Il-12-stat4-ifn-γ ašis yra pagrindinis pasroviui plintant il-13 tarpininkaujantiems astmos fenotipams th2 tipo astmos modelyje | eksperimentinė ir molekulinė medicina

Il-12-stat4-ifn-γ ašis yra pagrindinis pasroviui plintant il-13 tarpininkaujantiems astmos fenotipams th2 tipo astmos modelyje | eksperimentinė ir molekulinė medicina

Anonim

Anotacija

IL-4 ir IL-13 yra artimai susiję citokinai, kuriuos gamina Th2 ląstelės. Tačiau IL-4 ir IL-13 daro skirtingą poveikį astmos fenotipų vystymuisi. Čia mes įvertinome pasroviuose esančius molekulinius mechanizmus, susijusius su Th2 tipo astmos fenotipų kūrimu. Buvo naudojamas pelių Th2 astmos modelis, kuris jautė intraperitonealinę reakciją su alergenu (ovalbuminu) ir alumi, o po to buvo tiriamas tik su ovalbuminu. Astmos fenotipai, įskaitant kvėpavimo takų hiperjautrumą (AHR), plaučių uždegimą ir imunologinius parametrus, buvo įvertinti po pelių, kuriems trūksta kandidatų genų, alergenų. Šis tyrimas parodė, kad mehacholino AHR ir plaučių uždegimas išsivystė pelėms, turinčioms alergenų, kuriems nustatytas IL-4 trūkumas, bet ne pelėms, kurioms buvo nustatytas alergenas, IL-13, kurių trūkumas buvo blogas. Be to, sutrinka OVA specifinio IgG2a ir IFN-γ indukuoto baltymo (IP) -10 gamyba, jei nėra IL-13, bet ne IL-4. Plaučių nukreipta IFN-γ perraiška kvėpavimo takuose sustiprino metacholino AHR ir neeozinofilinį uždegimą; be to, pelėms, sergančioms alergenu, kurių IFN-γ trūkumas, šie astmos fenotipai buvo pažeisti. Be to, pelėms, alergiškoms IL-12Rβ2 ir STAT4 nepakankamoms, buvo sutrikdytas AHR, neeozinofilinis uždegimas ir IFN-γ raiška; tačiau pelėms, turinčioms alergenų, kuriems netaikomas alergenas, AHR ir neeozinofilinis uždegimas nepablogėjo, be to, šiuos reiškinius lydėjo sustiprinta IL-12 ir IFN-γ išraiška. Dabartiniai duomenys rodo, kad IL-13 tarpininkaujantys astmos fenotipai, tokie kaip AHR ir neeozinofilinis uždegimas, Th2 tipo astmoje priklauso nuo IL-12-STAT4-IFN-γ ašies, ir kad šie astmos fenotipai nepriklauso nuo IL-4Ralfa tarpininkaujama signalizacija.

Įvadas

Astma yra vis labiau paplitusi liga, kuriai būdingas padidėjęs reagavimas į kvėpavimo takus (AHR), lėtinis uždegimas ir atsinaujinimas (Pueringer ir Hunninghake, 1992). AHR, kuris yra perdėtas bronchų sutraukiantis atsakas į nespecifinius agonistus (pvz., Metacholiną), laikomas būdinga fiziologine anomalija, kuria grindžiama astminė diatėja (Pueringer ir Hunninghake, 1992; Weinberger, 1993; Whyte ir kt., 1993). Daugybė įrodymų rodo, kad alergenams būdingos CD4 + Th2 ląstelės vaidina svarbų vaidmenį inicijuojant ir generuojant šią anomaliją (Robinson et al., 1992; Robinson et al., 1993; Cohn ir kt., 1997). Tačiau IL-4 ir IL-5 negali visiškai atsižvelgti į šį fiziologinį atsaką. Pvz., AHR, pastebėtas pelėms, jautrioms alergenams ir sukeliančioms alergenų įtaką, yra tarp CD4 + T ląstelių priklausomo, nuo IL-4 ir IL-5 nepriklausomo aktyvacijos būdo, nors ir IL-4, ir IL-5 sukelia eozinofilus. infiltracija į plaučius (Hogan ir kt., 1998). Kalbant apie Th2 citokinų vaidmenį kuriant AHR ir plaučių uždegimą, dabar laikoma, kad IL-13 yra lemiamas; IL-13 blokada žymiai slopina alergenų sukeltą AHR ir plaučių uždegimą pagal Th2 tipo alerginės astmos modelį, o IL-13 patekimas į kvėpavimo takus išgelbėja šį poveikį (Wills-Karp et al., 1998).

IL-4 ir IL-13 yra artimai susiję citokinai, kuriuos dideliais kiekiais gamina aktyvinti CD4 + Th2 limfocitai (Kuipers ir kt., 2003). IL-4 ir IL-13 taip pat turi sutampančius biologinius profilius ir dalijasi IL-4Rα subvienetu ir IL-13Rα1 komponentais savo atitinkamuose multimerinių receptorių kompleksuose (Murata et al., 1998a; Kuipers et al., 2003). Kaip ir tikėtasi, palyginus pelių, nukreiptų į plaučius, IL-13 ir IL-4, transgeninių (TG) pelių, nustatyta daug panašumų. Šių pelių transgenai sukelia uždegiminį atsaką, kuriam būdinga makrofagų infiltracija ir nemažas skaičius eozinofilų (Zhu et al., 1999). Tačiau taip pat buvo pranešta apie ryškius IL-4 ir IL-13 įtakos astmos fenotipų vystymuisi skirtumus. Svarbu tai, kad IL-4 TG pelės neišreiškia AHR po mechaolino užduoties (Rankin ir kt., 1996), tuo tarpu IL-13 per didelis ekspresija kvėpavimo takuose sukelia AHR po metakolino užduoties (Zhu et al., 1999).

Prie IL-13 receptorių rišančios grandinės yra IL-13Rα1 ir IL-13Rα2 (Aman ir kt., 1996; Caput ir kt., 1996; Hilton ir kt., 1996; Donaldson ir kt., 1998). IL-13Rα1 suriša IL-13 su mažu afinitetu. IL-13Rα1 ekspresija kartu su IL-4Rα sukelia didelio afiniteto signalo signalo komplekso susidarymą (Aman ir kt., 1996; Hilton ir kt., 1996; Murata ir kt., 1998b). Šis receptorių kompleksas yra ekspresuojamas tiek limfoidinėse, tiek ne limfoidinėse ląstelėse, taip pat gali būti suaktyvinamas IL-4, kuris paaiškina, kad sutampa biologinis IL-4 ir IL-13 poveikis (Zurawski et al., 1993). Priešingai nei IL-13Rα1, IL-13Rα2 selektyviai jungiasi su IL-13 su dideliu afinitetu. Pelių IL-13Rα2 citoplazminė sritis neturi akivaizdaus signalinio motyvo (Donaldson ir kt., 1998). Tirpi IL-13Rα2 forma buvo nustatyta pelės serume (Zhang ir kt., 1997) ir yra panaši į IL-1 II tipo receptorius (Colotta et al., 1995). IL-13Rα2 gali veikti kaip masalas, kad sušvelnintų IL-13Rα-IL-4Rα receptorių komplekso poveikį. Tačiau pelėms, kurių organizme trūksta IL-13Rα2 (IL-13Rα2 - / - ), lipopolisacharidas (LPS) buvo sutrikdytas IL-12, susijęs su IFN-γ, gamyba (Wood et al., 2003)., leidžia daryti prielaidą, kad IL-13Rα2 tarpininkaujamas poveikis yra susijęs su IFN-γ gamyboje.

Šiame tyrime mes iškėlėme hipotezę, kad IL-13Rα2 tarpininkavimo būdas, be IL-4Rα ir IL-13Rα1 komplekso tarpininkavimo, taip pat yra svarbus paskesnis kelias kuriant IL-13 tarpininkaujamus astmos fenotipus. Norint patikrinti šią hipotezę, pelėms, kurioms trūko IL-4, IL-13, IL-4Rα, IL-12Rβ2, STAT4 ir IFN-γ, buvo taikomas Th2 tipo alerginės astmos pelių modelis. Taip pat įvertinome aukšto IFN-γ lygio kvėpavimo takuose poveikį, naudodamiesi transgeniniu metodu.

Rezultatai

Alergenų sukeltos mechololino AHR ir plaučių uždegimo raiška IL-4 - / - ir IL-13 - / - pelėse

Įvertinti IL-4 ir IL-13 vaidmenį kuriant Th2 tipo astmos fenotipus, IL-4 - / -, IL-13 - / - ir su amžiumi suderintą laukinio tipo (WT) kontrolę (visi BALB / c pelės buvo tiriamos naudojant pelės Th2 astmos modelį. Metacholino AHR praėjus 24 valandoms po galutinio sąlyčio su alergenu, IL-13 - / - pelėse, kurios buvo jautrios intraperitoniškai su ovalbuminu (OVA) ir alumi, buvo žymiai mažesnis nei WT pelėse, kurios buvo jautriotos tokiu pat būdu, tuo tarpu jis buvo panašus. IL-4 - / - pelės ir WT pelės, jautrios OVA + alumi (1A pav.). Ląstelių tiriamumas bronchoalveolinio plovimo (BAL) skysčiuose praėjus 48 valandoms po galutinio alergenų vartojimo, parodė, kad IL-13 - / - pelėms, įjautrintoms OVA + alumi, nebuvo išsivystęs alergenų sukeliamas uždegimas, palyginti su WT pelėmis, kurios jautrios tuo pačiu būdas; atvirkščiai, pelėse, jautriose OVA + alavo pelėse, IL-4 - / - pelėse nebuvo sukurta tik eozinofilinė infiltracija, palyginti su tuo pačiu būdu įjautrintomis WT pelėmis (1 lentelė ir 1B paveikslas). Plaučių histologijos analizė parodė, kad peribronchiolariniai ir perivaskuliniai uždegiminių ląstelių įsiskverbimai buvo panašūs tarp pelių, jautrių PBS ir OVA + alavo, su IL-13 - / - pelėmis, nors šis fenotipas padidėjo IL-4 - / - arba WT kontrolinėse pelėse, jautrinamose su OVA + alaunas, palyginti su IL-4 - / - arba WT kontrolinėmis pelėmis, jautriomis atitinkamai PBS (1C pav.). Kalbant apie specifinių alergenų antikūnų gamybą (1D paveikslas), praėjus 48 valandoms po galutinio sąlyčio su alergenu, OVA specifinio IgE nebuvo rasta nei sensibilizuotų IL-4 - / -, nei IL-13 - / - serumuose. su OVA + alum. OVA specifinio IgG2a (Th1 atsako biologinis žymeklis) koncentracija kraujo serume buvo mažesnė IL-13 - / - pelėse, įjautrintose OVA + alavo, nei WT pelėse, jautriose tuo pačiu būdu, nors atitinkami lygiai nebuvo mažesni IL-4 - / - pelėse, jautriose OVA + alavo, palyginti su pastarąja grupe. Mes taip pat įvertinome Th1 ir Th2 pasroviuose esančių mediatorių gamybą praėjus 48 valandoms po galutinio sąlyčio su alergenu (1E pav.). TGF-β1 (pagrindinė pasroviui gauta Th2 citokinų molekulė) kiekis BAL skysčiuose buvo žymiai mažesnis tiek IL-4 - / -, tiek IL-13 - / - pelėse, kurios buvo jautrios OVA + alavo, nei WT. pelės, jautrios tuo pačiu būdu. Priešingai, IP-10 (pagrindinės Th1 pasroviui priklausančios molekulės) kiekis BAL skysčiuose buvo mažesnis pelėse, jautriose OVA + alavu, IL-13 - / - pelėse, nei jautriose IL-4 - / - ir WT pelėse. tuo pačiu būdu, o pastarųjų grupių IP-10 lygis buvo panašus. Visi šie duomenys leidžia manyti, kad AHR, neeozinofilinis plaučių uždegimas ir alergenams specifinis IgG2a gaminimas, sukeltas alergenų iššūkio sergant Th2 tipo astma, priklauso nuo IL-13 tarpininkavimo, bet ne nuo IL-4 tarpininkaujamo signalo.

Image

IL-13, bet ne IL-4, yra būtini Th2 tipo astmos fenotipams kurti. Įvertinimai ( n = 5 kiekvienoje grupėje) buvo atlikti po sąlyčio su alergenu. *, P <0, 05, palyginti su pelėmis, įjautrintomis PBS; **, P <0, 05, palyginti su kitomis grupėmis. (A) Metacholino AHR praėjus 24 valandoms po paskutinio IL-13 - / - (kairiojo skydelio), IL-4 - / - (dešiniojo skydo) ir atitinkamų WT kontrolinių pelių alergenų užkrėtimo. (B) BAL ląstelių judėjimas 48 val. Po paskutinio alergenų vartojimo. (C) Reprezentatyvi plaučių histologija praėjus 48 valandoms po paskutinio alergenų vartojimo (dažymas H&E, originalus padidinimas × 200). a, WT-PBS; b, WT_OVA / alunas; c, IL-4 - / - _PBS; d, IL-4 - / - _OVA / alaunas; e, IL-13 - / - _PBS; f, IL-13 - / - _OVA / alaunas. (D) OVA specifinio IgE (kairioji skydinė) ir IgG2a (dešinė skydinė) koncentracija kraujo serume išmatuota praėjus 48 valandoms po paskutinio alergenų vartojimo. (E) TGF-β1 ir IP-10 koncentracija BAL skysčiuose 48 valandas po paskutiniojo alergenų vartojimo.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

AHR ir patologiniai pokyčiai TG pelėse, kai per plaučius nukreipta per didelė IFN-γ ekspresija

Norint įvertinti in vivo IFN-γ poveikį plaučių patologijai, buvo įvertinti patologiniai pokyčiai TG (BALB / c) pelėms, nukreiptoms į plaučius sukeliamoms IFN-γ perraiškoms ir WT kontrolės (BALB / c) pelėms, prieš ir 7 dienos po doksiciklino turinčio vandens (dox) vartojimo. Metacholino AHR reikšmingai padidėjo IFN-γ TG (+) pelėms tiek prieš, tiek po 7 dienų po dokso, palyginti su WT pelėmis, patekusiomis nuo kraiko prieš gydymą doksu ir 7 dienas po jo (2A pav.). BAL ląstelių matavimai parodė, kad makrofagų, limfocitų ir neutrofilų, bet ne eozinofilų, infiltracija į IFN-γ TG (+) pelių 7 dienas po dokso gydymo buvo žymiai padidėjusi, palyginti su kitomis grupėmis, nors infiltracija šių ląstelių padidėjo IFN-γ TG (+) pelėse prieš gydymą doksu, palyginti su WT pelėmis (2B paveikslas). Plaučių histologija taip pat parodė, kad per 7 dienas po dokso IFN-γ TG (+) pelėse pastebimai padidėjo peribronchiolarinė ir perivaskulinė uždegiminių ląstelių infiltracija, palyginti su kitomis grupėmis; be to, abiejų IFN-γ TG (+) pelių prieš ir po 7 savaičių metu buvo nustatyti emfizematiniai parenchimos pokyčiai (3C pav.). Šie duomenys kartu leidžia manyti, kad per didelis IFN-γ ekspresija plaučiuose sukelia ne tik emfizemą, bet ir astmą, būdingą neeozinofiliniam potipiui.

Image

Transgeninė per didelė IFN-γ ekspresija kvėpavimo takuose sustiprino mecholino AHR ir neeozinofilinį plaučių uždegimą. Įvertinimai ( n = 8 kiekvienoje grupėje) buvo atlikti prieš ir po 7 dienų po doksiciklino turinčio vandens (dox) vartojimo. *, P <0, 05, palyginti su WT pelėmis, sergančiomis krauju; **, P <0, 05, palyginti su kitomis grupėmis. Metacholino AHR (A) ir BAL ląstelingumas (B) prieš ir praėjus 7 dienoms po dokso skyrimo IFN-γ TG pelėms ir jų WT kontrolės vadoms. C) Tipinė plaučių histologija (dažymas H&E, originalus padidinimas × 200). a, WT_no dox; b, IFN-γ (+) - nėra dokso; c, IFN-γ (+) _ dox 7 d.

Visas dydis

Image

IFN-γ vaidina svarbų vaidmenį kuriant AHR ir neeozinofilinį plaučių uždegimą, naudojant pelių Th2 tipo astmą. Visiems paveikslams buvo atliktas įvertinimas ( n = 5 kiekvienoje grupėje) po to, kai buvo paveiktas alergenas. *, P <0, 05, palyginti su pelėmis, įjautrintomis PBS; **, P <0, 05, palyginti su kitomis grupėmis. (A) Metacholino AHR IFN-γ - / - ir WT (BALB / c) pelėse 24 val. Po paskutinio alergenų užkrėtimo. (B) BAL ląstelių (kairysis skydelis) ir reprezentatyvi plaučių histologija pelėms IFN-γ - / - ir WT (BALB / c) pelėms praėjus 48 valandoms po paskutiniojo alergenų vartojimo. (H&E dažymas, originalus padidinimas × 400). a, WT_PBS; b, IFN-y - / - _PBS; c, WT_OVA / alaunas; d, IFN-γ - / - _OVA / alaunas. (C) BAL IP-10 (kairiajame skydelyje) ir TGF-β1 (dešiniajame skydelyje) lygiai IFN-γ - / - ir WT kontrolinėse pelėse 48 valandas po paskutinio alergenų vartojimo. (D) BAL IL-12 (kairiajame skydelyje) ir IL-13 (dešiniajame skydelyje) lygiai IFN-γ - / - ir WT kontrolinėse pelėse po 6 val. Po trijų raundų alergenu.

Visas dydis

IFN-γ vaidmuo kuriant alergenų sukeltus Th2 astmos fenotipus

Norint įvertinti IFN-γ vaidmenį išreiškiant astmos fenotipus, pelių Th2 tipo astma buvo pritaikyta IFN-γ - / - ir amžių atitinkančioms WT kontrolės (BALB / c) pelėms, vertinant jas po alergenų. Metacholino AHR praėjus 24 val. Po to, kai buvo paveiktas alergenas, IFN-γ - / - pelėse, jautriose OVA + alavo, buvo žymiai mažesnis nei tuo pačiu būdu įjautrintose WT pelėse (3A pav.). Įvertinus BAL ląstelių ir plaučių histologiją praėjus 48 valandoms po sąlyčio su alergenu, paaiškėjo, kad IFN-γ - / - pelėse, jautriose OVA + alavu, plaučių uždegimas buvo mažesnis nei WT pelėse, jautriose tuo pačiu būdu; visų pirma, palyginti su antrąja grupe, mažesnė uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija plaučiuose (1 lentelė ir 3B paveikslas). Kalbant apie Th1 ir Th2 paskesnių priešuždegiminių mediatorių gamybą praėjus 48 valandoms po to, kai buvo paveiktas alergenas, IFN-γ - / - pelėms, jautrioms OVA + alavo, bet ne WT pelėms, jautrioms WT pelėms, IP-10 gamyba sutriko. tuo pačiu būdu, tuo tarpu ankstesnėje grupėje buvo padidinta TGF-β1 gamyba, palyginti su antrąja grupe (3C pav.). Toliau įvertinome IFN-γ vaidmenį ankstyvoje citokinų gamyboje po to, kai buvo paveiktas alergenas. Taigi Th2 astmos modelis buvo pritaikytas IFN-γ - / - ir WT kontrolės (BALB / c) pelėms ir citokinų lygis buvo išmatuotas praėjus 6 val. Po trijų raundų alergenu. IL-12 ir IL-13 lygiai buvo panašūs IFN-γ - / - ir WT pelėms, įjautrintoms OVA + alumi (3D paveikslas). Nors IP-10 gamybą padidino jautrinimas OVA + alavu WT pelėms, IFN-γ - / - pelėms jis buvo visiškai sutrikdytas (duomenys nepateikti). Šie atradimai kartu leidžia manyti, kad alergenų sukeltas AHR ir uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija plaučiuose priklauso nuo IFN-ted tarpininkavimo, ir kad tiek IL-12, tiek IL-13 yra gaminami kaip IFN-γ priešakiniai citokinai, po to, kai yra paveiktas alergenas. Th2 tipo astmos modelyje.

Alergenų sukeltas AHR ir plaučių uždegimas, jei nėra IL-4Rα tarpininkaujamo signalo

Norint įvertinti IL-4Rα tarpininkaujamo signalizacijos vaidmenį ankstyvame citokinų gamyboje po to, kai buvo paveiktas alergenas, Th2 astmos modelis buvo pritaikytas IL-4Rα - / - ir WT kontrolės (BALB / c) pelėms, kurios buvo įvertintos praėjus 6 valandoms po alergenų iššūkis. IL-4Ra - / - pelėms, kurios jautrinamos OVA + alavu, IL-13 gamyba nebuvo visiškai panaikinta, palyginti su pelėmis, kurios jautrinamos tik PBS; be to, IL-4Ra - / - pelėse padidėjo sensibilizacijos su OVA + alumi sukelta IL-12 gamyba, palyginti su WT pelėmis; be to, BAL IFN-γ lygis buvo labiau padidintas IL-4Rα - / - pelėse, įjautrintose OVA + alavo, nei WT pelėse, jautriose OVA + alavo (4A pav.). Šie radiniai rodo, kad IFN-γ gamyba po sąlyčio su alergenu pagerėja, jei Th2 astmos modelyje nėra IL-4Rα tarpininkaujamų signalų.

Image

AHR ir neeozinofilinio plaučių uždegimo nepablogina tai, kad Th2 astmos modelyje nėra IL-4Rα sukeltų signalų. Įvertinimai ( n = 5 kiekvienoje grupėje) buvo atlikti du kartus po sąlyčio su alergenu. *, P <0, 05, palyginti su pelėmis, įjautrintomis PBS; **, P <0, 05, palyginti su kitomis grupėmis. (A) Citokinų lygis IL-4Rα - / - ir WT (BALB / c) pelių BAL skysčiuose 6 valandas po trijų raundų alergenu. (B) Metacholino AHR praėjus 24 valandoms po paskutinio užkrėtimo alergenu. (C) BAL ląstelių (kairysis skydelis) ir reprezentatyvi plaučių histologija (dešinė panelė) IL-4Rα - / - ir WT pelėms 48 valandas po galutinio alergenų užkrėtimo. (H&E dažymas, originalus padidinimas × 200). a, WT_PBS; b, IL-4Ra- / - _PBS; c, WT_OVA / alaunas; d, IL-4Ra- / - _OVA / alaunas. (D) TGF-β1 (viršutinis skydelis) ir IP-10 (apatinis skydas) lygiai 48 valandas po galutinio alergenų užkrėtimo.

Visas dydis

Taip pat įvertinome IL-4Rα tarpininkaujamo signalizacijos vaidmenį kuriant Th2 astmos fenotipus, astmos modelis buvo pritaikytas IL-4Rα - / - ir WT kontrolės (BALB / c) pelėms, o AHR ir uždegimas įvertinti 24 val. ir atitinkamai 48 val. po galutinio alergenų užkrėtimo. Lyginant su alergenų jautrumu padidėjęs metacholino AHR nepakito IL-4Rα - / - pelėse, palyginti su WT pelėmis (4B paveikslas). Be to, BAL ląstelių ir plaučių histologija parodė, kad OVA + alumi jautriose pelėse IL-4Rα - / - pelėms buvo sutrikdyta tik eozinofilinė infiltracija, palyginti su WT pelėmis, jautriomis tuo pačiu būdu, nors uždegiminių ląstelių infiltracija plaučiuose išskyrus eozinofilus, buvo panašūs į šias dvi grupes (1 lentelė ir 4C paveikslas). Kalbant apie Th1 ir Th2 pasroviuose esančių mediatorių gamybą, TGF-β1 gamyba buvo visiškai sutrikusi pelėse, jautriose OVA + aliu, IL-4Rα - / -, palyginti su WT pelėmis, kurios jautriotos tokiu pat būdu; tačiau ankstesnėje grupėje padidėjo IP-10 gamyba, palyginti su antrąja grupe (4D paveikslas). Visi šie duomenys leidžia manyti, kad AHR ir neeozinofilinis uždegimas nepriklauso nuo IL-4Rα sukelto signalizacijos, tuo tarpu eozinofilų infiltracija plaučiuose priklauso nuo šio signalo.

IL-12Rβ2 tarpininkaujamų signalų vaidmuo kuriant alergenų sukeltą AHR ir plaučių uždegimą

Norint įvertinti IL-12R tarpininkaujamo signalizacijos vaidmenį kuriant Th2 astmos fenotipus, Th2 astmos pelių modelis buvo pritaikytas IL-12Rβ2 - / - ir amžiaus grupių WT kontrolės (C57BL / 6) pelėms. Mehacholino AHR praėjus 24 val. Po galutinio alergenų užkrėtimo buvo sutrikusi pelių, jautriotų OVA + alavo, IL-12Rβ2 - / - pelėmis, palyginti su WT pelių, jautriotų tokiu pat būdu (5A pav.). Be to, 48 valandas po alergenų vartojimo įvertinus BAL ląstelių ir plaučių histologiją, paaiškėjo, kad buvusioje grupėje, palyginti su antrąja grupe, sutriko makrofagų ir neutrofilų, bet ne eozinofilų, infiltracija plaučiuose (1 lentelė ir 5B paveikslas). Šiuos astmos fenotipų pokyčius lydėjo sumažėjęs IP-10 gamyba, bet ne TGF-β1 gamyba (5C pav.). Mes taip pat įvertinome IL-12Rβ2 tarpininkaujamo signalizacijos vaidmenį gaminant IFN-γ po sąlyčio su alergenu. Mes nustatėme, kad IFN-γ gaminančių CD4 + ir CD8 + T ląstelių infiltracija plaučiuose praėjus 6 valandoms po sąlyčio su alergenu buvo sutrikus pelėms, jautrioms OVA + alavo, palyginti su WT pelėmis, jautrinamomis OVA + alavo ( 5D pav.). Panašiai, palyginti su antrąja grupe, buvo sutrikdyta IFN-γ pasroviui tarpininko IP-10 gamyba, tuo tarpu IL-12 ir IL-13 gamybos lygis šiose dviejose grupėse nebuvo sutrikdytas (5E pav. ). Šie atradimai kartu leidžia manyti, kad IL-12Rβ2 tarpininkaujama signalizacija yra svarbi AHR vystymuisi ir uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracijai į plaučius, ir kad IFN-γ raiška po alergenų poveikio daugiausia priklauso nuo IL-12Rβ2 tarpininkaujamo signalo.

Image

AHR ir neeozinofilinių plaučių uždegimų sutrikdo tai, kad Th2 astmos modelyje nėra IL-12Rβ2 tarpininkaujamų signalų. Įvertinimai ( n = 5 kiekvienoje grupėje) buvo atlikti du kartus po sąlyčio su alergenu. *, P <0, 05, palyginti su pelėmis, įjautrintomis PBS; **, P <0, 05, palyginti su kitomis grupėmis. (A) IL-12Rβ2 - / - ir WT (C57BL / 6) pelių metacholino AHR praėjus 24 valandoms po paskutinio sąlyčio su alergenu. (B) BAL ląstelių judėjimas (kairiajame skydelyje) ir tipiška plaučių histologija praėjus 48 valandoms po galutinio alergenų užkrėtimo. (H&E dažymas, originalus padidinimas × 200). a, WT_PBS; b, IL-12Rβ2- / - _PBS; c, WT_OVA / alaunas; d, IL-12Rβ2 - / - _OVA / alaunas. (C) IP-10 (kairiajame skydelyje) ir TGF-β1 (dešiniajame skydelyje) lygiai IL-12Rβ2 - / - ir WT pelių BAL skysčiuose 6 valandas po trijų raundų alergenu. (D) IFN-γ gaminančios CD4 + ir CD8 + T ląstelės IL-12Rβ2 - / - ir WT pelėse 6 valandas po trijų raundų alergenu. (E) IP-10 (kairiajame skydelyje), IL-12 (vidurinis skydelis) ir TGF-β1 (dešiniajame skydelyje) lygiai pelėse IL-12Rβ2 - / - ir WT 48 valandas po galutinio alergenų užkrėtimo.

Visas dydis

STAT4 signalizacijos vaidmuo kuriant Th2 astmos fenotipus

Atsižvelgiant į įrodymus, kad IL-12 reguliuoja IFN-γ gamybą daugiausia per STAT4 signalizacijos kelią (Szabo ir kt., 2003), įvertinome STAT4 signalizacijos kelio vaidmenį kuriant Th2 astmos fenotipus. Taigi, pelių astmos modelis buvo pritaikytas STAT4 - / - ir amžiaus grupėms pritaikytoms WT kontrolės (BALB / c) pelėms. Mes nustatėme, kad mechacholino AHR praėjus 24 val. Po galutinio alergenų užkrėtimo buvo sutrikus STAT4 - / - pelėms, įjautrintoms OVA + alavo, palyginti su WT pelėms, įjautrintoms OVA + alavo (6A pav.). Be to, įvertinus BAL ląstelių ir plaučių histologiją praėjus 48 valandoms po sąlyčio su alergenu, nustatyta, kad ankstesnėje grupėje, palyginti su antrąja grupe, buvo pažeista uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija plaučiuose (1 lentelė ir 6B paveikslas). Kalbant apie IL-13 ir jo paskesnių mediatorių gamybą, kai nėra STAT4 sąlygoto signalizacijos, IL-13 ir TGF-β1 produkcijos lygiai, įvertinti 48 valandas po alergenų užkrėtimo, buvo panašūs STAT4 - / - ir WT kontrolei. pelės, jautrios OVA + alavo pavidalu (6C pav.). Be to, IL-12 gamybos lygis šiose dviejose grupėse buvo panašus (6D paveikslas). Tačiau IFN-γ gaminančių CD11b + ląstelių infiltracija plaučiuose, kuri buvo įvertinta 48 valandas po sąlyčio su alergenu, nepaaugino alergenų sensibilizacijos STAT4 - / - pelėse, nors WT pelėms ji buvo sustiprinta (6E pav.). Visi šie duomenys rodo, kad STAT4 tarpininkaujama signalizacija yra svarbi IL-12 sukelto IFN-γ gamyboje, taip pat vėlesniam AHR vystymuisi ir plaučių infiltracijai uždegiminėse ląstelėse, išskyrus eozinofilus.

Image

STAT4 tarpininkaujama signalizacija vaidina svarbų vaidmenį kuriant AHR ir neeozinofilinį uždegimą Th2 astmos modelyje. Įvertinimai (n = 5 kiekvienoje grupėje) buvo atlikti du kartus, 48 ​​valandas po galutinio sąlyčio su alergenu. *, P <0, 05, palyginti su pelėmis, įjautrintomis PBS; **, P <0, 05, palyginti su kitomis grupėmis; ***, P <0, 05, palyginti su WT_PBS grupe. Metacholino AHR (A) ir BAL ląstelingumas (B) STAT4 - / - ir WT (BALB / c) pelėse. (H&E dažymas, originalus padidinimas × 100). a, WT_PBS; b, STAT4 - / - _PBS; c, WT_OVA / alaunas; d, STAT4 - / - _OVA / alaunas. (C) IL-13 (viršutinis kairysis skydelis), TGF-β1 (viršutinis dešinysis skydas) ir IL-12 (apatinis skydas) lygiai STAT4 - / - ir WT kontrolinėse pelėse. (D) IFN-γ gaminančios CD11b + ląstelės STAT4 - / - ir WT kontrolinių pelių plaučiuose.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime, naudojant pelių Th2 tipo astmos modelį, mes sutelkėme dėmesį į pasroviuose esančius molekulinius mechanizmus, skirtus AHR ir plaučių uždegimui išsivystyti, ir parodėme, kad alergenų sukeltas AHR ir uždegimas yra visiškai priklausomi nuo IL-13, tuo tarpu tik plaučių infiltracija eozinofilai priklauso nuo IL-4 ir IL-4Rα tarpininkavimo. Šie duomenys rodo, kad AHR ir uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija vyksta tarp IL-13 ir jo receptorių (-ų), išskyrus IL-4 ir IL-4Rα ašį.

AHR yra kardinalus astmos požymis, o mecholinas AHR iššūkis dažnai naudojamas nustatant astmos diagnozę, kai egzistuoja klinikinis netikrumas (Pueringer ir Hunninghake, 1992; Weinberger, 1993; Whyte ir kt., 1993). Kalbant apie galimus AHR raiškos veiksnius, AHR gali būti nustatomas sustiprinant kai kuriuos fenotipus, pvz., Padidėjus miofibroblastų ar lygiųjų raumenų ląstelių hiperplazijai ir susilpnėjimui, ir slopinant kitus fenotipus, pvz., Subepithelialinę ir plaučių parenchiminę fibrozę (Hargreave et al. 1986). Visuotinai pripažįstama, kad AHR gali būti susijęs su uždegimu, atsirandančiu astminiuose kvėpavimo takuose (Weinberger, 1993), nors mechanizmai, kuriais astminis uždegimas sukelia AHR, yra mažai suprantami. Cohn ir kt. parodė, kad in vitro poliarizuotos ir pasyviai perkeltos Th2 ląstelės sukelia AHR kitokiais naiviais gyvūnais per IL-4 nepriklausomą kelią (Cohn ir kt., 1998). Hogan ir kt. taip pat parodė, kad AHR, pastebėtas pelėms, kurioms netaikomas alergenas, tarpininkauja per IL-4- ir IL-5 nepriklausomą aktyvacijos kelią (Hogan ir kt., 1998). Kalbant apie Th2 citokinų paskesnius mediatorius, į plaučius nukreiptos IL-4 TG ir IL-13 TG pelės išsivysto subepithelial ir plaučių parenhiminės fibrozės, daugiausia TGFβ1 priklausomais keliais (Rankin et al., 1996; Lee et al., 2001). . TGFβ1 yra pagrindinis žaizdų gijimo ir fenotipinio perėjimo nuo fibroblastų prie miofibroblastų dalyvis (Morishima ir kt., 2001). Manoma, kad miofibroblastai dalyvauja plaučių fibrozėje sergant astma ir gali būti aktyvesni gaminant kolageną nei ramūs fibroblastai (Vignola et al., 1997). Įdomu tai, kad ankstesni mūsų tyrimai rodo, kad per didelis TGF-β1 ekspresija kvėpavimo takuose slopina AHR, o tai susiję su plaučių fibroze, kurią sukelia didelis TGF-β1 kiekis kvėpavimo takuose (Jeon et al., 2007a). Šiame tyrime parodyta, kad eozinofilinė infiltracija priklauso nuo IL-4- ir IL-4Rα tarpininkavimo, susijusio su TGF-β1 gamyba; tačiau AHR ir uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija plaučiuose nepriklauso nuo šio signalo. Šie duomenys rodo, kad eozinofilinis uždegimas nėra būtinas kuriant AHR ir kad IL-13 tarpininkaujamas AHR yra susijęs su uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija plaučiuose per signalizaciją, kurią perduoda ne IL-4Rα, o kelias (-ai). TGF-β1.

Anksčiau gauti įrodymai rodo, kad IFN-γ slopina alergenų sukeltą eozinofilų pritraukimą į pelių plaučių audinius ir yra stiprus TGF-β1 biologinio poveikio inhibitorius (Iwamoto ir kt., 1993). Ankstesniame tyrime mes parodėme, kad jautrinimas kvėpavimo takuose su LPS turinčiais alergenais sukelia neeozinofilinius astmos fenotipus, kurie iš dalies priklauso nuo IFN-γ (Kim ir kt., 2007). Be to, jautrinimas kvėpavimo takuose su alergenu ir dviguba (ds) RNR taip pat sukelia neeozinofilinius astmos fenotipus, kurie priklauso nuo IFN-γ (Jeon et al., 2007b). Šis tyrimas rodo, kad per didelis IFN-γ ekspresija kvėpavimo takuose taip pat sukelia neeozinofilinį uždegimą ir emfizematinius pokyčius, kuriuos lydi sustiprėjęs AHR ir minimali plaučių fibrozė. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad IFN-γ buvo paskesnis IL-13 tarpininkas, bet ne IL-4- ar IL-4Rα tarpininkaujamas signalizavimas pelių Th2 astmos modelyje. Be to, IL-13 tarpininkaujama AHR ir uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija plaučiuose buvo susijusi su IFN-media tarpininkavimu. Šie radiniai kelia galimybę, kad IL-13 sukelia neeozofilinius astmos fenotipus per IFN-γ tarpininkaujamą poveikį.

IL-12, kurį gamina antigenus pristatančios ląstelės, yra svarbus Th1 ląstelių vystymosi reguliatorius (Gavett et al., 1995; Wills-Karp, 1999; Neurath ir kt., 2002). Ankstesniame tyrime mes parodėme, kad neeozinofilinių astmos fenotipų, kuriuos sukelia LPS turintys alergenai, tarpininkauja IL-12-STAT4-IFN-γ ašis (Kim et al., 2007). Ankstesni tyrimai taip pat parodė, kad IL-12 gamyba padidėja IL-13Rα2 - / - pelių audinių makrofaguose, palyginti su WT pelėmis (Wood et al., 2003). Mūsų atliktas tyrimas atskleidžia, kad IL-12Rβ2 - / - ir STAT4 - / - pelėms A2 ir uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija yra sutrikusi Th2 tipo astmos modelyje, palyginti su WT pelėmis. Šie duomenys rodo, kad AHR ir uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracija plaučiuose, išskyrus IL-13 sukeltus, priklauso nuo IL-12-IL-12Rβ2-STAT4 tarpininkavimo ir kad IL-13 gali paskatinti IL-12 susidarymą antigene. pateikiančios ląsteles, galbūt per IL-13Rα2 tarpinę signalizaciją.

Atsižvelgdami į ankstesnius ir dabartinius duomenis, mes siūlome IL-13 tarpininkaujamų Th2 astmos fenotipų patofiziologijos modelį, kaip parodyta 7 paveiksle. Įkvėpus alergenus, kvėpavimo takų dendritinės ląstelės (DC) pateikia alergenus į efektorinės atminties Th2 ląsteles., kurie gamina Th2 citokinus, įskaitant IL-4 ir IL-13. Šie citokinai sukelia infiltraciją į uždegiminių ląstelių, įskaitant eozinofilus (plaučių uždegimas), plaučius, veikdami Th2 chemokinus. Įdarbinti makrofagai (M2 fenotipas) ir eozinofilai sukuria TGF-β, kuris sukelia plaučių fibrozę ir vėliau slopina kvėpavimo takų hiperreaktyvumą. IL-13 taip pat skatina IL-12 gamybą iš DC, galbūt per IL-13Rα2 tarpininkaujant signalizacijai, ypač tais atvejais, kai nėra IL-4Rα tarpininkaujamos signalizacijos. IFN-γ, pagamintas iš efektorinių Th1 ląstelių per IL-12-STAT4-IFN-γ ašį, sukelia Th1 chemokinų poveikį uždegiminių ląstelių, išskyrus eozinofilus, infiltracijai (neeozinofilinis uždegimas). Įdarbinti makrofagai (M1 fenotipas) gamina mediatorius, kurie slopina TGF-β biologinį aktyvumą ir taip sustiprina AHR.

Image

Th2 tipo astmos fenotipų vystymosi hipotetinė schema. Įkvėpus alergenų, kvėpavimo takų dendritinėse ląstelėse (DC) yra alergenų efektorinėms Th2 ląstelėms, kurios gamina citokinus, tokius kaip IL-4 ir IL-13 (A). Šie citokinai sukelia uždegiminių ląstelių, įskaitant eozinofilus (eozinofilinį uždegimą), infiltraciją plaučiuose, veikdami chemokinus (B). Įdarbinti makrofagai (M2 fenotipas) ir eozinofilai sukuria TGF-β, kuris sukelia plaučių fibrozę ir slopina kvėpavimo takų hiperreaktyvumą (C). IL-13 taip pat skatina IL-12 gamybą iš DC, galbūt per IL-13Rα2 tarpininkaujant signalizacijai, o efektorinės Th1 ląstelės yra generuojamos per IL-12-IL-12Rβ2-STAT4 tarpininkaujamą kelią (D). IF1-γ, kurį gamina efektorinės Th1 ląstelės, chemokinų veikimu (E) sukelia kitų nei eozinofilų uždegiminių ląstelių infiltraciją plaučiuose (neeozinofilinis uždegimas). Įdarbinti makrofagai (M1 fenotipas) gamina mediatorius, kurie slopina TGF-β veikimą, o tai padidina kvėpavimo takų hiperreaktyvumą (F).

Visas dydis

Metodai

Pelės

Į plaučius nukreiptos IFN-γ TG pelės ir jų kontrolinės WT kontrolinės pelės BALB / c fone buvo generuojamos, kaip aprašyta anksčiau (Wang ir kt., 2000), ir laikomos Jeilio universiteto medicinos mokyklos gyvūnų skyriuje. IL-13 - / - pelės BALB / c fone buvo generuojamos Andrew McKenzie laboratorijoje, kaip aprašyta anksčiau (McKenzie et al., 1998). IFN-γ - / - (BALB / c fonas), IL-12Rβ2 - / - (C57BL / 6), STAT4 - / - (BALB / c), IL-4 - / - (BALB / c), IL- 4Rα - / - (BALB / c) ir WT kontrolės (C57BL / 6 ir BALB / c fonai) pelės buvo įsigytos iš „Jackson Laboratories“ („Bar Harbor“). Šios pelės buvo veisiamos patogenų neturinčiose patalpose Pohango universiteto mokslo ir technologijos (POSTECH) ir Jeilio universiteto medicinos mokykloje. Visus metodus ir protokolus, susijusius su pelėmis, patvirtino POSTECH ir Jeilio universiteto medicinos mokyklos Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

Th2 tipo alerginės astmos pelių modelis

Kaip alergenas buvo paruoštas LPS ardomas OVA (Sigma-Aldrich), kaip buvo aprašyta anksčiau (Eisenbarth et al., 2002). Th2 tipo pelių, sergančių astma, modelio generacija buvo aprašyta anksčiau (Jeon et al., 2007a). Trumpai tariant, 6 savaičių pelės buvo jautrios 0 ir 7 dienomis įšvirkštus į pilvaplėvės ertmę 75 µg OVA ir 2 mg aliuminio hidroksido (Sigma-Aldrich) arba PBS. Vėliau šioms pelėms buvo užkrėstos intranazalinės 50 µg OVA dozės. 14, 15, 21 ir 22. Metacholino AHR ir plaučių uždegimo įvertinimai buvo atlikti atitinkamai praėjus 24 ir 48 valandoms po galutinio alergenų vartojimo. T-ląstelių atsakai buvo įvertinti praėjus 6 val. Po alergenų užkrėtimo 21 dieną.

Mehacholino AHR ir plaučių uždegimo vertinimas

Kaip buvo aprašyta anksčiau, sąmoningų, nevaržomų pelių plaučių funkcijos tyrimas buvo atliktas naudojant neinvazinę viso kūno pletismografiją (Allmedicus) (Jeon ir kt., 2007a). Plaučių ir BAL mėginiai buvo gauti kaip aprašyta anksčiau (Jeon et al., 2007a). Bendras uždegiminių ląstelių skaičius buvo įvertintas praskiedus ląstelių granules 50 µl PBS. Po difuziškai greito BAL granulių dažymo (Dade Behring) citospino preparatuose uždegiminės ląstelės (makrofagai, limfocitai, neutrofilai ar eozinofilai) buvo klasifikuojamos suskaičiavus 300 ląstelių. Plaučiai per dešinįjį skilvelį buvo perfuzuojami šaltu PBS, kol plaučių kraujagyslės buvo švarios. Visas plautis buvo pripūstas histologiniais fiksatoriais. Plaučių sekcijų dažymas hematoksilinu ir eozinu (H&E) atliktas po slėgio fiksavimo Streck tirpalu (Streck Laboratories). Tas pats padidinimas buvo naudojamas žiūrint mėginių skaidres po mikroskopu, kad būtų galima palyginti.

FACS analizė ir tarpląstelinis citokinų dažymas

Ląstelių paviršiaus žymeklio analizei buvo paruoštos vienos ląstelės suspensijos iš plaučių, kaip aprašyta anksčiau (Kim ir kt., 2007). Trumpai tariant, ląstelės, išskirtos iš plaučių audinio (4x106 / ml), buvo inkubuotos 48 šulinėlių plokštelėse, padengtose anti-CD3 ir anti-CD28 antikūnais (po 1 µg / ml; kiekviena „eBioscience“, San Diegas, CA), esant 37 ° C temperatūrai. ℃ 6 valandas, o po to 2 valandas vėl imituojamas brefeldinu A (10 µg / ml). Ląstelės buvo dažytos paviršiaus specifiniais antikūnais (anti-CD3-APC, anti-CD4-FITC, anti-CD8-PE-Cy5 ir anti-CD11b-FITC; BD Biosciences) 30 minučių 4 ° C temperatūroje, tada fiksuotos 10 min kambario temperatūroje 4% paraformaldehide. Ląstelės buvo inkubuojamos su anti-IFN-γ-PE (BD Biosciences) 30 minučių kambario temperatūroje ir analizuojamos FACScalibur srauto citometru (BD Biosciences), naudojant „CellQuest“ programinę įrangą.

Antikūnų kiekis serume

Serumo OVA specifiniai IgG2a ir IgE lygiai buvo nustatyti taip, kaip aprašyta anksčiau (Kim ir kt., 2007). Trumpai tariant, ELISA plokštelės, padengtos OVA (10 μg / ml karbonato-bikarbonato buferyje; Sigma-Aldrich), buvo inkubuojamos per naktį kambario temperatūroje. Tinkamai praskiesti serumo mėginiai 2 valandas buvo inkubuojami kambario temperatūroje plokštelėse, užkimštuose 3% liesu pienu (Sigma-Aldrich). Pridedami biotinilinti anti-pelių IgE ir IgG2a antikūnai (BD Biosciences), ir plokštelės buvo inkubuojamos 2 valandas kambario temperatūroje. Pridedama streptavidino-krienų peroksidazės (BD Biosciences) ir substrato žingsnis buvo atliktas pagal gamintojo instrukcijas (BD Biosciences).

Citokinų kiekių nustatymas BAL skysčiuose

IFN-γ, IP-10, IL-12, TGF-β1 ir IL-13 lygiai BAL skysčiuose buvo išmatuoti ELISA metodu, vadovaujantis gamintojo instrukcijomis (R&D Systems).

Statistinė analizė

Reikšmingi gydymo skirtumai buvo įvertinti naudojant Studento t- testą, ANOVA arba Wilcoxon rango sumų testą. Keliems palyginimams iš pradžių buvo naudojama ANOVA, o radus reikšmingų skirtumų, buvo atlikti atskiri t -testai arba Wilcoxon rango sumų testai grupių poroms.

Žodynas

AHR

kvėpavimo takų hiperreaktyvumas

BAL

bronchoalveolinis plovimas

Doksas

doksiciklino turintis vanduo

LPS

lipopolisaharidas

OVA

ovalbuminas

TG

transgeninis

WT

laukinis tipas