Ibrolipimas padidina abca1 / g1 ekspresiją lxrα signalizacijos keliu iš thp-1 makrofagų gaunamų putų ląstelių | acta pharmaologica sinica

Ibrolipimas padidina abca1 / g1 ekspresiją lxrα signalizacijos keliu iš thp-1 makrofagų gaunamų putų ląstelių | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti ibrolipimo poveikį ir galimus mechanizmus ATP rišančios membranos kasečių transporterio A-1 (ABCA1) ir ATP rišančios membranos kasečių transporterio G-1 (ABCG1) ekspresijai iš žmogaus makrofagų putplasčio ląstelių, kurios gali vaidinti kritinį vaidmenį aterogenezėje .

Metodai:

Žmogaus THP-1 ląstelės, iš anksto inkubuotos su jautriu-MTL, buvo naudojamos kaip putplasčio ląstelių modeliai. Specifinė mRNR buvo kiekybiškai įvertinta naudojant realaus laiko RT-PGR ir baltymo ekspresiją, naudojant Western blot. Ląstelių cholesterolio kaupimasis buvo tiriamas naudojant cholesterolio ištekėjimo eksperimentus ir didelio efektyvumo skysčių chromatografijos tyrimus.

Rezultatai:

Ibrolipimas 5 ir 50 μmol / L reikšmingai padidino cholesterolio ištekėjimą iš THP-1 makrofagų gaunamų putplasčio ląstelių iki apoA-I arba DTL. Be to, tai padidino ABCA1 ir ABCG1 išraišką. Be to, gydymas ibrolipimu taip pat padidino LXRα. Be to, LXRα maža trukdanti RNR visiškai panaikino skatinamąjį poveikį, kurį sukėlė ibrolipimas.

Išvada:

Ibrolipimas padidino ABCA1 ir ABCG1 ekspresiją ir skatino cholesterolio ištekėjimą, kurį tarpininkavo LXRα signalizacijos kelias.

Įvadas

Koronarinių arterijų liga (CAD) yra pagrindinė mirštamumo priežastis išsivysčiusiose visuomenėse 1, 2 . Keli veiksniai prisideda prie pažeidimų, kurie galiausiai lemia CAD susidarymą. Pagrindinis aterosklerozės progresavimo įvykis yra monocitų diferenciacija į makrofagus, kurie kaupia lipoproteinų gaminamą cholesterolį ir sudaro putų ląsteles arterijos sienelėje 3 . Perteklinis neapibrėžtasis cholesterolis (UC) yra toksiškas ląstelėms; todėl ląstelės sukūrė kelis būdus, kaip apsisaugoti nuo toksiško cholesterolio. Vienas pagrindinių būdų yra cholesterolio ištekėjimas į tarpląstelinius „receptorius“ per cholesterolio eksportuotojus, tokius kaip ATP rišančios membranos kasečių pernešėjas A-1 (ABCA1) ir ATP surišančios membranos kasetės pernešėjas G-1 (ABCG1) 4, 5 .

Ibrolipimas yra veiksmingas lipoproteinų lipazės (LPL) aktyvatorius 6 . Anksčiau buvo pranešta, kad ibrolipimas padidina lipoproteinų lipazės (LPL) mRNR audiniuose ir LPL aktyvumą plazmoje po heparino, todėl sumažėja trigliceridų kiekis plazmoje ir padidėja DTL. Ankstesni mūsų ir kitų laboratorijų tyrimai taip pat parodė, kad padidėjęs LPL aktyvumas skeleto raumenyse sumažina riebalų kaupimąsi, o ilgalaikis ibrolipimo vartojimas apsaugo nuo eksperimentinės aterosklerozės 6, 7, 8 gyvūnams. Tačiau neaiškus ibrolipimo sukeltų cholesterolio transportavimo baltymų išsami mechanizmas.

Neseniai mūsų laboratorijoje paaiškėjo, kad kepenų X receptorių (LXR) sintetinis agonistas T0901317 skatino ABCA1 geno ir baltymų kiekį apoE - / - pelių aortoje, kepenyse ir plonojoje žarnoje ir žymiai padidino cholesterolio ištekėjimą iš pilvaplėvės makrofagų 9 . Mes taip pat parodėme, kad IFN-γ pirmiausia gali sumažinti LXRα ekspresiją JAK / STAT1 signalizacijos keliu ir tada sumažinti ABCA1 ir cholesterolio ištekėjimą THP-1 makrofagų išgautose putų ląstelėse 10 . Be to, eikozapentaeno rūgštis (EPA) sumažina ABCA1 serino fosforilinimą ir blokuoja nuo ABCA1 priklausomą cholesterolio ištekėjimą per cAMP / PKA kelią THP-1 makrofagų gautose putplasčio ląstelėse 11 . Šio tyrimo tikslas buvo ištirti ibrolipimo poveikį pagrindiniams makrofagų cholesterolio ištekėjimo ABCA1 ir ABCG1 eksportuotojams, branduolių transkripcijos faktoriui LXRα, kuris reguliuoja jų ekspresiją, ir makrofagų cholesterolio tvarkymui.

medžiagos ir metodai

Medžiagos

Ibrolipimo ([4- (4-brom-2-ciano-fenilkarbamoil) -benzil] -fosfonrūgšties dietilo esteris; Cheminių abstrakčių tarnyba (CAS) 133208-93-2; partijos Nr. C00C99), kuris buvo sintezuotas Naujoje vaistų tyrimų laboratorijoje iš Otsuka farmacijos fabriko (Tokushima, Japonija) pristatė prof. Wei-dong YIN. HDL ir be lipidų apoA-I buvo gauti iš Calbiochem (Kembridžas, MA). Triušių polikloniniai anti-ABCA1, anti-ABCG1, anti-LXRα ir anti-β-aktino antikūnai buvo gauti iš „Abcam“ (Kembridžas, JK). „CellTiter 96AQ“ naudingas vieno tirpalo reagentas buvo iš „Promega“ (Madisonas, WI). „PSilencer2.1-U6-Hygro“ buvo gautas iš bendrovės „Ambion“. Lipofectamine TM 2000 buvo iš bendrovės „Invitrogen“. 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-tetrazolio bromidas (MTT) ir kiti reagento kokybės chemikalai buvo gauti iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO).

Ląstelių kultūros

Žmogaus THP-1 ląstelės buvo auginamos RPMI-1640, papildytame 0, 1% neesminių aminorūgščių, penicilinu (100 V / ml), streptomicinu (100 μg / ml) ir 20% galvijo vaisiaus serumo (FBS) 37 ° C temperatūroje. % CO 2, kai ląstelių tankis yra nuo 0, 2 iki 1, 0 × 106 / ml. Po trijų-keturių dienų ląstelės 24 valandas buvo gydomos PMA (160 nmol / L), tada 48 valandas ht. Buvo pakeista terpe, kurioje nėra serumo, turinčio oxLDL (50 μg / ml), kad ląstelės galėtų prieš jų naudojimą eksperimentuose tampa visiškai diferencijuotais makrofagais.

Ląstelių proliferacijos ir citotoksiškumo tyrimas

Ląstelių citotoksiškumo tyrimas buvo įvertintas matuojant mitochondrijų dehidrogenazės aktyvumą, kaip aprašyta anksčiau 12 . THP-1 ląstelės buvo dedamos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis 1x104 / duobutėje. Po 24 val. Terpė buvo pakeista. Ląstelės buvo kultivuojamos, kaip nurodyta aukščiau. Po gydymo ibrolipimu, skirtingos koncentracijos 24 val., 10 μL / duobutėje CellTiter 96A vandeninio tirpalo reagento [3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil- 2H -tetrazolio bromido (MTT) reagentas]. Po 1 valandos inkubacijos 37 ° C temperatūroje sudrėkintoje 5% CO 2 atmosferoje, absorbcija 490 nm bangoje buvo užfiksuota ELISA plokštelių skaitytuvu. „Kontrolė“ reiškia inkubacijas, kai yra tik nešiklis (0, 1% DMSO arba etanolio) ir buvo laikoma, kad jos turi 100% gyvybingų ląstelių.

Transfekcija LXRα nutildymui

Trumpai trukdanti RNR (siRNR), būdinga žmogaus LXRα („Santa Cruz Biotechnology“), ir netirpioji kontrolinė siRNR buvo susintetinta „Biology Engineering Corporation“ Šanchajuje, Kinijoje. SiRNR dviguba grandinė DNR buvo sujungta su linearizuotu p duslintuvo 2.1-U6 siRNR ekspresijos vektoriu Bam HI ir Hin dIII vietose. Produktai buvo transformuoti į kompetentingas Escherichia coli DH5α ląsteles ir kultivuoti Luria-Bertani (LB) plokštelėse su 100 μg / ml ampicilino. Ampicilinui atsparios kolonijos buvo atrinktos restrikcijos būdu suardant ir patvirtintos DNR seka. Transfekcijai su mažomis trukdančiomis RNR (siRNR), putplasčio ląstelės buvo dedamos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis 2 x 106 ląstelių kiekvienoje duobutėje. Kitą dieną ląstelės buvo transfekuotos LXRα siRNR OPTI-MEM su 5 μg / ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Galutinė siRNR koncentracija buvo 100 nmol / l. Vertinant naudojant fluoresceinu pažymėtą RNR zondą, transfekcijos efektyvumas buvo maždaug 50%. Po 48 h transfekcijos į auginimo terpę buvo įpilta ibrolipimo (50 μmol / L). Ląstelės buvo kultivuojamos dar 24 valandas prieš atliekant ekspresiją arba atliekant funkcinius tyrimus. Žmogaus LXRα siRNR taikinio seka buvo AAGTACACAGGAGGCCATCTT, o kontrolinė neslopinančio siRNR seka buvo AATTCTCCGAACGTGTCACGT. Palyginti su kontroline siRNR, LXRα siRNR slopino LXRα baltymų ekspresiją 84% pagal Western blot analizę.

Western blot analizė

Buvo ekstrahuojami ląstelių ir viso audinio baltymai. Į 10% SDS-poliakrilamido elektroforezės gelį buvo įpiltas vienodas kiekis visų baltymų (40 μg) ir 2 val. Elektroforezuotas 100 V buferiniame tirpale, kuriame yra 25 mmol / l Tris bazės, 250 mmol / L glicino ir 0, 1% SDS. Po elektroforezės baltymai buvo elektra perkelti į immobilono P pernešimo membraną buferiniame tirpale, kuriame yra 25 mmol / l Tris, 192 mmol / L glicino, 20% metanolio ir 0, 005% SDS. Po pernešimo membrana užblokuota TBST (20 mmol / l Tris bazės, pH 7, 6, 150 mmol / L NaCl ir 0, 1% Tween-20), turinčio 5% lieso pieno, 4 valandas kambario temperatūroje. Membranos buvo inkubuojamos su antikūnais prieš ABCA1, ABCG1, LXRα ir β-aktiną blokuojančiame tirpale 4 ° C temperatūroje per naktį. Tada membrana tris kartus plaunama TBST 30 minučių, inkubuojama su antriniu antikūnu blokuojančiame tirpale 50 minučių kambario temperatūroje ir tris kartus plaunama TBST 30 minučių. Imunoreaktyvumas buvo nustatytas atliekant ECL testą. Baltymų kiekis buvo apskaičiuotas densitometrijos būdu, naudojant „Labwords“ analizės programinę įrangą.

RNR išskyrimas ir realiojo laiko kiekybinė PGR analizė

Bendra RNR iš ląstelių buvo ekstrahuota naudojant TRIzol reagentą pagal gamintojo instrukcijas. Realiojo laiko kiekybinė PGR, naudojant „SYBR Green“ aptikimo chemiją, buvo atlikta naudojant „Roche light Cycler Run 5.32“ realiojo laiko PGR sistemą. Kiekvienam keturkojui buvo sudarytas pagrindinis mišinys, kurio bendras reakcijos tūris buvo 30 μL su 5 μL cDNR (praskiedžiant santykiu 1: 5), 15 μL 2 × TaqMan universaliojo pagrindinio mišinio, be AmpErase UNG (Applied Biosystems), 5 μL. dietilpirokarbonatu apdorotu vandeniu („Ambion Ltd.“, Huntingdon, JK) ir 1, 5 μL 20 × grunto / zondo rinkiniu („Assay-on-Demand Assay Mix“; „Applied Biosystems“). Iš šio mišinio į kiekvieną iš keturių šulinėlių buvo įpilta 5 μL alikvotinė dalis. Šiluminės ciklo sąlygos buvo 95 ° C 10 min., Tada 40 ciklų 95 ° C 15 s ir 60 ° C 1 min. Kiekybiniai matavimai buvo nustatyti taikant ΔΔC t metodą, o kaip vidinė kontrolė panaudota β-aktino ekspresija. Gruntų sekos yra tokios, kaip parodyta 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Ląstelinio cholesterolio ištekėjimo eksperimentai

Ląstelės buvo auginamos, kaip nurodyta aukščiau. Tada jie buvo paženklinti 0, 2 μCi / ml [3H] cholesterolio. Po 72 valandų ląstelės buvo plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) ir inkubuojamos per naktį RPMI 1640 terpėje, kurioje yra 0, 1% ( m / v ) galvijų serumo albumino (BSA), kad būtų galima subalansuoti [3H] cholesterolį visuose ląstelių baseinai. Išlygintos [3H] cholesteroliu pažymėtos ląstelės buvo plaunamos PBS ir inkubuojamos 2 ml išpylimo terpės, turinčios RPMI 1640 terpę ir 0, 1% BSA, su arba be apoA-I (50 μg / ml) arba HDL (μg / ml) arba be jo. Tam tikru laiku buvo paimtas 150 μL ištekėjimo terpės mėginys, kuris buvo pašalintas per 0, 45 μm filtrą, kad būtų pašalintos visos plaukiojančios ląstelės. Vienuoliai sluoksniai buvo du kartus plaunami PBS, o ląsteliniai lipidai buvo ekstrahuojami izopropanoliu. Tuomet buvo išmatuotas terpės ir ląstelių [3H] cholesterolis, skaičiuojant skysčio scintiliaciją. Ištekėjimo procentas buvo apskaičiuotas pagal šią lygtį: [bendras terpių skaičius / (bendras ląstelių skaičius + bendras terpių skaičius)] × 100%.

Aukštos kokybės skysčių chromatografijos tyrimai (HPLC)

HPLC analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau 13 . Trumpai tariant, ląstelės buvo tris kartus plaunamos PBS. Tinkamas tūris (paprastai 1 ml) 0, 5% NaCl buvo pridėtas maždaug 50–200 μg ląstelinių baltymų viename ml. Ląstelės buvo ultragarsu apdorotos ultragarsu 2 minutes. Baltymų koncentracija ląstelių tirpale buvo matuojama naudojant BCA rinkinį. Laisvojo cholesterolio kiekiui matuoti buvo naudojama 0, 1 ml ląstelių tirpalo alikvotinė dalis (kurioje buvo 5–20 μg baltymų), o bendra alikvotinė dalis buvo naudojama bendrojo cholesterolio nustatymui. Laisvasis cholesterolis buvo ištirpintas izopropanolyje (1 mg cholesterolio / ml) ir laikomas pradiniame tirpale –20 ° C temperatūroje. Praskiedžiant cholesterolio atsarginį tirpalą toje pačioje ląstelių lizuotoje buferinėje medžiagoje buvo gautas standartinis cholesterolio kalibravimo tirpalas nuo 0 iki 40 μg / ml.

Kiekvieno mėginio 0, 1 ml alikvotinė dalis (standartiniai cholesterolio kalibravimo tirpalai arba ląstelių tirpalai) buvo papildyta 10 μL reakcijos mišinio, kuriame buvo 500 mmol / L MgC1 2, 500 mmol / L Tris-HCl (pH 7, 4), 10 mmol. / L ditiotreitolio ir 5% NaCl. Į bendrą mėgintuvėlį įpilama 0, 4 U cholesterolio oksidazės, esančios 10 μL 0, 5% NaCl, kad būtų nustatytas laisvasis cholesterolis, arba 0, 4 U cholesterolio oksidazės ir 0, 4 U cholesterolio esterazės, kad būtų galima išmatuoti bendrą cholesterolį. Bendras reakcijos tirpalas kiekviename mėgintuvėlyje buvo inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 30 min., Ir reakcijai sustabdyti buvo pridėta 100 µL metanolio: etanolio (1: 1). Kiekvienas tirpalas buvo laikomas šaltai 30 min., Kad būtų galima nusodinti baltymus, ir po to centrifuguojamas esant 1500 aps / min 10 min. 15 ° C temperatūroje. Dešimt mikrolitrų supernatanto buvo užtepta ant sistemos Chromatographer (PerkinElmer Inc), kuriame buvo „PerkinElmer“ serijos 200 vakuuminis degazatorius, pompa, „PerkinElmer“ serija 600 LINK ir „PerkinElmer“ serijos 200 UV / vis detektorius bei „Disovery C-18 HLPC“ kolonėlė. („Supelco Inc“). Kolonėlė buvo eliuuojama naudojant izopropanolį: n- heptaną: acetonitrilą (35:13:52) 1 ml / min srautu 8 minutes. Stebima absorbcija esant 216 nm, ir duomenys buvo analizuojami naudojant „PerkinElmer“ „TotalChrom“ programinę įrangą.

Statistinė analizė

Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± SD. Rezultatai buvo analizuojami naudojant vienpusį ANOVA ir Studento testą naudojant SPSS 13.0 programinę įrangą. Statistiškai reikšmingomis buvo laikomos mažesnės nei 0, 05 P vertės.

Rezultatai

Ibrolipimo ABCA1 ir ABCG1 ekspresijos reguliavimas THP-1 makrofagų gautose putų ląstelėse

Norint ištirti, ar gydymas ibrolipimu gali sukelti ląstelių toksiškumą, buvo lyginamas skirtingų ibrolipimo koncentracijų poveikis putų ląstelių gyvybingumui, naudojant MTT reagentą. Kaip parodyta 1A paveiksle, ląstelių gyvybingumo skirtumas tarp skirtingų gydymo būdų nebuvo statistiškai reikšmingas. Šie rezultatai rodo, kad eksperimentinės ibrolipimo koncentracijos nesukėlė ląstelių proliferacijos ir ląstelių žūties.

Image

Ibrolipimo poveikis ABCA1 ir ABCG1 ekspresijai ir cholesterolio ištekėjimui THP-1 makrofagų gautose putų ląstelėse. Ląstelės buvo apdorotos ibrolipimu skirtingomis koncentracijomis arba skirtinga ekspozicijos trukme, kaip nurodyta. A, Putplasčio ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant reagentą CellTiter 96AQueous One Solution. Kontrolė (0 μmol / L) reiškia inkubacijas tik esant nešikliui (0, 1% DMSO) ir buvo manoma, kad jos turi 100% gyvybingų ląstelių. B ir C, ABCA1 ir ABCG1 ekspresija buvo matuojama mRNR lygiu realiojo laiko PGR. D ir E, ABCA1 ir ABCG1 baltymų ekspresija buvo išmatuota Western blot metodu. F ir H, cholesterolio nutekėjimas į apoA-I arba DTL iš putplasčio ląstelių, reaguojant į skirtingas ibrolipimo koncentracijas 24 valandas. G ir I, Cholesterolio nutekėjimas į apoA-I arba DTL iš putplasčio ląstelių, reaguojant į ibrolipimą skirtingu ekspozicijos metu. Visi rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD. b P <0, 05 ν valdikliai. n = 3.

Visas dydis

ABCA1 ir ABCG1 yra pagrindiniai atvirkštinio cholesterolio pernešimo veikėjai ir yra labai svarbūs reguliuojant ląstelių cholesterolio homeostazę 14, 15 . Norėdami išsiaiškinti ibrolipimo poveikį ABCA1 ir ABCG1, ištyrėme mRNR ir baltymų ekspresijos lygius ABCA1 ir ABCG1 THP-1 makrofagų gautose putplasčio ląstelėse. Kaip parodyta, ibrolipimas padidino ABCA1 ir ABCG1 ekspresiją tiek transkripcijos (1B ir 1C paveikslai), tiek transliacijos lygmenyse (1D ir 1E paveikslai) priklausomai nuo dozės ir laiko. Panaudotas kaip teigiama kontrolė, LXR ligandas T0901317 (5 μmol / L) padidino ABCA1 ir ABCG1 raišką 24 val.

Ibrolipimas skatina cholesterolio ištekėjimą THP-1 makrofagų pagamintose putplasčio ląstelėse

Kadangi ibrolipimas padidino ABCA1 ir ABCG1 reguliavimą, toliau nustatėme ibrolipimo poveikį cholesterolio ištekėjimui iš THP-1 makrofagų gaunamų putplasčio ląstelių, matuojant 3H-cholesterolio ir cholesterolio kiekį. Reaguojant į gydymą ibrolipimu, pastebėtas reikšmingas cholesterolio ištekėjimo padidėjimas iki apoA-I (1F pav.). Toliau buvo atliktas laiko tėkmės tyrimas, o cholesterolio išsiskyrimo iš putplasčio ląstelių į apoA-I skirtumai tik tarp apoA-I ir ibrolipimu gydytų grupių pasiekė didžiausią reikšmę 12 ir 24 val. (1G pav.). Be to, ląstelinio cholesterolio kiekiui matuoti buvo naudojama aukštos kokybės skysčių chromatografija. Ibrolipimas padidino cholesterolio kiekį ląstelėse, o cholesterolio ištekėjimą padidino (2 lentelė), kas rodo, kad ibrolipimas gali reguliuoti ABCA1 ekspresiją putų ląstelėse. DTL, kitas cholesterolio ir fosfolipidų pernešėjas, gabenamas ABCG1, taip pat buvo naudojamas įvertinti ibrolipimo poveikį cholesterolio ištekėjimui putų ląstelėse. Gydymas ibrolipimu, kaip ir apoA-I, taip pat paskatino reikšmingą cholesterolio ištekėjimo padidėjimą iš putplasčio ląstelių į DTL, priklausomai nuo dozės ir laiko (1H ir 1I paveikslai). Tiesiogiai matuojant ląstelių cholesterolio kiekį, ibrolipimu apdorotų putų ląstelių kiekis taip pat sumažėjo, palyginti su kontrole (tik DTL, 3 lentelė). Panaudotas kaip teigiama kontrolė, LXR ligandas T0901317 (5 μmol / L) žymiai padidino cholesterolio ištekėjimą iš THP-1 makrofagų gautų putplasčio ląstelių iki apoA-I arba DTL per 24 val.

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

LXRα dalyvauja ibrolipimo sukeltų ABCA1 ir ABCG1 reguliavime iš THP-1 makrofagų gaunamose putų ląstelėse

Įrodyta, kad LXRα reguliuoja ABCA1 ir ABCG1 16, 17, kurie veikia kaip laisvojo cholesterolio ir fosfolipidų translokatoriai, raišką, leidžiančią cholesterolio ištekėjimą iš makrofago į įvairius receptorius, įskaitant besiformuojančius cholesterolio neturinčius DTL, todėl jie atlieka pagrindinį vaidmenį atvirkštinio cholesterolio pernešimo reguliavimas. Norint dar labiau patvirtinti, ar ibrolipimas gali paveikti LXRα ekspresiją, buvo atlikta realiojo laiko kiekybinė PGR ir Vakarų imunoblotų analizė. Kaip parodyta (2A – 2D pav.), LXRα mRNR ir baltymo ekspresija padidėjo priklausomai nuo dozės ir laiko, kai ląstelės buvo gydomos ibrolipimu. Tada mes ištyrėme LXRα siRNR įtaką ABCA1 ir ABCG1, kurias sukėlė ibrolipimas, reguliacijai. Apdorojimas siRNR dėl LXRα sumažino LXRα baltymų ekspresiją 88% (2E pav.) Ir visiškai panaikino ibrolipimo padidintą ABCA1 ir ABCG1 ekspresiją (2F ir 2G paveikslai). Tuo pačiu metu ląstelėse esantis cholesterolio ištekėjimas į apoA-I (2H paveikslas) arba HDL (2I paveikslas) ląstelėse, apdorotose LXRα siRNR ir ibrolipimu, buvo visiškai panaikintas, palyginti su ląstelėmis, gydomomis vien ibrolipimu.

Image

LXRα dalyvauja ibrolipimo reguliuojame ABCA1 ir ABCG1. Ląstelės buvo apdorotos ibrolipimu skirtingomis koncentracijomis arba skirtinga ekspozicijos trukme, kaip nurodyta. A ir B, LXRα ekspresija buvo matuojama mRNR lygiu realiojo laiko PGR. C ir D, LXRα baltymų ekspresija buvo išmatuota Western blot metodu. E, F, G, H ir I, THP-1 makrofagų išgautos putų ląstelės buvo transfekuotos kontroline arba LXRα siRNR ir po to inkubuojamos su ibrolipimu (50 μmol / L) 24 valandas. E, Baltymų mėginiai buvo imunoblotuoti anti-LXRα arba anti-β-aktino antikūnais. Duomenys rodo tris eksperimentus su skirtingais ląstelių preparatais. ABCA1 ir ABCG1 F ir G, mRNR ir baltymų ekspresija buvo nustatyti naudojant realaus laiko PGR ir Western blot. H ir I, Cholesterolio ištekėjimai į apoA-I arba DTL iš THP-1 makrofagų gautų putplasčio ląstelių buvo analizuojami skysčių scintiliacijos skaičiavimo tyrimais, kaip parodyta aukščiau. Panašūs rezultatai buvo gauti per tris nepriklausomus eksperimentus. Duomenys yra vidutiniai ± SD. b P <0, 05 palyginti su pradine verte.

Visas dydis

Diskusija

Aterosklerozė yra lėtinis patologinis procesas, ir gali praeiti dešimtmečiai, kad žmonėms išsivystytų sunkūs ateromatiniai pažeidimai 18 . Makrofagai vaidina pagrindinį vaidmenį formuojant arterijų pažeidimus, nes kaupiasi per daug lipidų, daugiausia cholesterolio esterio (CE), pasisavinant modifikuotus lipoproteinus. Tai įvyksta įvairiais mechanizmais, įskaitant skiediklio receptorių kelius, tokius kaip skiediklio receptoriai A (SR-A) ir CD36 19 . Šio proceso metu cholesterolio ištekėjimas gali atlikti lemiamą vaidmenį pašalinant cholesterolio perteklių iš papildomų kepenų ląstelių, įskaitant makrofagus ir kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles (VSMC) 20 . Taigi sumažėjęs cholesterolio nutekėjimas iš arterijų sienos gali skatinti aterosklerozės progresavimą. Pagrindinės molekulės, dalyvaujančios cholesterolio ištekėjime iš makrofagų putplasčio ląstelių, yra ABCA1 ir ABCG1 4, 5 . ABCA1, mutantinė Tangier ligos molekulė, dalyvauja cholesterolio nutekėjime iš periferinių audinių makrofagų į lipidų neturinčius apolipoproteinus, o ypač į apoAI 20, 21, 22, tuo tarpu, kai ABCG1 palengvina ląstelių cholesterolio ištekėjimą iš makrofagų į lipiduotas daleles, tokias kaip subrendęs DTL, bet ne į lipidų neturinčius apolipoproteinus 23, 24 .

Anksčiau buvo pranešta, kad ibrolipimas padidino LPL mRNR lygį, LPL baltymų masę ir LPL aktyvumą plazmoje po heparino ir sumažino TG kiekį plazmoje kartu padidindamas DTL-C lygį gyvūnams, sergantiems lipidų sutrikimais. Kusunoki ir kt. Pranešė, kad gydymas ibrolipimu slopina riebalų kaupimąsi riebių dietinių žiurkių modelyje. Tsutsumi ir kt. Įrodė, kad padidėjęs LPL aktyvumas padidina didelio tankio lipoproteinų cholesterolį, o ilgalaikis ibrolipimo vartojimas apsaugo nuo aterosklerozės išsivystymo žiurkėms, šeriamoms aterogenine dieta 6, 7, 8 . Neseniai mūsų laboratorija atskleidė, kad ibrolipimas padidina NPC1 ekspresiją per LXRα kelią THP-1 makrofagų gautose putų ląstelėse 25 . Be to, mes taip pat parodėme, kad ibrolipimas padidina ABCA1 reguliavimą ir slopina dietos sukeltą aterosklerozę Kinijos „Bama“ miniatiūrose 8 . Norėdami išsamiau ištirti ibrolipimo sukeltų cholesterolio pernešimo baltymų mechanizmą, pirmiausia parodėme, kad ibrolipimas gali sureguliuoti ABCA1 ir ABCG1 raišką ir skatinti cholesterolio ištekėjimą THP-1 makrofagų gautose putų ląstelėse.

Tiek ABCA1, tiek ABCG1 ekspresija gali būti slopinama cinko piršto baltymu 202 (ZNF202) ir reguliuojama padidinant cholesterolio kiekį arba apdorojant specifiniais oksisteroliais, įskaitant 25, 20 ( S ) - ir 22 ( R ) -hidroksikocholesterolį 16, 17., 26 . Akivaizdu, kad šių specifinių oksisterolių indukcija tiek ABCA1, tiek ABCG1 priklausė nuo LXR 16, 17, 26 aktyvacijos. Norėdami toliau suprasti LXRα vaidmenį reguliuojant ibrolipimo ABCA1 ir ABCG1 raišką, mes ištyrėme ibrolipimo poveikį LXRα raiškai, kad išsiaiškintume, ar gydymo metu keičiasi LXRα ekspresija. Paaiškėjo, kad LXRα raišką padidino ir ibrolipimas THP-1 makrofagų gautose putplasčio ląstelėse. Tada LXRα siRNR buvo naudojama norint išsiaiškinti, ar LXRα dalyvauja Ibrolipimo sukeltų ABCA1 ir ABCG1 reguliavime. LXRα siRNR visiškai panaikino ibrolipimo padidintą ABCA1 ir ABCG1 ekspresijos reguliavimą. Ląstelinio cholesterolio ištekėjimą, kurį skatina ibrolipimas, taip pat pakeitė LXRα siRNR. Todėl spėjame, kad LXRα dalyvavo ibrolipimo sukeltų ABCA1 ir ABCG1 reguliavime THP-1 makrofagų gautose putplasčio ląstelėse.

Apibendrinant, mūsų tyrimo rezultatai rodo, kad ibrolipimas padidina ABCA1 ir ABCG1 raišką, taip pat cholesterolio ištekėjimą THP-1 makrofagų gautose putų ląstelėse. LXRα ekspresiją taip pat padidina gydymas ibrolipimu. Tačiau sustiprintą ABCA1 ir ABCG1 ekspresiją, kurią sukėlė ibrolipimas, visiškai panaikino LXRα maža trukdanti RNR. Visi šie atradimai leidžia manyti, kad ibrolipimas pirmiausia gali sureguliuoti LXRα ekspresiją ir tada padidinti ABCA1 ir ABCG1 ekspresiją, taip pat cholesterolio ištekėjimą THP-1 makrofagų išgautose putų ląstelėse. Šie stebėjimai gali suteikti naujų įžvalgų apie aterosklerozės gydymą.

Autoriaus indėlis

Si-guo CHEN, Ji XIAO ir Chao-ke TANG sukūrė tyrimus; Si-guo CHEN, Ji XIAO, Jin JIANG, Li-bao CUI ir Mei-mei LIU atliko tyrimus; Wei-dong YIN, Guo-jun ZHAO ir Chao-ke TANG pateikė naujus analitinius reagentus ir įrankius; Xie-hong LIU, Zhong-cheng MO, Kai YIN ir Chun-zhi TAN išanalizavo duomenis; Ji XIAO parašė darbą.

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • BC013835
  • NM_004915
  • NM_005502
  • NM_013839

Žodynas

ABCA1

ATP rišantis kasečių pernešėjas A1

ABCG1

ATP rišantis kasečių transporteris G1

Kaip

aterosklerozė

CAD

Vainikinių arterijų liga

LXR

kepenų X receptoriai

RXR

retinoido X receptorių

jautis-MTL

oksiduotas mažo tankio lipoproteinas

PMA

forbolas 12-miristatas 13-acetatas

TC

bendrojo cholesterolio

CE

cholesterolio esteris

FC

laisvojo cholesterolio

RCT

atvirkštinis cholesterolio pernešimas

MTL

mažo tankio lipoproteinai

HDL

didelio tankio lipoproteinai

apoA1

apolipoproteino AI

IFN-γ

interferonas-γ

DUJOS

interferono-γ aktyvacijos seka

JAK

janus kinazė

STATAS

signalo keitiklis ir transkripcijos aktyvatorius

AAA

eikozapentaeno rūgštis

UC

neesterifikuotas cholesterolis

LPL

lipoproteinų lipazė

CAMP

ciklinis AMP

PKA

baltymo kinazė A

siRNR

trumpai trukdanti RNR

SR-A

Skerdyklų receptoriai

NPC1

C tipo „Niemann-Pick“

ZNF202

cinko piršto baltymas 202