Histono kodo skaitytuvas spin1 kontroliuoja skeleto raumenų vystymąsi ląstelių mirtis ir liga

Histono kodo skaitytuvas spin1 kontroliuoja skeleto raumenų vystymąsi ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių ciklo baltymai
  • Ląstelių signalizavimas
  • Skeleto ir raumenų raida
  • Skeletinis raumuo

Anotacija

Nors keli tyrimai koreliavo padidėjusią histono kodo skaitymo priemonės „Spin1“ raišką su naviko susidarymu ar augimu, apie baltymo fiziologines funkcijas mažai žinoma. Mes sukūrėme „Spin1 M5“ peles su „ Spin1“ abliacija myoblastų pirmtakuose, naudodami „ Myf5-Cre “ deleterio štamą. Dauguma „Spin1 M5“ pelių žūsta netrukus po gimimo ir turi sunkią sarkomero dezorganizaciją ir nekrozę. Išgyvenusios „Spin1 M5“ pelės yra sulėtinto augimo ir turi ryškiausius padus, blauzdikaulio priekinės dalies ir diafragmos raumenų defektus. Galūnių raumenų transkriptominės analizės embriono dieną (E) 15, 5, E16, 5 ir trijų savaičių amžiuje pateikė abejotiną vaisiaus miogenezę ir nustatė dereguliuotų skeleto raumenų (SkM) funkcinius tinklus. Nustatant viso genomo chromatino užimtumą pirminiame mioblastas atskleidė tiesioginius Spin1 taikinius genus ir pasiūlė, kad nereguliuojami baziniai spiralės-kilpos-spiralės transkripcijos faktorių tinklai atspindėtų Spin1 M5 vaisiaus vystymosi defektus. Be to, koreliuodami histologinę ir transkriptominę analizę, parodome, kad abejotina su titinu susijusių baltymų ekspresija, nenormalus glikogeno metabolizmas ir neuromuskulinės jungties defektai prisideda prie SkM patologijos Spin1 M5 pelėms. Kartu aprašome pirmąjį histono kodo skaitytuvo, kontroliuojančio SkM vystymąsi pelėse, pavyzdį, kuriame užuomina apie „Spin1“ kaip apie galimą žmogaus SkM ligos žaidėją.

Pagrindinis

„Spindlin1“ („Spin1“) yra aukšto afiniteto histono kodo skaitytuvas, jungiantis H3, trimetilintas H lizine 4 (H3K4me3). 1, 2, 3 H3K4me3 ryšį sustiprina histime H3 4 esantis asimetriškai dimetilinis argininas 8. „Spin1“ yra labai ekspresuojamas kelių tipų 5, 6, 7 navikuose ir turi įtakos ląstelių ciklui, chromatino segregacijai, apoptozei ir ląstelių linijų transformacijai, taip pat naviko susidarymui nuogai pelėms. 6, 8, 9, 10, 11 Nors šie tyrimai rodo svarbų vaidmenį sergant vėžiu, „Spin1“ fiziologinės funkcijos buvo tik ištirtos. Pelės oocitai, kuriems trūksta motinos „ Spin1“ , normaliai folikulogenezuojami, tačiau mejozės atnaujinti nepavyksta. 12 Be to, pelės, turinčios visur esančią Spin1 abliaciją, miršta netrukus po gimimo. 12 Tačiau nebuvo pranešta apie pažeistus audinius, susijusius su pogimdyvine mirtimi.

Griaučių raumuo (SkM) yra gausiausias stuburinių gyvūnų audinys, tarpininkaujantis atramai ir judėjimui bei prisidedantis prie bendro metabolizmo. SkM vystymąsi lemia pagrindiniai transkripcijos veiksniai, įskaitant Pax3 ir Pax7, kurie taip pat reikalingi raumenų kamieninių ląstelių specifikacijai, 13, 14 ir miogeniniai reguliavimo faktoriai (MRF) Myf5, MyoD (Myod1), Mrf4 (Myf6) ir miogeninas (Myog). ). 13, 14, 15 MRF yra audiniams būdingi baziniai spiralės-kilpos-spiralės (bHLH) transkripcijos veiksniai, veikiantys kaip homodimerai arba kaip heterodimerai su kitais bHLH transkripcijos veiksniais, tokiais kaip visur išreikšti E-baltymai E12 / E47 (Tcf3), E2-2. / ITF2 (Tcf4) ir HEB / HTF4 (Tcf12). 14

SkM pluošto formavimas pelėse susideda iš trijų vienas po kito einančių fazių: embriono bangos nuo maždaug embriono dienos (E) 10.5 iki E12.5, vaisiaus bangos maždaug nuo E14.5 iki E17.5 ir pogimdyminis laikotarpis, per kurį nustatomi suaugusiųjų pluoštai. 14, 16, 17, 18 suaugę miofiberiai pasižymi skirtingomis sutraukiamomis savybėmis (lėtu ar greitu susitraukimu), inervacijos modeliais ir metaboliniu aktyvumu (oksidaciniu ar glikolitiniu), kurie koreliuoja su specifinių miozino sunkiosios grandinės (MHC) izoformų ekspresija. 19, 20 suaugusių pelių galūnių raumenis sudaro I tipo (lėtas, oksidacinis), IIa tipo (greitas, oksidacinis), IIx tipo (greitas, glikolitinis) ir IIb tipo (greitas, glikolitinis) pluoštas. 19, 20 SkM masė ir funkcijos susilpnėja sergant ligomis, ir buvo užfiksuota daugybė genų mutacijų, sukeliančių miopatijas ar raumenų distrofijas. 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 Įdomu tai, kad tam tikros ligos metu vyrauja tam tikri pluošto ar raumenų tipai. 29, 30

Šiame tyrime mes sukryžiavome peles, turinčias sąlyginius Spin1 alelius ( Spin1 p / p ), naudodami „ Myf5-Cre “ deleterio padermę 31, kad galėtumėte pašalinti Spin1 iš miogeninių pirmtakų. Dauguma homozigotinių „ Spin1“ p / p „Myf5-Cre“ (toliau vadinamų „Spin1 M5“ ) pelėmis miršta netrukus po gimimo, o išgyvenusios pelės pasižymi dideliu augimo sulėtėjimu. Histologinė, transkriptominė ir cistrome analizė rodo neteisingą vaisiaus miogenezę ir panaikintus pagrindinius bHLH transkripcijos faktorių tinklus aplink SkM defektų atsiradimą. Be to, mūsų stebėjimai rodo, kad pakitusi titino susijusių baltymų ekspresija, nenormali glikogeno apykaita ir nekokybiški NMJs prisideda prie SkM patologijos Spin1 M5 pelėms. Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų duomenys rodo sunkų vystymosi defektą, kurį sukėlė histonų kodų skaitytuvo abliacija SkM ir užuomina apie „Spin1“ kaip galimą žmogaus SkM ligos žaidėją.

Rezultatai

„Spin1“ praradimas SkM lemia mirtį po gimdymo

Norėdami ištirti „Spin1“ fiziologines funkcijas in vivo , mes sukūrėme visur esančias nokautas („Spin1 R26“ ) peles, sukryžiuodami „Spin1“ p / p peles su „ Rosa26-Cre “ deleterio paderme 32 (papildomas 1a paveikslas). „Spin1 R26“ pelės gimė, bet mirė per vieną dieną po gimimo (papildomas 1b paveikslas), o tai sutinka su kitų pastebėjimais. 12 Atkreipkite dėmesį, kad E18.5 metu „Spin1 R26“ pelėms buvo rodomos krentančios priekinės kojos (1a pav.), Rodančios neuromuskulinį defektą. 33

Image

„Spin1“ praradimas SkM lemia mirtį po gimdymo. a ) Krentančios priekinės galūnės (rodyklė), rodančios neuromuskulinį defektą, pastebėtą visur, kur yra Spin1 nokautas (Spin1 R26 ), bet ne Spin1 + / + (Ctrl) vaisiuose. ( b, c ) Kontrolinių vaisiaus užpakalinių galūnių skyrių E15 ir naujagimių pelių (P0) dažymas imunofluorescenciniu (IF) antikūnais, nukreiptais prieš Spin1 (žalia), Pax7 (raudona) arba miozino sunkiąją grandinę (MHC) (raudona). . Rodyklių galvutės žymi miogeninių pirmtakų branduolius, kartu ekspresuojančius Spin1 ir Pax7 ( b ) arba Spin1 teigiamus branduolius miofiberuose ( c ). Rodyklės vaizduoja branduolius, neturinčius Spin1 dažymo miofiberuose ties P0 ( c ). ( d, e ) Jei „Spin1 M5“ vaisiaus užpakalinių galūnių skyriai dažomi E15 vietoje nurodytais antikūnais. Spin1 ekspresijos praradimas Pax7 teigiamuose miogeninių pirmtakų ( d ) arba miofibretų ( e ) branduoliuose Spin1 M5 vaisiuose yra pažymėtas rodyklių galvutėmis. ( be ) Branduoliai buvo vizualizuoti naudojant DAPI (mėlyną). f ) Pieno skrandyje nėra (strėlės) ir nenormali laikysena, stebima naujagimėms „Spin1 M5“ pelėms, tačiau nekontroliuojančioms vadų. g ) „Spin1 M5“ stebimos krintančios priekinės kojos (rodyklė), bet nekontroliuojamos vaisiaus

Visas dydis

Norėdami išsiaiškinti galimas Spin1 funkcijas SkM, mes išanalizavome Spin1 baltymo ekspresiją kontrolinių pelių užpakalinių galūnių skyriuose E15 ir po gimimo (P0) imunofluorescencijos būdu. Abiem laiko momentais stebėjome intensyvų „Spin1“ dažymą Pax7 teigiamuose mioblastų pirmtakuose (1b paveikslas (rodyklės galvutės)) ir silpnesnį dažymą miofiberio pluoštų branduoliuose (1c paveikslas (rodyklės galvutės)). Pažymėtina, kad naujagimiams pelėms Spin1 ekspresija nebuvo aptinkama kai kuriuose miofiberio pluošto branduoliuose (1c paveikslas, apatinė eilutė (rodyklės)).

Toliau mes pašalinome „ Spin1“ iš mioblastų pirmtakų sukryžiuodami „Spin1“ p / p peles su „ Myf5-Cre “ deleterio kamienu 31, gaudami „Spin1 M5“ peles. Imuninis dažymas patvirtino, kad Spin1 baltymo nėra Pax7 teigiamų mioblastų pirmtakų (1d pav. (Rodyklės galvutės); papildomas 1c pav.) Ir Spin1 M5 vaisiaus miofiberų (1e paveikslas (rodyklėlės galvutės); papildomas 1d paveikslas) branduoliuose. Likęs „Spin1“ dažymas atsiranda dėl ekspresijos ne miogeninėse ląstelėse, tokiose kaip Tcf4 teigiami fibroblastai 34 (papildomas 1e paveikslas (rodyklės galvutės); tolesnio apibūdinimo ieškokite medžiagose ir metoduose bei papildomame 1f paveiksle, g).

Homozigotinės „Spin1 M5“ pelės buvo gautos pagal numatomą Mendelio santykį gimus (papildomas 1h paveikslas). Tačiau apie 80% „Spin1 M5“ pelių mirė per vieną dieną po gimimo. Naujagimio „Spin1 M5“ pelės paprastai galėjo būti atskirtos nuo kontrolinių šiukšlintojų pagal nenormalią laikyseną ir pieno nebuvimą skrandyje (1f pav.). Be to, ties E16.5 stebėjome, kaip krinta Spin1 M5 vaisiaus priekinės kojos (1g paveikslas). Kartu mūsų duomenys rodo, kad Spin1 abliacija SkM sukelia daugumos pelių ankstyvą pogimdyvinę mirtį.

„Spin1 M5“ pelėms SkM būdinga nekrozinių skaidulų nekrozė ir struktūriniai defektai

Norėdami apibūdinti SpM1 pelių SkM defektus, mes apžiūrėjome hematoksilinu ir eozinu (H&E) dažytas užpakalinių galūnių dalis skirtinguose vystymosi etapuose. Palyginti su kontroliniais pakratų draugais, naujagimių „Spin1 M5“ pelėse pastebėjome skaidulų nuostolius (2a paveikslas, viršutinė eilutė (juodos žvaigždutės)) ir daugybę nesubrendusių ar degeneravusių pluoštų, neturinčių sutraukiančios medžiagos (brūkšniuoti apskritimai). Spin1 M5 vaisiuose ties E16.5 mes taip pat pažymėjome pluoštus su netaisyklingu H&E dažymu (2a paveikslas, vidurinė eilutė (brūkšniuoti apskritimai)) ir E15 išsiplėtusiais pluoštais, kurių kontroliniuose mėginiuose buvo mažiau (2a paveikslas, apatinė eilutė (balti žvaigždutės) )).

Image

„Spin1 M5“ pelėms SkM būdinga nekrozinių skaidulų nekrozė ir struktūriniai defektai. a ) Spin1 M5 priekinių pjūvių ir kontrolinių pelių skersinių blauzdikaulių dažymas hematoksilinu ir eozinu (H&E) esant P0, E16.5 ir E15. Pluošto praradimą „Spin1 M5“ pelėse rodo juodos spalvos žvaigždės (viršutinė eilutė), apsupti pluoštai su netaisyklingu H&E dažymu, o „Spin1 M5“ dažniau stebimi neįprastai dideli pluoštai nei E15 kontroliniuose vaisiuose, pažymėti baltais žvaigždutėmis (apatinė eilutė). b ) Naujagimio (P0) „Spin1 M5“ ir kontrolinių pelių SkM mėginių elektroninės mikroskopijos (EM) vaizdai. Punktyrinės linijos žymi degeneruojančius, nekrozinius pluoštus (I – II, apačia), rodyklių galvutės žymi normalias mitochondrijas (III, viršuje), rodyklės nurodo netinkamą mitochondriją (III, apačia), o žvaigždutės rodo nenormalų glikogeno kaupimąsi (IV, apačia).

Visas dydis

Užpakalinių galūnių pjūvių elektroninės mikroskopijos analizė, nustatyta naujagimio „Spin1 M5“ pelėms, išsigimusioms nekrotinėms skaiduloms (2b paveikslas, I – II stulpeliai (pažymėtos punktyrinėmis linijomis)), defektinėms mitochondrijoms (2b paveikslas, III stulpelis (rodyklės)) ir nenormaliam glikogeno kaupimuisi. (2b paveikslas, IV stulpelis (žvaigždutės)). Panašūs defektai buvo aptikti ir „Spin1 M5“ vaisiams E16.5 (papildomas 2 paveikslas). Be to, nekrotiniuose „Spin1 M5“ vaisiaus pluoštuose pastebėjome struktūrinius defektus, įskaitant mažą sutraukiančios medžiagos tankį ir aiškios M linijos nebuvimą (2 papildomas paveikslas, III stulpelis (trikampiai)). Kartu atlikta H&E ir elektronų mikroskopija analizuoja neaptiktus nekrozinius ir struktūros trūkumus turinčius pluoštus „Spin1 M5“ pelėse. Be to, duomenys rodo, kad SkM defektai atsirado prieš E16.5.

Transkriptominė ir histologinė analizės duomenys rodo abejotiną vaisiaus miogenezę Spin1 M5 pelėse

Norėdami ištirti Spin1 M5 vaisiaus transkripto pokyčius SkM, mes atlikome RNR sekos (RNR-seq) analizę, naudodami RNR, išskirtą iš galūnių raumenų. E15.5 metu mes stebėjome tik 17 diferencijuotai išreikštų genų (DEG) ( P ≤1e − 3; raukšlės pokytis ≥ 1, 5) (3a paveikslas; 1a papildoma lentelė). Palyginimui, E16.5 RNR-seq aptiko 193 DEG, iš kurių septyni ( Ankrd1, Ankrd2, Pmaip1, Scn4b (reguliuojamas aukščiau); Myf5, Msc, Nos1 (žemai sureguliuotas )) sutapo su E15.5 DEG (3a paveikslas; Papildomas 1b lentelė). Didelis DEG padidėjimas nuo E15.5 iki E16.5 suteikė įrodymų, kad E15.5 yra apytikslis SpM1 M5 vaisiaus SkM defektų atsiradimas.

Image

Transkriptominė ir histologinė analizės duomenys rodo abejotiną vaisiaus miogenezę Spin1 M5 pelėse. a ) Spin1 M5 ir kontrolinių vaisių SkM skirtingai išreikštų genų (DEG) susikertimas esant E15.5 (geltona) ir E16.5 (raudona). (R: sodrinimo koeficientas; p: P - apskaičiuota sankryžos vertė.) ( B ) Užpakalinės galūnės dalies, vaizduojančios priekinę blauzdikaulio dalį (TA), extensor digitorum longus (EDL) ir blauzdikaulį, analizuota c . Perspektyviosios oksidacinės arba glikolitinės TA dalys (pažymėtos brūkšniuotos linijos brūkšneliu) yra atitinkamai arti blauzdikaulio ar arti jo. c ) Ankrd1 arba Ankrd2 (žalios spalvos) aptikimas dažant imunofluorescenciniu (IF) būdu skersinėse užpakalinių galūnių „Spin1 M5“ dalyse ir kontroliniuose vaisiuose ties E16.5. Raumenų skaidulos buvo vizualizuotos miozino sunkiosios grandinės (MHC) antikūnu (raudona), branduoliai buvo nudažyti DAPI (mėlyna). Punktyrinės linijos nubraižo zonas su kontroliniais vaisiais su Ankrd1 arba Ankrd2 išraiška arba be jos. Žvaigždutės žymi „Spin1 M5“ vaisiaus TA regionus, kuriuose Ankrd1 arba Ankrd2 išreiškiami abejotinai. d ) E16.5 DEG (raudonos) susikertimas genais, diferencijuotai išreikštais kontroliniuose vaisiuose, esant E15.5 ir E16.5 (žali). e ) E16.5 DEG (raudonos) palyginimas su nuorašais, kurie, kaip pranešama, yra labiau išreikšti embriono ar vaisiaus myotube (MTs, cianinis) 37

Visas dydis

Įprasti E15.5 / E16.5 DEG Ankrd1 (CARP) ir Ankrd2 (ARPP) koduoja su titinais susijusius sarkorezės funkcijos reguliatorius, kurių ekspresija dažnai yra dereguliuota sergant SkM liga. 35 Todėl mes ištyrėme Ankrd1 ir Ankrd2 baltymų lygius E16.5 vaisiaus užpakalinių galūnių atkarpose imunofluorescencijos būdu (3b ir c pav.). Labiausiai pastebima, kad kontroliniuose vaisiuose abiejų baltymų ekspresija buvo ribojama vidinėje (potencialiai oksidacinėje) blauzdikaulio priekinės dalies (TA) dalyje, esančioje šalia blauzdikaulio (3c paveikslas (brūkšniuotos brūkšniais)), tuo tarpu „Spin1 M5“ vaisiuose dažymas taip pat buvo apribotas. esanti išorinėje (numatomoje glikolitinėje) TA dalyje (3c paveikslas (žvaigždutės)). Palyginimui, E15, Ankrd1 ir Ankrd2, Spin1 M5 ir kontrolinių pelių užpakalinių galūnių raumenų dažymas buvo panašus (papildomi 3a ir b paveikslai). Taigi Ankrd1 ir Ankrd2 nuorašų panaikinimas ties E15.5 ir E16.5 ir abejotina baltymo ekspresija ties E16.5 yra ankstyvieji SkM defektų Spin1 M5 vaisiuose žymenys.

Norėdami išanalizuoti, kuriai vystymuisi reguliuojamų genų daliai įtakos neturi „Spin1“ nebuvimas, palyginome E16.5 DEG su genų ekspresijos pokyčiais kontroliniuose vaisiuose nuo E15.5 iki E16.5. Kontroliniuose vaisiuose stebėjome 2042 genus, diferencijuotus tarp E15.5 ir E16.5 (3d paveikslas; 1c papildoma lentelė). Šių 2042 DEG fenotipo ir kelio analizė naudojant „WebGestalt 36“ patvirtino identifikuotų genų svarbą SkM raidai ar funkcijai (papildomi 3c ir d paveikslai). Susikirtimas su 193 E16.5 DEG parodė 125 genų sutapimą (3d pav.). Todėl, nesant „Spin1“, neleidžiama tinkamai ekspresuoti genų, kurie reguliuojami vaisiaus miogenezės fazėje, ekspresijos kontrolinėse pelėse.

Norėdami patvirtinti nukrypusią vaisiaus miogenezę Spin1 M5 pelėse, mes palyginome E16.5 DEG su nuorašais, kurie anksčiau buvo stebimi skirtingai diferencijuoti embriono ar vaisiaus myotube. 37 Iš 27 nuorašų, labiau išreikštų embrionų (palyginti su vaisiaus) myotubuliais, tik vienas ( Tnnc1 ) sutapo su E16.5 DEG (3e pav.). Svarbu tai, kad aštuoni iš trylikos nuorašų, labiau išreikštų vaisiaus myotubuliuose ( Myh8, Tnni2, Tnnt3, Atp2a1, Casq1, Pvalb, Ckm ir Eno3 ), buvo sumažintos DEG vertės „Spin1 M5“ pelėms ties E16.5 (3 pav. 3e). Kartu mūsų duomenys pateikė įrodymų apie sutrikusią vaisiaus miogenezės progresavimą Spin1 M5 pelėms.

Reguliuojamų SkM funkcinių tinklų identifikavimas Spin1 M5 vaisiuose

Norėdami nustatyti genus, susijusius su SpM1 M5 vaisiaus SkM defektais, atlikome E16.5 DEG fenotipo ir kelio analizę naudodami „WebGestalt 36“ (4a ir b pav.). Šios analizės atskleidė terminus, susijusius su SkM funkcija, metabolizmu ir patologija. Su fenotipo ir kelio terminais susieti genai buvo sugrupuoti pagal funkcinius tinklus, anksčiau pasiūlytus SkM 38, 39 sistemų biologijos analizėje (4c pav.). Nutrauktus SkM tinklus sudaro genai, koduojantys transkripcijos veiksnius ir signalines molekules, baltymai, svarbūs sarkorezės funkcijai, su titinu (Ttn) susieti faktoriai, metaboliniai fermentai ir baltymai, dalyvaujantys neuromuskulinėje jungtyje (NMJ) ir sužadinimo-susitraukimo jungimasis (ECC) (pav. 4c). Šių funkcinių tinklų panaikinimas greičiausiai sukelia SkM disfunkciją Spin1 M5 vaisiui.

Image

Reguliuojamų SkM funkcinių tinklų identifikavimas Spin1 M5 vaisiuose. ( a, b ) Fenotipo ( a ) ir b ) būdo analizė 193 DEG rinkinyje, stebėtame Spin1 M5 vaisiaus SkM esant E16.5. Nurodomas kiekvienos kategorijos genų skaičius. Fenotipo analizei pavaizduoti „top 5“ nereikalingi terminai. c ) Atrinktų E16.5 DEG, identifikuotų pagal fenotipo ir kelio analizę, priskyrimas funkciniams SkM tinklams. Nereguliuojami DEG vaizduojami raudonai, žemai sureguliuojami mėlynos spalvos (skliausteliuose keičiama raukšlė)

Visas dydis

Reguliuojami pagrindiniai spiralės-kilpos-spiralės transkripcijos faktorių tinklai atspindi „SkM“ defektus „Spin1 M5“ vaisiuose

Be genų, reikalingų SkM struktūrai ar funkcijai, tarp E16.5 DEG radome miogeninius bHLH transkripcijos faktorių koduojančius genus Myf5 , Myog , Msc (musculin, MyoR) ir Hes6 15, 40, 41, 42, 43. 4c paveikslas (tinklo „transkripcija ir signalizavimas“). Todėl nereguliuojama bHLH transkripcijos faktoriaus kontroliuojama genų ekspresija gali būti ankstyvas įvykis, atspindintis aberacinę miogenezę Spin1 M5 vaisiuose. Palaikydami šią idėją, „ Myf5“ ir „ Msc“ taip pat pateko į E15.5 DEG (papildoma 1a lentelė).

Norėdami koreliuoti genų ekspresiją su Spin1 chromatino užimtumu, mes atlikome chromatino imuninį nusodinimą, po kurio sekė masinis lygiagretus sekvenavimas (ChIP-seq), naudojant pirminius mioblastus. ChIP-seq su specifiniam Spin1 antikūnui nustatyta 17106 smailės, iš kurių didžioji dalis (61, 2%) buvo 12438 genų promotoriuose (transkripcijos pradžios vieta (TSS) ± 1 kb)) (5a paveikslas; papildomas 4a paveikslas). Tada ChIP-seq H3K4me3 analizė aptiko 37% 14832 genų promotorių smailių (5a paveikslas; papildomas 4a paveikslas). Tolesnės analizės patvirtino, kad H3K4me3 yra beveik visuose Spin1 užimtuose geno promotoriuose (5a paveikslas), taip pat sutampančio intensyvumo profiliai (5b paveikslas). Taigi pirminiuose mioblastuose Spin1 ir H3K4me3 užima didelę ląstelių genų promotorių dalį.

Image

Nereguliuojami pagrindiniai spiralės-kilpos-spiralės transkripcijos faktorių tinklai atspindi SkM defektus „Spin1 M5“ vaisiuose. a ) Genų susikertimas su Spin1 smailėmis (geltona) arba H3K4me3 smailėmis (ruda) prie promotoriaus (transkripcijos pradžios vieta (TSS) ± 1 kb) su E16.5 DEG (raudona). b ) Spin1 ir H3K4me3 užimtumo intensyvumo profiliai 12 429 genų promotoriuose (TSS ± ​​1 kb) ( K reiškia = 3 klasteriai (nuo C-1 iki C-3)). c ) Transkripcijos faktoriaus tikslinė analizė 88 E16.5 DEG su Spin1 ir H3K4me3 smailėmis prie promotoriaus, stebėta susikirtus duomenų rinkiniams, parodytiems a punkte. d ) Genų susikertimas su Spin1 ir H3K4me3 smailėmis (ruda) arba Myod1 smailėmis (cianomis) ties promotoriumi (TSS ± ​​1 kb) su E16.5 DEG (raudona). e ) pasirinktų genų, koduojančių miogeninius bHLH transkripcijos veiksnius, chIP-seq takeliai. „Spin1“ (žali) ir H3K4me3 (mėlyni) takeliai buvo gauti atliekant pirminių mioblastų ChIP-seq analizę, „Myod1“ (raudonos) trasos - gautos analizuojant anksčiau deponuotus C2C12 mioblastų „ChIP-seq“ duomenis (GEO duomenų rinkinys GSE36024). Identifikuotos smailės ir promotoriai (TSS ± ​​1 kb) žymimi brūkšniais

Visas dydis

Nepaisant to, kad jame užimta tūkstančiai genų promotorių, vaisiaus miogenezės metu „Spin1“, regis, reguliuoja tik tikslinių genų pogrupį. Norėdami toliau tirti Spin1 tarpininkaujamą genų reguliavimą, mes susikirtėme E16.5 DEG su cistrome, stebėtu pirminiuose mioblastuose. Ši analizė parodė, kad Spin1 ir H3K4me3 yra 88 E16.5 DEG promotoriuje (5a pav.). Šių 88 genų transkripcijos faktoriaus tikslinė analizė naudojant „WebGestalt 36“ atskleidė reikšmingą potencialių Myod1 taikinių genų, po kurių E12 (Tcf3) ir Mef2 taikinius, praturtėjimą (5c paveikslas).

Norėdami patvirtinti „Spin1“ taikinių genų „Myod1“ promotoriaus užimtumą, išanalizavome anksčiau deponuotą „Myod1 ChIP-seq“ duomenų rinkinį, skirtą C2C12 myoblastams (GEO duomenų rinkinys GSE36024), kuris atidengė „Myod1“ smailę 14612 genų promotoriuose (5d pav.). Susikirtimas su „Spin1“ užimtais genais parodė didelį 11695 „Spin1“ ir „Myod1“ tiesioginių taikinių sutapimą (5d pav.). Palyginimas su E16.5 DEG nustatė 82 tiesioginius Spin1 / Myod1 taikinius (5d paveikslas). Patikrinus „ChIP-seq“ takelius, buvo nustatyta, kad „Spin1“, H3K4me3 ir „Myod1“ yra SkM funkcinių, metabolinių ir reguliavimo genų promotoriuose (papildomas 4b paveikslas), taip pat Myf5 , Myod1 , Myog , Msc ir Hes6 promotoriuose (pav. 5e). Kartu mūsų duomenys rodo, kad nereguliuojami bHLH transkripcijos veiksniai daro įtaką nuo Spin1 / Myod1 priklausomai nuo tikslinio geno transkripcijai, tokiu būdu bent iš dalies įvertindami SkM defektus Spin1 M5 vaisiuose.

Išgyvenusios „Spin1 M5“ pelės turi didelius padus, blauzdikaulio priekinės dalies ir diafragmos defektus

Nors dauguma „Spin1 M5“ pelių mirė netrukus po gimimo, apie 20% išgyveno ir sulaukė pilnametystės. Toliau mes ištyrėme abejotinos vaisiaus miogenezės pasekmes SkM išgyvenančioms Spin1 M5 pelėms nuo 15 iki 30 savaičių, pastarosios atspindi seniausią gautą kohortą. Suaugusioms „Spin1 M5“ pelėms pasireiškia sunki skoliozė, kacheksija ir jos sveria tik apie 60% kontrolinių vadų (6a ir b paveikslai).

Image

Išgyvenusios „Spin1 M5“ pelės turi didžiuosius padus, blauzdikaulio priekinės dalies ir diafragmos defektus. ( a, b ) Spin1 M5 ir kontrolinių pelių ( n = 5 patelės kiekvienoje kategorijoje) išvaizda ( a ) ir vidutinis kūno svoris ( b ) 30 savaičių amžiaus. Klaidų juostos žymi + SD, ** P <0, 01. c ) Suaugusio Spin1 M5 raumenų, dengiančių raumenis, degeneracija, palyginti su kontrolinėmis pelėmis, kurių pavyzdys buvo 16 savaičių amžiaus. d ) „Spin1 M5“ ir kontrolinių pelių užpakaliniai galūnių raumenys (gastrocnemius (GC), plantaris (PL), soleus, tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) ir keturkampis (QC)) ir kontrolinės pelės po 30 savaičių. Rodyklės nukreiptos į padus, įterptą į gastrocnemius ir plantaris, kuris yra matomas kontrolėje, bet išsigimė Spin1 M5 pelėse. e ) „Spin1 M5“ ir kontrolinių pelių gastrocnemiuso, pado, TA ir EDL raumenų dažymas hematoksilinu ir eozinu (H&E) 30 savaičių amžiaus. f ) Pluoštų tipai glikolitinėse (baltosiose) arba oksidacinėse (raudonosiose) „Spin1 M5“ TA dalyse ir kontrolinės pelės po 15 savaičių (viršutinė ir vidurinė eilės), stebimos dažant imunofluorescenciniu (IF) būdu. Audinių sekcijos buvo dažytos selektyviais antikūnais, nukreiptais prieš MHC-I (purpurinė), MHC-IIb (cianas), MHC-IIa (raudona) ir MHC-IIx (žalia). Palyginimui buvo įtrauktas NADH dažymas (apatinė eilutė). Pluoštai su nenormaliu NADH dažymu žymimi rodyklėmis. Kiekviename vaizdų stulpelyje atitinkamos skaidulos yra kvadratinės

Visas dydis

Patikrinus užpakalinių galūnių raumenis, ryškiausiai pasirodė Spin1 M5 pelių neįprastai plonas ir blyškus padus (SOL) raumenys (6c paveikslas). Kiti užpakalinių galūnių raumenys (gastrocnemius (GC), plantaris (PL), TA, extensor digitorum longus (EDL) ir keturgalvis (QC)) taip pat parodė sumažintą masę, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis (6d paveikslas; papildomas 5a paveikslas). Raumenų masės sumažėjimas buvo ryškesnis (apie 60%) TA, nei gastrocnemius-plantaris, EDL ar keturgalvio raumenų (apie 30%) (papildomas 5a paveikslas). Skaičiavimas parodė, kad TA skaidulų skaičius sumažėjo maždaug 50%, tačiau reikšmingo Spin1 M5 EDL skirtumo nenustatyta, palyginti su kontrolinėmis pelėmis (papildomas 5b paveikslas).

H&E dažymas patvirtino pado degeneraciją, kurią patvirtino apvalūs pluoštai, milžiniški pluošto skersmenų skirtumai ir uždegiminių ląstelių buvimas (6e pav.). Taip pat dideli defektai buvo pastebėti TA, tuo tarpu gastrocnemius ir EDL atrodė normalūs (6e pav.). Taip pat Spin1 M5 pelių diafragmoje (DP) nustatyta sunki raumenų skaidulų degeneracija (papildomas 5c paveikslas). Gomori dažymas nustatė nenormalų kolageno nusėdimą, parodantį fibrozę, daugiausia Spin1 M5 pelių pado ir TA raumenyse (papildomas 5d paveikslas). Kartu mūsų stebėjimai atskleidė rimtus padų, TA ir diafragmos defektus.

Norėdami ištirti, ar degeneraciniai pokyčiai paveikė specifinius pluošto tipus, mes išanalizavome SkM sekcijas imunofluorescencijos būdu. Kontrolinių pelių TA rodė tipiškas pluošto tipo kompozicijas, tai yra, daugiausia IIb tipo pluoštus baltoje (pirmiausia glikolitinėje) TA ir IIa ir IIx tipo skaidulose raudonojoje (pirmiausia oksidacinėje) TA (6f pav., Viršutinė ir vidurinė eilutės). NADH dažymas koreliavo su pluošto rūšių glikolitinėmis ar oksidacinėmis savybėmis (6f paveikslas, apatinė eilutė). Palyginimui, kai kurių „Spin1 M5“ pelių TA nebuvo galima aiškiai atskirti pluošto rūšių, nes dauguma skaidulų išreiškė skirtingą MHC-IIx lygį, iš dalies kartu su MHC-IIb (6f pav.). Šių gyvūnų TA retai stebėjome IIa tipo pluoštus (6f pav.). Tačiau kitų Spin1 M5 pelių TA IIa pluoštuose buvo (skaidrus 5e paveikslas, dešinė skiltis). Be to, visi numatomi pluošto tipai buvo pastebėti Spin1 M5 pelių išsigimusiuose paduose ir gretimuose plantariuose (papildomas 5e paveikslas, kairioji ir vidurinė stulpeliai), nors defektus turinčius pluoštus buvo galima atpažinti pagal netaisyklingą pluošto dydį, formą ar NADH dažymą (6f paveikslas) ; Papildomas 5e paveikslas, apatinė eilutė (rodyklės)). Apskritai, šie stebėjimai prieštarauja selektyviam „Spin1 M5“ pelių skaidulų degeneracijai, tačiau rodo, kad tam tikri raumenys, įskaitant padus, TA ir diafragma, degeneravo.

Reguliuojamų SkM funkcinių tinklų identifikavimas išgyvenusioms Spin1 M5 pelėms

Toliau mes išanalizavome „Spin1 M5“ ir kontrolinių pelių TA transkriptomas trijų savaičių amžiaus (P21) metu. Tai parodė 1040 DEG ( P ≤1e −5; raukšlės pokytis ≥1, 5; 7a pav.; 1d papildoma lentelė). Susikirtimas su E16.5 DEGs aptiko labai reikšmingą 50 genų sutapimą (7a pav.), Kas rodo, kad išgyvenusių Spin1 M5 pelių defektai yra susiję su diferencine genų ekspresija ankstyvose ligos stadijose.

Image

Reguliuojamų SkM funkcinių tinklų identifikavimas išgyvenusioms Spin1 M5 pelėms. ( a ) SpEG1 M5 pelių TA stebimas DEG keitimas P21 (mėlyna) ir SkM ties E16.5 (raudona). (R: sodrinimo koeficientas; p: P-vertė, apskaičiuota sankryžoje.) ( B, c ) Fenotipo ( b ) ir kelio ( c ) analizė 1040 ° rinkinyje, stebėtame „Spin1 M5“ pelių TA esant P21. Fenotipo analizei pavaizduoti „top 5“ nereikalingi terminai. d ) Atrinktų P21 DEG, priskiriamų fenotipo ir būdo analizėms, priskyrimas funkciniams SkM tinklams. Nereguliuojami DEG vaizduojami raudonai, žemai sureguliuojami mėlynos spalvos (skliausteliuose keičiama raukšlė)

Visas dydis

P21 DEG fenotipo ir kelio analizė neidentifikuotų terminų, susijusių su raumenų funkcija ir liga, taip pat su metabolizmu (7b ir c paveikslai). Be to, mes pažymėjome tokius terminus kaip „židinio sukibimas“ ir „aktino citoskeleto reguliavimas“, kurie nebuvo identifikuoti E16.5 (4a ir b paveikslai). Grupuojant P21 DEG pagal sistemų biologinės klasifikaciją 38, 39, buvo atskleisti tie patys nereguliuojami SkM tinklai (7d pav.) Kaip ir E16.5 DEG (4c paveikslas). Tačiau P21 tinkluose buvo daugiau DEG nei E16.5, ir mes nustatėme papildomus tinklus („hipertrofijos ir atrofijos keliai“ ir „citoskeletas“). Pažymėtina, kad stiprus panaikintų genų, įskaitant kolageno izoformas, padidėjimas tinklo „tarpląstelinėje matricoje (ECM)“ (7d pav.), Koreliuoja su fibroze, aptinkama suaugusiųjų „Spin1 M5“ pelių TA (papildomas 5d paveikslas). Kartu ši analizė pateikė išsamų ligos požymį išgyvenusių Spin1 M5 pelių TA.

Diferencinė genų ekspresija išgyvenusioms Spin1 M5 pelėms koreliuoja su SkM ligos modeliais

Paskutiniame eksperimentų rinkinyje mes siekėme koreliuoti skirtingas genų ekspresijas išgyvenusiose Spin1 M5 pelėse su SkM ligos modeliais. Kadangi keli P21 DEG koduoja su titinu susijusius baltymus 21, 22 (7d paveikslas, tinklas „susijęs su Ttn“), mes hipotezėme panašumą su ligomis, kurias sukelia Ttn mutacijos, pavyzdžiui, blauzdikaulio raumenų distrofija (TMD). 44, 45 raumenų distrofija su miozito ( mdm ) pelėmis (naudojančiomis TMD modelį) ekspresuoja titino mutantą, neturintį N2A srities, jungiančio Ankrd1, Ankrd2 ir Ankrd23. Atitinkamai, su defektais „Ankrd1“ signalizavimas buvo susijęs su TMD pelėmis mdm . 46 P21 DEG susikertimas su 75 DEG, anksčiau praneštais mdm pelėmis 46, parodė reikšmingą 26 genų sutapimą (8a pav.). Atsižvelgiant į tai, kad Ankrd1 ir Ankrd2 reguliavimas Spin1 M5 vaisiuose jau yra E16.5 (3c ir 4c pav.), Abejotina su titinu susijusių baltymų ekspresija gali lemti SkM defektus Spin1 M5 pelėms.

Image

Diferencinė genų ekspresija išgyvenusioms Spin1 M5 pelėms koreliuoja su SkM ligos modeliais. a ) SpEG1 M5 pelių TA stebimas D21, kai P21 (mėlyna), ir 46 mdm pelių (pilka) SkM, parodanti blauzdikaulio raumenų distrofijos modelį (TMD) (R: praturtėjimo koeficientas; p: apskaičiuota P vertė) sankryžai). ( b ) Periodinis rūgšties-Schiffo (PAS) dažymas glikogeno kaupimuisi Spin1 M5 ir kontrolinių pelių TA ir pado raumenyse (SOL) 30 savaičių amžiaus. Pluoštai, rodantys nenormalų glikogeno kaupimąsi, pažymėti juodais trikampiais. c ) Naujagimio ir 15 savaičių amžiaus „Spin1 M5“ ir kontrolinių pelių diafragmos (DP) neuromuskulinių jungčių elektronų mikroskopijos (EM) vaizdai. Membranos prie sinapsinio plyšio yra pažymėtos baltais trikampiais, sinapsinės pūslelės su strėlėmis ir vakuolės, stebimos Spin1 M5 pelių su žvaigždutėmis neuromuskulinėse sankryžose.

Visas dydis

Toliau stebėjome genų, dalyvaujančių glikogeno metabolizme, įskaitant Pygm , Pfkm , Phka1 , Phkg1 , Prkaa2 ir Prkag3, sureguliavimą (7d pav., Tinklai „gliukozės ir glikogeno“ metabolizmas ir „hipertrofijos bei atrofijos keliai“). Yra žinoma, kad šių genų mutacijos vyksta glikogeno saugojimo ligose (glikogenozėse). Periodinis dažymas rūgšties-Schiffo (PAS) dažais parodė nenormalias glikogeno sankaupas TA ir pelėsio Spin1 M5 pelėse (8b paveikslas, juodi trikampiai). Nors šios sankaupos yra apribotos atskiromis skaidulomis, kurios skiriasi nuo tipiškų glikogenozių, mūsų pastebėjimai rodo, kad netinkamas glikogeno metabolizmas prisideda prie SkM ligos suaugusioms „Spin1 M5“ pelėms.

Galiausiai pažymėjome stiprų acetilcholino receptorių subvienetų ( Chrna1 , Chrnd , Chrne , Chrng ) ir keleto genų, dalyvaujančių sužadinimo-susitraukimo jungime (7d paveikslas, tinklai 'NMJ' ir 'ECC'), dereguliavimą , nurodantį apie trūkumus turinčius neuromuskulinius jungimus ir (arba) sužadinimą. -sutraukimo mova. Todėl elektroninės mikroskopijos būdu ištyrėme naujagimių ir suaugusiųjų „Spin1 M5“ pelių diafragmos neuromuskulinius sujungimus (8c pav.). Abiem laiko momentais analizė atskleidė sinapsinės membranos (baltų trikampių) defektus ir nenormalų išvaizdą, taip pat sumažino sinapsinių pūslelių (strėlių) skaičių Spin1 M5 pelėse (8c paveikslas). Be to, mes stebėjome, ar vakuumose nėra suaugusių „Spin1 M5“ pelių nervų galų (8c paveikslas, dešinės kolonos (žvaigždutės)). Šie duomenys rodo neuromuskulinių jungčių pažeidimus ir nenormalų sužadinimo-susitraukimo sujungimą Spin1 M5 pelėms.

Diskusija

Šiame tyrime mes pašalinome H3K4me3 skaitytuvo Spin1 mioblastų pirmtakuose, sukeldami nenormalią vaisiaus miogenezę, ankstyvą pogimdyvinę mirtį ar sunkius SkM defektus kelioms išgyvenusioms Spin1 M5 pelėms. Mūsų analizė rodo, kad daugybė E16.5 DEG yra tiesioginiai „Spin1“ ir „Myod1“ taikiniai. Be to, abejotina Myf5, Myog, Msc ir Hes6 ekspresija Spin1 M5 vaisiuose gali netiesiogiai paveikti nuo Myod1 priklausomą genų reguliavimą. Msc, for example, can repress transcription and antagonize the action of Myod1 in undifferentiated myoblasts by heterodimerization with E-proteins. 40 Hes6 was reported to inhibit expression of Msc thereby enhancing myoblast differentiation. 43 Therefore, deregulated bHLH transcription factor networks appear to determine, at least in part, aberrant gene expression in Spin1 M5 fetuses.

The preferential degeneration of soleus, TA, and diaphragm in adult Spin1 M5 mice raised the question whether this is caused by fiber type- or muscle type-selective mechanisms. Currently, we favor the latter hypothesis. While degeneration of type I and type II fibers might account for soleus defects, it would not convincingly explain the severe TA damage since this muscle contains only about 1 and 10% of these fibers types, respectively. 47 Furthermore, at E15.5 or E16.5, we did not identify DEGs involved in the regulation of fiber type identity or plasticity (eg, Six1 , Six4 , Eya1 , Sox6 ). 30

One possible determinant of muscle type-selective degeneration in Spin1 M5 mice could be the deregulation of titin-associated proteins such as Ankrd1, which has been linked with TMD in mdm mice. 46 However, despite some similarity with TMD, the SkM phenotype of Spin1 M5 mice is apparently more complex. We exemplarily correlated the P21 DEGs with abnormal glycogen accumulation in individual TA and soleus fibers as well as neuromuscular junction defects in Spin1 M5 mice. Due to the high number of DEGs observed in the TA of Spin1 M5 mice at P21, these examples only provide an initial characterization of deregulated SkM networks.

Compared with transcription factors, signaling molecules, SkM structural proteins, or metabolic enzymes, the roles of epigenetic regulators in SkM physiology and disease have only more recently become a focus of research. However, while epigenetic writers, erasers, and non-coding RNAs have received considerable attention, 48, 49 little is known about potential functions of histone code readers in SkM. Few readers (Brd4, Ing2, Sfmbt1, Dpf3) have been implicated in myogenesis using the C2C12 cell culture model 50, 51, 52, 53 or in zebrafish. 54 However, in these cases either knockout mouse models have not been reported, or in mice no apparent SkM phenotype was observed. 55, 56, 57 Thus, to the best of our knowledge, Spin1 is the first histone code reader, for which ablation in SkM has fatal consequences in mice. Together, our histological and transcriptome analyses provide insight into severe SkM defects in Spin1 M5 fetuses and surviving adult mice, hinting at Spin1 as a potential player in human SkM disease.

medžiagos ir metodai

Mouse studies

All mice were housed in the pathogen-free barrier facility of the University Medical Center Freiburg in accordance with institutional guidelines and approved by the regional board. Mice were maintained under temperature- and humidity-controlled conditions with a 12-h light/dark cycle, free access to water, and a standard rodent chow (3807, Provimi Kliba). Animals were killed by cervical dislocation and tissues immediately processed for further analyses.

Generation and validation of Spin1 R26 and Spin1 M5 mice

The targeting strategy for generation of a conditional Spin1 allele is outlined in Supplementary Figure 1a. Details are available upon request. The targeting construct was electroporated into C57BL/6 N Tac embryonic stem (ES) cells (Taconic), and neomycin-and puromycin-resistant clones were expanded. Selected ES cells were injected into blastocysts of C57BL/6 N mice. Resulting mice were bred to Rosa26-Flp mice to remove NeoR and PuroR selection markers. Offspring harbored a conditional Spin1 allele, in which exon 4 of Spin1 was flanked by loxP sites. C57/Bl6N mice homozygous for the conditional allele ( Spin1 p/p ) were crossed with the Rosa26-Cre deleter strain 32 to generate ubiquitous knockout (Spin1 R26 ) mice or with the Myf5-Cre deleter strain 31 to selectively ablate Spin1 in myoblast and brown adipocyte precursors (Spin1 M5 mice). Mice were maintained on the C57/Bl6N background. In phenotypic analyses of Spin1 M5 mice, Spin1 +/p or Spin1 p/p littermates served as controls. Mice were genotyped by PCR amplification using GoTaq G2 Flexi DNA polymerase (Promega) of genomic DNA extracted from tail biopsies with the NucleoSpin 96 tissue kit (Macherey Nagel). The following genotyping primers were used: forward 5-ATAGGCTCTCTGGCATGGTG-3 / reverse 5-ACAGCGTGACACATCAAAGC-3 detecting the wild-type (177 bp) and the conditional (337 bp) allele and forward 5′-GGAGGAAGACACCTAATAGCACC-3′ /reverse 5′-AAGGCAAAACGGAGACAGC-3′ detecting the deleted allele (395 bp).

Efficient Spin1 depletion in myogenic cells and remaining Spin1 expression in non-myogenic cells of Spin1 M5 mice was validated as follows. Spin1 M5 and control mice were crossed with mice harboring a green fluorescent protein/nuclear lacZ (GNZ) reporter. 58 In mice harboring the reporter, GNZ expression is Cre dependent. GNZ-positive myogenic cells in Spin1 M5 mice did not express Spin1, whereas Spin1-positive cells were GNZ-negative and therefore non-myogenic (Supplementary Figure 1f). Part of these Spin1-expressing, non-myogenic cells were Tcf4-positive fibroblasts 34 (Supplementary Figure 1e). Reduction of Spin1 mRNA in hind limb muscle of newborn Spin1 M5 mice was confirmed by quantitative RT-PCR (Supplementary Figure 1g).

Quantitative RT-PCR and RNA sequencing

SkM tissue was homogenized in TRIzol reagent (Life Technologies, Darmstadt, Germany) using a Minilys personal homogenizer (Bertin, Montigny, France) and 0.5 or 2.0 ml CK14 lysing kits (Precellys, Montigny, France). RNA was isolated using a standard phenol/chloroform extraction protocol. cDNA was prepared by reverse transcription of total RNA using SuperScript II (Life Technologies) and oligo(dT) primer according to the supplier's protocol. Quantitative RT-PCR was performed with a Lightcycler 480 II (Roche, Mannheim, Germany) using Absolute SYBR green ROX Mix (Thermo Scientific, Scherte, Germany) and the following primers: Spin1 (exon 4, forward) 5′-CAGGTGCCTGTGAATCCTTC-3′, Spin1 (exon 5, reverse) 5′-ACATGTGCTCCACTGCTTTG-3′, Tbp (forward) 5′-CCCCTTGTACCCTTCACCAAT-3′, Tbp (reverse) GAAGCTGCGGTACAATTCCAG-3′, Hprt (forward) 5′-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3′, Hprt (reverse) 5′-AGGGCATATCCAACAACAAACTT-3′, Polr2a (forward) 5′-CACCCCAGCTTCTCCCAAAT-3′, and Polr2a (reverse) 5′-AGTATGTCGGGGAGGTTGGA-3′. Data were analyzed using the 2(-Delta Delta C(T)) method. 59

RNA-seq analyses for E15.5 and E16.5 were performed with SkM dissected from front and hind limb of three Spin1 M5 and four control fetuses. For RNA-seq analysis of mice at three weeks of age (P21), TA isolated from four Spin1 M5 and four control mice was used. RNA was isolated as described above, except that minced tissue in TRIzol was further homogenized with QIA shredder spin columns (Qiagen, Hilden, Germany). RNA quality was determined using the RNA 6000 Nano Kit (Agilent, Waldbronn, Germany) on an Agilent 2100 Bioanalyzer. RNA with a RIN above 8.0 was sequenced at the DKFZ core facility (Heidelberg, Germany) or the Deep Sequencing Unit (Max-Planck-Institute of Immunology and Epigenetics, Freiburg) using the standard Illumina protocol. Paired-end reads were mapped to Ensemble annotation NCBIm38/mm10 with TopHat2 60 using default parameters. The aligned reads were counted with HOMER software 61 and DEGs calculated with edgeR. 62 Overrepresentation analyses for the identified DEGs ( P ≤1e−3 (E15.5 and E16.5), P ≤1e−5 (P21); fold change ≥1.5; ≥50 reads in all Spin1 M5 or all control samples] were performed using WebGestalt 36 with 'genome' as reference set.

Of note, none of the RNA-seq analyses identified Spin1 as differentially expressed gene. Examination of the normalized reads at exons 1 to 6 of the Spin1 gene explained this observation (Supplementary Table 1e). Reads were significantly decreased at exon 4 (which is excised in a Myf5-Cre -dependent manner in myogenic cells), but not at other exons in Spin1 M5 relative to control mice. Thus, in myogenic cells of Spin1 M5 mice a truncated transcript (lacking exon 4) is expressed, which results in translation of a truncated Spin1 peptide (containing 56 N-terminal amino acids lacking any known functional domain) due to the presence of a premature STOP codon in exon 5. Normal Spin1 transcript (containing exon 4) present in SkM of Spin1 M5 mice is most likely produced by non-myogenic cells (Supplementary Figures 1e and f). Since mapped reads at all exons contribute to the overall count, differential expression of Spin1 is not detected in RNA-seq analyses.

Antikūnai

The generation and validation of anti-SPIN1 antibodies 5865 and 5867 was described previously. 6 Antibodies SPIN1(5867) and H3K4me3 (Diagenode, Oxford, UK, C15410003) were used for ChIP. For immunofluorescence staining the following primary antibodies were used: SPIN1(5865) 1 μ g/ml; Pax7 (PAX7, DSHB, batch 7/2/15) 2 μ g/ml; Tcf4 (6H5-3, Millipore, Darmstadt, Germany, 05-511, batch 2155406) 10 μ g/ml; Ankrd1 (Proteintech Group, Manchester, UK, 11427-1-AP, batch 1951) 1:100; Ankrd2 (Proteintech Group, 11821-1-AP, batch 7649) 1:100; dystrophin (Abcam, Cambridge, UK, ab15277, batch GR226781-6) 1:500; MHC-I (NOQ7.5.4D, Sigma, Munich, Germany, M8421, batch 035M4792V) 1:2000; MHC-IIa (SC-71, DSHB, batch 4/7/16) 1:10; MHC-IIx (6H1, DSHB, batch 3/3/16) 1:6; MHC-IIb (BF-F3, DSHB, batch 5/12/16) 1:20; MCH, skeletal, fast (MY-32, Sigma, M4276, batch 083M4790V) 1:1000; GNZ (anti-GFP, Abcam, ab13970, batch GR236651) 1:1000; normal rabbit IgG (Santa Cruz, Heidelberg, Germany, sc-2027). The following secondary antibodies were used: Alexa Fluor 488 (goat anti-mouse IgM, Molecular Probes, Karlsruhe, Germany, A21042, batch 1387726) 1:600; Alexa Fluor 488 (goat anti-mouse IgG, Molecular Probes, A11029, batch 1306597) 1:600; Alexa Fluor 546 (goat anti-mouse IgG, Molecular Probes, 11030, batch 517979) 1:600; Alexa Fluor 594 (goat anti-chicken IgG, Molecular Probes, A11042, batch 762712) 1:600; donkey anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz, sc-2313) 1:500.

Imunofluorescencinis dažymas

SkM tissues were either fixed in 4% paraformaldehyde/PBS or flash-frozen in 2-methylbutane (Sigma). Paraffin sections (5 μ m) were deparaffinized, heated in antigen retrieval solution (20 mM Tris (pH9.0)) for 20 min in a pressure cooker, and blocked for 1 h at room temperature in 3% skim milk powder/PBS containing 0.1% Tween (PBST). Cryosections (10 μ m) were blocked with 5% fetal calf serum/PBST. Sections were incubated overnight with primary antibody at 4 °C, washed with PBST, incubated with secondary antibody for 1 h at room temperature, and then washed with PBST. For Spin1 staining, signal amplification using the TSA fluorescein system (Perkin Elmer, NEL701A001KT) was applied according to the manufacturer's instructions. Briefly, tissue sections were blocked in 0.5% TNB blocking buffer, labeled with primary and secondary antibody, and then incubated with TSA reagent for 15 minutes at room temperature followed by two washing steps with PBST. Finally, nuclei were stained with DAPI (1 μ g/ml) followed by two washing steps with PBST, and sections were mounted using Fluoromount-G (SouthernBiotech). Images were recorded with a confocal microscope (Leica TCS SP2 AOBS). Counting was done with ImageJ 63 followed by visual validation of the results. Pax7-positive nuclei or nuclei of myofibers (expressing Spin1 or being Spin1-negative) were quantified using confocal images with dimensions of 187.5 μ m × 187.5 μ m or 375 μ m × 375 μ m, respectively.

Isolation of primary myoblasts and ChIP sequencing

Primary myoblasts were isolated from 10- day-old C57BL/6 N mice using an established preplating protocol. 64 Briefly, limb muscles were collected from front and hind leg, minced, digested for 1 h in 0.2% collagenase type I (Sigma, C0130), and filtered through 100 μm cell strainers (Falcon, 352360). Cells were collected by centrifugation, resuspended in DMEM medium (Gibco, Schwerte, Germany, 11995-065) supplemented with 10% FCS, 10% horse serum, and 1.25% chicken embryo extract (Seralab, CE-650-J), and cultivated for 1 h on 6 cm tissue culture dishes to allow for attachment of fibroblasts. Supernatants were transferred to 6 cm dishes, again incubated for one hour, and then transferred to 10 cm tissue culture dishes coated with collagen (Gibco, A10483-01). Myoblasts were cultivated for 3 to 4 days until a confluency of about 70% was reached. Cells were fixed with 1% formaldehyde for 5 minutes, quenched in glycine (1.25 M), washed with PBS buffer, collected, and snap-frozen in liquid nitrogen.

Chromatin was prepared using the NEXSON procedure. 65 Briefly, nuclei were extracted by sonication with a Covaris E220 sonicator (75 W peak power, 2% duty factor, 200 cycles/burst, 60 s). Nuclei were pelleted, resuspended in 1 ml of shearing buffer, and sonicated for 12 min (140 W peak power, 5% duty factor, 200 cycles/burst). Chromatin was diluted 1:2 in buffer H (Diagenode auto histone ChIP-seq kit (C01010022)) before ChIP. For ChIP, one tenth of the chromatin was incubated with 1 μg of H3K4me3 antibody (Diagenode, C15410003). The remaining chromatin (from ~1.2 million cells) was incubated with 5 μg of SPIN1(5867) antibody. ChIP was performed using the automated platform SX-8G IP-Star (Diagenode) and the program 'ChIP indirect method'. Chromatin was incubated with antibody for 10 h followed by 3 h of incubation with protein A-conjugated beads. 1% of the original chromatin was used as input. After elution from beads, ChIP and input samples were reverse crosslinked, and DNA purified with MinElute columns (Qiagen, 28004). Libraries were prepared using the NEBNext Ultra DNA library preparation kit (NEB, E7370S) according to the manufacturer's instruction and without size selection. Adapter-ligated fragments were amplified with 12 PCR cycles and sequenced on the Illumina HiSeq 2500 platform by the Deep Sequencing Unit of the Max-Planck-Institute of Immunology and Epigenetics (Freiburg).

Paired-end reads were mapped to the mouse reference genome (mm10) using bowtie 266 with default parameters. Data were further analyzed using the peak finding algorithm of MACS 1.4.2 67 using input as control. All peaks with a false discovery rate >1% were excluded from further analyses. The uniquely mapped reads were used to generate genome-wide intensity profiles, which were visualized using the integrative genomics viewer (IGV). 68 Peaks were annotated and overlaps between different peak files were calculated with HOMER. 61 The genomic features (promoter, exon, intron, 5′ or 3′ untranslated region, and intergenic region) were defined and calculated using Refseq and HOMER. Myod1 chromatin association in C2C12 myoblasts was analyzed using a previously deposited GEO data set (GSE36024). Venn diagrams were generated with the help of Venny. 69 Intensity profiles for Spin1 and H3K4me3 gene promoter occupancy were analyzed with SeqMINER. 70

GEO data availability

The RNA and DNA sequencing data discussed in this publication have been deposited in NCBI's Gene Expression Omnibus 71 and are accessible through GEO Series accession number GSE92539.

Elektronų mikroskopija

Muscle samples were fixed by immersion in 2.5% glutaraldehyde and 2.5% paraformaldehyde in cacodylate buffer (0.1 M, pH 7.4) and then washed in cacodylate buffer for further 30 min. The samples were post-fixed in 1% osmium tetroxide in 0.1 M cacodylate buffer for 1 h at 4 °C, and dehydrated in an ascending ethanol gradient (50, 70, 90, and 100%) and propylene oxide for 30 min each. Samples were embedded in Epon 812 substitute (Sigma-Aldrich). Semi-thin sections cut at 2 μm and ultra-thin sections cut at 70 nm were contrasted with uranyl acetate and lead citrate and examined at 70 kV with a Morgagni 268D electron microscope. Images were digitally captured by Mega View III camera (Soft Imaging System).

Hematoxylin & eosin staining

Deparaffinized and rehydrated or flash-frozen tissue sections (5 or 10 μ m, respectively) were stained according to a standard protocol with hematoxylin (Gill No. 3, Sigma, GHS332) and eosin Y solution (Sigma, HT110332) and mounted using Roti-Histokitt (Roth).

Gomori trichrome staining

Deparaffinized and rehydrated tissue sections (5 μ m) were stained using Bouin's solution (Sigma, HT10132), hematoxylin-Weigert's iron kit (Dianova, HWI-2), and trichrome stain (blue) solution (Dianova, TGB500) according to the supplier's instructions and mounted using Roti-Histokitt (Roth).

NADH staining

Cryosections (10 μ m) were incubated with staining solution (0.2 M Tris (pH 7.4), 1.5 mM NADH (Roche, 10128015001), 1.5 mM nitroblue tetrazolium (Sigma, N-6876)), dehydrated in an ascending ethanol gradient, incubated twice with xylene, and mounted using Roti-Histokitt (Roth).

Periodic acid–Schiff staining

Deparaffinized and rehydrated tissue sections (5 μ m) were treated with 0.5% periodic acid solution (Sigma, 3951), stained with Schiff's reagent (Sigma, 3952016), dehydrated, and mounted using Roti-Histokitt (Roth).

Statistika

Transcriptome and cistrome data were analyzed as described above. Statistical significance of gene set intersections was evaluated by a hypergeometric test using the program 'R' (//www.R-project.org) [phyper (N12-1, N1, N-N1, N2, lower.tail=FALSE) with N1 (genes in set 1), N2 (genes in set 2), N12 (genes in intersection), and N (genome size)]. The enrichment factor (R) was calculated according to R =(N × N12)/(N1 × N2). Other data are presented as the mean value or percentage change +SD Comparisons between two data sets were made using the two-tailed Student's t -test for parametric data and the Wilcoxon signed-rank test for nonparametric data. Statistiškai reikšminga P vertė buvo mažesnė nei 0, 05. Statistical significance is indicated as follows: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.

Prisijungimai

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE92539

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

  2. 2.

    Papildomos lentelės 1

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos paveikslėlių ir lentelių legendos

    Leidėjo pastaba

    „Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

    Papildoma informacija pridedama prie šio pranešimo ląstelių mirties ir ligų svetainėje (//www.nature.com/cddis)