Nepriklausoma naviko kilmė dviem sinchroninės abipusės ląstelių inkstų ląstelių karcinomos atvejais | mokslinės ataskaitos

Nepriklausoma naviko kilmė dviem sinchroninės abipusės ląstelių inkstų ląstelių karcinomos atvejais | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vėžinė epigenetika
  • Inkstų ląstelių karcinoma

Anotacija

Dvišalės inkstų ląstelių karcinomos (RCC) yra klinikinio gydymo ir gydymo iššūkis. Dauguma dvišalių RCC yra atsitiktiniai ir neparodo paveldimo modelio, rodančio VHL sindromą ar kitus paveldimus vėžius. Šių atsitiktinių dvišalių RCC kilmė ir raida išlieka neaiški. Gavome normalius ir navikinius mėginius iš dviejų vyrų pacientų, kenčiančių nuo ankstyvos stadijos sinchroninio dvišalio skaidraus ląstelinio RCC (ccRCC), ir išanalizavome genominę DNR, naudodami visą egzomo seką ir bisulfito pirosekvenciją. Kiekvienam pacientui nustatėme skirtingą 3p heterozigotumo (LOH) praradimą abiejuose navikuose. Dviejų to paties paciento navikų VHL promotoriuje atsirado skirtingos vairuotojo mutacijos ir skirtingos CpG hipermetilinimo vietos. Be to, navikai pasižymi nepriklausomomis evoliucijos trajektorijomis. Todėl skirtingi 3p LOH kartu su neapibrėžtomis vairuotojo genų mutacijomis ir nepriklausomu VHL hipermetilinimu sąlygojo nepriklausomą naviko atsiradimą ir lygiagrečią dvišalio ccRCC evoliuciją šiems dviem pacientams. Mūsų rezultatai rodo, kad navikai šiais dviem atvejais atsirado ne dėl įprastų lytinių takų onkogeninių mutacijų. Tai buvo daugelio de novo mutacijų kiekviename inkste rezultatai, o ne pirminė ccRCC su priešinga inkstų metastaze. Todėl histopatologinis ir genetinis atskiro naviko mėginio profiliavimas gali nuvertinti dvišalių ccRCC mutacijos naštą ir somatinį heterogeniškumą.

Įvadas

Inkstų ląstelių karcinoma (RCC) sudaro 2–3% visų suaugusiųjų piktybinių navikų 1, 2 . RCC galima histologiškai suskirstyti į keletą potipių, o aiški ląstelių inkstų ląstelių karcinoma (ccRCC) sudaro 70–80% visų RCC 1 . Daugeliu atvejų RCC atsiranda viename inkste (vienišas RCC) ir pažengusiais etapais migruoja į kitus organus. Tačiau nedaugeliui pacientų (0, 7–4, 7%) RCC atsiranda abiejuose inkstuose (dvišalis RCC) 3, 4 . Sinchroninis dvišalis RCC (diagnozuotas kartu arba per 6 mėnesius nuo pirmojo pirminio naviko) pasireiškė 0, 3–2, 6% RCC pacientų 3, 5 . Metachroniniai dvišaliai RCC (diagnozuoti praėjus mažiausiai 6 mėnesiams po pirmojo pirminio naviko) išsivystė maždaug 0, 4% RCC sergančių pacientų 3, 6 . Panašus paplitimas pastebėtas ir Kinijos populiacijoje 7 . Dauguma dvišalių RCC yra atsitiktiniai ir neturi paveldimo modelio, rodančio Von Hippel-Lindau (VHL) sindromą, paveldimą papiliarinę inkstų karcinomą ar kitą paveldėtą vėžį 3 . Šių atsitiktinių dvišalių RCC kilmė ir raida vis dar neaiški. Dėl gyvybinės inkstų funkcijos šiems pacientams teikiama pirmenybė daline nefrektomija, nes radikali abiejų inkstų nefrektomija lemtų viso gyvenimo hemodializę 1, 8 . Esant tokioms aplinkybėms, pasikartojimo laipsnio ir galimo invaziškumo sumažinimas yra iššūkis. Todėl supratimas apie dvišalio RCC augliogenezę yra labai svarbus klinikiniam šio vėžio gydymui ir valdymui.

Pastaraisiais metais atliktais tyrimais, naudojant integruotą ir išsamų ccRCC genominį profiliavimą, buvo nustatyti svarbūs genetiniai ir epigenetiniai įvykiai, susiję su šiuo vėžiu. Daugelis žinomų įvykių dažnai būna subkloniniai, tuo tarpu VHL mutacija / hipermetilinimas ir 3p chromosomos heterozigotumo praradimas (3p LOH) yra vieninteliai nuosekliai pasitaikantys reiškiniai daugumoje ccRCC9. Todėl 3p LOH ir VHL mutacija / hipermetilinimas yra laikomi dviem vyraujančiais atsitiktinių ccRCC 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 pagrindiniais varikliais. VHL genas yra trumpoje 3-osios chromosomos dalyje. 3p LOH ir likusio VHL alelio nutildymas somatine mutacija arba promotoriaus hipermetilinimu lemia visišką VHL inaktyvaciją. Be VHL , dar trys ccRCC tvarkyklės genai, PBRM1 , BAP1 ir SETD2 , taip pat yra tarp 3p25 ir 3p21, bendroje 3p LOH vietoje ccRCC 12, 14 .

Pacientams, sergantiems VHL sindromu, daugialypės inkstų cistos ir karcinomos abiejuose inkstuose. VHL sindromas nustatytas 4, 3% dvišalių RCC 19 . Paveldimas VHL sindromas priskiriamas vieno VHL geno alelio gemalinės linijos mutacijai, o vėliau - pernešėjų gyvenimo metu - prarandant likusį laukinio tipo alelį 20 . Tačiau dauguma dvišalių RCC sergančių pacientų yra atsitiktiniai. Belieka išsiaiškinti, ar dažna lytinių takų mutacija lemia atsitiktinių dvišalių RCC vystymąsi, ar du navikai yra visiškai nepriklausomi. Šio darbo tikslas buvo ištirti sinchroninio dvišalio ccRCC kilmę ir raidą atliekant dviejų egzempliorių pavyzdžių visišką egzomo sekvenavimą (WES) ir bisulfito pirosequencing.

Rezultatai

Visas egzomo sekos nustatymas (WES)

Į šį tyrimą buvo įtraukti du pacientai vyrai (BC_1 ir BC_2), kenčiantys nuo ankstyvos stadijos sinchroninio dvišalio ccRCC (1 papildoma lentelė ir 1 pav.). Abu paciento BC_1 navikai buvo klasifikuojami kaip I stadijos navikai (pT1aN0M0) pagal inkstų ląstelių karcinomos TNM klasifikaciją, tuo tarpu paciento BC_2 navikai buvo šiek tiek labiau pažengę (pT1bN0M0) (1 papildoma lentelė) 21, 22 .

Image

( A ) KT tyrimas rodo naviko dydį ir dviejų inkstų perinefrines aplinkybes BC_1 atveju. ( B ) hematoksilino ir eozino (HE) dažymas dvišalėje ccRCC byloje BC_1. ( C ) dvišalio ccRCC CT nuskaitymo vaizdai tuo atveju, kai BC_2. ( D ) dvišakio ccRCC dažymas HE, esant BC_2. Rodyklė, navikai. Mastelio juostos, atliekant KT nuskaitymą, 5 cm; skalės juostos HE dažymu, 10 μm.

Visas dydis

Atliekant genetinę analizę, WES buvo pasirinktas vienas regionas su homogenine makroskopine išvaizda iš kiekvieno naviko. Mes taip pat surinkome pilvaplėvės audinius (normalų inkstų audinį), skirtus WES, ir panaudojome juos kaip atskirą somatinę mutaciją nuo lytinių ląstelių variantų navikuose. Iš paciento BC_1 auglio mėginiai BC_1R ir BC_1L buvo paimti atitinkamai iš dešiniojo ir kairiojo inksto, tuo tarpu BC_1P buvo paimti iš normalaus pilvaplėvės audinio dešiniajame inkste. Panaši nomenklatūra buvo taikoma pacientui BC_2.

Visų šių mėginių vidutinis gylis buvo 50 × ar didesnis. Daugiau nei 80% tikslinių bazių buvo padengta bent 10 skaitymų. Iš viso 413 egzomo variantų sudarė 360 pavienių nukleotidų variantų (SNV) ir paciento BC_1 buvo aptikti 53 įterpimai / delecijos (indeliai). Paciento BC_2 buvo 401 egzomo variantas, kurį sudarė 352 SNV ir 49 indeliai (2 papildoma lentelė). Norint patvirtinti WES duomenis, PGR ir Sangerio sekos buvo atliktos 11 variantų alelių (įskaitant SNV ir indelius), aptiktų vairuotojo genuose arba reikšmingai mutavusių genų ccRCC, kiekviename iš trijų atitinkamo paciento mėginių. Viena NAV3 mutacija BC_2L pavyzdyje nebuvo patvirtinta, o įvertintas patvirtinimo laipsnis yra 97% (3 papildoma lentelė).

Abiejų abiejų ccRCC pacientų navikai išskiria 3p LOH reiškinius

Kadangi 3p LOH yra vienas iš ccRCC atsiradimo įvykių, mes siekėme nustatyti galimus LOH įvykius kritiniuose regionuose, analizuodami somatinių kopijų skaičiaus aberacijos (SCNA) profilius, rekonstruotus iš WES duomenų. Iš tiesų, abiejų pacientų BC_1 navikai rodė 3p LOH, nors profiliai skiriasi. Kairiojo naviko (BC_1L) atveju buvo vienas lūžio taškas, pažymėtas 3p12, 2 (arti pseudogeno CYP51A1P1 ) (2A pav.). Dėl naviko BC_1R 3p chromosomoje buvo du SCNA segmentai. Vienas segmentas apėmė VHL (3p25.3-3p25.1, nuo TTLL3 iki CAPN7 ), o kitas aprėptis - ccRCC tvarkyklės genai SETD2 , PBRM1 ir BAP1 (3p22.3-3p14.3, nuo CNOT10 iki DENND6a ) (2A pav.) . Pacientui BC_2 3 chromosomoje nepastebėta didelio masto SCNA segmentų; tačiau vietoje to buvo aptikta daug židinio įvykių (2 pav.). Be to, šie du navikai pasižymėjo skirtingais židinio SCNA profiliais. Naviklyje BC_2R židininės SCNA buvo regionuose, apimančiuose VHL , SEDT2 , PBRM1 ir BAP1 , tuo tarpu židinio SCNA buvo aptiktos tik regione, apimančiame VHL , kairiajame auglyje (BC_2L) (2B pav., C).

Image

( A ) Nukopijuokite keturių navikų 3 chromosomos skaičių profilius. ( B, C ) Židinio kopijų skaičiaus profiliai, apimantys ccRCC tvarkyklės genus 3p chromosomoje. Y ašis yra log2 R, o X ašis žymi padėtį išilgai 3 chromosomos hg19. X rodo apytikslę centromero padėtį. Raudonos linijos, vidutinis variantinių alelių Log 2 R, apskaičiuotas naudojant apskrito dvejetainio segmento (CBS) algoritmą, rodo atitinkamų chromosomų segmentų kopijų skaičių.

Visas dydis

Be 3 chromosomos, BC_1 buvo rasta ir kitų chromosomų SCNA. Naviklyje BC_1R buvo didelio masto SCNA segmentai 16, 20 ir 22 chromosomose, o auglyje BC_1L buvo prarasta viena visos 6 ir 14 chromosomos kopija (papildomas 1 paveikslas). Paciento BC_2 navikuose didelio masto SCNA segmentų nepastebėta (2 papildomas paveikslas).

Skiriamos VHL mutacijos ir hipermetilinimo vietos jo promotoriaus regione

Toliau mes ištyrėme VHL geną dėl galimų mutacijų iš mūsų WES duomenų. Abiems pacientams VHL normaliuose pilvaplėvės audiniuose nenustatyta nesinoniminių mutacijų, kurios buvo patvirtintos atlikus Sangero seką visus 3 šio geno egzonus ir sujungimo vietas. Šis rezultatas rodo, kad skirtingai nuo VHL sindromo, lytinių ląstelių mutacija VHL gene nebuvo šių dviejų pacientų ccRCC priežastis. Įdomu tai, kad navikas BC_1L turėjo žalingą rėmo poslinkio ištrynimą VHL , tačiau auglyje BC_1R arba normaliame pilvaplėvės audinyje (BC_1P) nebuvo nustatyta VHL mutacijų (3 pav. Ir 4 ir 5 papildomos lentelės). Abiejų navikų VHL geno promotoriaus sritis buvo hipermetilinta; tačiau CpG vietos su dideliu metilinimo lygiu buvo skirtingos tarp dviejų navikų (4 pav.). Pacientui BC_2 navikas BC_2R turėjo žalingą rėmo poslinkio ištrynimą VHL , tuo tarpu auglio BC_2L VHL promotoriuje buvo aptiktos CpG vietos su dideliu metilinimo lygiu (3 ir 4 pav.). Visos VHL mutacijos buvo patvirtintos atliekant Sangerio seką (3 papildoma lentelė). Todėl navikai šiems dviem pacientams, turintiems sinchroninius dvišalius ccRCC, neturėjo bendrų VHL mutacijų.

Image

( A ) BC_1 mutacijos. ( B ) Mutacijos BC_2 atveju. Mėlyna rodo mutacijų buvimą.

Visas dydis

Image

( A ) CpG salų schema VHL rėmėjų regione. Pirmasis vertimo pradinio kodono A, esančio 1 egzone, pirmasis A buvo pažymėtas kaip 1 padėtis. ( B ) 11 CpG vietų DNR metilinimo lygis, pateiktas C%% pirozės nustatymo duomenyse.

Visas dydis

Įdomu tai, kad dviem pacientams, turintiems metachroninius dvišalius ccRCC (pacientams BC_3 ir 4), mes taip pat stebėjome skirtingas VHL mutacijas iš Sanger sekos rezultatų (1 ir 6 papildomos lentelės). Panašiai kaip dviem sinchroniniais dvišaliais ccRCC atvejais, lytinių takų VHL mutacija nebuvo pastebėta. Paciento BC_3 organizme 4 eksonogramoje dešiniajame navike buvo aptiktas SNV, turintis neigiamą poveikį baltymų funkcijai (PROVEAN balas = −4, 53) 2 egzone, tuo tarpu kairiajame auglyje nustatyta 3 eksono ekspozicijos kadrų pašalinimas. Pacientui BC_4 kairiajame naviklyje buvo 1 eksono ekspozicijos rėmo įterpimas, tuo tarpu dviejose skirtingose ​​tiriamojo dešiniojo naviko vietose VHL mutacija nebuvo nustatyta (6 papildoma lentelė).

Skiriamos nesinoniminės somatinės mutacijos ir evoliucijos trajektorijos

Toliau mes išanalizavome kitas nesinonimines ir besiribojančias somatines navikų mutacijas, apibrėžtas mūsų WES duomenimis (4 papildoma lentelė). Genai buvo suskirstyti į penkias kategorijas pagal paskelbtus kriterijus: 1, ccRCC vairuotojo genai; 2, žymiai mutavę genai ccRCC; 3, genai su mutacijomis, susijusiomis su ccRCC; 4, kiti vėžio genai; 5, nežinomos reikšmės vėžiui genai 12, 13, 14, 23 . Du paciento BC_1 navikai patyrė skirtingas genų mutacijas iš visų penkių kategorijų (3 pav.). BC_1 navikuose nebuvo jokių žalingų vairuotojo genų mutacijų, išskyrus VHL . Vairuotojo KDM5c geno, esančio BC_1L , SNV turi tik neutralų poveikį jo baltymų funkcijai ((PROVEAN balas = −1, 77, 5 papildoma lentelė). Todėl 3p LOH ir rėmelio poslinkio trynimas / hipermetilinimas VHL sąlygojo naviko BC_1L naviko augimą, tuo tarpu LOH 3p segmentas, apimantis VHL, ir VHL promotoriaus hipermetilinimas buvo du auglio BC_1R pagrindiniai faktoriai.

Pacientui BC_2 navikas BC_2L patyrė žalingą kadrų poslinkio ištrynimą PTEN , dar viename ccRCC variklyje. Įdomu tai, kad nesinoniminis SNV buvo GRB7 , reikšmingai mutavusio geno ccRCC, tiek navikuose, tiek pilvaplėvės audiniuose (3 pav.). Tačiau prognozuojamas neutralus šio SNV poveikis (PROVEAN balas = -2, 78) rodo, kad mažai tikėtina, kad jis turės įtakos jo baltymo funkcijai, atmesdamas galimą šio paciento ankstyvųjų dvišalių ccRCC mutacijų vaidmenį (5 papildoma lentelė). . Visi šie duomenys rodo, kad paciento BC_2 navikai neturėjo bendrų pradinių vairuotojo mutacijų.

Ne sinoniminės ir nesusiejančios vietos mutacijos, kurių genai nežinomi, reikšmingi vėžiui, taip pat skyrėsi tarp dviejų paciento BC_1 navikų (iš viso 25 genai, 3A pav.). Pacientui BC_2 tarp dviejų navikų pasidalijo tik viena iš 54 šios kategorijos genų mutacijų (3 pav. B). Šis genas IGHV3–30 koduoja imunoglobulino sunkiosios grandinės kintamąją sritį ir neturi jokio ryšio su ccRCC navikogeneze ir su ja susijusiais keliais.

Nesinoniminių ir besiribojančių somatinių mutacijų šiems dviem pacientams yra nedaug, palyginti su ankstesniais pranešimais su didesnėmis grupėmis ir labiau pažengusiomis ccRCC, greičiausiai dėl ankstyvos naviko stadijos. Norėdami toliau palyginti dviejų navikų raidą tais pačiais pacientais, išanalizavome visų variantų alelių dažnį (VAF) (išskyrus žinomus aukšto dažnio SNV ir indelius viešosiose duomenų bazėse), atskirtus nuo WES duomenų. Alelių dažnis keičiasi vėžio evoliucijos metu dėl stochastinių procesų 13, 24 . Todėl VAF, apskaičiuotas suskaičiavus iliuminacijų sekų, gautų kiekvienam alelio variantui, skaičių, gali būti naudojamas kaip vėžio progresavimo ir heterogeniškumo rodiklis. Varianto aleliams, dalijamiems tarp navikų ir normalaus audinio paciento BC_1, dviejų navikų VAF yra labai koreliuojami (r = 0, 80), kas rodo jų bendrą kilmę kaip lytinių ląstelių variantai (5A pav.). Tačiau tam tikram navikui būdingų alelių (kurių nėra normaliame audinyje) dažniausiai buvo aptikta tik viename navike (237 iš 253 alelių VAF viename navike buvo> 0, 1, o kitame - VAF = 0). Apskritai navikui specifiniai VAF yra neigiamai koreliuojami (r = –0, 86) (5B pav.). Panašus VAF pobūdis buvo stebimas ir paciento BC_2, kai 152 iš 169 navikui būdingų variantų buvo stebimas tik vienas navikas (r = –0, 81) (5 pav., C). Šie rezultatai kartu rodo, kad du dvišalių ccRCC navikai turi aiškias evoliucijos trajektorijas.

Image

( A, B ) Mutacijos BC_1 atveju. ( C, D ) Mutacijos BC_2 atveju. ( A, C ) lytinių takų variantai. ( B, D ) navikams būdingos mutacijos. Kiekvienas taškas žymi WES aptiktą alelio variantą. Kiekvieno taško vertė apskaičiuojama kaip alelio gylis / bendras gylis. Juodi taškai žymi SNV, o raudoni taškai - indelius. r , Pirsono koreliacijos koeficientas; p <0, 05, statistiškai reikšmingas.

Visas dydis

Su vėžiu susijusių kelių konvergencija

Nepaisant abiejų dvišalių ccRCC sergančių pacientų genetinių skirtumų, visų keturių navikų nesinoniminės ir jungiamosios vietos mutacijos parodė su vėžiu susijusių funkcijų konvergenciją, įskaitant ubikvitino tarpininkaujamą proteolizės kelią, PI3K-Akt-mTOR signalizacijos kelią ir kitus. su keliu susiję keliai (6 pav. ir 7 papildoma lentelė). Pavyzdžiui, navikas BC_1L ir navikas BC_2R patyrė rėmo poslinkio delecijas VHL, kurių baltymų produktas pasižymi E3 ubikvitino ligazės aktyvumu 25, o KDM5C baltymo produktas (mutavęs auglyje BC_1L) sąveikauja su RING1, E3 ligaze ubiquitino kelyje. Navikas BC_2R sukėlė WWP1 mutaciją, koduojančią E1 ligazę . Įdomu tai, kad, nors navikams BC_1R ir BC_2L nebuvo nustatyta VHL mutacija, UBE2Q2 ir PARK2 , dviejų genų, dalyvaujančių ubikvitino sukeltoje proteolizėje, mutacijos buvo atitinkamai šiuose dviejuose navikuose.

Image

Genai, kurių mutacijos aptiktos navikų mėginiuose, yra mėlynos spalvos.

Visas dydis

PI3K-AKT-mTOR signalizacijos kelias yra dar vienas svarbus būdas, susijęs su ccRCC. Navikas BC_2L turėjo rėmelio poslinkio mutaciją PTEN , koduojančią fosfatazę, kuri defosforiluoja ir inaktyvuoja Akt. Navikas BC_1R sukėlė PTENP1 , geno, esančio PTEN , mutaciją, koduojančią nekoduojančią RNR, neigiamai reguliuojančią PTEN raišką 26, 27 . FGF10 mutacija buvo nustatyta auglyje BC_1L. FGF10 gali suaktyvinti PI3K-Akt signalizaciją per FGFR. Naviklyje BC_2R nebuvo nustatyta genų, dalyvaujančių šiame kelyje, mutacijų.

Be ubikvitino tarpininkaujamo proteolizės kelio ir PI3K-AKT-mTOR signalizacijos kelio, taip pat buvo nustatyti kiti genai, dalyvaujantys vėžio keliuose. Pavyzdžiui, auglyje BC_1L buvo PTCH1 , geno, reguliuojančio ląstelių proliferaciją, mutacija. Navikas BC_2L sukėlė SMAD1 , geno, reguliuojančio ląstelių išgyvenimą, mutaciją. Nepaisant didelių genetinių skirtumų tarp navikų dvišaliuose ccRCC, vėžio progresavimo keliai suvienodėja, o tai rodo, kad evoliucinė atranka ir adaptacija kontroliuoja vėžio progresavimą esant didelei mutacijų įvairovei.

Diskusija

Pateikiame dviejų atsitiktinių ankstyvosios stadijos atvejų sinchroninių dvišalių ccRCC WES analizę ir bisulfito pirosekvansavimą, jei nėra VHL sindromo. Abiem atvejais du to paties paciento navikai turėjo skirtingas vairuotojo mutacijas. Svarbių genų, įskaitant VHL ir PTEN , mutacijos buvo tik viename navike kiekvienam pacientui. Tų pačių pacientų navikų mėginiuose hipermetilinamos skirtingos VHL promotoriaus CpG vietos, tai rodo, kad naviko VEN promotoriaus hipermetilinimas navikogenezės metu. Nors abipusio ccRCC sergančių pacientų abiejų navikų atvejais atsirado 3p LOH, jie buvo nepriklausomi genetiniai pažeidimai. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad nebuvo bendrų įkūrėjų įvykių, susijusių su šių sinchroninių dvišalių ccRCC kilme. Dvišaliai ccRCC atsiranda ne dėl gemalo linijų mutacijų ar de novo somatinių mutacijų ankstyvajame embriono vystymosi etape.

Intraumorinis heterogeniškumas (ITH) dažniausiai stebimas vienišose ccRCC, ypač labiau pažengusiose stadijose. Skirtingi regionai vienišuose ccRCC su ITH turi bendrus įkūrėjo vairuotojo įvykius, 3p LOH ir VHL mutacijas / hipermetilinimą. Jie turi skirtingas mutacijas kituose genuose, įskaitant vairuotojo geną SETD2 , PBRM1 ir BAP1 13, 28 , 29, 30 . Vis dėlto genetiniai navikų skirtumai sinchroninių dvišalių ccRCC atvejais nėra visiškai dėl ITH. Šiais dviem atvejais du to paties paciento navikai nepažeidė tų pačių pradinių vairuotojo mutacijų, 3p LOH ir VHL mutacijos / hipermetiliacijos, ir tai rodo jų nepriklausomą naviko kilmę. Todėl mažai tikėtina, kad jie buvo pirminiai ccRCC su priešinga inkstų metastaze. Įdomu tai, kad metachroniniame dvišaliame ccRCC paciente BC_3 keturiuose dešiniojo naviko regionuose buvo ta pati VHL mutacija, o kairiajame navike buvo skirtinga VHL mutacija, kas rodo, kad skirtingi dešiniojo naviko regionai turėjo bendrą kilmę, o kairysis navikas buvo nepriklausomas. Ar dabartiniai WES duomenys negali aiškiai atskirti, ar kitų genų variantų skirtumus lemia ITH, ar lygiagreti naviko evoliucija; tačiau labiau tikėtina, kad tai yra nepriklausomos naviko evoliucijos rezultatai, atsižvelgiant į nepriklausomą navikų kilmę šiais dviem atvejais.

Šios retos vėžio formos genetinė analizė suteikia unikalią galimybę ištirti naviko evoliuciją. Mūsų rezultatai rodo, kad atsitiktinis sinchroninis dvišalis ccRCC gali būti daugybinių de novo mutacijų kiekviename inkste rezultatas, o ne įprastos lytinių takų onkogeninės mutacijos, kaip plačiai žinomos dvišalės retinoblastomos ir VHL sindromo pasekmė. Dėl atskirų somatinių mutacijų, susiliejančių keliais bendrais svarbiais signalizacijos keliais, atsiranda RCC, turinčių identiškas histopatologines savybes. Tas pats organas (inkstai) nustato histologinius apribojimus ribotame diapazone, kai atsiranda ir vystosi dvišaliai RCC. Norint patvirtinti mūsų išvadas, būtina atlikti nuodugnesnę tokių pacientų analizę. Be to, būtų įdomu ištirti kitų dvišalių organų, įskaitant krūtis ir plaučius, vėžį, kad būtų galima patvirtinti, kad vieno paciento navikogenezė yra nepriklausoma.

Mūsų išvados, kad atsitiktiniai sinchroniniai dvišaliai ccRCC gali turėti nepriklausomą naviko kilmę ir evoliucija turės keletą svarbių klinikinių padarinių ikiklinikinių vaistų srityje. Šie stebėjimai taip pat rodo, kad reikia optimizuoti naviko mėginių ėmimą vertinant ccRCC 9 genomo kraštovaizdį. Pirmiausia histopatologinis ir genetinis atskirų navikų mėginių profiliavimas gali nuvertinti dvišalių vėžių mutacijos naštą ir somatinį heterogeniškumą. Navikų biopsija iš abiejų pusių yra būtina ne tik norint nustatyti specifinius biomarkerius, bet ir atlikti genetinę analizę, siekiant palengvinti klinikinių sprendimų priėmimą vėlesniame gydyme. Antra, pacientams, kuriems nerekomenduojamos jokios chirurginės galimybės, sistemingas gydymas, pavyzdžiui, chemoterapija ir ląstelių imunoterapija, paremtas vienu naviku, gali būti neefektyvus augliui priešingoje pusėje ir jo dariniams. Trečia, nors dvišalės karcinomos gali apimti savitas somatines mutacijas, naviko evoliucijos trajektorijos susilieja ribotu skaičiumi signalizacijos kelių. Vaistai, nukreipti į bendrą kelią, gali būti veiksmingesni sistemingai gydant šiuos pacientus.

Metodai

Pavyzdžiai

Į šį tyrimą, kurį patvirtino Pekino draugystės ligoninės etikos komitetas (registro numeris BJFH-EC / 2013-079), dalyvavo trys pacientai vyrai ir viena moteris su dvišaliu ccRCC. Visos procedūros buvo vykdomos laikantis patvirtintų gairių. Iš visų keturių pacientų buvo gauti rašytiniai informuoti sutikimai. Visi atvejai buvo atsitiktiniai ir nežinoma šeimos istorija. Nebuvo nustatyta inkstų cistų ar navikų kituose organuose, pavyzdžiui, tinklainėje ir smegenyse, atmetant VHL sindromo galimybę. Dalinė nefrektomija buvo atliekama dviem etapais, trijų mėnesių pertrauka, kad būtų pašalinti navikai (po vieną kiekvienoje stadijoje). Vėliau atlikta histopatologinė analizė patvirtino visus aštuonis navikus kaip ccRCC (1 pav. Ir 3 papildomas paveikslas). Nefrektomijos metu buvo gauti ir perdirbti švieži užšaldyti arba į parafiną įterpti audinių mėginiai (kiekvienas 0, 5–0, 8 cm). Pacientui BC_1 iš kairiojo inksto buvo paimti švieži užšaldyto naviko BC_1L ir pilvaplėvės audinio BC_1P (normalus pilvaplėvės audinys) mėginiai. Dešinysis naviko mėginys BC_1R buvo įterptas parafinu. Paciento BC_2 dešiniojo naviko mėginys BC_2R ir pilvaplėvės mėginys BC_2P buvo šviežiai užšaldyti. Kairysis naviko mėginys BC_2L buvo įterptas parafinu. BC_3 ir BC_4 pacientams visi mėginiai buvo šviežiai užšaldyti. BC_3R1, BC_3R2, BC_3R3 ir BC_3R4 buvo paimti iš keturių atskirų paciento BC_3 dešiniojo naviko regionų, parodančių šio naviko erdvinį mastą ir jo morfologinį nevienalytiškumą. BC_4R1 ir BC_4R2 buvo išpjaustytos iš dviejų skirtingų regionų, esančių dešiniajame paciento BC_4 navike. Normalūs pilvaplėvės audiniai buvo imami kaip kiekvieno naviko atskaitos taškai (BC_3RP, BC_3LP, BC_4RP ir BC_4LP). Iš kiekvieno naviko buvo paimtas suderintas mėginys histopatologiniam įvertinimui. Šio pranešimo metu visi keturi pacientai išgyvena visišką remisiją.

Visa egzomo seka

Genominė DNR buvo išgauta iš audinių mėginių, naudojant „Qiagen DNeasy“ rinkinį pagal gamintojo protokolą. WES buvo atliktas paciento BC_1 ir BC_2 DNR mėginiams. „Genewiz, Inc.“ (Pekinas) atliko pirminį kokybės kontrolės vertinimą ir paskesnį egzomo užfiksavimą naudodamas „Illumina TruSeq Exome Enrichment“ rinkinį. Visi mėginiai buvo padalinti poriniais galais (2x100) ant „Illumina Hiseq 2500“ platformos, kad vidutinis taikinio gylis būtų didesnis nei 50 ×. WES duomenys buvo perduoti NCBI, naudojant „BioProject ID“ PRJNA295344.

Duomenų sekos apdorojimas

„Genewiz, Inc.“ (Pekinas) suplanuotiems skaitymams buvo atlikta kokybės kontrolė prieš derinant juos su etaloniniu žmogaus genomu (hg19), naudojant „Burrows-Wheeler“ suderinimą (BWA, versija 0.6.2-r126) ir „SAMtools“ (0.1.18 versija (r982)). : 295)). Pasikartojantys skaitymai buvo pašalinti naudojant įrankius „SAMtools“. Pakartotinis nustatymas ir pakartotinis kalibravimas buvo atlikti naudojant „Genomo analizės įrankių rinkinį“ (GATK, versija 2.3–9-ge5ebf34). Pavienių nukleotidų variantai (SNV) ir indeliai buvo vadinami naudojant GATK su numatytuoju nustatymu. Variantų skambučiai buvo filtruojami (kiekvieno alelio, kurio 5≤ gylis ≤ 150, bendras etaloninio alelio gylis ir alternatyvaus alelio ≥ 15), siekiant pašalinti variantus blogai suderintais rodmenimis arba su sekos paklaidomis. Žinomi aukšto dažnio SNV ir indeliai buvo filtruojami naudojant dbSNP ir 1000 g. Somatiniai SNV ir indeliai navikų mėginiuose buvo aptikti kaip atskaitos taškas naudojant atitinkamą normalų audinį. Norint patvirtinti WES ir iškvietimo tikslumą, PGR ir Sangerio seka buvo atliekama iš viso 11 alelių variantų (kiekvienam iš visų trijų atitinkamo paciento mėginių).

SCNA profilio analizė

Neapdoroti navikų pavyzdžių skaičiavimai buvo gauti iš WES duomenų, naudojant VarScan2 su numatytaisiais 31 nustatymais. Neįtraukti žemo matomumo regionai ir lytinės chromosomos. Pakoregavus log 2 reikšmes GC turiniui, DNRkopijos pakete buvo pritaikytas apskrito dvejetainio segmento (CBS) algoritmas, norint segmentus atskirti pagal kopijos numerį (pažymėtą kaip raudona linija) ir nustatyti reikšmingus pokyčių taškus 31, 32 . Vėliau sujungti panašaus egzemplioriaus numerio segmentai. Segmentai, apimantys ≥25% chromosomos rankos, buvo laikomi didelio masto; kitaip buvo klasifikuojami kaip židiniai 31 .

Baltymų funkcijos mutacijų įvertinimas

Baltymų kitimo efekto analizatorius (PROVEAN) buvo naudojamas SNV ir indelių poveikiui baltymų funkcijai įvertinti. Mutacijos, kurių balas mažesnis nei −4, 1 (tikimybė> 90, 3%, jautrumas 57, 6%), buvo laikomos žalingomis 33 .

Bisulfito modifikavimas, PGR ir DNR pirosekvantavimas

Bisulfito konversijai atlikti, naudojant ‚EpiTect Bisulfite kit“ (QIAGEN), pagal Vartotojo vadovą, buvo apdorota 1, 2 μg genomo DNR. Bisulfito konversija buvo atlikta terminiu cikleriu, naudojant nurodytas ciklo sąlygas. Modifikuota DNR buvo surišta į „EpiTect“ verpimo kolonėles, du kartus plaunama, desulfonuojama ir po to eliuuojama 20 μl tūrio. Bisulfitu konvertuota DNR buvo panaudota nedelsiant arba laikoma –20 ° C temperatūroje.

BIS sulfitu konvertuotos DNR amplifikacija buvo atlikta naudojant PyroMark PCR rinkinį (QIAGEN). Pradmenys PGR amplifikacijai buvo suprojektuoti naudojant „Methyl Primer Express v1.0“ (8 papildoma lentelė). Visi pradmenys buvo CpG salose, VHL promotoriaus regione. PGR reakcija buvo naudojama tokiomis sąlygomis: 95 ° C 15 minučių, po to 45 ciklai: (95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s) ir 72 ° C 10 min.

Pirozės nustatymas buvo atliktas siekiant įvertinti VHL promotoriaus regiono metilinimo lygį naudojant „PyroMark Q96 ID“ ir „PyroMark Gold Reagent Kit“ (QIAGEN) pagal Vartotojo vadovą. Pirozės didinimo pradmenys buvo sukurti naudojant „Pyromark“ tyrimo projektą (8 papildoma lentelė). 50 μl PGR produkto buvo pridėta prie bendro 50 μl reakcijos tūrio, kuriame yra rišamasis buferis ir sepharose granulės. Reakcijos mišinys maišomas 10 minučių kambario temperatūroje, kad būtų lengviau granulėms prisirišti prie biotinilintos vienos grandinės DNR. Po to biotinilinta DNR buvo išleista į PyroMark plokštelę, kurioje kiekvienoje buvo sekveneravimo gruntas su atkaitinimo buferiu, esant 45 μl reakcijos tūriui. Mišinys denatūruotas 2 minutes 80 ° C temperatūroje ir pakartotinai atkaitintas kambario temperatūroje. Plokštė buvo įdėta į PyroMark Q96 ID ir buvo paleista su atitinkamu paleidimo failu. Bylų pogrupiai buvo pakartotinai išanalizuoti naudojant pakartotinius PGR ir po to atlikus pirozės nustatymą, kad būtų patvirtinti pradiniai rezultatai.

Kelio analizė

Iš viso keliuose komentuojama 47 genai. Informacija apie genų anotacijas buvo gauta Kioto genų ir genomų enciklopedijoje (KEGG) ir „Reactome“. Mutantiniai genai taip pat buvo išbandyti programoje STRING, kad būtų galima numatyti baltymų sąveiką.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Ji, Z. et al . Nepriklausoma naviko kilmė dviem sinchroninės dvišalės aiškios ląstelės inkstų ląstelių karcinomos atvejais. Mokslas. Rep. 6, 29267; „doi“: 10.1038 / srep29267 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.