Il-6 tarpininkavimas dėl netinkamo th1 diferenciacijos aplinkos sutrumpina priešnavikinius imuninius atsakus senatvėje | gamtos komunikacijos

Il-6 tarpininkavimas dėl netinkamo th1 diferenciacijos aplinkos sutrumpina priešnavikinius imuninius atsakus senatvėje | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Vėžio imunoterapija
  • Geriatrija
  • Interleukinai
  • T-helper 1 ląstelės

Anotacija

Imuniteto funkcijos sumažėjimas ir uždegimas kartu su senėjimu vystosi. Čia sutelkiame dėmesį į šios uždegiminės aplinkos įtaką T ląstelėms ir parodome, kad, priešingai nei sėkmingai pašalinant auglį jaunoms pelėms, navikams būdingų CD4 + T ląstelių papildymas nesukelia auglių regresijos seniems šeimininkams. Sutrikusį priešnavikinį CD4 + T ląstelių poveikį, turintį trūkumų turinčią Th1 diferenciaciją senatvės aplinkoje, atstato interleukino (IL) -6 blokada arba IL-6 trūkumas. IL-6 blokada taip pat atstato susilpnėjusį CD4 + T ląstelių sugebėjimą skatinti nuo CD8 + T-ląstelių priklausomą naviko pašalinimą senosioms pelėms, tam reikia IFN-γ. Be to, dėl sutrikusios Th1 diferenciacijos yra stimuliuojama IL-6 / IL-21 gamyba naudojant c-Maf indukciją. IL-6 taip pat prisideda prie IL-10 gaminimo iš senų pelių CD4 + T ląstelių, sukeldamas susilpnėjusias CD8 + T ląstelių reakcijas. Šie duomenys rodo, kad IL-6 yra išorinis faktorius, neutralizuojantis CD4 + T-ląstelių tarpininkaujamą imunitetą prieš naviką senatvėje.

Įvadas

Vis labiau vertinamas navikams būdingų T ląstelių medijuoto vėžio imunoterapijos naudingumas. Ilgą laiką terapiniame poveikyje pagrindinis dėmesys buvo skiriamas priešnavikinėms CD8 + T ląstelių reakcijoms. Šiuo metu kaupiami įrodymai rodo, kad aktyvi imunoterapija, sukelianti navikui specifines CD4 + T ląsteles, taip pat yra potencialiai galinga ir plačiai taikoma naviko atmetimui 1, 2, 3, 4 . CD4 + T ląstelės pašalina naviką, nes padeda suaktyvinti kitus imuninius komponentus, tokius kaip CD8 + T ląstelės, natūralios žudikiškos ląstelės ir 1, 5, 6 makrofagai, pasižymi tiesioginiu citotoksiškumu prieš navikines 3 ląsteles ir pritraukia naviko ląsteles į 4 senėjimą. Interferoną (IFN) gaminančių T helpero (Th) 1 ląstelių padidėjimas buvo pripažintas priešvėžiniu imuniniu signalu vėžiu sergantiems pacientams 5, 7, nes palanki prognozė yra glaudžiai susijusi su didele su Th1 susijusių genų, Ifng ir „Tbx21“ („T-bet“) 5 . Pacientams, sergantiems progresavusiu vėžiu 7 ir vyresniems nei 8, 9, daugiausia Th2, o ne Th1 ląstelių yra daugiausia. Todėl manoma, kad efektyviam vėžio imunoterapijai būtų naudingos augliui specifinių Th1 ląstelių aktyvavimo strategijos.

Imuniteto metodai yra mažiau toksiški nei chemoterapija ar radioterapija. Žvelgiant iš šios perspektyvos, imunoterapija gali būti tinkama vyresniems vėžiu sergantiems pacientams. Tačiau senstant imuninė reakcija susilpnėja. Su amžiumi susiję defektai, įskaitant santykinai mažą senų T ląstelių skaičių ir disfunkciją, atrodo, kad ne tik padidina vėžio dažnį vėlesniame gyvenime, bet ir sumažina imunoterapijos efektyvumą, kad būtų padidintos T ląstelių reakcijos į vėžį, o tai lemia didelį pagyvenusių žmonių sergamumas ir mirtingumas 10 . Mūsų ir kiti tyrimai parodė, kad CD4 + T ląstelių funkcijas labai keičia senėjimo procesas 11, 12, 13 . Mažesnis CD4 + T-ląstelių sukelto imuninio atsako efektyvumas senatvėje gali būti susijęs su keliais mechanizmais, įskaitant T-ląstelių vidinį 11, 12, 13 ir išorinį poveikį 14 . Tačiau su amžiumi susijusių pokyčių, susijusių su CD4 + T-ląstelių sukeltu imuniniu atsaku, įtaka imuninės vėžio terapijos veiksmingumui yra neaiški, nes daug mūsų supratimo apie priešvėžinį imunoterapijos pagrindą sudaro tyrimai su jaunais gyvūnais. Norint suprojektuoti veiksmingas imunoterapines intervencijas, specialiai pritaikytas vyresniems vėžiu sergantiems pacientams, svarbu žinoti, kodėl senatvėje susilpnėja T-ląstelių funkcijos ir kaip sustiprinti senyvo amžiaus imuninę sistemą.

Buvo manoma, kad lėtinis žemo laipsnio uždegimas, lydimas senėjimo, vaidina tam tikrų ligų, įskaitant vėžį, patogenezėje, įskaitant vėžį 10, 15, 16, 17 . Pavyzdžiui, padidėjęs priešuždegiminis citokinų interleukino (IL) -6 lygis koreliuoja su trapumu šiems pacientams 15, 18 . Be to, įvairūs tyrimai atskleidė, kad IL-6 yra vienas iš neigiamų vėžio progresavimo prognostinių veiksnių ir turi naviką skatinantį poveikį 19 . Tačiau per mažai IL-6 lygio įtakai T-ląstelių sukeltiems priešnavikiniams atsakams senatvėje buvo skiriama mažai dėmesio.

Šiame tyrime mes paklausėme, ar CD4 + T-ląstelių disfunkcija senyvo amžiaus šeimininkams galėtų būti panaikinta, jei būtų papildytos jaunomis navikui būdingomis CD4 + T ląstelėmis. Tačiau jaunoms navikams būdingoms CD4 + T ląstelėms, kurios buvo paruoštos pagyvenusioms pelėms, nesukurtas apsauginis imuninis atsakas prieš naviką. Taigi, mes sutelkėme dėmesį į pakitusią senų gyvūnų citokinų aplinką ir įvertinome IL-6, kurio, kaip nustatyta, gausiai tarp pagyvenusių pelių ir žmonių, įtaką blogam CD4 + T-ląstelių tarpininkaujamam priešvėžiniam atsakui. Nors IL-6 nesumažino ir neskatino in vivo CD4 + T ląstelių išsiplėtimo reaguojant į vakcinaciją, su amžiumi susijęs IL-6 padidėjimas slopino CD4 + T ląstelių diferenciaciją Th1 ir vėlesnį navikui būdingų CD8 + T ląstelių indukciją, ir taip paskatino vėžio progresavimą vyresnėms pelėms. Mūsų išvados taip pat rodo, kad IL-6 sukeltas c-Maf / IL-4 / IL-21 / IL-10 ašis yra mechaninis CD4 + T ląstelių sąlyčio su aplinka požymis.

Rezultatai

CD4 + T-ląstelių terapija yra mažiau veiksminga senyvo amžiaus pelėms

Mes ištyrėme CD4 + T-ląstelių tarpininkavimo priešnavikinių vakcinacijų poveikį, naudojant MCA205 naviko ląsteles, ekspresuojančias ovalbuminą (OVA) kaip surogatinį antigeną (toliau - MCA-OVA). Kaip anksčiau buvo pranešta vėžiu sergantiems pacientams 10, navikų masė augo lėčiau nei jaunoms pelėms (1a pav., Kairėje). Jaunų pelių auglių augimas buvo užkirstas kelią skiepijant OVA peptidu, kurį atpažino didžiojo histokompatibilumo komplekso (MHC) II klasės ribojamos CD4 + T ląstelės (vadinamos OVA-IIp). Priešingai, paskiepytos pelės auglių nepašalino (1a pav., Dešinėje). Tai gali būti dėl sumažėjusio senstamų CD4 + T ląstelių skaičiaus ir vidinio jų gebėjimo plėstis trūkumo, reaguojant į antigeninę stimuliaciją 11, 12, 13 .

Image

( a ) Jaunos ir pagyvenusios pelės buvo vakcinuojamos su IFA emulguotu OVA-IIp arba be jo. Po septynių dienų po imunizacijos pelės buvo pasėtos MCA-OVA. ( b ) CD45.1 + jaunos naivios OT-II T ląstelės buvo perkeltos į jaunas ar senas CD45.2 + peles. Po to pelės buvo imunizuotos perduodant DC, impulsinius su arba be OVA-IIp. Tada buvo atlikta auglio inokuliacija. Kiekviena eilutė parodo atskiros pelės naviko augimo kinetiką ( n = 4–12 pelių kiekvienoje grupėje). * P <0, 05, *** P <0, 001, nesuporuotas Studentų t- testas. c ) IL-6 (viršutinė) ir sIL-6R (apatinė) kiekiai 3-, 6-, 18 ar 24 mėnesių amžiaus pelių serumuose. Kontrolinė arba anti-Gr-1 Ab buvo suleista 5 dienas prieš serumo derlių. Kiekvienas taškas žymi atskirą pelę. ( d ) OT-II ląstelių perkėlimas ir imunizavimas buvo atlikti, kaip aprašyta b punkte . Pelės buvo gydomos kontroliniu arba anti-IL-6 Ab 1 ir 1 dieną. Šešios dienos po imunizacijos buvo sušvirkštos MCA-OVA. Parodyti reprezentatyvūs trijų nepriklausomų eksperimentų su panašiais rezultatais duomenys ( n = 6–8 pelės kiekvienoje grupėje). * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, dispersijos analizė ir Tukey post-hoc testas. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Todėl mes paklausėme, ar jaunų OT-II ląstelių perkėlimas ir imunizavimas OVA-IIp impulsinėmis jaunomis dendritinėmis ląstelėmis (DC) pašalina šiuos amžiaus pelių trūkumus. Kai buvo inokuliuoti MCA-OVA, OT-II ląstelių perdavimas buvo ypač efektyvus atmetant auglį jauniems šeimininkams, tačiau senatvinėms pelėms turėjo mažai terapinio poveikio (1b pav.). Šie rezultatai leidžia manyti, kad priešvėžiniai imuniniai atsakai, kuriuos sukelia navikui būdingos CD4 + T ląstelės, yra susilpnėję pagyvenusioms pelėms, ir kad su amžiumi susijusi disfunkcija CD4 + T ląstelėse in vivo iš dalies atsiranda dėl išorinių veiksnių, supančių CD4 + T ląsteles. amžiaus šeimininkai.

IL-6 slopina CD4 sukeltą priešnavikinį imunitetą

Kaip anksčiau buvo pranešta 18 metų žmonėms, IL-6 lygis serume padidėjo senstant (1c pav.). Senstant, ne tik IL-6, bet ir tirpaus IL-6 receptoriaus (sIL-6R), kuris sudaro kompleksą su IL-6 ir skatina pernešti tarpląstelinį signalą per glikoproteiną 130 (nuoroda 20), lygis. . Norėdami nustatyti, ar cirkuliuojantis IL-6 daro įtaką CD4 + T ląstelių gebėjimui kontroliuoti navikus, mes panaudojome IL-6 blokadą kartu su OT-II ląstelių perdavimu. Po to, kai buvo paveiktas navikas, jaunų pelių MCA-OVA augimas buvo šiek tiek greitesnis nei senų pelių, gavusių kontrolinį antikūną (Ab) atskirai (1d pav., Kairėje). Jauniems šeimininkams buvo pastebimas naviko išnaikinimas, neatsižvelgiant į IL-6 blokadą, kai donoro CD4 + T ląstelės buvo nugruntuotos peptido impulsinėmis DC, tuo tarpu, kaip buvo tikėtasi, CD4 + T ląstelių priešvėžinis poveikis buvo sumažintas kontroliuojamomis Ab gydytomis pelėmis. Kita vertus, vakcinacijos derinimas su gydymu anti-IL-6 Ab žymiai pagerino antinavikinį OT-II ląstelių poveikį senosioms pelėms (1d pav., Dešinėje).

Neigiamas senėjančios aplinkos poveikis CD4 + T-ląstelių atsakams gali išryškėti labiau, jei yra piktybinės ląstelės, turinčios stiprią progresavimą ir metastazes. Todėl, taikydami metastazinį agresyvios melanomos modelį, mes pakartotinai įvertinome CD4 + T-ląstelių sukeliamą priešnavikinį poveikį senyvo amžiaus pelėms. Kaip buvo pastebėta naudojant MCA-OVA, OT-II ląstelės, gruntuotos peptidiniais impulsiniais DC, buvo neefektyvios metastazavusiai melanomai sergančioms IL-6 + / + pelėms, palyginti su jaunomis IL-6 + / + ar IL-6 - / - pelės (2a pav.). Tačiau, kai imunizuota senyvo amžiaus IL-6 - / - pelėms, jų veiksmingumas žymiai pagerėjo, o tai rodo, kad padidėjęs IL-6 lygis senyvo amžiaus šeimininkams slopina navikams būdingų CD4 + T ląstelių funkciją.

Image

( a ) OT-II ląstelės buvo perkeltos į jaunas ar senas IL-6 + / + arba IL-6 - / - peles. Imunizacija buvo atlikta kaip 1b pav. Praėjus penkioms dienoms po imunizacijos, plaučių metastazavimo modeliui į veną buvo sušvirkšta luciferazę ekspresuojančio MO4. Parodyti liuminescenciniai vaizdai 32 dieną (kairėje) ir fotonų skaičiaus kinetika vienoje pelėje (dešinėje). ( b ) Jaunos ir pagyvenusios pelės buvo imunizuotos perkeliant EnvH13.3 peptido impulsą sukeliančius DC ir buvo gydomos kontroliniu Ab arba anti-IL-6R Ab 1 dieną prieš ir po imunizacijos. 6 dieną po imunizacijos buvo užkrėstos RMA naviko ląstelės ir stebimas jų augimas. ( c, d ) Jaunos ir pagyvenusios pelės buvo gydomos anti-CD4 Ab. Po 2 dienų pelės buvo imunizuotos DC, impulsiniais OVA-Ip (SIINFEKL), o paskui paskiepytos MCA-OVA. Naviko eiga buvo stebima laikui bėgant ( c ). Praėjus penkioms dienoms po auglio užkrėtimo, ištuštinti LN buvo surinkti ir vėl stimuliuoti OVA-Ip impulsine DC ex vivo . IFN-γ gamyba buvo nustatyta ELISPOT tyrimu ( d ). Dviejų ar trijų eksperimentų reprezentatyvumas parodomas kaip vidurkis ± sem ( n = 5–10 pelių kiekvienoje grupėje). * P <0, 05, ** P <0, 01, dispersijos analizė ir Tukey post hoc testas. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Taip pat mes ištyrėme slopinantį IL-6 poveikį labiau fiziologinėms endogeninių CD4 + T ląstelių imuninėms reakcijoms, apsaugančioms senyvo amžiaus peles nuo pelių leukemijos viruso (MuLV) sukeltos limfomos (RMA 21 ) apimties. Kai pelės buvo imunizuotos DC, impulsiniais EnvH13. 3 peptidas, kuris buvo natūralus viruso epitopas, gautas iš MuLV ir kurį atpažino IA b ribojamos CD4 + T ląstelės, skiepijimas sulėtino jaunų pelių auglių augimą, palyginti su nevakcinuotų jaunų pelių 21 ar vakcinuotų senų pelių ( 2b pav.). Be to, vyresnio amžiaus pelėms, kurioms buvo taikoma DC vakcinacija kartu su anti-IL-6 Ab, RMA naviko progresavimas buvo ženkliai slopinamas, kaip pastebėta MCA-OVA modelyje.

Net tada, kai endogeninės CD4 + T ląstelės buvo išeikvotos ir OT-II ląstelės nebuvo perkeltos, imunizacija DC, impulsiniu SIINFEKL (OVA-Ip), kurį pripažįsta MHC I klasės ribotos OVA specifinės CD8 + T ląstelės, sukelia vidutinišką priešvėžiniai atsakai jaunoms pelėms (2c pav.). Tačiau senyvo amžiaus pelėms imunizacija DC, kurie pradmena endogenines OVA specifines CD8 + T ląsteles be OT-II perkėlimo, buvo mažiau efektyvi nei stebėta jaunoms pelėms. Be to, IL-6 blokada nei pagerino, nei susilpnino priešnavikinį imunitetą pelėms, turinčioms CD4 + T-ląsteles ir nuo CD8 + T-ląstelių. Šis priešnavikinis poveikis buvo glaudžiai susijęs su OVA-Ip (naviko) specifinių CD8 + T ląstelių IFN-γ reakcijomis, kurioms nepaveikė anti-IL-6 Ab skyrimas (2d pav.), Nors ir CD8 + T ląstelės atsakai buvo mažesni, palyginti su jaunais, dėl jų kiekybinio CD8 + T ląstelių sumažėjimo 13 . Šie rezultatai atmetė galimybę, kad teigiamas IL-6 blokados poveikis buvo daromas tiesiogiai per CD8 + T-ląstelių tarpininkaujamą priešnavikinį imunitetą. Todėl padidėjęs IL-6 daugiausia veikė naviko specifines CD4 + T ląsteles senyvo amžiaus pelėse.

Pagyvenusi aplinka slopina CD4 + T-ląstelių dauginimąsi

Gali būti, kad senėjančioje aplinkoje CD4 + T ląstelės nesugebėjo efektyviai išsiplėsti reaguodamos į antigeninę stimuliaciją ir dėl to sumažėjo priešvėžinis imunitetas. Norėdami patikrinti šią galimybę, mes ištyrėme jaunų OT-II donoro ląstelių dalį senyvo amžiaus pelėse po imunizacijos. Periferiniame kraujyje per 7 dienas buvo stebimas ryškus donoro OT-II ląstelių padidėjimas tiek kontroliniuose, tiek anti-IL-6 Ab gydytuose jaunuose šeiminiuose, o donoro ląstelės po to susitraukė (3a pav.). Priešingai, donoro T-ląstelių išsiplėtimas buvo mažiau pastebimas senyvo amžiaus šeimininkams nei jaunų partnerių kraujyje ir blužnyje bei limfmazgiuose (LN), kai skiepijamos DC (3a, b pav.) Arba kai buvo sukeltas homeostatinis dalijimasis. švitintose pelėse (papildomas 1 pav.). Be to, gydymas anti-IL-6 Ab nepagerino netinkamo OT-II donoro ląstelių išsiplėtimo senyvo amžiaus pelėms.

Image

( a - c ) OT-II ląstelių perkėlimas, imunizavimas ir gydymas Ab buvo atlikti taip, kaip aprašyta 1d pav. Donoro CD45.1 + OT-II ląstelių dažnis PBL buvo stebimas laikui bėgant ( a ), o bendras donoro OT-II ląstelių ( b ) ir CD4 + Foxp3 + Treg ląstelių ( c ) skaičius blužnyje ir LN nustatytas praėjus 6 dienoms po imunizacijos. ( d ) Nustatytas Gr-1 + CD11b + MDSC skaičius blužnies ir LN ląstelėse iš jaunų ar pagyvenusių IL-6 + / + ar IL-6 - / - pelių. ( e - g ) Anti-Gr-1 Ab buvo sušvirkštas likus 5 dienoms iki CFSE pažymėtų OT-II ląstelių perkėlimo, po to atliktas imunizavimas. Parodytas bendras donoro OT-II ląstelių skaičius 6 ( e ) ir CFSE požymiai 4 ( f ) dieną nurodytomis sąlygomis. Septynias dienas po imunizacijos MCA-OVA buvo pasėjamos į pagyvenusias peles. Pagyvenusių pelių augimas buvo matuojamas laikui bėgant ( g ). Vertės yra vidurkis ± sem ( n = 6 vienai grupei); * P <0, 05, ** P <0, 01, dispersijos analizė ir Tukey post hoc testas. Pateikti tipiniai dviejų ar trijų eksperimentų su panašiais rezultatais duomenys.

Visas dydis

CD4 + Foxp3 + reguliuojančios T ląstelės (Treg) galėtų veikti kaip išorinis veiksnys, darantis įtaką T ląstelių reakcijai į senyvus šeimininkus, nes jų buvo gausu vyresnio amžiaus žmonėms 22 ir pelėms (3c pav.) 23 . Tačiau kontrolinių ir anti-IL-6 Ab gydytų amžiaus pelių Treg skaičius buvo panašus. Kitas T-ląsteles slopinantis komponentas buvo Gr-1 + CD11b + iš mieloidų pagamintos slopinančios ląstelės (MDSC), kurios taip pat buvo išplėstos senstant (papildomas 2 pav.) 23 . Įdomu tai, kad IL-6 trūkumas nepakeitė su amžiumi susijusios MDSC dalies padidėjimo (3d pav.). Norėdami patikrinti jų slopinamąjį poveikį antigeno sukeltai CD4 + T ląstelių plėtrai, mes sunaikinome Gr-1 + ląsteles, įskaitant MDSC, naudodami anti-Gr-1 Ab. Nors bendras OT-II donorų ląstelių skaičius ir karboksifluoresceino diacetato sukcinimidilo esterio (CFSE) pobūdis parodė jų sumažėjusį proliferaciją pagyvenusiose pelėse, tarp anti-Gr-1 Ab gydytų ir kontroliuotų senyvų šeimininkų nepastebėta jokių išmatuojamų jų išsiplėtimo pokyčių (pav. 3e, f). Be to, skirtingai nuo anti-IL-6 Ab, gydymas anti-Gr-1 Ab neturėjo įtakos senyvo amžiaus pelių CD4 + T-ląstelių tarpininkaujamam imunitetui (3g pav.). Šie rezultatai rodo, kad sukauptų Treg, MDSC ar kitų Gr-1 + ląstelių, tokių kaip neutrofilai, slopinamasis poveikis nepriklausė nuo pagerėjusio CD4 + T-ląstelių tarpininkaujamo priešvėžinio imuniteto pagerėjimo IL-6 neutralizuotų pelių metu.

IL-6 trukdo Th1 vystymuisi senėjančioje aplinkoje

Buvo iškelta hipotezė, kad IL-6 padidėjęs reguliavimas pagyvenusioms pelėms pakeitė citokinų gamybą navikui būdingomis CD4 + T ląstelėmis, kad jos negalėtų pulti auglių. Iš tikrųjų, kai CD62L lo efektorinės CD4 + T ląstelės, įskaitant OT-II ląsteles, gruntuotas in vivo su IL-6 blokada ar be jos, buvo pakartotinai stimuliuotos OVA-IIp ex vivo , mes nustatėme, kad IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13 ir IL-10, bet ne IL-2, IL-17A, naviko nekrozės faktoriaus (TNF) -α ar IL-9, gaminamų iš efektorinių CD4 + T ląstelių, nepaprastai paveikė senyvoji aplinka ir IL-6 blokada (4a pav.). Norėdami patikrinti, ar šie pokyčiai atsirado dėl pakitusios efektorinių CD4 + T ląstelių diferenciacijos in vivo , mes įvertinome donoro OT-II ląstelių gebėjimą gaminti citokinus kiekvienos ląstelės pagrindu. Senų šeimininkų IFN-γ gaminančių OT-II ląstelių dažnis buvo žymiai mažesnis nei jaunų šeimininkų (4b, c pav.). Pažymėtina, kad šį netinkamą donoro OT-II ląstelių diferenciaciją Th1 žymiai atstatė IL-6 blokada senyvo amžiaus šeimininkams. Nerasta jokio skirtumo tarp kontroliuojamų ir anti-IL-6 Ab gydytų amžiaus pelių, galinčių gaminti IL-2, TNF-α ir IL-17A (4b, c pav.). Ir atvirkščiai, IL-21 ir IL-10 gaminančių ląstelių proporcijos padidėjo senyvo amžiaus pelėms, ir jas sumažino IL-6 blokada (4c pav.; Papildomas 3a pav.). Panašios tendencijos buvo stebimos ir šių citokinų ekspresijos RNR (mRNR) ekspresijose CD4 + T ląstelėse (papildomas 3b pav.). Be to, citokinų gamybos iš OT-II donoro ląstelių, gautų iš IL-6 trūkumų turinčių senų pelių, įvertinimas patvirtino, kad nuo IL-6 priklausomas Th1 diferenciacijos pakenkimas vyresnio amžiaus šeimininkams (4d pav.). Atsižvelgiant į tai, kad anti-Gr-1 Ab nedaro reikšmingo poveikio IL-6 gamybai (2a pav.) Ir priešnavikiniam imuniniam atsakui senstančioms pelėms (3 g pav.), Gr-1 + ląstelių, įskaitant MDSC, išeikvojimas nepakeitė citokino donoro OT-II ląstelių profiliai, paruošti pagyvenusioms pelėms (papildomas 2b pav.). Šie rezultatai leidžia manyti, kad padidėjęs IL-6 lygis yra pagrindinis mechanizmas, dėl kurio sutrinka donoro CD4 + T ląstelių Th1 diferenciacija, kai sensta pelėms. Sutrikęs Th1 atsakas į OT-II donoro ląsteles senyvo amžiaus pelėms atitiko jų sumažintą IFN-γ indukuojamo chemokino receptoriaus CXCR3 (nuoroda 24) ekspresiją, kurį padidino IL-6 blokada (papildomas 2c, d pav. ). Nors CD25 ekspresija taip pat sumažėjo donoro ląstelėse, paruoštose nuo senų pelių, palyginti su jaunomis pelėmis, IL-6 blokada nepakeitė jos išraiškos, kaip ir kitų paviršiaus žymenų atveju. Padidėjusi išsekusių T ląstelių, tokių kaip PD-1, žymenų raiška nebuvo nustatyta OT-II donoro ląstelėse senyvo amžiaus pelėms (papildomas 2d pav.).

Image

( a ) OT-II ląstelių perkėlimas, imunizavimas ir gydymas Ab buvo atlikti taip, kaip aprašyta 1d pav. Po šešių dienų po imunizacijos CD4 + CD62L lo ląstelės buvo išrūšiuotos iš jaunų ir pagyvenusių pelių blužnies ir LN (detalės aprašytos metoduose), o po to 36 valandas pakartotinai stimuliuotos OVA-IIp impulsinėmis DC. Kultūros supernatantas buvo surinktas ir išmatuota nurodytų citokinų koncentracija. Vertės yra vidurkis ± sem ( n = 4 vienai grupei). ( b - d ) Atliktas OT-II ląstelių perkėlimas, imunizacija ir anti-IL-6 Ab injekcija. IL-6 + / + arba IL-6 - / - pelės buvo naudojamos kaip šeimininkai per d . Donoro OT-II ląstelės buvo išskirtos praėjus 6 dienoms po imunizacijos ir vėl stimuliuotos forbole-12-miristato-13-acetato / jonomicinu. Citokinų gamyba buvo įvertinta dažant ląstelėse. Parodytos reprezentatyvios taškų diagramos ( b ) ir atskiros vertės kartu su vidurkiu ( c, d ) nurodytose citokinų teigiamose frakcijose. Parodyti reprezentatyvūs 3–4 nepriklausomų eksperimentų su panašiais rezultatais duomenys. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, dispersijos analizė ir Tukey post-hoc testas. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Taip pat mes ištyrėme su amžiumi susijusio IL-6 padidėjimo įtaką pagrindinių transkripcijos veiksnių, reguliuojančių T-ląstelių diferenciaciją, genų ekspresijai. Iš viso iš OT-II perkeltų ir vakcinuotų pelių išskirtų CD4 + T ląstelių Tbx21 ekspresijos lygis, koduojantis T-bet ir reguliuojantis Th1 diferenciaciją 25, senyvo amžiaus pelėms paprastai sumažėjo, palyginti su jaunomis pelėmis. skirtumas nebuvo reikšmingas. Be to, Gata3 ekspresija, reguliuojanti Th2 diferenciaciją, taip pat buvo mažesnė CD4 + T ląstelėse iš vakcinuotų amžiaus pelių nei jaunų pelių. Priešingai, Foxp3 ir Th17 specifinis transkripcijos faktorius Rorc buvo sureguliuotas aukščiau , tačiau tų išraiškų nepakeitė IL-6 blokada nei jaunoms, nei senyvo amžiaus pelėms (5a pav.). Kaip pastebėta atliekant Rorc ekspresiją, senyvų šeimininkų organizme c-maf raiška CD4 + T ląstelėse pastebimai padidėjo, tačiau ją slopino IL-6 blokada. Norint tiksliau išanalizuoti transkripcijos faktorių raišką antigeno specifinėse CD4 + T ląstelėse, buvo tiriamos jų baltymų ekspresijos OT-II donoro ląstelėse vienos ląstelės lygmeniu. Kaip ir tikėtasi, panašūs modeliai buvo stebimi ir OT-II donoro ląstelių, ekspresuotų jaunų ar senų pelių, baltymų ekspresijoje (5b pav.). Pažymėtina, kad tiek šeimininko amžius, tiek IL-6 lygis pakeitė tik c-Maf raišką, ir tai buvo patvirtinta donoro OT-II ląstelėse, paruoštose nuo IL-6 turinčių ir neturinčių amžiaus pelių (5c pav.).

Image

OT-II ląstelių perkėlimas, imunizacija ir anti-IL-6 Ab injekcija buvo atlikta, kaip parodyta 1d pav. ( a ) Po 5 dienų visos CD4 + T ląstelės buvo išrūšiuotos iš blužnies ir LN, iš jų išskirtos RNR. Nurodytų transkripcijos veiksnių mRNR raiška buvo analizuojama realiojo laiko kiekybine PGR. Parodyta santykinė Gapdh išraiškos vertė (vidurkis ± sem, kai n = 4–6 vienai grupei). Y, jauni šeimininkai; A, pagyvenę šeimininkai. ( b, c ) Praėjus šešioms dienoms po imunizacijos, OT-II donoro ląstelėse buvo tiriama nurodytų transkripcijos faktorių baltymų ekspresija. Parodytos atskiros vertės kartu su Ab apdorotų IL-6 + / + pelių ( b ) vidurkiais ir reprezentatyviomis histogramomis iš IL-6 + / + arba IL-6 - / - pelių ( c ). Parodytas trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, dispersijos analizė ir Tukey post-hoc testas. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Defektyvus IFN-γ atsakas esant IL-6 tarpininkaujant CD4 + T-ląstelių disfunkcijai

Mes nustatėme, kad IFN-γ lygis serume padidėjo OT-II perneštoms ir vakcinuotoms jaunoms pelėms, reaguojant į naviko inokuliaciją (6a pav.). Be to, santykinai mažesnis IFN-γ lygis vakcinuotose amžiaus pelėse buvo pagerintas gydymu anti-IL-6 Ab, kuris atitiko daugiau Th1 diferenciacijos OT-II donoro ląstelėse. Tačiau pagyvenusios pelės, kurioms buvo perduotos IFN-γ deficito turinčios OT-II ląstelės, nesukėlė IFN-γ indukcijos net tada, kai buvo skiriamas anti-IL-6 Ab.

Image

Jaunų, laukinio tipo (WT) arba IFN-γ trūkumų turinčių (IFN-γ išmušimo (KO)) pelių OT-II ląstelės buvo perkeltos į jaunas ir senas peles. Imunizacija ir naviko inokuliacija buvo atlikta, kaip aprašyta 2a pav. ( a ) Praėjus vienai savaitei po naviko užkrėtimo, IFN-γ koncentracija serume buvo nustatyta atliekant imunofermento ryšį su fermentais. Parodomos atskiros vertės kartu su vidurkiu. ( b ) Luciferazę ekspresuojančių MO4 ląstelių augimas in vivo buvo stebimas laikui bėgant, ir tai parodyta kaip fotonų skaičius luminescencijos vaizduose. Pateikti duomenys yra dviejų eksperimentų su panašiais rezultatais atstovai (vidurkis ± sem, kai n = 4–6 vienai grupei; * P <0, 05, dispersijos analizė ir Tukey post-hoc testas). NS, nereikšminga.

Visas dydis

Atsižvelgiant į tai, kad IFN-γ, vieno iš kritiškiausių priešvėžinių imunitetų 3, 5, 7 citokinų, gamyba buvo nepakankama navikams būdingose ​​CD4 + T ląstelėse senosiose pelėse, toliau ištyrėme, ar IL-6 sukeltas Th1 diferenciacijos sutrikimas iš tikrųjų prisidėjo prie su amžiumi susijusių CD4 + T ląstelių priešnavikinių ligų disfunkcijos. Kaip parodyta 6b pav., Jaunoms pelėms buvo užkirstas kelias intensyviam metastazavusio plaučių naviko progresavimui, kai buvo perkeltos arba pakankamos IFN-γ, arba nepakankamos CD4 + T ląstelės, tuo tarpu vakcinuotoms senatvės pelėms nepavyko slopinti naviko augimo. Tačiau IL-6 blokada žymiai pagerino laukinio tipo (WT) donoro OT-II ląstelių terapinį efektyvumą senyvo amžiaus pelėms, kaip buvo parodyta anksčiau. Priešingai, šio pagerėjimo nepastebėta, kai senyvo amžiaus pelėms buvo skirtas kombinuotas gydymas anti-IL-6 Ab ir IFN-γ deficito T ląstelėmis. Šie rezultatai rodo, kad IL-6 blokada pagerina priešnavikinį CD4 + T ląstelių poveikį, padidindama IFN-γ gamybą pagyvenusioms pelėms.

Sumažėjusi CD8 pagalba dėl CD4 + T ląstelių senėjimo aplinkoje

MCA-OVA neišskiria MHC-II ir neteikia OVA peptido CD4 + T ląstelėms 26 . CD4 + T ląstelių priešnavikinis poveikis gali būti daromas per kitus iš šeimininko gaunamus komponentus, tokius kaip navikui būdingos CD8 + T ląstelės. Todėl mes ištyrėme, ar pagyvenę šeimininkai, kurių organizme trūksta CD8 + T ląstelių, galėtų sustiprinti priešnavikinį imunitetą, kai CD4 + T-ląstelių terapija derinama su IL-6 blokada. Kaip buvo parodyta anksčiau, net ir senyvo amžiaus pelėms naviko augimą iš esmės sumažino OT-II donorinės ląstelės, gruntuotos kartu su IL-6 blokada, kai buvo išsaugotos endogeninės CD8 + T ląstelės (7a pav.). Tačiau CD8 + T ląstelių išeikvojimas panaikino šį priešnavikinį poveikį, kas rodo, kad navikui būdingų CD4 + T ląstelių terapinis poveikis IL-6 neutralizuotų pelių metu buvo susijęs su CD8 + T ląstelėmis.

Image

( a ) T-ląstelių perkėlimas, imunizavimas ir gydymas Ab buvo atlikti taip, kaip parodyta 1d pav. Po penkių dienų po imunizacijos pelėms buvo sušvirkšta anti-CD8 arba kontrolinis Ab. MCA-OVA buvo paskiepyta 0 dieną. Duomenys apie naviko augimą yra vidutiniai ± sem ( n = 8–10 pelių kiekvienoje grupėje). ( b - e ) MCA-OVA buvo pasėjama praėjus 5 dienoms po OT-II perkėlimo ir imunizacijos. Dar po 6 dienų buvo analizuojamos OVA specifinės CD8 + T ląstelės, auginančios navikus kanalizuojančiuose LN (c ir d) ir navikuose įsiskverbusiuose limfocituose (TIL) ( e ). Parodyti tipiniai OVA-Ip / H-2K b- tetramerio + CD8 + CD44 hi ląstelių plotai ( c ) ir bendras skaičius ( d ). ( f, g ) WT arba IFN-γ deficito (išmušimo (KO)) OT-II ląstelės buvo perkeltos į jaunas ir senyvas peles. OVA specifinės CD8 + T ląstelės jaunuose arba senuose šeimininkuose, kurie buvo apdoroti taip, kaip aprašyta b punkte, buvo nustatyti naudojant OVA-Ip / H-2K b- tetrametrą ( f ). OVA-Ip specifinis CD8 + T-ląstelių atsakas naviko drenavimo LNs taip pat buvo įvertintas IFN-g ELISPOT ( g ). ( h ) Imunizacija naudojant EnvH13.3 impulsinę DC ir RMA inokuliaciją jaunoms ar pagyvenusioms pelėms buvo atlikta, kaip aprašyta 2b pav. Praėjus penkioms dienoms po auglio užkrėtimo, ELISPOT įvertino nurodytą su naviku susijusio peptidui būdingo IFN-γ gamybą navikų kanalizacijos LN. Parodyti 2–3 eksperimentų tipiniai duomenys (vidurkis ± sem, kai n = 4–5 kiekvienoje grupėje). * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 dispersijos analizė, po kurios sekė Tukey post hoc testas.

Visas dydis

IL-6 aktyvumo neutralizavimas turėjo įtakos tik pradėjus donoro CD4 + T ląsteles DC, tačiau nepaveikė CD8 + T-ląstelių aktyvacijos, nes šioje vakcinacijoje naudojami DC buvo impulsuojami tik su OVA-IIp, o navikui būdinga CD8 + T ląstelės turėtų būti veikiamos antigenu tik po to, kai užterštos MCA-OVA (7b pav.). Taigi mes išanalizavome efektorinių CD4 + T ląstelių, paruoštų pagyvenusiems šeimininkams, gebėjimą skatinti navikui būdingas CD8 + T-ląstelių reakcijas po naviko užkrėtimo. Po šešių dienų po auglio užkrėtimo jaunos pelės, kuriose buvo paruoštos OT-II donoro ląstelės, indukuodavo OVA specifines CD8 + T ląsteles naviko drenavimo LN ir auglyje efektyviau nei pelės, turinčios naivias OT-II ląsteles, neskiepydamos DC. anti-IL-6 Ab apdorojimo (7c – e pav.; papildomas 4 pav.). Priešingai, mažiau OVA specifinių CD8 + T ląstelių skatino OT-II donorinės ląstelės, gruntuotos senyvo amžiaus pelėms. Pažymėtina, kad jų pagalbinis aktyvumas OVA specifinėms CD8 + T ląstelėms buvo žymiai pagerėjęs senyvo amžiaus pelėms, kuriose OT-II ląstelės buvo paruoštos esant anti-IL-6 Ab.

Atliekant RMA naviką senosioms pelėms, naviko (MuLV EnvH13.3) specifinių CD4 + T ląstelių IFN-γ atsakas buvo atkurtas vykdant IL-6 blokadą (7f pav.). Kita vertus, EnvH13.3 specifinės IL-4 ir IL-10 produkcija buvo abipusiai sumažinta dėl IL-6 blokados pagyvenusioms pelėms (papildomas 5 pav.). Be to, skiepijimas, iš kurio buvo gautos specifinės navikui būdingos CD4 + T ląstelės, sustiprino naviko (Env / Kb ir GagL / Db) 21- specifinių CD8 + T ląstelių atsaką senyvo amžiaus pelėse, tik tuo atveju, kai anti-IL-6 Ab buvo skiriamas CD4 + T-ląstelių pradėjimo fazė (7f pav.).

Taip pat mes ištyrėme poreikį iš donoro CD4 + T-ląstelių gauto IFN-γ skatinti navikams būdingų CD8 + T ląstelių atsaką. Sutikus su naviko augimo rezultatais (6 pav.), Senyvo amžiaus pelėms, perkeltoms su IFN-γ-deficituota OT, nebuvo stebimas ryškus OVA-specifinių CD8 + T ląstelių indukcija ir jų funkcinis sustiprėjimas, stebimas pagal IFN-γ atsaką. -II ląstelės, nepriklausomai nuo IL-6 blokados (7g pav., H). Šie rezultatai leidžia manyti, kad CD4 + T-ląstelių gautas IFN-γ prisideda prie navikui būdingo CD8 + T-ląstelių atsako skatinimo anti-IL-6 Ab gydomose amžiaus pelėse.

IL-6 slopina Th1 vystymąsi per c-Maf / IL-4 / IL-21 ašį

Norėdami dar labiau išaiškinti slopinantį IL-6 poveikį Th1 diferenciacijai, jaunos CD4 + T ląstelės buvo stimuliuojamos anti-CD3 / CD28 Abs, esant arba neturint IL-6 in vitro . Esant IL-12, stimuliuotos T ląstelės padidino T-bet išraišką (8a pav.). Vienu metu vykstanti IL-6 stimuliacija nepakeitė nei T-bet, nei GATA-3 lygio, tačiau padidino c-Maf išraišką net Th1 pasvirusiomis sąlygomis. Norėdami tiesiogiai įvertinti c-Maf poreikį dėl IL-6 tarpininkaujamo Th1 slopinimo, mes panaudojome T-ląsteles su homozigotiniu mutantu c-Maf, kuriam trūksta DNR, rišančio jo tikslinius genus 27 . c-Maf veikla yra būtina T ląstelių vystymuisi ir periferinei homeostazei (papildomas 6a, b pav.). Anksčiau nebenaudotų c-Maf-mutantinių CD4 + T ląstelių proliferacija, reaguojant į antigeninę stimuliaciją, taip pat buvo panaši į WT ląstelių (papildomas 6c pav.). Kaip parodyta 8b pav., WT ląstelių stimuliavimas IL-6, kuris mėgdžiojo seną aplinką, susilpnino IFN-γ gaminančių ląstelių vystymąsi in vitro . Šiomis sąlygomis buvo tik nedidelis Th1 diferenciacijos slopinimas IL-6 būdu c-Maf mutantuose T ląstelėse, o tai rodo c-Maf svarbą IL-6 tarpininkaujant Th1 slopinimui.

Image

Jaunos naivios CD4 + T ląstelės buvo stimuliuotos anti-CD3 ir anti-CD28 Abs ir eksogeniniu IL-12 in vitro . ( a ) Praėjus keturioms dienoms po stimuliavimo, buvo išanalizuota nurodytų transkripcijos veiksnių išraiška. ( b, c ) Naivios polikloninės CD4 + T ląstelės iš homozigotinių c-Maf-mutantinių pelių (c-Maf Mut) arba kontrolinių pelių (WT) buvo stimuliuojamos esant arba neturint IL-6. Praėjus penkioms dienoms po stimuliacijos, efektorinės ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos forbole-12-miristato-13-acetato / jonomicinu. Pavaizduoti citokinus gaminančių ląstelių plotai ( b ). Nurodyta citokinų mRNR ekspresija 3 dieną taip pat buvo įvertinta realiojo laiko kiekybine PGR ( c ). Rezultatai parodomi kaip vidurkis ± sem, kai n = 4–6 vienai grupei; * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, dispersijos analizė ir Tukey post-hoc testas. NS, nereikšminga. ( d, e ) Naivios OT-II ląstelės buvo stimuliuojamos esant nurodytiems citokinams arba Abs. Praėjus penkioms dienoms po stimuliacijos, efektorinės ląstelės buvo pakartotinai stimuliuojamos ir išanalizuotas jų gebėjimas gaminti IFN-γ, IL-2 ir (arba) IL-21. Parodyti tipiniai sklypai. Duomenys atspindi bent tris nepriklausomus eksperimentus. NS, nereikšmingas; PBS, fosfatinis buferinis tirpalas.

Visas dydis

c-Maf yra kritinis transkripcijos faktorius, sukeliantis IL-4 ir IL-21 gamybą 25, 28 . Iš tiesų, tiek jaunų C57BL / 6, tiek Balb / c pelių IL-6 stimuliuotos CD4 + T ląstelės išgavo žymiai didesnius IL-4 kiekius iškart po pirminio T ląstelių receptoriaus (TCR) stimuliacijos, ir tai sumažėjo c-Maf- mutantinės T ląstelės (papildomas 7a, b pav.; 8c pav.). IL-6 stimuliacija taip pat paskatino IL-21 ir IL-10 gamybą priklausomai nuo c-Maf (8b pav., C; papildomas 7 pav.). Nuo c-Maf priklausomas pakitęs citokinų ekspresijos profilis iškėlė galimybę, kad šie citokinai prisidėjo prie IL-6 tarpininkaujamo Th1 diferenciacijos slopinimo. Norint patikrinti šią galimybę, Th1 diferenciacija buvo įvertinta IL-6 stimuliuojamose T ląstelėse, kai šie citokinų aktyvumai buvo neutralizuoti. IL-4 aktyvumo neutralizavimas žymiai pagerino Th1 diferenciaciją (8d pav.; Papildomas 7d pav.). IL-21 aktyvumo blokavimas taip pat mažesniu mastu sušvelnino IL-6 tarpininkaujamą Th1 slopinimą, o egzogeninis IL-21 sumažino Th1 diferenciaciją, nesant IL-6 stimuliacijos (8e pav.). Pažymėtina, kad šiuos in vitro rezultatus patvirtino faktas, kad tiek IL-4, tiek IL-21 neutralizavimas reikšmingai atstatė senų pelių Th1 diferenciaciją (9a pav.), O IL-10 blokada nepagerino susilpnėjusios Th1 diferenciacijos ( 9b pav.). Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad IL-6 sukeltas Th1 slopinimas buvo vykdomas per c-Maf / IL-4 / IL-21 ašį pagyvenusioje aplinkoje.

Image

( a, b ) OT-II ląstelės buvo paruoštos jaunoms ar senyvo amžiaus pelėms 0 dieną, kaip parodyta 1b pav., ir po to buvo apdorotos kontroliniu Ab, anti-IL-4 ir anti-IL-21 Abs ( a ) arba anti -IL-10 Ab ( b ) 3 ir 4 dienomis. Po šešių dienų po imunizacijos buvo nustatytas IFN-γ + ląstelių dažnis donoro OT-II ląstelėse. b ) Tipiniai apskaitos bareliai. ( c ) OT-II perkėlimas, imunizavimas, gydymas Ab ir MCA-OVA inokuliacija buvo atlikti, kaip parodyta 1d pav. Praėjus keturioms dienoms po auglio užkrėtimo, buvo nustatyta IL-10 koncentracija serume. ( d, e ) anti-IL-4 ir anti-IL-21 Abs OT-II perkėlimas, imunizavimas ir gydymas buvo atlikti kaip a . Praėjus penkioms dienoms po imunizacijos, pelės buvo pasėtos MCA-OVA. Anti-IL-10 Ab buvo švirkščiamas du kartus per 2 ir 3 dienas po naviko užkrėtimo. Praėjus penkioms dienoms po auglio užkrėtimo, tiriant OVA-Ip tetramerą ( d ), buvo tiriami OVA specifinių CD8 + T ląstelių drenavimo LN. OVA-Ip specifinis CD8 + T-ląstelių atsakas taip pat buvo įvertintas atliekant IFN-γ ELISPOT testą ( e ). Pateikti duomenys yra vidutiniai ± sem, kai n = 4–5 kiekvienoje grupėje. ( f ) CD62L lo efektorinės OT-II ląstelės, paruoštos jaunoms ar pagyvenusioms IL-6 + / + ar IL-6 - / - pelėms, buvo surūšiuotos taip, kaip parodyta 4a pav., ir buvo auginamos kartu su CFSE pažymėtomis CD8 + T ląstelėmis anti-IL-10 Ab buvimo ar nebuvimo. Po 3 dienų CFSE profilis ir IFN-γ gamyba CD8 + T ląstelėse buvo nustatyti srauto citometru. Parodyti reprezentatyvūs dviejų nepriklausomų eksperimentų duomenys. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, dispersijos analizė ir Tukey post-hoc testas.

Visas dydis

IL-6 pakeista citokinų aplinka moduliuoja CD8 + T-ląstelių atsakus

Atsižvelgiant į nuo IL-6 priklausomą IL-10 gamybą OT-II ląstelėse (4c pav.), Padidėjusio IL-10 lygio serume buvo pastebėtas senyvo amžiaus pelėms po auglio užkrėtimo (9c pav.), Tuo tarpu šis padidėjimas nebuvo aptinkamas pagyvenusioms pelėms, turinčioms IL-6 blokadą. Taigi, norint ištirti IL-10, be IL-4 ir IL-21, poveikį priešnavikinių CD8 + T-ląstelių reakcijų indukcijai per CD4 pagalbininko aktyvumą, buvo įvertintas CD8 + T ląstelių skaičius ir funkcija vyresniame amžiuje pelėms, gydytoms blokuojant Abs šiuos citokinus. Remiantis diferenciacijos Th1 rezultatais (9a pav.), Kombinuotas anti-IL-4 ir anti-IL-21 Abs gydymas reikšmingai pakeitė sutrikusį navikui būdingų CD8 + T ląstelių indukciją ir funkciją, reaguojant į naviko inokuliaciją amžiaus pelės. IL-10 blokada taip pat pagerino CD8 + T-ląstelių atsaką pagyvenusioms pelėms, nors IL-10 blokada neturėjo įtakos Th1 diferenciacijai, o tai rodo, kad, priešingai nei IL-4 / IL-21, IL-6 tarpininkaujant IL-10 CD4 + T ląstelėmis, kurios buvo paruoštos sendintoje aplinkoje, moduliavo CD8 + T-ląstelių atsaką, nepriklausomai nuo Th1 diferenciacijos.

Norėdami patvirtinti tiesioginį IL-6 jautrinamų CD4 + T ląstelių slopinamąjį vaidmenį, mes atlikome CD8 + T ląstelių kultūrą kartu su efektorinėmis OT-II ląstelėmis, pradžiugintomis jaunuose ar senuose IL-6 + / + ar IL-6 - / - pelės (9f pav.). Bendras kultivavimas su CD4 + T ląstelėmis, pradžiūvusiomis pagyvenusiose IL-6 + / + pelėse, žymiai slopino CD8 + T ląstelių išsiplėtimą ir IFN-γ gamybą, tačiau šios reakcijos buvo iš esmės sukeltos, kai auginamos kartu su išskirtomis efektorinėmis CD4 + T ląstelėmis. iš senų IL-6 - / - pelių arba su CD4 + T ląstelėmis iš senų IL-6 + / + pelių, esant anti-IL-10 Ab in vitro . Šie duomenys rodo, kad per didelis IL-4, IL-21 ir IL-10 gaminimas, kurį sukelia IL-6 senyvo amžiaus pelėms, neigiamai veikia priešnavikinius CD8 + T ląstelių atsakus, nes (1) silpnina Th1 diferenciaciją ir jų pagalbininkų aktyvumą ir ( 2) tiesioginį slopinantį poveikį CD8 + T ląstelių išsiplėtimui ir funkcijai.

Diskusija

Atsižvelgiant į platų senėjimo poveikį CD4 + T ląstelėms, viena iš pagrindinių priešnavikinių imuninių atsakų nesugebėjimo priežasčių yra kiekybinis periferinių T ląstelių skaičiaus sumažėjimas ir TCR repertuarų skaičius dėl šlaunikaulio įsitraukimo senatvėje 12, 13, 29 . Manoma, kad antrasis rizikos faktorius yra antigeno sukeltos T-ląstelių išsiplėtimo sutrikimas, kurį reguliuoja tiek vidiniai mechanizmai pagyvenusiose CD4 + T ląstelėse 11, 12, tiek išorinis faktorius (-iai) senėjimo aplinkoje (3 pav.) 14 . Įgimtas pagyvenusių CD4 + T ląstelių proliferacinis defektas daugiausia susijęs su sumažėjusia IL-2 gamyba 11, tuo tarpu molekulinis mechanizmas (-ai), pagal kurį (-i) sendinta aplinka slopina jaunų CD4 + T-ląstelių plėtrą, dar nėra apibrėžtas; todėl reikės atlikti papildomą analizę.

Given that the balance between Th1 and Th2 cytokines is important for antitumour responses 5, 7, particular attention has been devoted to evaluating the age-related decline in IFN-γ production. Although a shift from Th1 towards Th2 responses in elderly subjects has been suggested 8, 9, some reports are contradictory 30 . This discrepancy may be due to the experimental materials, in which the effector CD4 + T cells primed at old age were not distinguished from the memory T cells that had been committed at young age. To rule out such possibilities, we established a model system that enabled us to assess the differentiation from naive to effector CD4 + T cells in the aged environment. Using this system, we found that the excessive increase in IL-6 induced the dysregulation of Th1 differentiation, which was suggested to a third cause of impaired antitumour immunity in aged animals.

Young mice rejected the OVA-expressing tumour even when IFN-γ-deficient OT-II was transferred, because IFN-γ deficiency in the transferred OT-II cells could be counterbalanced by abundant IFN-γ-producing endogenous WT CD4 + T cells in young mice, which might be sufficient to mount antitumour immunity. In this regard, in aged mice, the effect of IFN-γ deficiency in the transferred OT-II cells appeared to be underscored by significantly decreased proportion of endogenous CD4 + T cells 13, 29 . Taken together, not only complementation with tumour-specific young CD4 + T cells, but IL-6 blockade that augmented IFN-γ production was also necessary for improvement of antitumour responses in aged mice.

IL-6-mediated Th1 suppression may be involved in a recent finding that the level of IL-6 is correlated with clinical outcome in melanoma patients receiving immunotherapy 31 . Therefore, the effect of IL-6 on endogenous or transferred T cells should be taken into account in aged individuals therapeutically infused with tumour-targeting T cells 32, 33 . Age-related chronic inflammation accompanied with cancer, smoking, subclinical disorder (atherosclerosis, sarcopenia and cognitive decline) and obesity seem to contribute to systemic increase of IL-6/sIL-6R in an elderly population 15, 17 . Overall, we suggest that a rational design of cancer immunotherapy mediated by CD4 + T cells in the elderly can be administered concurrently with temporal neutralization of IL-6 activity to restore the defective Th1 development without adversely affecting their antitumour activities. Theoretically, depletion of cells producing IL-6 or sIL-6R might represent viable options to ameliorate their activities. However, under inflammatory conditions, diverse types of cells such as aged adipose tissue 34, MDSC 26, 35, macrophages 36, nonhematopoietic endothelial stromal cells and/or cancer-associated fibroblasts 37 can serve as the sources of IL-6 in tumour-bearing mice. For this reason, it has to be considered that the production of IL-6 and sIL-6R are not confined to one cell type and thus it is difficult to target their cellular sources that contribute to systemic control of Th1 suppression.

At present, IL-6 blockade using humanized anti-IL-6 Ab 19, anti-IL-6R Ab tocilizumab or curcumin, a potent inhibitor of IL-6 production 35, is a promising clinical application for improvement of the currently inefficient antitumour vaccination in aged individuals, and for controlling the age-dependent pro-inflammatory status, called 'inflammaging', responsible for tissue damage or systemic toxicities in aged animals 16, 17 .

The detailed molecular mechanism(s) underlying the defect in Th1 development are still unclear, and several scenarios are worth considering. (1) It was intriguing that IL-4/IL-21 neutralization substantially relieved the suppressive effect of IL-6 on Th1 differentiation. This was supported by the finding that IL-6-mediated impairment of Th1 development was substantially restored by a loss of function in c-Maf. Diminished IL-4/IL-21 production in c-Maf-mutant T cells likely allowed them to differentiate into Th1 cells, since IL-4 inhibits IFN-γ production and stimulates the production of other Th2 cytokines 25 . Furthermore, in addition to previous in vitro study 38, we have first demonstrated the IL-6-mediated regulation of c-Maf expression under in vivo situation of aged mice (Fig. 5). On the basis of these findings, immunotherapy for aged individuals aimed at cancer regression may be accomplished by overcoming or redirecting Th2-prone responses. However, IL-4/IL-21 blockade did not completely rescue the impaired Th1 differentiation in aged mice, suggesting an additional requirement for optimal Th1 development.

(2) In addition to the IL-4/IL-21-mediated Th1 suppression, direct engagement of c-Maf in repressing ifng transcription is also likely. This possibility is supported by a previous report that forced expression of c-Maf in Th1 cells inhibited IFN-γ production via an IL-4-independent mechanism 39 . Furthermore, in addition to increased c-Maf expression, expression of T-bet and GATA3 were downregulated in donor OT-II cells primed in aged mice, implying that mutually balanced expression of several transcription factors within T cells contributes to attenuated Th1 differentiation in the aged environment. (3) Moreover, as an alternative mechanism of IL-6-mediated Th1 suppression, impaired Signal Transducer and Activator of Transcription 1-dependent IFN-γ receptor signalling via IL-6-induced expression of Suppressor of Cytokine Signalling protein has been proposed 40 . These possible mechanisms should be investigated in greater detail.

Our finding provides the notion that less susceptibility to the antitumour vaccination in aged individuals should be carefully considered in terms of the complex effects of ageing on other components that interact with CD4 + T cells. In addition to the quantitative declines in aged CD8 + T cells, their qualitative defects have been also reported 41 . However, there are other conflicting data suggesting that intrinsic function of CD8 + T cells is preserved even in later life 42, 43 . These seeming discrepancies can be explained in part by the defective ability of CD4 + T cells to help cognate CD8 + T cells in old age. Indeed, we found that CD4 + T cells primed in aged mice were ineffective in supporting cognate CD8 + T-cell responses, resulting in poor control of tumour progression in aged mice. Moreover, their helper activity for CD8 + T cells was mediated through IFN-γ, which was consistent with previous reports showing that CD4 + T-cell-derived IFN-γ enhanced the function and recruitment of CD8 + T cells into draining LNs following viral or bacterial infection 44, 45 . Importantly, when Th1 differentiation was restored by the blockade of IL-6 or subsequent IL-4/IL-21 activities, induction of tumour-specific aged CD8 + T cells was enhanced as well, implying minimum intrinsic functional defects in aged CD8 + T cells.

It is noteworthy that IL-21 is known to have the ability to potentiate the expansion and function of CD8 + T cells in a synergistic context with IL-15 in young mice 46, which is apparently opposed to our findings. One likely cause for this contradiction may be the reduced availability of IL-15 presentation in the aged environment, because the stimulatory effect of IL-21 is not exerted on CD8 + T cells in the absence of IL-15 (ref. 46). Indeed, previous studies reported that the levels of IL-15 and IL-15Rα decline with ageing 47, 48 . These reports appear to be consistent with our hypothesis that insufficient cooperative action of IL-15 is responsible for the decreased stimulatory function of IL-21. However, it remains a matter of debate as to whether ageing alters levels of IL-15, because in contrast to these reports, a recent study demonstrated that IL-15 expression in splenic stromal cells was increased with ageing 49 .

Interestingly, our in vitro experiments demonstrated that IL-4/IL-21 blockade downregulated IL-10 production from IL-6-sensitized effector CD4 + T cells (Supplementary Fig. 7c), suggesting that IL-21 stimulated IL-10 production in CD4 + T cells, which in turn, constrained the optimal response of CD8 + T cells in an IL-10-dependent manner. Taken together, in addition to the negative impact on Th1 differentiation, this cytokine circuit could be another mechanistic feature of IL-6 in converting the function of IL-21 from immunostimulatory to tolerogenic for tumour outgrowth in aged animals. On the basis of these ideas, strategies that bypass the requirement of CD4 + T-cell-mediated help and compensate for apparently 'helpless CD8 + T cells', such as treatment with agonistic anti-CD40L Ab (plus TNF-α blockade) 16, or anti-PD-1 Ab 50 may be the potential approaches to restore the ineffective cancer immunosurveillance in aged animals without distraction of defective CD4 + T cells.

Metodai

Pelės

Two-month-old young male C57BL/6 mice were purchased from Nihon Clea, and were maintained until they reached 18–24 months of age, which were utilized as aged mice. Two-month-old Balb/c mice (Nihon Clea) were also utilized as a source of naive CD4 + T cells. OVA-specific OT-II TCR-transgenic mice were crossed with B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ (The Jackson Laboratory) or with IFN-γ-deficient mice 51 to establish CD45.1 + OT-II mice or IFN-γ-deficient OT-II mice, respectively. C3H/HeH F1 background Maf Ofl mice bearing a mutant c-Maf that lacks the ability to bind to its target genes 27 were provided from the Medical Research Council. All mice including IL-6-deficient mice were housed at the Center for Animal Resources and Development, Kumamoto University under specific pathogen-free conditions. All the experimental procedures were performed in accordance with the guidelines of the Institutional Animal Committee of Kumamoto University.

Tumour inoculation and Ab treatment in vivo

An MCA205 fibrosarcoma cell line expressing OVA protein was previously established 21 . RMA cells, a Rauscher MuLV-induced lymphoma 21 was kindly provided by Dr Akira Shibuya (University of Tsukuba, Japan). Mice were inoculated subcutaneously with 8 × 10 5 MCA-OVA or 1 × 10 5 RMA, or were intravenously injected with 1 × 10 5 of the OVA/firefly luciferase-expressing melanoma cell line, MO4-Luc 26, 52, in the pulmonary metastatic model. Tumour size is expressed as a tumour index, the square root of (length × width), as described previously 53 . To measure MO4 metastasis in the lung, luminescence images were analysed using NightOWL II (Berthold Technologies) 26 . Two hundred μg of anti-IL-6R Ab, 15A7; anti-IL-6 Ab, MP5–20F3 (BioXCell); or control rat IgG Ab (Millipore) was injected 1 day before and after immunization. Daily intraperitoneal injections of 200 μg of anti-IL-4 Ab (BioXCell) and 100 μg of anti-IL-21 Ab (R&D Systems) were performed for 2 days after T-cell transfer. Two hundred μg of anti-IL-10 Ab (JES5-2A5; BioXCell) was injected every other day after tumour inoculation. For in vivo cell depletion, mice were injected with 200 μg of anti-CD4 Ab (GK1.5), anti-CD8 Ab (2.43) or anti-Gr-1 Ab (R56–86; BioXCell) 4–5 days before T-cell transfer, immunization or tumour inoculation.

Priėmimas ir imunizavimas

Naive CD4 + T cells (1 × 10 6 ) isolated from OT-II TCR-transgenic mice using the naive CD4 + T-cell isolation kit (Miltenyi Biotec) were injected intravenously into mice. Eight hours after the T-cell transfer, mice were immunized by an intravenous injection of 4 × 10 5 young bone marrow-derived DCs 26 pulsed with peptide ISQAVHAAHAEINEAGR, which is recognized by IA b -restricted OT-II cells, or peptide SIINFEKL, which is recognized by H2-K b -restricted OVA-specific CD8 + T cells (referred to as OVA-IIp or OVA-Ip, respectively). Alternatively, OVA-IIp emulsified in IFA was subcutaneously injected. Transfer of DCs pulsed with MuLV Env-gp70 H13.3 peptide SLTPRCNTAWNRL (EnvH13.3) was also performed for the vaccination against RMA tumour progression 21 . Labelling with CFSE (Dojindo) was performed according to the manufacturers' instructions.

Srauto citometrinė analizė

Tumour-infiltrated lymphocytes were prepared from tumours by enzymatic digestion with 2.5 mg ml −1 collagenase D (Roche) and 0.1 mg ml −1 DNase I (Sigma) for 30 min at 37 °C. Cell suspensions from blood, spleen, LNs and tumour were stained with the following antibodies for flow cytometric analysis: anti-CD11b (1:400), anti-Vβ5 (1:200), anti-CD8 (1:200), anti-CD4 (1:400), anti-CD27 (1:100), anti-CD25 (1:400), anti-CD69 (1:400) Abs and PerCP-streptavidin (1:400) were purchased from BD Biosciences. Anti-Ly6C, (Biolegend), anti-Gr-1 (1:100), anti-CD45.1 (1:200), anti-Ly6G (1:100), anti-CXCR3 (1:100), anti-CD127 (1:100), anti-PD-1 (1:100), anti-PD-L1 (1:200), anti-ICOS (1:200) and anti-OX40 (1:100) Abs were purchased from eBioscience. The H-2K b /SIINFEKL-OVA tetramer-PE was purchased from MBL (1:50). For cytokine staining, CD4 + T cells that were isolated from mice using anti-CD4 beads or from in vitro cultures were re-stimulated with OVA-IIp-pulsed DCs or Phorbol-12-Myristate-13-acetate/ionomycin, and then were stained with anti-IL-2 (1:400), anti-IL-17A (1:100), anti-IL-10 (1:100), anti-IFN-γ (2:100), (eBioscience) or anti- TNF-α Abs (1:400; Biolegend) 54 . Intracellular staining of IL-21 was performed by using IL-21R-Fc chimeric protein (R&D Systems) and fluorescein-conjugated anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch) 28 . Staining with anti-T-bet (1:200), anti-GATA-3(1:50), anti-RORγt (1:50), anti-Foxp3 (1:50) or anti-c-Maf Abs (1:100) were performed using the Transcription factor buffer set (BD Biosciences). Immunofluorescence images were analysed using the FACSVerse or FACSCalibur (Becton Dickinson). Data were analysed using FlowJo software (Treestar).

Realaus laiko kiekybinė PGR

Total RNA from isolated CD4 + T cells was extracted using the RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen), and then was reverse-transcribed with the ReverTra Ace (TOYOBO). Real-time quantitative PCR was performed in triplicate on the ViiA7 Real-Time PCR System with TaqMan probes and Master Mix reagents (Applied Biosystems). Each gene expression was normalized to the expression of mouse Gapdh on the basis of the comparative 2 [−ΔΔCT] method. TaqMan probes were as follows: c-maf (Mm02581355_s1), Tbx21 (Mm00450960_m1), Gata3 (Mm00484683_m1), Rorc (Mm01261022_m1), Foxp3 (Mm00475162_m1), Il10 (Mm01288386_m1), Bcl6 (Mm00477633_m1), Il17a (Mm00439618_m1), Il4 (Mm00445259_m1), Ifng (Mm01168134_m1), Il21 (Mm00517640_m1) and Gapdh (Mm99999915_g1).

Homeostatic expansion

To analyze homeostatic division, young and aged mice were lethally irradiated with 9.5 Gy in two doses of 4.75 Gy each, with a 6-h interval. These irradiated mice were then intravenously transferred with CFSE-labelled young OT-II cells (1 × 10 6 ).

Platinimo tyrimas

To assess the primary T-cell expansion, naive CD4 + T cells (2.5 × 10 4 per well) were isolated from homozygous Maf Ofl/Ofl mice or littermate control mice, and then stimulated with plate-coated anti-CD3 Ab (2 μg ml −1 ) and anti-CD28 Ab (5 μg ml −1 ). After 48 h of in vitro culture, T cells were pulsed with [ 3 H]-thymidine, and the incorporation of radiolabel was determined by counting radioactivity 18 h later.

Citokinų matavimas

CD62L lo effector CD4 + T cells were isolated using the CD4 + T-cell isolation kit, followed by negative selection with the CD62L MACS beads (Miltenyi Biotec) from mice that were transferred OT-II cells and immunized with OVA-IIp-pulsed DCs, and then the T cells (3 × 10 4 ) were re-stimulated with OVA-IIp-pulsed DCs for 36 h ex vivo . Cytokine levels in culture supernatants were measured using the custom Bio-Plex Pro assay kit and suspension array system (Bio-Rad). IL-6 and soluble IL-6R (sIL-6R) levels in serum, or IL-4 and IL-21 levels in supernatants were determined using the enzyme-linked immunosorbent assay (R&D systems).

For the mouse enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay (BD Biosciences), draining LN cells (1 × 10 5 cells per well) and bone marrow-derived DCs (3 × 10 4 ) pulsed with OVA-Ip, OVA-IIp, D b -binding MuLV GagL peptide (LCCLCLTVFL) or K b -binding Env peptide (SSWDFITV) 21 were added to wells of ELISPOT plates in triplicate and incubated for 12 h. IFN-γ spots were visualized with biotin-conjugated IFN-γ detection Ab, avidin-horseradish peroxidase and 3-amino-9-ethylcarbazole substrate reagent (BD Biosciences). ELISPOT plates were analysed using Eli photo (Minerva Tech, Tokyo, Japan).

In vitro Th1 differentiation

Naive T cells from young mice were stimulated with plate-bound anti-CD3 and anti-CD28 Abs (both eBioscience) in the presence of IL-12 (8 ng ml −1 ; Wako) at 2.5 × 10 5 cells ml −1 for 5 days. IL-6 (10 ng ml −1 ; Peprotech), IL-21 (20 ng ml −1 ; Wako), anti-IL-4 Ab (10 μg ml −1 ) and/or anti-IL-21 Ab (10 μg ml −1 ; R&D Systems) was added to the culture.

CD8 + T-cell suppression assay

CD62L lo effector CD4 + T cells primed in young or aged mice were isolated using CD4 isolation kit, followed by depletion of non-CD62L hi cells with CD62L MACS beads (Miltenyi Biotec). Sorted CD4 + T cells were co-cultured with CFSE-labelled naive CD8 + T cells in anti-CD3 and anti-CD28 Abs-coated plates at CD4 + /CD8 + T-cell ratios of 4:1. After 3 days, proliferation and IFN-γ production in CD8 + T cells were determined by CFSE dilution and intracellular IFN-γ staining, respectively. IL-10 activity was neutralized by the addition of anti-IL-10 Ab (10 μg ml −1 ).

Statistinė analizė

All statistical analyses were performed using Prism 4.0 software (GraphPad). Multiple group comparisons were performed by one-way analysis of variance followed by Tukey's post hoc tests. Data were also analysed using an unpaired Student's t -test when comparing two experimental groups. Mažesnės nei 0, 05 P vertės buvo laikomos reikšmingomis.

Papildoma informacija

How to cite this article: Tsukamoto, H. et al. IL-6-mediated environmental conditioning of defective Th1 differentiation dampens antitumour immune responses in old age. Nat. Bendruomenė. 6:6702 doi: 10.1038/ncomms7702 (2015).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi 1-7 paveikslai

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.