgšties (PA) sukelto lipotoksiškumo (6e pav.) 34 . Norėdami pašalinti galimą nuo gydymo JAK2 priklausomą ruksolitinibo poveikį, mes papildomai pasinaudojome nedideliu trukdančiu (si) RNR sukeltu Jak2 numušimu . Visiškas p19 ARF - / - hepatocitų sunaikinimas buvo atliktas po 48 valandų (6f pav.). Remiantis ruxolitinibu gydytais p19 ARF - / - hepatocitais, Jak2 sunaikinimas padidino Gsta1 , Gsta2 ir Gstm3 raišką (6g pav.) Ir sumažino ROS sukeltą DNR žalą po H 2 O 2 ir PA ekspozicijos (6 pav. ; Papildomas S6d pav.).

Taigi, remiantis genetiniu JAK2 praradimu, šie duomenys rodo, kad Jak2 farmakologinis slopinimas ir siNRA sąlygotas numušimas sumažina oksidacinio streso sukeltą DNR žalą, greičiausiai, padidinus Gst fermentų veiklą.

Visi mūsų duomenys rodo, kad STAT5 trūkumas apsunkina kepenų tumourigegenezę GH tg fone dėl neteisingo STAT3 aktyvavimo ir padidėjusio oksidacinio pažeidimo. Priešingai, JAK2 trūkumas uždelsia naviko susidarymą GH tg pelėse, o tai yra susiję su nereikšmingu onkogeniniu STAT3 signalizavimu ir sumažėjusiu ROS sukeltu oksidaciniu pažeidimu. Mūsų išvadų modelis (papildomas S7 pav.) Vaizduoja stebėtiną skirtumą tarp kepenų STAT5 ir JAK2 trūkumo ir tai sukelia oksidacinį kepenų pažeidimą.

Diskusija

NAFLD vystymasis buvo susijęs su sutrikusiu GH signalo perdavimu 14, 15 . Pelių modeliai dar labiau susiejo GH signalo praradimą su NAFLD, parodydami, kad specifinis kepenų GHR, JAK2 ar STAT5 trūkumas sukelia metabolinius defektus, pasireiškiančius kepenų steatoze 17, 18, 19 . HCC yra dažna lėtinės kepenų ligos pasekmė 4, 5 . Nors JAK2-STAT5 signalizacija atlieka onkogenines funkcijas sergant kraujodaros vėžiu 35, GH aktyvuotas STAT5 vaidina apsauginį vaidmenį lėtinės kepenų ligos pelių modeliuose - 12, 20, 22, 23, 24, 36 .

Čia aprašome, kad kepenų JAK2 trūkumas apsaugo nuo oksidacinio kepenų pažeidimo ir tokiu būdu potencialiai sumažina kepenų tumourigenezės riziką naudojant GH tg pelių modelį.

Mes patvirtiname, kad JAK2 praradimas sukelia akivaizdžią hepatomegaliją ir steatozę. Buvo aprašyta, kad šis fenotipas priklauso nuo GH priklausomos FFA mobilizacijos iš WAT ir padidėjusio jų įsisavinimo kepenyse, padidėjusiai PPARγ ir CD36 18, 27 ekspresijai . Priešingai nei GH tg JAK2 Δhep pelėms, JAK2 Δhep gyvūnams nepadidėjo didelis cirkuliuojančių FFA padidėjimas ir WAT atsargų išeikvojimas. Tačiau net esant normaliai cirkuliuojančiai FFA koncentracijai, transgeninė CD36 ekspressija pelių kepenyse sukelia žymiai padidėjusį FA įsisavinimą ir lipidų kaupimąsi 37 . Taigi labai padidėjusi CD36 ekspresija JAK2 Δhep kepenyse greičiausiai skatina kepenų FA įsisavinimą ir nusėdimą panašiu būdu. CD36 yra transkripcinis PPARγ 38 taikinys ir ankstesnis darbas susieja GH signalizaciją su PPARγ 18 transkripcine represija. Atitinkamai, hiperaktyvuotas GH signalizavimas, kaip matyti iš GH tg pelių, slopina PPARγ ir jo pasroviui taikomų tikslų, CD36 ir SCD1, transkripciją. Atvirkščiai, sutrikęs GH signalo perdavimas per kepenis pašalinus JAK2 arba STAT5, padidėja Cd36 18, 19 išraiška, o tai papildomai patvirtina Jak2 numušimas p19 ARF - / - hepatocituose (papildomas S6e pav.). Šiuos duomenis pratęsime įrodydami, kad dėl kepenų JAK2 trūkumo padidėja lipogeninių fermentų FAS ir SCD1, kurie abu yra dažnai susiję su NAFLD 40, 41, baltymų ekspresija . Sutikus su FAS ir SCD1 40, 41 reguliavimu, buvo pastebėtas specifinis palmitato (C16: 0), palmitoleato (C16: 1) ir oleato (C18: 1) koncentracijos padidėjimas, kas rodo padidėjusią de novo sintezę ir sočiųjų riebalų virsmą. FA į mononesočiųjų FA.

Būdingas NAFLD bruožas yra padidėjęs ROS susidarymas. Kepenų FA rūšių padidėjimas daro didelę įtaką ROS susidarymui dėl oksidacinių įvykių 7 ir dėl to lipotoksiškumo 42 . Nuolatinis oksidacinis stresas padidina lėtinę kepenų žalą ir padidina kepenų vėžio išsivystymo riziką 7 . GHR-JAK2-STAT5 signalizacijos sutrikimas lemia padidėjusią citoplazminės ir mitochondrinės ROS gamybą steatotiniuose hepatocituose 20 . Nepaisant panašaus riebalinio degeneracijos laipsnio ir ROS susidarymo GH tg STAT5 Δhep ir GH tg JAK2 Δhep kepenyse, kepenų JAK2 trūkumas atitolino auglių susidarymą GH tg fone. Remiantis mūsų duomenimis, padidėjęs JAK2 aktyvavimas koreliuoja su prastu bendru išgyvenimu HCC sergantiems pacientams, kurių prolaktino koncentracija kraujyje yra aukšta 43 . Be to, pelės, kurioms trūko GHR, pasireiškiant cholestazės modeliui, buvo nepaprastai atsparios naviko vystymuisi, nepaisant kepenų fibrozės paūmėjimo 44, o klinikinis tyrimas atskleidė labai mažą vėžio dažnį populiacijose, kenčiančiose nuo GHR mutacijos45. Be kliniškai patvirtinto ruksolitinibo, klinikiniuose tyrimuose 46 yra daugiau nei 10 skirtingų JAK2 inhibitorių, pabrėžiančių šio kelio farmakologinį svarbą.

Aberrantinis STH3 suaktyvintas GH suaktyvinimas buvo susijęs su pagreitinta kepenų augmenine STAT5 turinčių kepenų 19, 20, 24 . Sutinkant su JAK2 reikalavimu dėl STH baltymų aktyvavimo, veikiant GH meditacijai, kepenyse, kuriose trūksta JAK2, nebuvo pastebėtas per didelis STAT3 aktyvumas, todėl, matyt, tai prisidėjo prie uždelsto naviko atsiradimo GH tg JAK2 Δhep pelėse. Įdomu tai, kad nesant JAK2, padidėjęs ROS kaupimasis nesusijęs su padidinta lipidų peroksidacija, baltymų oksidacija ir DNR pažeidimais. Buvo pasiūlyta keletas galimų terapinių strategijų mažinant oksidacinį stresą NAFLD 10 . Visų pirma, vitamino E papildai yra naudojami siekiant sumažinti TG kaupimąsi ir sumažinti lipidų peroksidaciją 10, 47 . Be to, parodome, kad JAK2 trūkumas padidino GST, grupės detoksikacijos fermentų, apsaugančių nuo oksidacinio streso, 48 ekspresiją ir aktyvumą. Panašus GST ekspresijos ir aktyvumo padidėjimas nebuvo nustatytas STAT5 turinčiose kepenyse, kuriose padidėjęs ROS kaupimasis koreliavo su padidėjusia oksidacine žala. Neseniai atliktas tyrimas susiejo STAT5 aktyvaciją su padidėjusia ROS gamyba lėtinės mieloleukemijos ląstelėse, slopindamas antioksidacinius fermentus, kurie rodo STAT5 49 specifines audinių funkcijas.

Remdami mūsų atradimus in vivo , p19 ARF - / - hepatocitų gydymas ruksolitinibu ir siRNR prieš Jak2 ne tik padidino Gst reguliavimą, bet ir efektyviai sumažino H 2 O 2 ir palmitino rūgšties sukeltą oksidacinį DNR pažeidimą. Atsižvelgiant į detoksikuojantį GST izoformų vaidmenį, padidėjęs reguliavimas nesant JAK2 gali sumažinti oksidacinį pažeidimą ir uždelstą naviko pradžią GH tg JAK2 Δhep pelėms. Nesuprantamas GST vaidmuo NAFLD ir jo eiga. Tačiau GSTM1 nulinis genotipas buvo susijęs su NAFLD plėtra ir šis radinys gali būti susijęs su padidėjusia HCC rizika Azijos populiacijoje 50 . Taip pat buvo pranešta, kad GST aktyvumas mažėja progresuojant NAFLD, lydint sumažėjusiam glutationo telkiniui, kuris atvirkščiai koreliuoja su lipidų peroksidacija 11 . Be to, mūsų išvados pateikia įrodymų, kad GST fermentai, pašalindami oksidacinį stresą, gali būti naudingi siekiant išvengti su NAFLD susijusių kepenų pažeidimų.

Įrodyta, kad Gsts raišką indukuoja panašus branduolinis faktorius 2 (NRF2), o branduolinio hormono receptoriai - retinoinės rūgšties receptorių alfa (RARα) ir retinoido X receptorių alfa (RXRα) 51 . Nei Nrf2 mRNR išraiška, nei RARα ir RXRα baltymų lygis reikšmingai nebuvo sureguliuotas kepenų JAK2 trūkumuose (papildomas S5e pav.). Įdomu tai, kad JAK2 gali atlikti branduolinę ar peri-branduolinę funkciją hepatocituose, pieno epitelio ar hematologinėse ląstelėse 52, 53, 54 . Tai gali būti galimas Gst indukcijos slopinimo mechanizmas, esant JAK2. Tačiau iki šiol nustatytas JAK2 priklausomas chromatino architektūros reguliavimas yra labiau susijęs su aktyvinančiąja nei represine 52 funkcija.

Kartu parodome, kad steatotinėse JAK2 stokojančiose kepenyse yra užkirstas kelias ROS sukeltam oksidaciniam pažeidimui, kuris koreliuoja su uždelstu naviko atsiradimu GH tg fone. Svarbu tai, kad remiantis genetinio modelio išvadomis, mūsų duomenys rodo, kad farmakologinis JAK2 slopinimas apsaugo nuo oksidacinio pažeidimo. Tolesni tyrimai, vertinantys JAK2 inhibitorių veiksmingumą mažinant oksidacinį stresą, gali pagrįsti galimą jų naudojimą lėtinėmis kepenų ligomis.

Metodai

Pelės

Pelės, kurių kepenyse buvo išbraukta Jak2 arba Stat5 ( Jak2 fl / fl 25, Stat5ab fl / fl ; vadinamos JAK2 Δhep arba STAT5 Δhep 55 ), buvo auginamos su GH transgeniniais gyvūnais (GH tg ; aprašyta nuorodoje 26), kad būtų sukurtas GH tg Pelės JAK2 Δhep ir GH tg STAT5 Δhep . Linų draugai, neišreiškiantys AlfpCre rekombinazės, tarnavo kaip WT kontrolė. Visų tirtų pelių genetinis fonas buvo C57BL / 6J × SV129. Visoms analizėms buvo naudojami tik pelių patinai. Eksperimentai su gyvūnais buvo atliekami pagal etišką gyvūnų licencijos protokolą, patvirtintą Austrijos vyriausybės ir Vienos medicinos universiteto. Pelių priežiūra ir eksperimentinės procedūros išsamiai aprašytos papildomoje medžiagoje ir metoduose (žr. Papildomą informaciją).

Serumo biochemija

Alanino aminotransferazės (ALT) ir aspartato aminotransferazės (AST) koncentracija serume buvo nustatyta naudojant bandymo juostelėmis pagrįstą Reflotron Plus analizatorių (Roche). Laisvųjų riebalų rūgščių lygis buvo įvertintas fotometriškai naudojant NEFA-HR (2) rinkinį (Wako).

Kepenų metabolitų matavimas

Kepenų trigliceridai (CaymanChemical), lipidų peroksidacija, baltymų oksidacija ir GST aktyvumas (BioVision) buvo nustatyti naudojant komerciškai prieinamus kolorimetrinius tyrimus. ROS ir kepenų riebalų rūgščių lygio matavimas aprašytas papildomose medžiagose ir metoduose (žr. Papildomą informaciją).

Imunoblotai ir imunohistochemija

Atlikta Western blot analizė ir imunohistochemija pagal standartinius protokolus. Naudojami antikūnai išsamiai išvardyti papildomoje medžiagoje ir metoduose (žr. Papildomą informaciją).

Mikro matricų analizė

12 ir 40 savaičių metu iš 3 kepenų / genotipo (WT, GH tg, GH tg JAK2 Δhep ir JAK2 Δhep ) RNR buvo išskirtos naudojant RNAeasy rinkinį (# 74104; Quiagen) ir hibridizuotos su „GeneChip Mouse Gene 1.0 ST“ (Affymetrix). ). Mikro matricos duomenys ir eksperimento projekto aprašymas yra dedami į „ArrayExpress“, registracijos numeris E-MTAB-3774. Išsami analizė pateikiama papildomoje medžiagoje ir metoduose (žr. Papildomą informaciją).

Genų ekspresijos analizė naudojant kiekybinę PGR

Visa RNR buvo išskirta TRIzol reagentu (Invitrogen) ir atvirkščiai transkribuota, naudojant Revert Aid cDNR sintezės rinkinį („Thermo Fisher Scientific“). Išsamus metodas kartu su pradmenų sekomis pateiktas papildomoje medžiagoje ir metoduose (žr. Papildomą informaciją).

Ląstelių kultūros

P19 ARF - / - pelių hepatocitai buvo išskirti ir padauginti, kaip aprašyta 33 punkte . P19 ARF - / - hepatocitų priežiūra ir in vitro eksperimentai yra aprašyti papildomoje medžiagoje ir metoduose (žr. Papildomą informaciją).

Statistika

Visos vertės pateikiamos kaip vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida, jei nenurodyta kitaip. Statistinis reikšmingumas buvo įvertintas naudojant 95% pasikliovimo intervalą, naudojant vienpusį ANOVA, po kurio sekė Tukey, Dunns ar Bonferroni post-hoc testas, skirtas daugybiniam palyginimui, arba dvipusis studentų t-testas, skirtas palyginti dvi grupes. Skirtumai tarp eksperimentinių grupių buvo laikomi reikšmingais esant * p <0, 05, ** p <0, 01 ir *** p <0, 001. Visi skaičiavimai buvo atlikti naudojant „GraphPad Prism“ programinę įrangą (La Jolla, CA).

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Themanns, M. et al . „Janus Kinase 2“ pašalinimas iš kepenų neutralizuoja pelių oksidacinį stresą. Mokslas. Rep. 6, 34719; „doi“: 10.1038 / srep34719 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.