Histono demetilazės kdm5a skaitymo sritis reguliuoja per teigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmą | gamtos komunikacijos

Histono demetilazės kdm5a skaitymo sritis reguliuoja per teigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmą | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Chromatinas
  • Molekulinė biofizika
  • Modifikacijos po vertimo

Anotacija

Retinoblastomą surišantis baltymas KDM5A pašalina metilo ženklus iš H3 (H3K4) lizino 4. Neteisingas KDM5A reglamentavimas prisideda prie plaučių ir skrandžio vėžio patogenezės. Be katalizinio jumonji C domeno, KDM5A turi ir tris PHD skaitytojų domenus, paprastai žinomus kaip chromatino įdarbinimo moduliai. Nežinoma, ar kuris nors iš šių KDM5A domenų turi funkcijų, kurios nėra susijusios su įdarbinimu, ir ar jos reguliuoja demetilazės katalizinį aktyvumą. Naudodamiesi biocheminiais ir branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) pagrįstais struktūriniais tyrimais, parodome, kad PHD1 pirmiausia atpažįsta nemetilintą H3K4 histono uodegą, KDM5A tarpininkaujant metilinto H3K4 (H3K4me3) demetilinimo produktą. Nemodifikuoto H3 peptido surišimas su PHD1 skatina katalizinio domeno sąlygotą metilo žymių pašalinimą iš H3K4me3 peptido ir nukleosomų substratų. Šis teigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmas, įgalintas funkciniu skaitytuvo ir katalizinio domeno sujungimu KDM5A, rodo chromatino demetilinimo plitimo modelį.

Įvadas

Dinaminis posttransliacinių modifikacijų (PTM) sąveikavimas histonų uodegėlėse nukleosomose suteikia molekulinį mechanizmą, skirtą reaguoti į ląstelės dirgiklius, reguliuojant chromatino struktūrą ir funkciją 1, 2 . Tarp daugybės PTM ant histono uodegų, histono lizino metilinimas vaidina lemiamą vaidmenį kontroliuojant genų ekspresiją 1 . Chrizino lizino metilinimo dinamiką tiksliai kontroliuoja fermentų ir baltymų, kurie „rašo“, „skaito“ ir „trina“ šį ženklą, suderinta funkcija 3 . Lizino metilo žymių pašalinimas iš chromatino atliekamas histono demetilazėmis. Nuo flavino priklausomos demetilazės LSD1 ir LSD2 veikia mono- ir dimetilinto lizino liekanų pogrupį, o platesnė ir pastaruoju metu atrasta jumonji C (JmjC) domeno turinti demetilazės šeima veikia platų mono-, di- ir trimetilinto lizino substratai. Priešingai nei histono lizino metiltransferazės (KMT), kur buvo atlikti išsamūs in vitro ir in vivo tyrimai, apibūdinantys jų aktyvumą chromatinu, informacijos apie histono lizino demetilazių (KDM) aktyvumą kontroliuojančius mechanizmus yra nedaug, o ypač apie jumonji šeima. Vis dėlto poreikis mechaniškai išpjaustyti histomatinius KDM, veikiančius chromatiną, priklauso nuo tvirtinamų įrodymų, kad JmjC domeną turintys KDM yra svarbūs vystymosi metu ir yra neteisingai reglamentuoti keliuose vėžiuose ir neurologiniuose sutrikimuose ( 4, 5, 6, 7, 8) .

KDM5A (RBP2, JARID1A) priklauso Jumonji histonų demetilazių KDM5 pošeimiui, veikiančiam H3 histono tri-, di- ir metilinuotą liziną 4 (H3K4me3 / 2/1). „KDM5“ šeimai taip pat priklauso PLU-1 / KDM5B, SMCX / KDM5C ir SMCY / KDM5D. KDM5 fermentai turi labai konservuotą domeno architektūrą, apimančią JmjN domeną, katalitinį JmjC domeną, ryškią / aridinę DNR jungiančią domeną, C5 HC2 cinko pirštą ir du ar tris PHD domenus. Iš pradžių aprašytas kaip naviko slopintuvo retinoblastomos baltymo jungiamasis partneris, KDM5A yra kritinis transkripcijos reguliatorius ląstelių diferenciacijai ir vystymuisi 9, 10, 11, 12, 13, 14 . KDM5A per didelis ekspresas skatina naviko genezę ir toleranciją vaistams vėžio ląstelėse, taigi parodo galimą terapinį taikinį 6, 15, 16, 17, 18 . Nepaisant svarbos fiziologijoje ir ligoje, mechanizmai, kuriais KDM5A demetilazės aktyvumas ir apskritai KDM5 demetilazės yra reguliuojami chromatinu, nežinomi.

Augalų homeodomeno (PHD) pirštuose yra „Cys 4 HisCys 3“ motyvas, kuris koordinuoja du cinko jonus kryžminio jungimo būdu ir atsirado kaip sekai ir modifikacijai būdingi histonų atpažinimo domenai 19, 20, 21, 22, 23 . Iki šiol buvo nustatyta, kad PHD domenai, esantys demetilazėse ir demetilinimo kompleksuose, veikia kaip įpareigojantys moduliai, skirti sureguliuoti demetilazių užimtumą ir substrato specifiškumą 24, 25, 26, 27 . Norėdami ištirti, ar PHD sričių funkcijos demetilazėse neapsiriboja įdarbinimu ir ar jos galėtų prisidėti prie šių fermentų katalizinio aktyvumo reguliavimo, mes norėjome apklausti jų vaidmenis KDM5A kontekste. Tarp trijų KDM5A PHD sričių, PHD3 buvo tiriamas jo susiliejimo su NUP98 nukleoporinu kontekste, kur buvo įrodyta, kad jis specifiškai jungiasi su H3K4 tri-metilo ženklu 28 . Nors PHD2 srities funkcija nėra žinoma; Kokybiniai ištraukiami KDM5A PHD1 domeno tyrimai rodo, kad šis domenas suriša nemodifikuotą H3K4 peptidą 28 . Tačiau šio jungimosi funkcinis reikšmingumas ir galimas poveikis KDM5A demetilinimo veiklai nežinomas. Normos dėl reguliavimo vaidmens išplaukia iš eksperimentų, rodančių, kad PHD1, bet ne PHD2 ar PHD3 išbraukimas iš žmogaus ir Drosophila KDM5A homologų panaikina jų fermentinį aktyvumą in vivo , padidindamas ląstelių H3K4me3 lygį 29, 30 . Be to, pirminėje demetilazės sekoje PHD1 yra tarp JmjN ir JmjC domenų, kurie, kaip teigiama, sudaro kompozicinę aktyvią vietą KDM5 histono demetilazėse 29, 31, 32 . Šie stebėjimai rodo galimą PHD1 domeno vaidmenį reguliuojant KDM5A katalizinį aktyvumą.

Rezultatai

PHD1 pirmiausia atpažįsta H3K4me0 histono uodegas

Norėdami sužinoti PHD1 domeno funkciją ir kiekybiškai įvertinti jo histono uodegos surišimo specifiškumą, pirmiausia klonavome ir rekombinantiškai išreiškėme glutationo S-transferazės (GST) sulietą PHD1 291–347 konstruktą. Naudodamiesi fluorescencine poliarizacija (FP) pagrįstu tyrimu, stebėjome jo ryšį su fluorescenciniu etikete pažymėtais H3, H4, H2A ir H2B uodegos peptidais (1b pav.). Iš visų keturių histono uodegos peptidų PHD1 domenas atpažino tik H3 uodegos histoną su mažu mikromolių afinitetu, sąveikos stiprumas panašus į kitus histoną surišančius PHD domenus (1b, d pav.). PHD1 domeno surišimas su H3 uodegos peptidu buvo prarastas, kai buvo pašalinti pirmieji keturi liekanos, ARTK (H3 5–18 ) (1b pav.). Be to, naudodami nemetilintus ir metilintus H3 uodegos peptidus, mes nustatėme, kad PHD1 domenas teikia pirmenybę H3 peptidui, kuriame yra nemetilintas Lys4 (H3K4me0), ir rodo mažiausią afinitetą H3 uodegos peptidui, kuriame Lys4 yra metilinamas (H3K4me3; pav. 1c, d). Nors Lys4 metilinimas suteikia selektyvumo filtrą, tačiau jungiantis nereikia lizino šoninės grandinės (mutanto peptido, kuriame Lys4 yra mutavęs į Ala (K4A peptidas), Kd yra 2 μM, 1d pav.). Arginino mutacija 2-oje padėtyje (R2) prieš alaniną, priešingai, sukelia afiniteto sumažėjimą daugiau nei 25 kartus (Kd R2A peptidas = 49 μM, 1d pav.). Simetriškas (H3R2me2s) arba asimetriškas (H3R2me2a) R2 dimimelavimas sumažina surišimo afinitetą maždaug penkis kartus (1d pav.). Nors ir R2, ir K4 metilinimas daro įtaką peptidų prisijungimui prie PHD1, 9 lizino metilinimas neturi jokio poveikio PHD1 prisijungimui (papildomas 1 pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad PHD1 – H3 uodegos sąveika yra jautri tiek R2, tiek K4 liekanų metilinimo būklei. Pirmenybė nemetilintiems H3 uodegos peptidams lygiagreti Drosophila homologo 30 dangčio PHD1 domeno ir PHD1 domeno specifiškumui KDM5B (nuorodos 33, 34). Šie radiniai rodo, kad nepageidaujamas nemodifikuoto lizino 4 surišimas H3 histone gali būti evoliuciškai išsaugotas šio skaitytojo domeno bruožas KDM5 demetilazių šeimoje.

Image

a ) KDM5A domeno žemėlapis. ( b, c ) Peptidų prisijungimas prie PHD1, įvertintas polarizuota fluorescencine poliarizacija: b ) histono uodegos peptidai (1–18 aminorūgštys ir H3 5–18); c ) peptidai su skirtingu histon H3 metilinimo laipsniu 4. ( d ) H3 histono H3 peptidų disociacijos konstantos (1–18 aa). ( e ) KDM5A 1–797 demetilinimo aktyvumas metilinamų H3K4 histono uodegos peptidų atžvilgiu. ( f ) KDM5A PHD1 ir KDM5A 1–797 afiniteto H3K4me0 peptido atžvilgiu matavimas H3 uodegos peptidams, esant skirtingam K4 metilinimo laipsniui. ( g ) H3K4me3 demetilinimo stimuliavimas WT KDM5A 1–797 demetilaze, didinant H3 1–18 ir H3 5–18 efektorinius uodegos peptidus. Klaidos ( n ≥ 3) reiškia sem

Visas dydis

Užimtumas PHD1 skatina peptidų demetilinimą

Mūsų duomenys rodo, kad PHD1 domenas, esantis KDM5A, geriausiai atpažįsta H3 uodegos peptidus, kurie yra metilinami ir mažesniu mastu mono metiliuojami K4, palyginti su tais, kuriuose yra aukštesnės šios liekanos metilinimo būsenos (1c, d pav.). Kadangi šie tinkamiausi rišamieji substratai yra KDM5A sąlygoto demetilinimo produktai, šis pastebėjimas iškelia galimybę, kad šio fermento demetilinimo aktyvumą reguliuoja teigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmas. Norėdami ištirti šią galimybę ir atskirti PHD1 vaidmenį nuo PHD2 ir PHD3, mes panaudojome KDM5A konstrukciją, neturinčią PHD2 ir PHD3 domenų (1a pav., KDM5A 1–797 ). Pirmiausia įvertinome šio konstrukto katalizinį aktyvumą H3K4me3, 2 ir 1 metilintuose peptiduose, naudodamiesi fermento sujungtu fluorescenciniu tyrimu 35 . Mes nustatėme, kad KDM5A 1–797 demetiliuoja visas H3K4 metilinimo būsenas, o pirmenybė teikiama H3K4 trimetiliniam substratui (1e pav. Ir 1 papildoma lentelė), suderinta su ankstesniais atradimais 13 . Palyginus su ankstesniais KDM5A tyrimais in vitro (nuorodos 13, 14), mes taip pat nustatėme H3K4me1 peptidų demetilinimą (papildomas 2 pav.). Nors šis neatitikimas gali kilti dėl eksperimentinių sąlygų skirtumų, mūsų rezultatai atitinka pastebėjimą, kad KDM5A in vivo gali demetilioti visas tris K4 metilinimo būsenas.

Tuomet įvertinome KDM5A 1–797 jungimosi selektyvumą diferencijuotai metilinamų H3K4 peptidų atžvilgiu. Analogiškai izoliuotam PHD1, KDM5A 1–797, palyginti su di- ir trimetilintais H3K4 peptidais, pirmiausia jungiasi su metilintais ir monometiliniais H3K4 peptidais (1f pav.), Kas rodo, kad PHD1 funkcija išlieka demetilazės. Norėdami patikrinti, ar ligando peptido jungimasis su PHD1 domenu daro įtaką KDM5 demetilazės aktyvumui, palyginome KDM5A 1–797 konstrukcijos aktyvumą H3K4me3 peptido atžvilgiu, jei yra nemodifikuotas H3 1–18 peptidas, PHD1 ligadas ar apipjaustytas H3 5–18 peptidas, neprisijungiantis prie PHD1 (1b pav., g). Įdomu tai, kad demetilazės aktyvumas buvo stimuliuojamas esant H3 1–18 peptidui, tačiau kontrolinio H3 5–18 peptido stimuliacija nepastebėta (1g pav.). Taip pat pastebėjome fermento katalizinės greičio sumažėjimą esant didelėms H3 1–18 peptido koncentracijoms (> 50 μM) ir tokį poveikį priskyrėme šio peptido veikliosios vietos slopinimui. Šie rezultatai rodo modelį, pagal kurį efektorinis peptidas prisijungia prie PHD1 domeno allosteriškai stimuliuoja katalitinio domeno aktyvumą.

H3 uodegos surišimo vietos, esančios PHD1, struktūros analizė

Norėdami sužinoti apie H3 uodegos peptido atpažinimo pagal PHD1 būdą ir nustatyti likučius, kurie mutavus ardo PHD1 – H3K4 uodegos kompleksą, mes panaudojome branduolinį magnetinį rezonansą (BMR). Apo PHD1 dviejų dimensijų heteronuklearinis vieno kvantinio koherencijos (2D15 N-HSQC) spektras atskleidė gerai išsisklaidžiusį kryžminių smailių rinkinį, kuris likučiams buvo priskirtas atliekant trigubo rezonanso stuburo eksperimentus (2a pav.). Išmatuoti cheminiai poslinkiai ( 1 H n, 15 N, 1 Hα, 13 Cα ir 13 Cβ) buvo naudojami apo PHD1 domeno CS-Rosetta modeliui (2b pav. Ir papildomiems 3 ir 4 paveikslams) sukurti, kuris buvo filtruojamas susitarimas su išmatuotais dvišlaičiais tvirtinimais (2 papildoma lentelė). CS-Rosetta modeliai, nors ir labai panašūs į kanoninių PHD pirštų domenų struktūras ir ypač į neseniai nustatytą KDM5B PHD1 NMR struktūrą (nuoroda 34), rodo naują „atvirą“ L2 kilpos konformaciją (žr. 34 pav.). likučiai 323–335; 2b pav. ir papildomas 5 pav.). Titruodami H3K4me0 peptidą, mes pastebėjome didelius daugelio kryžminių smailių PHD1 spektrų cheminių poslinkių pokyčius, atitinkančius tiesioginį surišimą (2a pav., C ir papildomas 6 pav.). Cheminiai poslinkio pokyčiai buvo susieti su apo PHD1 modeliu, kad būtų galima pamatyti išplėstą peptidą surišančią vietą (2d, e pav.). Didžiausias pasipiktinimas pastebėtas dėl liekanų, vedančių į pirmąją β-grandinę (Glu305-Asp306), pačią pirmąją β-sruogą (β1, Leu308-Leu310) ir regioną, kuriame yra antrasis Zn pirštas (Cys311-Asp315; pav. 2c – e). Dideli cheminių poslinkių pasipiktinimai taip pat buvo aptikti arti PHD1 C galo (Val330-Trp335), taip pat likučiuose, esančiuose netoli PHD1 N galo (Tyr294-Val295; 2c – e pav.). Panašūs cheminių poslinkių pasipiktinimai buvo stebimi H3 peptido jungimosi su KDM5B PHD1 kontekste (nuorodos 33, 34).

Image

( a ) KDM5A PHD1 apo ir H3 surištų formų HSQC spektrų stuburo sritys. Apo ir H3 surišti spektrai yra atitinkamai mėlynos ir oranžinės spalvos. Intarpai rodo titravimą pagrindiniuose struktūriniuose regionuose. b ) „apo KDM5A PHD1“ CS-Rosetta modelis, atitinkantis mažiausią energijos ir dvilypį suvaržymą. ( c ) Normalus cheminio poslinkio (Hn, N, Hα, Cα ir Cβ) pokytis, atsižvelgiant į H3 jungties liekanas. Punktyrinės linijos žymi 25-ą, 50-ą ir 75-ą procentilių klasifikaciją, o spalvų gradientas yra toks, kad netrikdomi (75-asis procentilis) yra oranžinės spalvos. d ) KDM5A PHD1 CS-Rosetta modelis su stuburo amidais, nubrėžtais kaip rutuliai, nuspalvintais cheminiu poslinkiu. Nurodomi pasirinkti likučių numeriai. e ) KDM5A PHD1 paviršiaus vaizdas, nudažytas cheminių poslinkių perturpacijomis, atskleidžia H3 rišantį paviršių. f ) KDM5A PHD1 eilės suderinimas, norint uždaryti homologus. Cinko koordinuojančios liekanos yra paryškintos pilka spalva, konservuoti triptofano mėlynai ir aspartato likučiai, siūlomi koordinuoti H3R2, yra paryškinti raudonai. Likučiai, kurie sąveikauja su H3K4, yra paryškinti šviesiai ruda spalva. g ) Mutacijų poveikis nemodifikuoto H3 peptido atpažinimui KDM5A PHD1 (NB = neįsiriša, KD> 100 μM. Klaidos ( n ≥3) reiškia sem).

Visas dydis

Analizuodami PHD1 likučių cheminio poslinkio pertrūkius titruojant H3 uodegos peptidą, mes sugebėjome nustatyti keletą liekanų, kurios padeda atpažinti H3 uodegą. Panašiai kaip ir kiti PHD domenai, atpažįstantys H3, Trp335 (W335), labai konservuota aminorūgštis (aa), atpažįstanti N3 galinį Ala H3, yra būtina rišant peptidus, nes W335A pakeitimas sutrikdo H3 prisijungimą prie PHD1 (3 pav. 2c, f, g) 24, 34, 36, 37 . Toliau prognozuojame, kad Asp312 ir 315 (D312 ir D315), liekanos, atpažįstančios guanidino R2 fragmentą UHRF1, yra svarbūs atpažįstant R2 pagal KDM5A PHD1 domeną (2c pav., F ir papildomas 7 pav.) 38, 39, 40, 41 . Remiantis mūsų spėjimais, KDM5A PHD1 mutacijos D312A ir D315A daro neigiamą poveikį peptidų surišimui (2g pav.). Didelis energetinis R2 indėlis į surišimą dar labiau patvirtinamas mūsų atradimu, kad šios liekanos H3 uodegos peptide mutacija į Ala sumažina surišimo afinitetą daugiau nei 25 kartus (1d pav.).

Panašus į D312 vaidmenį atpažįstant R2, KDM5B PHD1 domeno BMR struktūra rodo kritinį atitinkamo D328 vaidmenį formuojant druskos tiltą su H3 uodegos 34 R2. R2 pakeitimas alaninu šioje sistemoje sumažina prisijungimą prie H3 uodegos ~ 30 kartų (1d pav.).

Nemetilintų H3K4 PHD skaitytuvų struktūrinis palyginimas

Atsižvelgiant į tai, kad KDM5A PHD1 domenas pirmiausia atpažįsta nemetilintą H3K4 uodegos peptidą, mes palyginome šį domeną su kitais PHD domenais, kurie pirmiausia sąveikauja su nemodifikuota H3K4 uodega (pavyzdžiui, KDM5B, BHC80 ir AIRE PHD1; 2 pav. 2f) 24, 34, 37 . Nors nemodifikuotą Lys4 atpažįsta BHC80 ir AIRE PHD domenai, pasiekiami vandenilio ryšiais su dviem poliniais liekanomis ir Lys4 aminorūde (D297 šoninė grandinė ir N295 stuburas AIRE ir D489 šoninėje grandinėje ir E488 stuburas BHC80; 2f pav. Ir papildomi elementai). 7 pav.) 24, 36, 37, 42, Lys4 atpažinimas KDM5B PHD1 domene vyksta vandenilio ryšiu su Asp308 ir dviem hidrofobinėmis sąveikomis su L325 ir Y310 (nuoroda 34). Mūsų BMR tyrimai rodo didelius Y294 cheminius poslinkio sutrikimus KDM5A PHD1 (atitinkančio Y310 KDM5B) ir gretimame V295, atsižvelgiant į jų vaidmenį tiesiogiai jungiantis (2c, d, e pav.). Įdomu tai, kad KDM5A PHD1 domene gali būti alaninas H3 uodegos peptido 4-oje padėtyje ir jis neturi išmatuojamo poveikio afinitetui, palyginti su laukinio tipo (WT) H3 uodegos peptidu (1d pav.). Mes spėjame, kad lizino metilinimo selektyvumas iš esmės pasiekiamas atliekant šitos liekanos H3 uodegos sterilų okliuziją. Kartu mūsų CS-Rosetta modeliavimo ir cheminių poslinkių perturbacijos tyrimai nusako KDM5A PHD1 H3 rišamąją kišenę (2e pav.) Ir atskleidžia struktūrines ypatybes, paaiškinančias didelį energetinį indėlį, atsirandantį dėl R2 surišimo. KDM5A ir KDM5B PHD1 domenų kritinio R2 atpažinimo svarba ir jų teikiama pirmenybė nemodifikuotoms Lys4 (nuorodos 33, 34) pabrėžia galimą PHD1 domenų funkcijos visumoje KDM5 šeimą.

KDM5A aktyvinimui reikalingas funkcinis PHD1 domenas

Mūsų biocheminiai ir struktūriniai duomenys rodo, kad triptofano 335 mutacija su alaninu (W335A) panaikina PHD1 surišimą su H3K4 uodegos peptidais (2g pav.). Todėl mes panaudojome šią mutaciją norėdami paklausti, ar fermentas, turintis atpažinimo sutrikusią PHD1 domeną, prarado stebėtą H3K4me3 uodegos peptidų KDM5A 1-797 sukelto demetilinimo stimuliaciją. Nors W335A mutacija nesutrikdo nei PHD1, nei KDM5A 1–797 bendrosios raukšlės ir stabilumo (papildomas 8 pav.), Remiantis mūsų duomenimis, H3 peptidų surišimas su KDM5A 1–797 mutantu W335A yra panaikintas (2 pav. 3a). Dar svarbiau, kad H3 1–18 peptidas stimuliuoja tik WT KDM5A 1–797, o ne PHD1 surišto W335A mutanto demetilazę (3b pav.). Ištyrę šio KDM5A mutanto, kuriam trūksta PHD1, demetilinimo aktyvumą, mes nustatėme, kad KDM5A 1–797 W335A katalizinis efektyvumas yra stipriai pablogėjęs, palyginti su WT fermentu (3c pav. Ir 1 papildoma lentelė). Šie eksperimentai rodo, kad PHD1 funkcijos sutrikimas demetilazės kontekste neigiamai veikia katalizę ir kad peptido prisijungimas prie funkcinio PHD1 yra susijęs su KDM5A kataliziniu aktyvumu.

Image

( a ) WT KDM5A 1–797 ir W335A KDM5A 1–797 surišimas su H3K4me0 uodegos peptidais. ( b ) H3K4me3 demetilinimo skatinimas WT ir W335A KDM5A 1–797 didinant H3K4me0 efektorinių uodegos peptidų koncentraciją. c ) WT KDM5A 1–797 ir W335A KDM5A 1–797 demetilinimo aktyvumas H3K4me3 histono uodegų atžvilgiu. Klaidos ( n ≥ 3) reiškia sem

Visas dydis

Užimtumas PHD1 skatina nukleozomų demetilinimą

Visi šie eksperimentai rodo, kad peptidų jungimasis su PHD1 domenu stimuliuoja KDM5A demetilinimo aktyvumą. Norėdami įvertinti stimuliacijos mastą, norėjome atlikti demetilinimo reakcijas vienos apyvartos sąlygomis. Palyginus su daugialypėmis apyvartos sąlygomis, naudojamomis peptidų demetilinimui tirti (1e, g pav.), Kai tiek kiekviename demetilinimo etape susidarantis produktas, tiek perteklinis substratas galėtų užimti PHD1 domeną, panaudodami demetilazės ir PHD1 ligando peptido perteklių substrate leidžia tiesiogiai įvertinti PHD1 srities užimtumo įtaką katalizei. Demetilinimo testai buvo atlikti su nukleosomomis kaip demetilinimo substratais, turinčiais sočiųjų vienkartinės apykaitos sąlygų (žr. Metodus ir papildomą 9 pav.). Mes sukūrėme homogenines H3K4 tri-metilines nukleosomas, naudodamiesi natūraliu cheminiu ryšiu tarp H3 (1–14) tioesterio peptido, metilinto K4 ir išreikšto N gale sutrumpintu H3 (A15C 15–135) baltymu (4a pav.). Po desulfurizacijos gautas K4 metiletas H3 buvo įterptas į rekombinantines nukleosomas 43 (4a pav.). Nukleosomų demetilinimas buvo tiriamas kiekybiniu Western blot metodu, kuris stebi H3K4me3 signalo, normalizuoto H4 histonui, išnykimą, analogiškai kaip ir anksčiau atliktame tyrime 44 . Svarbu pažymėti, kad tyrimo sąlygomis antikūnas buvo specifiškas H3K4me3 žymeniui ir kad nebuvo pastebėtas kryžminis reaktyvumas prieš H3K4me2 ir H3K4me1 modifikacijas (papildomas 10 pav.).

Image

a ) Homogeninių H3K4me3 nukleozomų paruošimas natūralia chemine ligacija ir nukleosomų rekonstrukcija. R = benzilas. ( b ) KDM5A 1–797 demetilinimo aktyvumas H3K4me3 nukleozomų atžvilgiu, atliekant kiekybinę „Western blot“ analizę, jei nėra arba nėra skirtingų H3 uodegos peptidų. Nukleosomų demetilinimui naudojamos tokios sąlygos: [X]> [E]> [N], [X]> Kd ir [N] < K m, kur X = H3 uodegos peptidas, E = KDM5A ir N = nukleozoma. ; Kd reiškia disociacijos konstantą tarp PHD1 domeno ir H3 uodegos peptido, o K m - akivaizdžią Michaelis-Menten konstantą tarp KDM5A ir nukleosomų. ( c ) KDM5A aktyvumo H3K4me3 nukleozomoje stimuliavimas pridedant įvairių H3 uodegos peptidų. Raukšlės stimuliacija buvo gauta palyginus greitį, stebimą k obs esant efektoriniam peptidui (H3 1–18 arba H3 5–18 ), palyginti su greičiui, stebėtam nesant efektoriaus peptido. Klaidos ( n ≥3) atspindi sem ( d ) KDM5A teigiamo grįžtamojo ryšio reguliavimo modelį: naujai sugeneruotos H3K4me0 nukleozomos prisijungia prie KDM5A PHD1 srities. Tada PHD1 srities užimtumas stimuliuoja demetilazės aktyvumą alosteriniu mechanizmu.

Visas dydis

Norėdami patikrinti, ar PHD1 užimtumas stimuliuoja KDM5A demetilinimo aktyvumą nukleosomose, mes stebėjome nukleozomų demetilinimą esant H3 1–18 peptidui ar apipjaustytam H3 5–18 peptidui (4b pav., C). Pridėjus H3 1–18, bet nesusijęs su H3 5–18, H3 5–18 stimuliuoja KDM5A demetilinimą nukleozomose ~ 30 kartų (4c pav.).

Šie rezultatai rodo, kad nemodifikuotos H3 uodegos surišimas su PHD1 domenu stimuliuoja KDM5A katalizinį aktyvumą ir papildomai palaiko modelį, pagal kurį PHD1 skaitytuvo domeno ir JmjC katalitinio domeno funkcijos yra energetiškai sujungtos (4d pav.).

Diskusija

Chromatiną modifikuojančių fermentų ir (arba) kompleksų, kuriuose yra šių fermentų, skaitymo ir katalizinių domenų buvimas turi svarbų norminį poveikį chromatino biologijai. Ankstesni rezultatai parodė skaitytojų domenų vaidmenį histonų demetilazių susiejime su chromatinu. Pvz., BHC80, PHD domeno turintis baltymas LSD1 bendro represoriaus komplekse, pirmiausia jungiasi su metilintu K4 ir stabilizuoja LSD1 pritraukimą į chromatiną 24 . Panašiai dvigubas jumonji histono demetilazės KDM4C tudoro domenas perkelia šią demetilazę į regionus, kuriuose yra H3K4me3 žymės 45, 46 . Be to, skaitytojų domenai gali reguliuoti demetilazių substrato specifiškumą, kaip KDM7A ir KDM7B atveju (nuoroda 25).

Čia parodome, kad skaitytojų domenų, esančių demetilazėse, funkcija išplečiama už šių vaidmenų. Naudodami biocheminių ir struktūrinių tyrimų derinį, parodėme, kad PHD1 domenas pirmiausia atpažįsta nemetilintus H3K4 histono uodegas, KDM5A tarpininkaujamo H3K4me3 demetilinimo produktą. Nemetilinto H3K4 peptido surišimas PHD1 stimuliuoja KDM5A katalitinį aktyvumą. Šis poveikis ypač ryškus homogeninėms H3K4me3 nukleozomoms kaip demetilinimo substratams, kur stebime stiprią KDM5A aktyvumo stimuliaciją esant PHD1 ligando peptidui. Mes taip pat parodome, kad KDM5A PHD1 domeno afinitetą H3 histonui moduliuoja ne tik metilinimas K4, bet ir metilinimas R2, ir tai rodo papildomą PHD1 – H3 uodegos komplekso katalizinio aktyvumo reguliavimo sluoksnį.

Mūsų išvados atitinka modelį, kai produkto atpažinimas pagal PHD1 domeną allosteriškai stimuliuoja fermento katalitinį aktyvumą chromatinui (4d pav.). Po pradinių demetilinimo įvykių, kuriuos tikriausiai įgalino bazinio katalitinio domeno aktyvumo ir di- ir tri-metilintų H3K4 nukleozomų sujungimo su PHD1 domenu derinys, prisijungimas prie susidarančių H3K4me1 / me0 nukleozomų padidina KDM5A katalitinį aktyvumą likusios H3K4me3 nukleozomos. Produkto ir substrato suderintas atpažinimas dviem skirtingais to paties fermento domenais rodo modelį, pagal kurį demetilinimas galėtų plisti išilgai nukleosomų, naudojant teigiamo grįžtamojo ryšio reguliavimo mechanizmą. Teigiami grįžtamojo ryšio reguliavimo mechanizmai anksčiau buvo aprašyti keliuose histonų metilinimo kompleksuose ir buvo susiję su metilinimo į chromatiną sklidimu. Pavyzdžiui, funkcinis kryžminis pokalbis tarp EED, produktą jungiančio WD40 skaitytuvo subvienetų, turinčių 2 polikombo represinį kompleksą (PRC2), ir katalizinio komplekso subvieneto, EZH2 metiltransferazės, leidžia skleisti H3K27 metilinimą ant 47 chromatino. Panašūs mechanizmai galioja ir Suv39h klasės histonų metiltransferazėms - fermentams, pridedantiems di- ir tri-metilo žymių H3K9 (nuorodos 48, 49, 50). Mūsų išvados, kad KDM5A katalizę reguliuoja teigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmas, gali būti ypač svarbios atsižvelgiant į HOX genų klasterių, žinomų nuo KDM5A priklausomo nutildymo, turinčių didelius Lys 4 metilinius regionus, transkripcijos reguliavimą, kuriuose yra 13, 51, 52, 53 .

Alternatyva, tačiau nepaneigianti galimybės, yra ta, kad PHD1 domeno užėmimas histono uodegoje gali stabilizuoti kompozicinę aktyvią vietą, kurią sudaro JmjN ir JmjC domenai, ir tokiu būdu prisidėti stiprinant bazinį demetilazės aktyvumą. Nors įvairios modifikuotos H3 uodegos galėtų tarnauti kaip ligadai, optimalų stimuliavimą galima pasiekti tik be metilinto H3K4 uodegos, atsižvelgiant į tai, kad nepakitusios būsenos H3 uodega turi didžiausią afinitetą PHD1 (1 pav., D, f).

Atsižvelgiant į didelę PHD1 skaitytuvo domenų homologiją tarp KDM5 šeimos narių 30, 33, mes hipotezuojame, kad funkcinis PHD1 vaidmuo reguliuojant KDM5A katalizę yra išsaugotas tarp KDM5 fermentų. Jei duomenys bus išsaugoti, tai gali padėti paaiškinti ankstesnius in vivo pastebėjimus, kad PHD1 išbraukimas iš Drosophila KDM5 homologo dangtelio panaikina jo katalizinį aktyvumą ląstelėse 29, 30 . Be to, neseniai buvo parodyta, kad H3 uodegos atpažinimo panaikinimas atliekant taškinę mutaciją KDM5B PHD1 domene sumažina H3K4 demetilinimą ląstelėse, dėl to naviko slopintuvusį geną galima slopinti maždaug dvigubai 34 . Mes tikimės, kad būsimi mechanistiniai ir struktūriniai tyrimai, skirti suprasti funkcinį kryžminį ryšį tarp katalizinių ir ligandą rišančių domenų KDM5 fermentuose, padės geriau išaiškinti šio kryžminio pokalbio vaidmenį reguliuojant H3K4 metilinimą ląstelių kontekste.

Galiausiai, atsižvelgiant į onkogeninę KDM5A funkciją sergant keliais vėžiais ir jos vaidmenį atsparumu vaistams nuo vėžio, alosterinės reguliavimo vietos nustatymas suteikia patrauklią galimybę plėtoti mažų molekulių alosterinius šio fermento aktyvumo moduliatorius.

Metodai

Rekombinantinio H3 C-galo fragmento ekspresija

SMT3 (1–98) ir po jo esantis H3 H3 fragmentas (15–136 A15C) buvo klonuotas į pET28b (NheI-BahmHI) ir transformuotas į Rosetta (DE3) pLysS. Ląstelės buvo auginamos 37 ° C temperatūroje iki OD6o ~ 0, 6 ir 3 valandas indukuojamos galutine 0, 4 mM izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozido koncentracija. Ląstelės buvo surinktos ir lizuotos ultragarsu. Granuliuoti inkliuziniai kūneliai du kartus buvo plaunami plovimo buferiu (50 mM Hepes, pH 7, 5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ir 1 mM benzamidino), turinčio 1% Triton X-100, ir du kartus plaunant buferiu be ploviklio. Inkliuziniai kūneliai buvo ekstrahuojami sulankstomu buferiu (7 M guanidinio HCl, 20 mM Hepes, pH 7, 5 ir 10 mM ditiotreitolio (DTT)) ir inkubuojami su Ni: NTA. Derva plaunama 10 kolonėlių tūrių didelio druskos buferio (2 M karbamido, 20 mM natrio acetato, pH 5, 2, 1 M NaCl, 5 mM β-merkaptoetanolio (βME) ir 25 mM imidazolo) ir 2 kolonų tūriais skilimo / skiedimo buferio. (2 M karbamidas, 2 mM DTT, 150 mM L-Arg, 10 mM L-Cys, 150 mM NaCl ir 50 mM Hepes, pH 6, 8). Baltymai išplaunami skilimo / skiedimo buferiu, kuriame yra 250 mM imidazolo. Išplautas baltymas buvo praskiedžiamas taip, kad galutinė koncentracija buvo ~ 0, 25 mg ml −1, o imidazolo koncentracija buvo <150 mM. Dializuojant vandenyje, kuriame yra 5 mM BME, į baltymus buvo pridėta maždaug 1:10 Senp-SUMO (419–644) proteazės. Išskaidytas C-galo H3 fragmentas buvo liofilizuotas ir toliau išgryninamas pusiau paruošiamuoju C-18 RP-HPLC, naudojant 0–60% acetonitrilo (ACN) su 0, 1% trifluoracto rūgšties gradientu 1 val.

Natūralus H3K4me3 cheminis jungimas ir sieros pašalinimas

Natūralus cheminis jungimas buvo atliktas iš esmės, kaip aprašyta anksčiau 54 . Trumpai tariant, 11, 1 mg (0, 804 μM, 1 ekvivalentas) H3 (aa 15–136 A15C) buvo ištirpinta 518 μl ligavimo / sieros šalinimo buferyje (200 mM natrio fosfato, pH 7, 8, 6 M guanidininio HCl). Ištirpęs histonas buvo redukuotas naudojant 28 μl 1 M Tris (2-karboksietil) fosfino TCEP (~ 50 mM) 1 valandą 37 ° C temperatūroje. Tada buvo pridėta 9, 25 mg (~ 100 mM) 4-merkaptofenileto rūgšties (MPAA) ir (2, 2 μmol, 2, 8 ekvivalento) H3K4me3- (S-benzil) 14-meras (AnaSpec Inc.), praplautas argonu ir paliktas reaguokite energingai maišydami 50 ° C temperatūroje iki reakcijos pabaigos (paprastai per naktį). Produktas buvo išvalytas pusiau paruošiamuoju C-18 RP-HPLC, naudojant 0–60% ACN su 0, 1% TFA gradientu 1 val.

Cisteino 15 nusierinimas į natūralųjį alaniną buvo atliktas remiantis laisvųjų radikalų metodu 54, 55 . Įprastoje reakcijoje 1 mg H3K4me3 A15C buvo ištirpinta 114 μl ligavimo / sieros pašalinimo buferio (200 mM natrio fosfato, pH 7, 8, 6 M guanidininio HCl). Buvo pridėta apie 20 μl 400 mM redukuoto glutationo, 50 μl 1 M TCEP ir 6 μl 0, 2 M VA-061 (Wako Chemicals) radikalų iniciatoriaus metanolyje. Reakcijos mišinys praplaunamas argonu ir paliekamas reaguoti 37 ° C temperatūroje per naktį. Produktas buvo išvalytas pusiau paruošiamuoju C-18 RP-HPLC, naudojant 0–60% ACN su 0, 1% TFA gradientu 1 val.

Nukleosomų surinkimas

Išskyrus H3K4me3, viso ilgio histonai H2A, H2B ir H4 buvo rekombinantiškai ekspresuojami ir gryninami denatūravimo sąlygomis 43 . H3K4me3 nukleozomos buvo surinktos ant 147 bp DNR, naudojant 601 padėties nustatymo seką. DNR buvo amplifikuota PGR ir išgryninta geliu. DNR fragmentas buvo surinktas į mononukleosomas su rekombinantiniais Xenopus laevis histonais druskos dialize 43 .

Expression of recombinant GST–PHD1 (aa 291–347)

GST-tagged PHD1 (aa 291–347) protein was expressed in E. coli BL21-Gold (DE3) in 2 × YT broth (2 × Yeast extract and Tryptone) via isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside induction overnight at 18 °C. Cells were resuspended in 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 5 mM βME, 50 μM ZnCl2, 1 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride PMSF pH 7.3, lysed by sonication and centrifuged. The supernatant was purified using a Glutathione Separose 4B resin, washed with high salt buffer (50 mM Hepes pH 8, 700 mM KCl, 10% glycerol, 5 mM βME, 50 μM ZnCl 2, 1 mM PMSF) and low salt buffer (50 mM Hepes, 150 mM KCl, 10% glycerol, 5 mM βME, 50 μM ZnCl 2, 1 mM PMSF pH 8) and recovered by elution using low salt buffer with 30 mM glutathione. The sample was dialyzed overnight in 40 mM Hepes, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP and 50 μM ZnCl 2 . Protein was further purified by anion exchange on MonoQ 10/100 with a linear gradient of low salt buffer (40 mM Hepes, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP and 50 μM ZnCl 2 ) and high salt buffer (40 mM Hepes, 1 M KCl, 0.5 mM TCEP and 50 μM ZnCl 2 ).

Thermal shift assay

The thermal denaturation of WT and mutant proteins was monitored indirectly by a fluorescence-based thermal shift assay using SYPRO orange dye in a buffer containing 50 μl of 1 μM protein with 1/5, 000 SYPRO orange in 50 mM Hepes, 50 mM KCl pH 7.5. The plate was heated from 25 to 95 °C with a heating rate of 1 °C/min. The fluorescence intensity was measured with exication/emission of 492/590 nm, respectively.

Far-ultraviolet circular dichroism spectrophotometry

Far-ultraviolet circular dichroism measurements were recorded on a Jasco J-715 spectropolarimeter at 11 °C using 1-mm path length from 300 to 200 nm with a scan speed of 50 nm min −1, three scans and 3 ml, 320 nM for GST-PHD1 WT and W335A or 145 nM for KDM5A 1–797 WT, W335A in buffer (20 mM KH 2 PO 4 pH 7.5 10 μM Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2, 100 mM ascorbate). The spectra were corrected for buffer.

FP studies

The association of GST-PHD1 291–347 with H3 1–18 was measured by either direct or competition-based FP. All measurements were obtained in a buffer containing 50 mM Hepes pH 7.5, 50 mM KCl and 0.01% Tween-20 at 25 °C. The binding mixture was incubated for 30 min at room temperature and FP was measured using a Molecular Devices HT Analyst with excitation and emission wavelengths of λ ex 480 nm and λ em 530 nm, respectively. All data were visualized using Graphpad Prism.

For direct FP binding assay, 10 nM of C-terminal fluorescently labelled H3 peptide (GenScript) were incubated with varying concentrations of GST-PHD1 291–347 . Data were analyzed as previously reported in Canzio et al. 56 For competition-based FP assays, 2 μM GST-PHD1 291–347 was incubated with 10 nM of C-terminal fluorescently labelled H3 peptide and different concentrations of unlabelled peptides were used as competitors. All data were visualized using Graphpad Prism and analyzed using the following model adapted from Narlikar et al. 57 :

Image

Baculoviral expression and purification of KDM5A 1–797

KDM5A (aa 1–797) was expressed in sf21 cells following Invitrogen Bac-to-Bac Baculovirus expression system protocol. KDM5A 1–797 was cloned into a pFASTBAC HTA vector following a ligation-independent PCR cloning method 58 . Purified bacmid was transfected in sf21 cells. Approximately 0.8 × 10 −5 cells per well of a six-well dish were allowed to attach in 2 ml of SF-900 II SFM media containing 50 U ml −1 penicillin and 50 μg ml −1 streptomycin. While cells attached, 8 μl of Cellfectin II reagent (Invitrogen) in 100 μl of unsupplemented Grace's Medium was mixed with ~2–5 μg of bacmid in 100 μl of unsupplemented Grace's Medium and incubated for 15–30 min at 25 °C. Once cells were attached, media was removed and cells were washed with 2 ml of Grace's unsupplemented media. The Bacmid DNA:Cellfectin mixture was then diluted to 1 ml with Grace's unsupplemented media and added to the well. Cells with Bacmid:Cellfectin II mixture were incubated for 5 h at 27 °C. After 5 h of incubation, bacmid:Cellfectin mixture was removed and replaced with 2 ml of SF-900 II SFM 50 U ml −1 penicillin and 50 μg ml −1 streptomycin. Transfected cells were incubated 3–5 days or until signs of viral infection were observed. After transfection, the supernatant was spun down to remove the dead cells. The supernatant was then sterile filtered to obtain the P1 viral stock. To make P2, 20 ml of viral stock at ~2 × 10 6 cells per ml of sf21 was infected with 2 ml of P1 virus and incubated for 48–60 h. After 56 h, the cells were spun down and the supernanant was collected and sterile filtered to obtain P2 viral stock. Similarly, P3 viral stock from P2 viral stock was obtained. Generally, 1 l of sf21 at 2 × 10 6 cells per ml was infected with ~40 ml of P3 virus for ~48–56 h. Cells were then collected and resuspended in the lysis buffer (25 mM Hepes pH 7.9, 350 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM imidazole, aprotinin 2 μg ml −1, leupeptin 3 μg ml −1, pepstatin 3 μg ml −1, 1 mM PMSF). Cells were homogenized by emulsiflex. After lysis, the supernatant was recovered by centrifuging at 35k rpm for 45 min, and incubated with cobalt resin equilibrated in lysis buffer for 1 h at 4 °C. After incubation the resin was washed with wash buffer (25 mM Hepes, pH 7.9, 350 mM NaCl, 0.5 mM MgCl 2, 10% glycerol, 10 mM imidazole, aprotinin 2 μg ml −1, leupeptin 3 μg ml −1, pepstatin 3 μg ml −1 and 1 mM PMSF). His-KDM5A was eluted with elution buffer (25 mM Hepes pH 7.9, 100 mM NaCl, 0.5 mM MgCl 2, 10% glycerol, 100 mM imidazole, aprotinin 2 μg ml −1, leupeptin 3 μg ml −1, pepstatin 3 μg ml −1 and 1 mM PMSF). The his-tag was removed by overnight incubation with TEV protease at 4 °C in the dialysis buffer (25 mM Hepes, pH 7.9, 100 mM NaCl and 2 mM DTT). After cleavage, protein was further purified by size-exclusion chromatography using S200 column. Purified KDM5A was eluted, aliquoted and stored at −80 °C in 40 mM Hepes, pH 7.9, 50 mM KCl. The percentage of Cobalt in purified KDM5A was 24.3%, as determined by inductively coupled plasma mass spectrometric analysis (ActLabs, Ancaster, Ontario). Prior to an experiment, KDM5A aliquots were defrosted in ice and immediately used.

Demethylation assay on H3 peptides

Demethylation reactions on H3 peptides were performed in a demethylation buffer containing 50 mM Hepes pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM α-ketoglutarate, 50 μM Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 and 2 mM ascorbic acid. Reactions were performed at room temperature. For the enzyme-coupled assay: 2 mM NAD + and 0.05 FDH (Sigma) were added to the reaction to monitor lysine 4 demethylation of histone H3 by following the production of formaldehyde 35 . Different concentrations of H3K4me3/2/1 peptides (aa 1–18, GenScript) were incubated with 1 μM KDM5A. Reactions were initiated by the addition of substrate and followed in 20-s intervals on a SpectraMax M5e (Molecular Devices) using 350 nm excitation and 460 nm emission wavelengths. An NADH standard curve was used to convert fluorescence to concentration of product formed. The initial 2 min were used to calculate initial velocities, which were plotted against substrate concentration. Michaelis–Menten parameters were determined using Graphpad Prism. For the stimulation assay, the H3K4me3 substrate was kept constant (10 μM) while the concentration of the effector H3 peptides (aa 1–18 or 5–18) was varied.

For the mass-spectrometry demethylation assay, 5 μM KDM5A was incubated with 200 μM H3K4me3/2/1 in demethylation buffer. After incubation at room temperature for 3 h, the reaction was quenched by EDTA (final concentration of 5 mM) and incubation at 100 °C for 3 min. Reactions were desalted through C-18 ZipTips (Millipore). The eluted peptide was further diluted ten times in 0.1% formic acid. The extent of demethylation was analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight mass-spectrometry using 2, 5-dihydroxybenzoic acid as matrix.

Subsaturating single turnover nucleosome demethylation assay

Demethylation reactions on nucleosomes were carried out using 300 nM H3K4me3 nucleosomes and 3 μM KDM5A in the presence or absence of 12.5 μM H3 1–18 or H3 5–18 in the demethylation buffer (50 mM Hepes pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM α-ketoglutarate, 50 μM Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 and 2 mM ascorbic acid). The experiment was performed under subsaturating single turnover conditions where the effector peptide (H3 1–18 ) is above its K d to the PHD1 domain and KDM5A is 10-fold above H3K4me3 nucleosome concentration. Reactions were initiated by the addition of methylated nucleosomes and quenched with 6 × SDS sample loading buffer and 0.5 M EDTA, pH 8.0. The reaction mixture was analyzed by Western blotting using anti-H3K4me3 (1:2, 000, Millipore cat# 05–1339) anti-H4 (1:1, 400, Abcam cat# ab31830), IRDye 680 LT goat polyclonal anti-mouse immunoglobulin-G (1:20, 000, Licor cat# 926–68020). All data were visualized using Graphpad Prism and analyzed as previously reported in Shiau. et al. 44

Nuclear magnetic resonance

A minimal PHD1 construct of KDM5A (D292-E344) was used in the structural studies. This 6 × -His-TEV-PHD1 was expressed in M9 minimal media containing 15 N ammonium chloride and 13 C 6 -D-glucose. The 13 C-/ 15 N-enriched protein was purified as described for the binding studies with the additional steps of TEV protease cleavage and anion exchange chromatography via HiTrap Q (GE Healthcare). 3D triple-resonance experiments for backbone assignment (HNCACB (pulse programme: hncacbgpwg3d, TopSpin1.3p18) and CBCA(CO)NH) (pulse programme: cbcaconhgpwg3d, TopSpin1.3p18) 59 and 3D quantitative-J HNHA (pulse programme: hnhagp3d, TopSpin 1.3p18) 60 experiments were recorded with a 500 MHz Bruker AVANCE DRX500 spectrometer equipped with a Z-gradient QCI cryoprobe ( 15 N/ 13 C/ 31 P, 1 H). The 2D [ 15 N, 1 H]-HSQC (pulse programme: fhsqcf3gpph, TopSpin1.3p18) 61 spectra for the H3K4me0(1–10) titration series were recorded on an 800 MHz Bruker AVANCEI spectrometer equipped with a Z-gradient TXI cryoprobe. The 3D spectra were processed in NMRPipe 62 and proton chemical shifts were referenced to a DSS standard and 13 C and 15 N were referenced indirectly to this value 63 . Resonance assignments and data analysis, including prediction of ψ and ϕ dihedral angles from chemical shifts using DANGLE 64 and extraction of 3 J-HNHA ( ϕ ) coupling constants, were performed with CCPNMR 65 .

The 3D experiments for the assignment of Apo PHD1 used a 180 μM PHD1 sample; 2D 15 N-HSQC titration spectra were collected with a 55 μM PHD1 sample ([H3K4me0] ranged from 11 to 260 μM) and the experiments for the assignment of H3-bound PHD1 were acquired with a 160 μM PHD1 sample containing 2 mM H3K4me0. Assignment of the H3-bound PHD was deemed critical for correct mapping of peaks that broadened (underwent intermediate time scale exchange) during the titration points prior to saturation. See Supplementary Fig. 6 for high resolution HSQC spectra of all titration points.

In calculation of per residue chemical shift perturbation, all recorded chemical shifts were considered and normalized with the following equation:

Image

All experiments were carried out at 298 K (calibrated with 4% v/v MeOH in MeOD) in 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.5 mM TCEP and 0.1 mM ZnCl 2 at pH 7.5 in 5% D 2 O. Chemical shifts for the apo and H3-bound KDM5A PHD1 will be deposited in the Biological Magnetic Resonance Data Bank.

CS-Rosetta model calculations

After assignment in CCPNMR, chemical shifts for 1 H, 15 N, 1 Hα, 13 Cα and 13 Cβ of the apo PHD1 protein were submitted to the BMRB CS-Rosetta web server for generation of fragment libraries. The chemical shift-selected fragments were then used in Rosetta ab initio structure prediction (Rosetta v3.5). Simulations included restraints for the metal coordination of the two Zn-binding sites 66, and stereochemistry of the chiral zinc centres was inferred by comparison with homologous structures.

For the apo structure predictions, 30, 975 starting decoys were generated with the ab initio protocol. These decoys were ranked by energy and the top 5, 000 were further optimized using a fast relax protocol, generating an additional 25, 000 decoys. These models were then filtered by score using the all-atom Rosetta force field, and only the lowest scoring fast relax models from the 5, 000 ab initio models were included with the ab initio set. Rosetta decoys were sorted by score and all residue pairwise Cα RMSDs were calculated for this set of 35, 975 Rosetta decoys using fast_protein_cluster 67 . For a flow chart of CS-Rosetta model generation see Supplementary Fig. 3a. Plotting the Rosetta all-atom energy as a function of RMSD (to the lowest energy model) did not reveal the drop in energy at low RMSD values ('funnel' shape) typically observed for well-converged simulations, when Cα RMSDs were computed over the entire length of the PHD domain (Supplementary Fig. 3b). However, recalculation of Cα RMSD using different regions of the domain produced the characteristic funnel shape that is typical for successful structural prediction 68 . The converged regions are those of well-defined secondary structure (the core beta-sheet and the C-terminal alpha-helix; Supplementary Fig. 4).

The top 50 models by Rosetta all-atom energy were compared with the measured dihedral restraints ( 3 J HN-HA ; Supplementary Table 2), and only those with violations <15° were included in the structural ensemble ( n =8) used in the comparison with other known PHD finger structures.

Comparison to structurally determined homologous PHD fingers

In superposition of the KDM5A ensemble of decoys and all closely related PDB homologues, the structural core of the domain is well-conserved. However, the extended/'open' conformation of the L2 loop appears unique to KDM5A (Supplementary Fig. 5). The L2 loop was defined as spanning residues 322 through 337. The centres of mass for these regions were calculated by taking the mean Cα position of residues within these regions across each individual model. The relative position of the L2 loop was determined by calculating the center of mass of the zinc ligands (Supplementary Fig. 5a-c). This angle ( θ ) then defines the relative position of the L2 loop with respect to the core of the PHD finger, with small theta presenting as a compact/'closed' form and large theta giving a more extended/'open' form. The angle theta was calculated for the CS-Rosetta ensemble and the homologous structures and these distributions are presented in Supplementary Fig. 5d.

Papildoma informacija

How to cite this article: Torres, IO et al. Histone demethylase KDM5A is regulated by its reader domain through a positive-feedback mechanism. Nat. Bendruomenė. 6:6204 doi: 10.1038/ncomms7204 (2015).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-10 and Supplementary Tables 1-2

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.