Žmogaus nervų kamieninės ląstelės nukreipia terapinį geną ir pristato jį į eksperimentinę leptomeningealinę medulloblastomą | genų terapija

Žmogaus nervų kamieninės ląstelės nukreipia terapinį geną ir pristato jį į eksperimentinę leptomeningealinę medulloblastomą | genų terapija

Anonim

Anotacija

Medulloblastomos yra labai piktybiniai neuroektoderminiai vaikų smegenų augliai. Viena iš medulloblastomų gydymo sunkumų priežasčių yra jiems būdingas polinkis metastazuoti per smegenų smegenų skysčio (CSF) kelią, vedantį į leptomeningealinę sklaidą. Neseniai buvo įrodyta, kad genetiškai modifikuotos nervų kamieninės ląstelės (NSC) gali selektyviai migruoti į gliomos masę ir tiekti terapinius agentus, turinčius didelę terapinę naudą. Šiame tyrime mes taikėme NSC strategiją, taikydami medulloblastomas, ypač jų išsidėstymą leptomeningealiniu būdu. Mes panaudojome NSC, kurie buvo retrovirusiškai perduoti su citozino deaminazės genu (CD-NSC). In vitro atlikti tyrimai parodė, kad CD-NSC turi pakankamą migracijos aktyvumą link medulloblastomos ląstelių ir, panaudojus 5-fluorocitoziną (5-FC), šioms ląstelėms padarė nepaprastą pašalinį poveikį. Pažymėtina, kad hepatocitų augimo faktoriaus neutralizavimas blokavo jų migraciją. Tyrimuose su gyvūnais, naudojant mūsų leptomeningealinės sklaidos modelį, nustatyta, kad CD-NSC, implantuoti tiesiai į CSF erdvę, pasiskirsto difuziškai paskleistose naviko ląstelėse ir gali suteikti puikų priešnavikinį poveikį, kai intraperitonealiai įvedama 5-FC. Be to, gydymas CD-NSC ir 5-FC skyrimas pailgino eksperimentinių gyvūnų išgyvenimo laikotarpius. Mūsų duomenys rodo, kad CD-NSC strategija taip pat gali būti taikoma medulloblastomų platinimui leptomeningealiai.

Įvadas

Medulloblastomos yra labai piktybiniai ir invaziniai smegenų augliai, kurie pirmiausia pasireiškia vaikams. Medulloblastomos dažniausiai yra smegenų vermose ir turi įgimtą polinkį metastazuoti kitus smegenų regionus ir leptomeninus per smegenų skystį (CSF). 1 Nors pažanga daugiamodalinėje terapijoje su agresyviomis operacijomis, radiacija ir chemoterapija leido dramatiškai pagerinti prognozę per pastaruosius dešimtmečius, penkerių metų išgyvenamumas vis dar svyruoja nuo 50 iki 70%. 2, 3, 4 Visų pirma manoma, kad leptomeningealinis skleidimasis, atsirandantis dėl metastazių per CSF erdvę, yra vienas slapčiausių medulloblastomų požymių ir apibūdina jų piktybinį elgesį. Trečdaliui pacientų pacientų chirurginės chirurgijos metastazės yra mazginio ar difuzinio kontrasto padidėjimo židiniai leptomeningene ar skilvelio paviršiuje. Platinimo atkrytis dažnai stebimas ankstyvame eigoje ir nustatomas dažniau nei vietinis atkrytis. 5 Suaugusiesiems, nors ir rečiau aptinkami, dažniausiai recidyvai ir pasikartojimai įvyksta tolimose neuroaksijos vietose, nepaisant to, kad pirminis ligos pasireiškimas dažniausiai būna tik užpakalinė fossa. Buvo pranešta, kad kraniospinalinė sklaida yra vienas iš veiksnių, susijusių su prasta prognoze. 7 Nors radioterapija buvo pripažinta veiksmingiausiu pooperaciniu medulloblastomų gydymu, padidinus radiacijos dozę, ypač jauniems suaugusiesiems, gali atsirasti reikšmingų neurokognityvinių pasekmių. 8 Taigi idealus gydymas būtų toks, kuris gali selektyviai nukreipti į medulloblastomos ląsteles nepažeisdamas normalios nervų parenchimos.

Neuroninės kamieninės ląstelės (NSC) pastaruoju metu sukėlė daug dėmesio neuroonkologijos, kaip terapinių genų nešiklių, srityje. Be jų daugialypių galimybių, leidžiančių diferencijuoti į tris pagrindinius centrinės nervų sistemos (CNS) ląstelių tipus, tai yra, neuronus, astrocitus ir oligodendrocitus, NSC taip pat yra būdingos nepaprastomis galimybėmis migruoti per smegenis. 9, 10, 11 Ši NSC migracija yra nukreipta į patologiškai pakitusį audinį, ir ši savybė gali būti panaudota gydant įvairius pažeidimus, tokius kaip išeminiai pažeidimai, traumuotas audinys, uždegimo vietos ir metastazavę ar pirminiai smegenų navikai. . 12 Naujausi tyrimai parodė, kad NŠK ekspansinis eksperimentinės gliomos tropizmas, pasiskirsto po visą pirminį naviko sluoksnį ir migruoja kartu su gausiai augančiais naviko mikrosatellitais. 13, 14 Be to, eksperimentiniuose gliomos modeliuose šie gliomą stebintys NŠK gali pristatyti agentus, turinčius didelę terapinę naudą, išreikšdami jų nešamus genus. 13, 14, 15, 16, 17, 18 Remiantis šiais duomenimis, NSC pagrįsta terapija gali būti perspektyvus naujas terapinis metodas nepagydomoms piktybinėms gliomoms gydyti. Tačiau, kiek mums žinoma, skleidžiamąjį elgesį demonstruojančios medulloblastomos dar nebuvo taikinių navikai tyrimuose, kuriuose buvo naudojama NSC strategija.

Šio tyrimo tikslas buvo ištirti galimybę išplėsti genų modifikuotą NSC strategiją medulloblastomų gydymui, tikintis, kad ŠNS migracijos gebėjimai gali būti naudingi, ypač leptomeningealinių sklaidų atvejais, kurie atspindi progresuojančią ir atspariomis ligomis problemą. valstybės. Šiame tyrime mes panaudojome NSC, kurie buvo perduoti su citozino deaminazės (CD) genu, kuris yra terapinis savižudybės genas. CD yra fermentas, paverčiantis inertinį provaistinį 5-fluorocitoziną (5-FC) į toksišką produktą 5-fluorouracilą (5-FU). 19 Ši fermentų ir (arba) vaistinių preparatų sistema daro „pašalinį poveikį“, dėl kurio nemodifikuotos auglio ląstelės, esančios greta genetiškai modifikuotų ląstelių, žūva. Pirmiausia mes įvertinome, ar CD-NSC rodo medulloblastomos ląstelių tropizmą ir ar jas paveikia pašaliniai žmonės, kai in vitro veikia 5-FC. Antra, mes sukūrėme eksperimentinį pelių sklaidos modelį leptomeningeal ir stebėjome, kaip elgiasi intratekaliai implantuoti CD-NSC. Trečia, mes įvertinome, ar CD-NSC vaidina svarbų vaidmenį slopinant naviko augimą ir pailginant gydytų pelių išgyvenimą.

Rezultatai

NSC selektyviai migruoja į smegenų naviko ląsteles in vitro

Siekiant ištirti, ar NKS gali migruoti į medulloblastomos ląsteles, jų migracijos aktyvumas buvo įvertintas naudojant dvigubos kameros indus. Apatinėje kameroje kaip tikslines ląsteles įdėjome dviejų tipų medulloblastomos ląstelių linijas - „Daoy“ ir „ONS76“ ir dvi gliomos ląstelių linijas - U87MG ir U251MG. DiI-NSC migracinis aktyvumas buvo lyginamas su DiI-293 žmogaus embrioninių inkstų ląstelių, kurios naudotos kaip kontrolė, aktyvumu. Remiantis ankstesnės ataskaitos 21 rezultatais, 22 gliomos ląstelės, palyginti su kontrole, žymiai paskatino NSC migraciją. Dar svarbiau, kad dviejų tipų medulloblastomos ląstelės taip pat žymiai padidino migracijos aktyvumą (1a pav.).

Image

a ) NSC migracija į smegenų naviko ląsteles. Migracijos aktyvumas buvo įvertintas naudojant dviejų kamerų indus. Medulloblastomos ląstelių linijos (Daoy ir ONS76) ir gliomos ląstelių linijos (U87MG ir U251MG) buvo dedamos į apatines kameras kaip tikslinės ląstelės. Su DiI pažymėtų F3 NSC migracinis aktyvumas buvo lyginamas su DiI pažymėtomis 293 žmogaus embriono inkstų ląstelėmis, kurios naudotos kaip kontrolė. Plokštelės buvo inkubuojamos 24 valandas su terpe, kurioje nėra serumo. Tada visos apatinėje kameroje esančios ląstelės buvo surinktos tripsinu ir atlikta srauto citometrija. NSC migracija į smegenų naviko ląsteles buvo apskaičiuota pagal šią formulę: migracijos% = = (DiI pažymėtų ląstelių skaičius / nepaženklintų ląstelių skaičius) × 100. NSC patraukė visos eksperimente naudojamos smegenų naviko ląstelės ir buvo palygintos su 293 ląstelėmis. ( b ) HGF neveikimas blokuoja NSC migracijos aktyvumą. Į terpę buvo įpilta neutralizuojančio monokloninio antikūno prieš SF / HGF, kurio apatinė kamera buvo 20 μg / ml. Dėl SF / HGF inaktyvavimo sumažėjo visų keturių ląstelių linijų migracijos aktyvumas. Visų pirma, po SF / HGF blokavimo reikšmingai slopino NSC migraciją į Daoy, U87MG ir U251MG ląsteles.

Visas dydis

HGF inaktyvacija blokuoja NSC migracijos aktyvumą

Kadangi buvo pranešta, kad sklaidos faktorius / hepatocitų augimo faktorius (SF / HGF) yra svarbus NSCs 21 chemoatraktantas, o Daoy ir ONS76 ląstelės išreiškia didesnį SF / HGF lygį, 23 atlikome blokavimo testą, kurio metu neutralizuojantis monokloninis antikūnas buvo pridėtas prie terpės, esančios apatinėje kameroje. Rezultatai parodė, kad dėl SF / HGF inaktyvavimo sumažėjo migracijos aktyvumas visose keturiose ląstelių linijose. Visų pirma, NSC migracija į Daoy, U87MG ir U251MG ląsteles buvo smarkiai slopinama po to, kai buvo užblokuotas SF / HGF per neutralizuojantį antikūną (1b pav.).

NSC, nešiojantys CD savižudybės geną, po apvaisinimo 5FC sukelia kaimyninių medulloblastomos ląstelių apoptozę

Mes patvirtinome, ar išnyko DiI pažymėtos F3.CD ląstelės ir ar jie sukėlė apoptozinius pokyčius Daoy ląstelėse po to, kai DiI-F3.CD ląstelės ir Daoy ląstelės buvo paveiktos 5-FC. Trūkstant 5FC, DiI-F3 ląstelės gerai augo ir susilygino su DiI-F3.CD ląstelių grupėmis tarp Daoy ląstelių. Kita vertus, esant 5-FC 2 dienoms, dauguma DiI pažymėtų ląstelių išnyko, o nedaugelis Daoy ląstelių liko su teigiamo galinio transferazės dUTP slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) reakcija. Šie rezultatai parodė, kad CD genas buvo funkcionuojantis F3.CD ląstelėse, o vėlesnė apoptozinė ląstelių mirtis buvo sukelta kaimyninėje Daoy ląstelėje dėl pašalinio poveikio (2a pav.).

Image

a ) NSC, turinčių CD geną, savižudybė sukelia apoptozę kaimyninėse medulloblastomos ląstelėse po 5-FC gydymo. DiI pažymėtos F3.CD ląstelės ir Daoy ląstelės (po 5 x 104 ląstelių kiekviena) buvo kultivuojamos ir apdorotos 5-FC. Išplauta kultūra vėliau buvo dažoma TUNEL. Neapdorotoje kultūroje ląstelės gerai augo su DiI-F3 ląstelių grupėmis tarp Daoy ląstelių (apatinės plokštės). Kita vertus, atliekant 2 dienų 5-FC apdorojimą, kultūroje dauguma DiI pažymėtų ląstelių išnyko, o nedaugelis Daoy ląstelių liko TUNEL dažymo teigiamos (viršutinės plokštės). ( b ) F3.CD ląstelės turi pašalinį žudymo poveikį Daoy ląstelėms. F3.CD ląstelės buvo auginamos kartu su Daoy ląstelėmis (2x104 ląstelių / duobučio) įvairiais santykiais, o gyvybingų ląstelių skaičius buvo įvertintas praėjus 3 dienoms po 5-FC apdorojimo, palyginti su kultūra, kurioje buvo tik Daoy ląstelės. Gyvybingų ląstelių skaičius žymiai sumažėjo, kai F3.CD/Daoy santykis padidėjo. Mažiausias santykis, lygus 1:40 (2, 5%), taip pat galėtų sukelti pastebimą ląstelių proliferacijos slopinimą.

Visas dydis

F3.CD ląstelės rodo pašalinį žudymo poveikį Daoy ląstelėms

Norint kiekybiškai įvertinti pašalinių žmonių žudantį CD-NSC poveikį Daoy ląstelėms, F3.CD ir Daoy ląstelės buvo kultivuojamos įvairiais santykiais, o gyvybingų ląstelių skaičius buvo įvertintas praėjus 3 dienoms po gydymo 5-FC; tada šis skaičius buvo palygintas su kultūros, kurioje yra vien Daoy ląstelės, skaičiumi. Kaip parodyta 2a paveiksle, nė viena F3.CD ląstelė neišgyveno, kai 5-FC koncentracija buvo 500 μg / ml. Gyvybingų ląstelių skaičius žymiai sumažėjo, kai F3.CD/Daoy santykis padidėjo. Mažas 1:40 santykis taip pat galėtų paskatinti pastebimą ląstelių skaičiaus sumažėjimą (2b paveikslas).

Implantuotos F3.CD ląstelės difuziškai susimaišo su Daoy ląstelių sklaida leptomeningealiai

F3.CD ląstelių implantacijai buvo naudojamas tiesioginis CSF kelias. Norint patvirtinti CD-NSC migracijos galimybes, patologiškai buvo ištirtas visas nugaros smegenys, įskaitant juosmens dalį. Kaip parodyta 3 paveiksle, DiI-F3.CD ląstelės, implantuotos į cisternos magnos subarachnoidinę erdvę, pasklinda po visą stuburą ir pasiskirsto Daoy ląstelių sluoksniuose. Pažymėtina, kad DiI-F3.CD ląstelės pasiekė juosmens sritį, esančią toliau nuo injekcijos vietos. Be to, DiI-F3.CD ląstelės įsiskverbė į naviko ląstelių sluoksnį ir egzistavo ne tik sluoksnio paviršiuje, bet ir gilesniuose lygiuose šalia virvelės (3 pav.). Taigi padarėme išvadą, kad į subarachnoidinę erdvę įšvirkšti NŠS sugebėjo pakankamai migruoti ir maišyti su Leptomeningeally paskleistomis Daoy ląstelėmis.

Image

Implantuotos F3.CD ląstelės difuziškai pasiskirsto Daoy ląstelių leptomeningealinėje sklaidoje. DII žymėtos F3 ląstelės buvo sušvirkštos į cisternos magnos subarachnoidinę erdvę 15 dienų po sklaidos modelių sukūrimo. Po 2 dienų pelė buvo perfuzuota fiziologiniu tirpalu, po to 4% paraformaldehido. Audiniai buvo padalyti į dalis ir nudažyti hematoksilinu / eozinu. DiI-F3 ląstelės buvo identifikuotos nenudažytose atkarpose, naudojant fluorescencinę mikroskopiją. Pažymėtina, kad DiI-F3 ląstelės pasiekė ne tik gimdos kaklelio dalį ( a - f ), bet ir juosmens sritį, esančią nuo injekcijos vietos ( g ) ir ( h ). Be to, DiI-F3 ląstelės įsiskverbė į naviko ląstelių sluoksnį ir egzistavo ne tik sluoksnio paviršiuje, bet ir gilesniuose lygiuose šalia virvelės. Didinimas: × 100, išskyrus e ir f punktus (× 200).

Visas dydis

F3.CD ląstelės sumažina naviko augimą, sukeldamos apoptozę

Norėdami išsiaiškinti galimą savižudybės indukciją in vivo ir pašalinio poveikio, susijusio su CD genu, suleidus 5-FC, atlikome viso stuburo dalies patologinius tyrimus. Daoy ląstelių implantuotose pelėse, kurios gavo F3.CD ląsteles, bet nebuvo atliekamas 5-FC gydymas, visame stuburo smegenų paviršiuje buvo stori naviko ląstelių sluoksniai (4a – c pav.). DiI žymėtos ląstelės vis dar išliko difuzinės naviko sluoksnyje (4d ir e paveikslai), o ląstelių sluoksniuose buvo aptikta nedaug TUNEL teigiamų ląstelių (4f paveikslas). Kita vertus, gyvūnams, kurie buvo gydomi 5-FC injekcijomis į pilvaplėvės ertmę (ip) 10 dienų iš eilės po DiI-F3.CD ląstelių implantavimo, nebuvo storo Daoy ląstelių sluoksnio išilgai stuburo smegenų, bet gana mažos liekanų grupės Daoy ląstelių (4g – i, k ir m paveikslai). TUNEL teigiamos ląstelės buvo iš dalies stebimos likusiose naviko masėse (4l ir n paveikslai). Remdamiesi šiais radiniais, mes sugebėjome patvirtinti, kad subachnoidinėje erdvėje esančios F3.CD ląstelės mirė po 5-FC ip injekcijos; vėliau jie slopino naviko augimą sukeldami apoptozinę ląstelių mirtį kaimyninėse Daoy ląstelėse.

Image

Leptomeningealinės sklaidos histopatologiniai požymiai implantuojant CD-NSC su 5-FC ip injekcijomis ar be jų 10 dienų iš eilės. DiI pažymėtos F3.CD ląstelės buvo suleistos į cisternos magna subarachnoidinę erdvę praėjus 10 dienų po Daoy ląstelių inokuliacijos, o po 2 dienų 5-FC buvo skiriamos kasdien ip injekcijomis 10 dienų iš eilės. Kitą dieną po paskutinės 5-FC dozės pelės buvo nužudytos ir visas nugaros smegenys buvo išpjaustytos histologiniam stebėjimui. Pelėms, kurioms nebuvo sušvirkšta 5-FC ( a - f ), virvelės paviršiuje buvo pastebėtas Daoy ląstelių sluoksnis ( a - c ). DI žymėtos F3.CD ląstelės vis dar egzistavo sluoksnyje ( d ir e ), o Daunoy ląstelėse nepastebėta jokių apoptozinių pokyčių dažant TUNEL ( f ). Pelėms, įpurškiamoms 5-FC ( g - n ), priešingai, paviršiuje ( g ir h ) buvo tik keletas mažų Daoy ląstelių likučių (strėlių). Labai nedaug DiI pažymėtų ląstelių egzistavo sluoksnyje ( j ), o TUNEL dažymas iš dalies atskleidė apoptozinius Daoy ląstelių ( l ir n ) pokyčius. ( I - n ) sekcijos buvo greta viena kitos. Didinimas: × 200, išskyrus a, g ir h punktus (× 100).

Visas dydis

CD-NSC, veikiami 5-FC, prailgina Daoy platinamų pelių išgyvenimą

Norint nustatyti, ar CD-NSC implantacija ir sekančios 5-FC ip injekcijos gali suteikti terapinės naudos in vivo , gydymas buvo pradėtas praėjus 7 dienoms po Daoy ląstelių inokuliacijos į subarachnoidinę erdvę. Išmatuojome Daoy paskleistų pelių, gavusių F3.CD ląsteles ir 5-FC ip (A grupė), F3.CD ląsteles ir fiziologinio tirpalo ip (B grupė), tik 5-FC ip (C grupė) ar tik fiziologinio tirpalo ip, išgyvenamumą. (D grupė). Pelių, gydomų F3.CD ląstelėmis ir 5-FC ip injekcijomis, išgyvenimas buvo žymiai ilgesnis nei pelių B, C ir D grupėse (atitinkamai P = 0, 0476, 0, 0305 ir 0, 0060). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp B, C ir D grupių išgyvenamumo laikotarpiu nebuvo (5 pav.). Šie rezultatai rodo, kad CD-NSC strategija gali turėti teigiamą priešnavikinį poveikį medulloblastomų platinimui leptomeningealiai.

Image

CD-NSC, veikiami 5-FC, pratęsė Daoy platinamų pelių išgyvenimą. Gyvūnai buvo atsitiktinai suskirstyti į šias keturias grupes praėjus 7 dienoms po Daoy ląstelių implantavimo: (A) F3.CD/5-FC grupė, kuriai pelėms buvo injekuota ip 5-FC po 2 dienų po F3.CD inokuliacijos; (B) F3.CD/saline grupė, kurioje pelėms buvo injekuotos ip druskos tirpalo praėjus 2 dienoms po F3.CD inokuliacijos; (C) tik 5-FC grupė, kurioje pelėms buvo sušvirkšta tik 5-FC, ir (D) tik fiziologinio tirpalo grupė, kurioje pelėms buvo įšvirkšta tik fiziologinis tirpalas. Išgyvenimo kreivės buvo sudarytos Kaplan – Meier metodu. Pelių, gydytų F3.CD ląstelėmis, į kurias buvo įšvirkšta i-5-FC, išgyvenimas buvo žymiai ilgesnis nei B, C ir D grupių pelių (atitinkamai P = 0, 0476, 0, 0305 ir 0, 0060). Statistiškai reikšmingo skirtumo B, C ir D grupių išgyvenamumo laikotarpiuose nebuvo.

Visas dydis

Diskusija

Mūsų atliktas migracijos in vitro tyrimas parodė, kad medulloblastomos ląstelės sukelia tropizmo NSC indukciją, atitinkančią žmogaus gliomos ląstelių linijas, U87MG ir U251MG; anksčiau buvo pranešta, kad šios ląstelės padidina NSC migraciją. 21, 22 Šios išvados pagrindė NSC strategijos galimybes gydyti medulloblastomas.

Tarp gliomų ir medulloblastomų yra keletas skirtumų, atsižvelgiant į jų biologinius ypatumus ir klinikines apraiškas. Gliomos pirmiausia pasireiškia smegenų pusrutuliuose, o gliomų kilmė ilgą laiką buvo manoma, kad jos yra visiškai diferencijuotos glijos ląstelės. Naujausi kamieninių ląstelių biologijos pasiekimai rodo, kad vėžinės kamieninės ląstelės arba progenitorinės ląstelės gali būti neoplastinio formavimosi priežastis, o kai kurie genetiniai pokyčiai, tokie kaip p53, RB, PTEN, MDM2 ar epidermio augimo faktoriaus receptoriai, yra susiję su piktybine glioma. . 24 Kita vertus, medulloblastomos yra embriono CNS naviko rūšis ir taip pat priskiriamos neuroektoderminiams navikams. Manoma, kad šis piktybinis invazinis navikas atsirado iš išorinio smegenėlių granulinių ląstelių sluoksnio, ir tai yra susiję su vyraujančiu smegenų dangalu. Naujausi tyrimai parodė, kad medulloblastomos atsiranda dėl anatominių ežių raidos signalizacijos kelių anomalijų progenitorinių ląstelių populiacijoje. 25, 26, 27 Kiti molekuliniai genetiniai įvykiai, tokie kaip retinoblastomos naviko slopintuvo geno (Rb) 27 inaktyvacija arba c-myc 28 ir n-myc 29 amplifikacija, taip pat buvo susiję su medulloblastomos patogeneze. Medulloblastomos išreiškia aukštą neuronų žymenų, tokių kaip neurofilamentinis baltymas, lygį ir, manoma, kad jie turi kryptį / polinkį link nervų, o ne iš gliaudinės linijos. 30

Mūsų in vitro migracijos tyrimo rezultatai rodo, kad šie du skirtingi smegenų navikų tipai gali išskirti kai kuriuos tirpius veiksnius, kurie gali skatinti NSC tropizmą. Kalbant apie gliomos ląsteles, keletas gliomos ląstelių gaminamų veiksnių, tokių kaip kraujagyslių endotelio faktorius 31 ir CXCR4, 32, buvo pasiūlyti skatinti NSC tropizmą. Ankstesnis tyrimas parodė, kad SF / HGF yra galingiausias chemoattraktantas, išsiskiriantis iš gliomos. Medulloblastomų atveju, nors dar nenustatyti veiksniai, skatinantys NSC tropizmą, yra įdomi ataskaita, kad SF / HGF vaidina svarbų vaidmenį piktybiniuose medulloblastomų susirgimuose. 23 Jau seniai žinoma, kad SF / HGF yra daugiausia epitelio, o ne mezenchiminis stimuliatorius 33, o šiame tyrime naudojamos medulloblastomos ląstelių linijos Daoy ir ONS-76 išreiškė vidutinį ar aukštą c-Met ir SF / HGF kiekį, palyginti su lygis, stebimas gliomos ląstelėse. 23 Mes hipoteze, kad SF / HGF yra viena iš tirpių chemoattractant, kuri skatina NSC tropizmą. Šiame tyrime mes parodėme, kad SF / HGF pašalinimas naudojant neutralizuojančius antikūnus kultūroje reikšmingai slopino NSC migraciją link medulloblastomos ląstelių. Šie rezultatai rodo, kad SF / HGF, išsiskiriantis iš medulloblastomos, gali atlikti chemoatraktanto vaidmenį tropizme, kurį rodo medulloblastoma. Remdamasi šiais pastebėjimais, ankstesnė ataskaita parodė, kad NŠK gali nukreipti neneralinius navikus, tokius kaip prostatos vėžys ir piktybinė melanoma. Remiantis šiais duomenimis, NŠK turi didžiulį migracijos pajėgumą ieškoti neoplastinių pažeidimų.

Atlikdami eksperimentus su gyvūnais, daugiausiai dėmesio skyrėme leptomeningealiniam sklaidos modeliui, nes viena pagrindinių kliūčių įprastiniam medulloblastomų gydymui yra jų gebėjimas metastazuoti visoje smegenų ašyje. Mūsų atlikta meduloblastomų leptomeningealinės sklaidos eksperimentinių modelių sudarymo procedūra buvo atkuriama ir pateikė norimus gyvūnų modelius, kuriuose naviko ląstelės plačiai ir difuziškai pasiskirstė nugaros smegenimis, sudarydamos sluoksnius; šie modeliai atrodo idealūs norint efektyviai įvertinti implantuotų NSC elgesį. Mūsų metodas, kurio metu NSC implantuojamos tiesiogiai injekuojant į cisternos magnos subarachnoidinę erdvę, sąlygojo pakankamą NSC pasiskirstymą nustatytuose naviko ląstelių sluoksniuose. Kiek mums yra žinoma, toks NSG, esančių CSF, elgesys su navikinėmis ląstelėmis buvo parodytas pirmą kartą literatūroje. Pastebėtina, kad NKS pasiekė juosmens sritį, nutolusią nuo implantacijos vietos, taip pat pasirodė, kad infiltruoja naviko ląstelių sluoksnius. Šie atradimai verčia spėlioti, kad NŠS pirmiausia pasklinda CSF erdvėje plūduriuojančioje būsenoje, prisitvirtina prie naviko sluoksnio paviršiaus ir tada įsiskverbia į naviko masę.

Ankstesnis tyrimas parodė jų intrakranijinės gliomos modelį, kad NSC eksplotavo didelį gliomų tropizmą įvairiais būdais, tokiais kaip tiesioginė implantacija naviko lovoje, tolimoje intrakranijinėje vietoje, priešingoje pusrutulyje, skilveliuose ir periferinėje intravaskulinėje vietoje. Tikėtasi tam tikro NKS tropizmo link periferinėje venoje esančių išsiskyrusių ląstelių. Mes atlikome eksperimentą, kurio metu NKS buvo implantuojami per uodegos veną. Tačiau NSC migracija į paskleistą ląstelių sluoksnį nebuvo pakankamai didelė ir negalėjo sukelti terapinio poveikio (duomenys nepateikti). Taip pat ištirtas kamieninių ląstelių implantavimo į CSF metodas, skirtas gydyti sužeistus nugaros smegenis ar uždegimines ligas. 34, 35, 36, 37 Yra įdomus pranešimas, kad kaulų čiulpų stromos ląstelės veiksmingiau migruoja link pažeisto nugaros smegenų audinio CSF ​​būdu nei į veną. 34 Siūloma viena iš priežasčių, kodėl sudėtinga NSC patekti į CNS parenchimą į veną, yra poreikis atidaryti kraujo ir smegenų barjerą (BBB). Mūsų sklaidos modelyje naviko ląstelės egzistavo visiškai už centrinės nervo ašies ir buvo mažiau linkusios į parenchiminės invazijos progresą. Ši situacija galėjo sukelti nedidelį BBB sunaikinimą ir paskatinti auglio ląstelių neprieinamumą intraveniniu būdu. Priešingai, implantacija CSF būdu suteikė galimybę laisvai NSC patekti į medulloblastomos ląsteles, ir tai tikriausiai prisidėjo prie nepaprasto jų pasiskirstymo pasklidusiose ląstelėse. Klinikinėms reikmėms atrodo, kad NSC injekcija juosmenine punkcija yra tinkamesnė dėl jos įgyvendinamumo ir saugumo. Toks mūsų metodo pakeitimas yra pateisinamas pranešimais, kad NKS, implantuotų į CSF, pasiskirstymas stuburo smegenų modeliuose buvo pastebėtas vienodas, neatsižvelgiant į injekcijos vietą, tai yra, skilvelius, cisternos magną ar juosmens dalį. 36

Buvo ištirti įvairių rūšių genetiškai modifikuoti NŠK, tokie kaip koduojantys citotoksinius junginius, imunitetą stiprinančius ar apoptozę skatinančius agentus, ir jie turi stiprų priešnavikinį poveikį. 13, 14, 15, 16, 17, 18 Šiame tyrime naudotas CD genas koduoja grybelinį ir bakterinį fermentą, kuris katalizuoja netoksiško 5-FC deaminavimą į labai toksišką 5-FU. Be to, ląstelės, ekspresuojančios CD, sunaikinamos po vaisto skyrimo. Ši vadinamoji „savižudybės geno“ strategija piktybiniams navikams gydyti priklauso nuo pašalinių žmonių įtakos aplinkinėms ląstelėms. Vienas iš 5-FC naudojimo mūsų sklaidos modelyje pranašumų yra tai, kad ji yra maža ir gerai vandenyje tirpi molekulė ir gali gerai įsiskverbti į daugumą kūno vietų, įskaitant CSF. Kitas pranašumas yra tas, kad ši CD – 5-FC strategija nereikalauja kontakto tarp ląstelių ir jungčių ekspresijos. 38, 39 Mūsų tyrimas parodė, kad medulloblastomos ląstelių dauginimasis buvo smarkiai slopinamas, kai šių ląstelių mišinys su F3.CD ląstelėmis buvo veikiamas 5-FC, o tai, savo ruožtu, paskatino apoptozę. Šie rezultatai atitinka anksčiau paskelbtus duomenis, kuriuose buvo įrodyta, kad tik 2% naviko masės, turinčios CD ekspresuojančių ląstelių, gali sukelti reikšmingą naviko onkolizę. 40 Mūsų eksperimentuose su gyvūnais CD genas, perduotas NSC, veikė efektyviai ir, sukeldamas apoptozę, užmušė aplinkines Daoy žmogaus medulloblastomos ląsteles. Tai taip pat demonstravo puikų naviko slopinimą. Be to, CD-NSC implantacija ir 5-FC skyrimas sąlygojo reikšmingą gyvūnų išgyvenimo pailgėjimą, palyginti su kitomis gydymo grupėmis. Nors šie duomenys labai patvirtino priešnavikinį CD-NSC terapijos poveikį, mūsų eksperimentai galėjo būti užkrėsti tik septynių gyvūnų. Turėtų būti būdų, kaip gauti maksimalią naudą. Pirma, medulloblastomos ląstelių proliferacija galėjo būti daug didesnė už pašalinių žmonių žudymo efektą, kurį sukelia CD-NSCs / 5-FC. Gali būti naudingiau pradėti gydymą ankstesnėje sklaidos būsenoje, implantuoti didesnius CD-NSC kiekius arba pakartoti gydymą. Antra, buvo tikimybė, kad 5-FU toksiškumas sušvirkštus 5-FC turėjo sisteminį poveikį. Buvo nustatyta, kad eksperimentinis žiurkių prostatos naviko modelių CD-genų terapija sukelia reikšmingą svorio kritimą skiriant 5-FC. 41 Mūsų išgyvenimo tyrime pelės, implantuotos su CD-NSC ir paveiktos 5-FC, parodė tendenciją numesti kūno svorį anksčiau nei kitos gydymo grupės (duomenys nepateikti). Todėl reikia apsvarstyti tinkamas 5-FU toksiškumo sumažinimo priemones. Be to, šis išgyvenimo tyrimas parodė, kad vien tik NŠK negalėjo suteikti naudos išgyvenimui mūsų leptomeningealinės sklaidos modeliuose. Buvo pranešta, kad NSC arba nervų progenitorinės ląstelės, kurios nebuvo modifikuotos, turėjo įgimtą gebėjimą slopinti naviko augimą, 17, 42, 43, o kai kurie faktoriai, išskiriami iš pačių NSC, buvo siūlomi norint kontroliuoti naviko ląstelių dauginimąsi. Atrodė, kad pačių neuronų progenitorinių ląstelių auglio slopinimo poveikis priklauso nuo naviko ląstelių profilio, pavyzdžiui, nestino ekspresijos lygio. Tai gali būti priežastis, kodėl „Daoy“ ląstelės, kurios ekspresuoja nestiną, taip pat yra atsparios NSC.

F3.CD ląstelių taikymas klinikinėje praktikoje kelia tam tikrų problemų. Pirma, įamžinta žmogaus NSC ląstelių linija HB1.F3, kurią mes panaudojome šiuo atveju, turi tam tikrų trūkumų, nes ji turi potencialiai pavojingą v-myc onkogeną, kuris gali sukelti neoplazmos susidarymą in vivo, kai jis implantuojamas gyvūno smegenyse. Tačiau ankstesni tyrimai neparodė jokių transformacijos / neoplazmų formavimosi požymių in vitro ar in vivo 44, ir mes patvirtinome, kad pelės, kurioms buvo transplantuotos tik F3 ląstelės į subarachnoidinę erdvę, išgyveno daugiau nei 120 dienų, neparodė kūno svorio sumažėjimo. Antra, yra keletas techninių ir etinių problemų, susijusių su NSC klinikiniu naudojimu, ir šias problemas reikia išspręsti. Nors autologiniai NŠK yra idealūs klinikiniam pritaikymui, šiuo metu neįmanoma įsigyti pakankamo kiekio tokių NŠK. Neseniai buvo pranešta, kad mezenchiminės kamieninės ląstelės turi tokį patį migracijos aktyvumą kaip gliomos ląstelės, o adenovivalinių genų modifikuotos MSC buvo naudingos gliomą turintiems gyvūnams. Mesenchiminės kamieninės ląstelės galėtų būti labiau prieinamos klinikiniam naudojimui ir galėtų tapti alternatyvios NSC.

In vitro tyrimais mes įrodėme, kad žmogaus NŠK ekspansijos metu buvo didelis medulloblastomos ląstelių tropizmas ir kad NŠK perduotas CD-genas veikė efektyviai ir turėjo nepaprastą pašalinių žmonių žudymo poveikį medulloblastomos ląstelėms po gydymo 5-FC. Naudodami leptomeningealinės sklaidos pelių modelius, mes patvirtinome, kad NSC sugebėjo difuziškai pasiskirstyti medulloblastomos ląstelėms, kurios po implantacijos cisternos magnoje pasklido po visą stuburo smegenis, ir kad NSC perduotas CD genas veikė efektyviai ir pašaliniai žmonės užmušė medulloblastomos ląsteles. poveikis sušvirkštus provaisto 5-FC. Be to, gydymas CD-NSC buvo naudingas auglių turinčių gyvūnų išgyvenamumui pailginti. Šie rezultatai suteikia naują perspektyvų terapinį būdą, kai žmogaus NŠK yra naudojami medulloblastomų platinimui leptomeningealiai.

medžiagos ir metodai

Ląstelių linijos

„Eagle“ minimalioje būtinoje terpėje (Nissui, Tokijas, Japonija) buvo auginamos Daoy ir ONS76 ląstelės (žmogaus medulloblastomos ląstelės), U87MG ir U251MG ląstelės (žmogaus gliomos ląstelės) ir 293 ląstelės (žmogaus embriono inksto ląstelės). (FBS), 5 ml ML-gliutamino, 2 mM nebūtinų aminorūgščių ir antibiotikų (100 V / ml penicilino ir 100 μg / ml streptomicino) 37 ° C temperatūroje, drėgnoje 5% CO 2 atmosferoje. Daoy, U87MG, U251MG ir 293 ląstelės buvo gautos iš Amerikos audinių kultūros kolekcijos (Mannasas, VA, JAV), o ONS76 ląstelės buvo gautos iš Dr K Shimizu (Kochi medicinos koledžas, Kochi, Japonija).

NSC

Nemirtinga žmogaus NSC linija HB1.F3 (F3) buvo gauta transfekuojant vaisiaus žmogaus telencefalono ląsteles retrovirusiniu vektoriu, koduojančiu v-myc onkogeną, kaip aprašyta anksčiau. Ši ląstelių linija yra kloniškai izoliuota daugiapotencinė žmogaus NSC linija ir buvo patvirtinta, kad ji geba savarankiškai atsinaujinti ir diferencijuotis į neuronų ir žandikaulių linijas tiek in vivo , tiek in vitro . 44 Šiame tyrime F3 ląstelės buvo transduotos retrovirusiniu vektoriu, turinčiu geną, koduojantį onkolizę skatinantį priešvaisto aktyvavimo fermentą, tai yra CD geną (F3.CD) (13). F3.CD ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje su dideliu gliukozės kiekiu (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV), papildyta 10% FBS, Fungizone (2, 5 μg / ml) ir gentamicinu (20 μg / ml).

NSC ženklinimas DiI

F3.CD ląstelės buvo iš anksto paženklintos, įpilant į auginimo terpę CellTracker CM-DiI (Invitrogen) ir inkubuojant 20 min. CM-DiI maksimali fluorescencijos emisija yra 570 nm, o iš anksto paženklintus CD-NSC galima identifikuoti fluorescencine mikroskopija, kurios metu jie atrodo raudonos spalvos (DiI-F3.CD). Jos taip pat gali būti atskirtos nuo nepaženklintų ląstelių srauto citometrijos (FACSCalibur) pagalba, sužadinant 488 nm bangoje, naudojant 575/26 dažnių juostos filtrą.

In vitro migracijos tyrimas

DiI-F3.CD ląstelės (2, 5 × 105) buvo dedamos į Transwello plokštelės viršutinę kamerą (Costar, Kembridžas, MA, JAV), kurios porų dydis buvo 8 μm, ir 293 ląstelės, pažymėtos CM-DiI (DiI- 293 ląstelės) buvo naudojamos kaip kontrolė. Dviejų tipų medulloblastomos ląstelės - Daoy ir ONS76 - buvo naudojamos kaip tikslinės ląstelės ir dedamos į apatinę kamerą (2, 5 × 10 5 ), o palyginimui buvo naudojami dviejų tipų gliomos ląstelės - U87MG ir U251MG. Plokštelės 24 valandas buvo inkubuojamos su terpe, kurioje nėra serumo. Tada visos apatinės kameros ląstelės buvo surinktos tripsinu ir pakartotinai suspenduotos Hanks subalansuotame druskos tirpale (Invitrogen). Buvo išmatuota srauto citometrija, norint išmatuoti DiI žymėtų ląstelių ir nepaženklintų ląstelių santykį. F3.CD ląstelių migracija į smegenų naviko ląsteles buvo apskaičiuota pagal šią formulę: migracijos% = = (su DiI pažymėtų ląstelių skaičius / nepaženklintų ląstelių skaičius) × 100. Blokavimo tyrimui naudojamas neutralizuojantis monokloninis antikūnas prieš į terpę buvo įpilama (SF / HGF; R&D Systems, Mineapolis, MN, JAV) 20 μg / ml koncentracijos apatinėje kameroje tokiomis pačiomis sąlygomis, kaip aprašyta aukščiau. Migracijos dažnis buvo nustatytas tuo pačiu metodu ir palygintas su kontroliniu.

TUNEL dažymas

Dvidešimt keturias valandas po to, kai Daoy ląstelės (5x104 ląstelės) ir DiI-F3.CD (5x104 ląstelės) buvo išaugintos ant dangtelio 35 mm lėkštelėje, 5-FC buvo pridėtas prie kondicionuojamos terpės esant 500 μg / ml koncentracija ir auginimas buvo tęsiamas dar 48 valandas. Tada ląstelės buvo du kartus praplaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) ir lipnios ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu 30 minučių. Ant lėkščių pritvirtintos ląstelės buvo dažytos TUNEL, naudojant MEBSTAIN Apoptosis Kit II (MBL, Nagoja, Japonija) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, proteazėmis apdorotos sekcijos buvo inkubuotos su biotino-dUTP, po to sekančiu avidinfluoresceino izotiocianatu. Tada pjūviai buvo apžiūrimi fluorescencine mikroskopija.

Kiekybinio pašalinių asmenų poveikio tyrimas in vitro

Norint kiekybiškai įvertinti pašalinį poveikį „Daoy“ ląstelėms, atsirandančioms dėl F3.CD veikimo 5-FC, „Daoy“ ląstelės buvo pasėtos į 24 duobučių plokštelę (2 × 104 ląstelių), o F3.CD ląstelės sumaišytos su „Daoy“ ląstelėmis tuose pačiuose šuliniuose, esant įvairiems santykiams nuo 1: 0 iki 1: 2. Po 1 dienos buvo pridėtas 5-FC, kurio galutinė koncentracija buvo 500 μg / ml, ir auginimas buvo tęsiamas dar 3 dienas. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas trimis egzemplioriais. Ląstelės buvo du kartus praplaunamos PBS, o priklijuotos ląstelės buvo atskirtos naudojant tripsiną / etilengndiamintetraacto rūgštį. Gyvybingų ląstelių skaičius buvo suskaičiuotas Trypan blue metodu ir išreikštas vien Daoy ląstelių skaičiaus procentine dalimi, nedarant jokio 5-FC poveikio.

Eksperimentai su gyvūnais

Leptomeningealinis sklaidos modelis pelėms

BALB / c nuogų pelių patelė buvo anestezuojama į pilvaplėvės ertmę suleidžiant pentobarbitalį (60–70 mg / kg kūno svorio). Galva buvo pritvirtinta stereotaksiniame kreipiamojoje priemonėje, o cisterna magna buvo paveikta po mikroskopu. Daoy ląstelės, suspenduotos PBS, kai koncentracija buvo 1, 5 × 106 ląstelių 30 μl, lėtai buvo įšvirkščiamos į cisternos magnos subarachnoidinę erdvę, naudojant 30-os adatos adatą. Adata lėtai buvo pašalinta, o injekcijos vieta užklijuota „BD Matrigel Matrix“ („BD Biosciences“, Franklin Lakes, NJ, JAV). Šis leptomeningealinis sklaidos modelis buvo atkuriamas ir išgyveno maždaug 30–40 dienų. Histologiškai Daoy ląstelės difuziškai pasklinda subarachnoidinėje erdvėje nugaros smegenyse iki juosmens kanalo (6 paveikslas).

Image

Daoy žmogaus medulloblastomos ląstelės difuziškai lokalizuojasi leptomeninose iš gimdos kaklelio per juosmens stuburo smegenis. Pelė buvo nužudyta praėjus 32 dienoms po Daoy ląstelių pasėjimo į cisternos magna subarachnoidinę erdvę. Pelė patyrė sunkią ligą ir nepaprastą svorio metimą. Pavaizduotos reprezentatyviosios dalys a ) medullocervikalinėje sankryžoje, b ) gimdos kaklelio, c ) krūtinės ląstos ir d ) nugaros smegenų juosmeninėse dalyse. Hematoksilinas / eozinas, × 40.

Visas dydis

F3.CD implantacija

Praėjus keturiolikai dienų nuo medulloblastomos sklaidos modelio sukūrimo, DiI-F3.CD ląstelės, suspenduotos PBS, kai koncentracija buvo 5 × 107 ląstelių 30 μl, buvo sušvirkštos į tą pačią cisterna magna dalį, kaip aprašyta procedūroje. sklaidos modelio sukūrimas. Po 2 dienų pelės buvo perfuzuojamos fiziologiniu tirpalu, po to 4% paraformaldehido, giliai nejautrinant. Tada visas stuburo smegenys buvo atsargiai išpjaustytos iš slankstelių kaulų. Nugaros smegenys per naktį buvo pritvirtintos 4% paraformaldehidu ir po to 48 valandas išbalansuojamos PBS, kuriame yra 30% sacharozės. Fiksuotos stuburo virvės buvo įmerktos į optimaliausią pjovimo temperatūros junginį („Miles Inc.“, Elkhart, IN, JAV) ir laikomos –70 ° C temperatūroje. Audinys buvo suskirstytas po 20 μm ir dažytas hematoksilinu. DiI-F3.CD ląstelės buvo identifikuotos nenudažytose atkarpose, naudojant fluorescencinę mikroskopiją.

Gydymas F3.CD/5-FC

10 dienų po Daoy ląstelių implantavimo į cisterna magną buvo suleistos DiI-F3.CD ląstelės (5 × 107 ląstelių per 30 μl). Po 2 dienų 5-FC buvo švirkščiamas ip 900 mg / kg kūno svorio doze kasdien 10 dienų iš eilės. Kontrolinės pelės gavo tik fiziologinį tirpalą. Dieną po paskutinės 5-FC dozės visas nugaros smegenys buvo išpjaustytos taip, kaip aprašyta aukščiau, ir po nakties pritvirtintos 4% paraformaldehido. Tada jis buvo įdėtas į parafiną. Audiniai buvo suskaidyti 20 μm atstumu histologiniam tyrimui, įskaitant hematoksilino / eozino dažymą, TUNEL dažymą ir fluorescencinę mikroskopiją.

7 dienos po Daoy ląstelių implantavimo gyvūnai atsitiktinai buvo suskirstyti į šias keturias grupes: (A) F3.CD/5-FC grupė, kuriai pelėms buvo injekuotos ip 5-FC 2 dienas po F3. CD inokuliacija; (B) F3.CD/saline grupė, kurioje pelėms buvo injekuotos ip druskos tirpalo praėjus 2 dienoms po F3.CD inokuliacijos; (C) tik 5-FC grupė, kurioje pelėms buvo sušvirkšta tik 5-FC; ir (D) tik fiziologinio tirpalo grupė, kurioje pelėms buvo įšvirkščiamas tik fiziologinis tirpalas.

Statistinė analizė

Blokuojančiame tyrime statistinis skirtumo reikšmingumas buvo nustatytas dispersijos analize (StatView, SAS institutas, Cary, NC, JAV) ir panaudota Bonferroni korekcija keliems palyginimams. Išgyvenimo kreivės buvo sudarytos Kaplan – Meier metodu. Log-rank statistika (StatView) buvo naudojama palyginant išgyvenamumo laiko pasiskirstymą. Visos praneštos P vertės buvo dvipusės ir buvo laikomos statistiškai reikšmingomis, kai buvo mažesnės nei 0, 05.