Atskiri amiloido beta agregatai sukelia laikiną kalcio antplūdį per neuronų ląstelių membraną | mokslinės ataskaitos

Atskiri amiloido beta agregatai sukelia laikiną kalcio antplūdį per neuronų ląstelių membraną | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Iš esmės netvarkingi baltymai
  • Neurodegeneracinės ligos

Anotacija

Vietinis amiloidinių beta oligomerų tiekimas iš nanopipetės galiuko, kontroliuojamas per ląstelės paviršių, buvo naudojamas fiziologinėms pikomolinėms oligomerų koncentracijoms pristatyti į pirminius astrocitus ar neuronus. Kalcio antplūdis buvo pastebėtas, kai į ląstelės paviršių pateko tik 2000 oligomerų. Nutraukus oligomerų dozavimą, tarpląstelinis kalcis vėl atsidūrė baziniame ar žemesniame lygyje. Kalcio antplūdžiui buvo išvengta tarpląstelinio chaperono klasterino, kuris, kaip žinoma, selektyviai suriša oligomerus, ir tam tikro nanodalelio amiloido beta sudėtyje. Šie duomenys atitinka atskirų oligomerų, didesnių nei trimeriai, sukeliančių kalcio patekimą, kai jie kerta ląstelės membraną, rezultatą, pagrįstą vaizdavimo eksperimentais su dvisluoksniais sluoksniais, ir rodo, kad pradinis molekulinis įvykis, sukeliantis neuronų pažeidimą, neturi jokių ląstelių receptorių, priešingai. dirbti daug didesnėmis oligomerų koncentracijomis.

Įvadas

Patologinis Alzheimerio ligos (AD) požymis yra tarpląstelinių plokštelių, sudarytų iš amiloidinių beta fibrilių, buvimas hipokampo ir smegenų neokortekso 1, 2, 3 . Amiloidas beta (Aβ) susidaro proteolitiškai perdirbant transmembraninį amiloido pirmtako baltymą beta ir gama sekretazėmis. Jis kaupiasi, sudarydamas mažus oligomerus, kurie po to savaime kaupiasi į protofibrilius ir fibrilius, kurie kaupiasi kaip plokštelės. Yra svarių įrodymų, kad pačios plokštelės nėra toksiškos; iš tikrųjų atrodo, kad tikrieji toksiškumo veiksniai yra mažai tirpūs oligomerai 4, 5, 6, 7 . Nors Aβ yra susijęs su Alzheimerio liga nuo devintojo dešimtmečio pradžios, pagrindinis Aβ oligomerų taikinys ir jų toksiškumo mechanizmas vis dar nėra aiškus ir apima specifinį prisijungimą prie daugybės ląstelių receptorių, taip pat ląstelių membranos sutrikimą ir porų susidarymą. ląstelės membrana 8, 9 . Šis svarbus klausimas iki šiol nebuvo išspręstas dėl daugelio veiksnių. Pirma, trūko metodų, kaip atkurti ir apibūdinti Aβ oligomerus, ir, antra, eksperimentai, skirti nustatyti šių oligomerų sąveiką su ląstelėmis, dažnai atliekami esant daug aukštesnėms oligomerų ir monomerų koncentracijoms nei tos, kurios atsiranda fiziologinėmis sąlygomis. Be to, daugybė ląstelių reakcijų per šiuos eksperimentus stebimos minutėmis ar valandomis, įskaitant ląstelių žūtį, todėl kyla klausimų, kodėl ligai išsivystyti reikia dešimtmečių.

Anksčiau eksperimentai buvo atlikti tiesiogiai naudojant Alzheimerio liga sergančių žmonių smegenų stuburo skystį (CSF) be jokių paruošimo žingsnių. Tai parodė, kad esantys Aβ oligomerai gali sukelti ilgalaikį smegenų skiltelių potenciacijos deficitą, kurio galima išvengti pridedant antikūnų prie Aβ 10 . Įrodyta, kad Alzheimerio liga sergantiems pacientams CSF sukelia toksinį poveikį ląstelėms, kurių galima išvengti pridėjus fiziologinius tarpląstelinių chaperonų 11, tokių kaip klasterinas, kiekį. Be to, neseniai buvo sukurtas jautrus ELISA pagrįstas metodas, skirtas tiesiogiai išmatuoti Aβ oligomero koncentraciją KSF, ir buvo naudojamas parodyti, kad tai yra maždaug 0, 5 pM pacientams, sergantiems Alzheimerio liga 12 . Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad mažos pM Aβ oligomerų koncentracijos gali sukelti neuronų pažeidimus, tačiau nebuvo pranešta apie šių mažų koncentracijų pažeidimo mechanizmo tyrimus.

Mes taip pat anksčiau tyrėme sintetinių Aβ 40 ir Aβ 42 oligomerų poveikį pirminėms neuronų ląstelėms kaip 13 oligomerų dozės funkciją. Šiame tyrime mes naudojome fluoroforu pažymėtą peptidą, kad būtų galima panaudoti vienos molekulės fluorescencijos aptikimą šiuose eksperimentuose naudojamų oligomerų koncentracijai ir santykiniam dydžiui apibūdinti. Oligomerų dydis svyravo nuo dimerų iki 30 memerų, eksponentiškai mažėjant kartu su oligomero dydžiu, taigi dauguma oligomerų buvo maži, mažiau kaip 10 milimetrų oligomerai. Mūsų rezultatai rodo, kad esant 200 oligomerų oligomerų koncentracijai astrocituose, bet ne neuronuose, galima stebėti kalcio virpesius, kai koncentracija yra 100 kartų didesnė nei oligomerų koncentracija žmogaus CSF 12 . Kalcio virpesiai, atsirandantys dėl tarpląstelinio kalcio patekimo į ląstelę, paskatino reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamybą ir kaspazės 3 aktyvaciją tiek astrocituose, tiek neuronuose. Šie duomenys atitinka ankstesnius tyrimus, kurie rodo, kad pirmieji Aβ oligomerų paveikti ląstelių tipai yra 14, 15 astrocitai.

Šiame darbe mes panaudojome nanopipetę, kad lokaliai pateiktume Aβ oligomerus į astrocitus, kad būtų galima kontroliuoti oligomerų, esančių kiekvienoje ląstelėje, vietą ir skaičių, kad būtų galima gauti išsamesnių žinių apie oligomerų sukelto kalcio antplūdžio molekulinę bazę ir kaip tai priklauso apie oligomerų, su kuriais susiduria ląstelė, skaičių. Eksperimento schema parodyta 1 pav. Mūsų metodas pagrįstas skenavimo jonų laidumo mikroskopija (SICM) 16, kai pipetės srovės pokytis suteikia realaus laiko grįžtamąjį ryšį, kad nanopipetė galėtų išlaikyti kontroliuojamą atstumą per ląstelę. 17 ir lengvai suderinamas su fluorescenciniu vaizdavimu. Mes panaudojome nanopipetę mažoms molekulėms, baltymams ar antikūniams kontroliuojamai įtampai ir slėgiui tiekti į nurodytas paviršiaus vietas 18 .

Image

Visas dydis

Anksčiau mes išmatuojome ir modeliavome reagentų tiekimą iš nanopipetės kaip pipetės dydį, atstumą nuo paviršiaus ir taikomą įtampą bei slėgį 19 . Šis modelis naudojamas įvertinti Aβ oligomerų, išskiriamų iš nanopipetės, skaičių. Šiame darbe iš pipetės, esančios 300 nm aukštyje virš ląstelės paviršiaus, oligomerai yra dozuojami tik maždaug 1 μm 2 srityje, taigi, prieš susiduriant su ląstelės paviršiumi, molekulėms reikia tik nedidelio atstumo. Tai žymiai padidina vietinį oligomerų srautą, pasiekiantį ląstelės paviršių, palyginti su vonios uždėjimu, dėl pastaruoju atveju dėl oligomerų išeikvojimo sluoksnio už ląstelės paviršiaus. Taigi SICM naudojimas leidžia mums turėti pastovią ir apibrėžtą oligomerų dozę į ląstelės paviršių. Tai leidžia labai kokybiškai išmatuoti mažų oligomerų koncentracijų poveikį kalcio srautui neuronų ląstelėse.

Rezultatai

AP42 sintetinių oligomerų apibūdinimas

Anksčiau mes parodėme, kad oligomerai, pagaminti naudojant fluoroforu pažymėtą Aβ peptidą, yra toks pat citotoksiškas ląstelėms kaip nepaženklintas peptidas, tuo tarpu fluoroforų buvimas leidžia išmatuoti esamų oligomerų koncentraciją, naudojant vienos molekulės fluorescenciją 20 . Pirmiausia apibūdinome sintetinius Aβ 42 oligomerus, susiformavusius agregavimo reakcijos metu, naudojant Alexa Fluor 488 ir HiLyte Fluor 647, pažymėtus Aβ 42, esant 500 nM monomerui. Šiuose eksperimentuose mes tiesiogiai skaičiuojame esamų oligomerų skaičių, nes jie sukelia atsitiktinius fluorescencijos pliūpsnius. Taip pat galime naudoti atsitiktinio pliūpsnio iš oligomerų ryškumą, kad įvertintume oligomerų dydžio pasiskirstymą. Agregacija 5 valandas purtant, susidarė maždaug 3 nM ± 0, 5 nM oligomerai, kurių dydis pasiskirstė nuo dimerų iki 20 milimetrų, matuojant vienos molekulės konfokaline mikroskopija. Agregacijos metu nepastebėta jokių oligomerų dydžio pasiskirstymo pokyčių. Reprezentatyvio dydžio histograma, gauta naudojant vienos molekulės konokalinės fluorescencijos matavimus, parodyta 2 pav. Po 6 valandų agregacijos.

Image

( A ) Oligomerų dydžio pasiskirstymas po 6 valandų agregacijos, išmatuotas naudojant vienos molekulės konfokalinę mikroskopiją. ( B ) Bendras vidinio atspindžio fluorescencinis mikroskopinis oligomerų vaizdas ant stiklo paviršiaus, naudojant tioflaviną T, ir atitinkama 27 regėjimo lauko ryškumo histograma.

Visas dydis

Taip pat mes panaudojome naują agregatui būdingą metodą, apibūdinantį Aβ oligomerus. Šiuo metodu aptinkami paviršiuje adsorbuoti agregatai naudojant tioflaviną T (ThT), kuris fluorescuoja, kai jungiasi su oligomerais, kartu su ypač jautria vidinio atspindžio fluorescencine mikroskopija (TIRFM) 21 . Šio metodo pranašumas buvo tas, kad monomerai nesukėlė jokio signalo. Šis metodas leido suskaičiuoti esančių oligomerų skaičių ir išmatuoti jų santykinį ryškumą. Tyrimai buvo atlikti tik su „HiLyte Fluor 647 Aβ 42“, nes „Alexa Fluor 488“ fluorescencija sutampa su ThT fluorescencija, ir šie mėginiai buvo pavaizduoti naudojant ThT, praskiedus koeficientu 200, atitinkančiu 15 pM oligomerų koncentraciją. Rezultatai parodyti 2B pav. Tai pateikė paprastesnį metodą, užtikrinantį, kad dozavimo eksperimentuose naudojami Aβ oligomerų preparatai būtų atkuriami.

Astrocitų dozavimo eksperimentai

Iš pradžių atlikome astrocitų eksperimentus, nes anksčiau stebėjome, kad oligomerai sukelia kalcio antplūdį astrocituose, naudodami vonią, ir parodė, kad astrocitai yra pirmosios ląstelės, kurias oligomerai pažeidžia 20 . Mišinio glijos preparato astrocitai buvo įpilti į kalciui jautrų dažą „Fluo-4“ ir laikomi Leibovitz 15 terpėje (L15), kad būtų galima ištirti kalcio srautą į ląsteles dėl Aβ 42 oligomerų taikymo (1 pav.). Tirpalai, kuriuose buvo skirtingų oligomerų ir monomerų koncentracijų pavyzdžiai, per SICM nanopipetę buvo pristatomi į atskirų astrocitų paviršių, naudojant slėgio ir įtampos derinį. Šiuose eksperimentuose pipetė kontroliuojama 300 nm aukštyje virš ląstelės paviršiaus ir lokaliai uždedami oligomerai maždaug 1 μm 2 plote. Ankstesnis darbas parodė, kad porų atidarymas ląstelės membranoje neturi įtakos SICM 22 veikimui. Mes sukūrėme kiekybinį dozavimo iš nanopipetės modelį (žr. Papildomą medžiagą). Kalcio antplūdis, susidaręs dozuojant oligomerus, buvo užfiksuotas per EMCCD fotoaparatą (3A – C pav. Ir 1 papildomas filmas). Pradiniai eksperimentai parodė, kad dažni Ca 2+ svyravimai buvo stebimi kartu su pastoviu tarpląstelinio kalcio padidėjimu, naudojant Aβ 42 oligomerus. 6-metil-2- (feniletinil) piridino hidrochloridas (MPEP), specifinis metabotropinio glutamato receptoriaus 5 (mGlu5) blokatorius, buvo įpiltas į vonią, kad būtų išvengta šių Ca 2+ virpesių (žr. Papildomas medžiagas). Kontroliniai eksperimentai parodė, kad pridėjus vien pipetės L15 terpę ar tik sintetinį monomerą, ląstelėje padidėjęs kalcio kiekis nepadidėjo (papildomi paveikslai S1 ir S2). Kadangi Fluo-4 įsisavinimas skirtingose ​​ląstelėse skiriasi, eksperimento pradžioje norminome kalcio pėdsakus iki pradinio kalcio lygio, todėl galėjome tiesiogiai palyginti skirtingų ląstelių rezultatus.

Image

( A – C ) Tipiniai duomenys, rodantys astrocitus, kurių vidutinė paviršiaus koncentracija yra 500 pM Aβ 42 oligomerų. ( A ) eksperimento pradžioje ( B ) po 5 min., ( C ) po 10 min. ( D ) Vidutinis normalizuotų tarpląstelinio kalcio astrocitų, kurių Aβ 42 oligomerų paviršiaus koncentracijos yra nuo 500 fM – 25 nM, pokytis. Filmai buvo imami per 10 min. Vaizdai buvo imami kas 400 msec iki 1 sek (n yra didesnis nei 6 kiekvienam pėdsakui). Neigiamai kontrolei iš nanopipetės buvo lašinamas tik L15 buferis, o teigiamajai kontrolei buvo naudojamas 2 μM jonomicinas. Klaidų juostos SEM rodomos kas 50 sekundžių. Kiekvieno pėdsako n vertė pateikiama lentelėse su papildomomis medžiagomis.

Visas dydis

Tada buvo atlikti kiekybiniai dozavimo eksperimentai, naudojant anksčiau apibūdintą standartinį maždaug 3 nM ± 0, 5 nM Aβ 42 oligomerų tirpalą su maždaug 500 nM Aβ 42 monomeru (4 pav.). Šis standartinis tirpalas buvo gaminamas šviežiai kiekvieną dieną, o po to praskiedžiamas, kad nanopipetoje būtų skirtingos oligomerų koncentracijos. Anksčiau mes parodėme, kad susidarę pikomolinės koncentracijos oligomerai yra stabilūs keletą valandų. Tai leidžia mums nustatyti apibrėžtą oligomerų koncentraciją pipetėje dozavimo eksperimentams, nes skiedžiant 20, oligomerai neišsiskiria. Remdamiesi savo modeliu, galime įvertinti oligomerų koncentraciją ląstelės paviršiuje. Eksperimento sąlygomis oligomero koncentracija ląstelės paviršiuje, c paviršiuje , taške, esančiame po pipetės centru, yra 0, 33 c 0 , kur c 0 yra oligomero koncentracija pipetėje (žr. Papildomas medžiagas). Oligomero koncentracija paviršiuje sumažėja iki 0, 5 c paviršiaus , maždaug 500 nm radialiniu atstumu nuo šio centro taško 19 . Vidutinė paviršiaus oligomerų koncentracija šioje 500 nm spindulio srityje yra 0, 2 c 0 , o ši vertė bus cituojama likusiame popieriuje. Kai pipetėje yra 30 pM oligomerų, mes apskaičiuojame, kad per 10 minučių eksperimentą į ląstelės paviršių buvo pristatyta apie 1250 oligomerų, tai atitinka 2 oligomerus per sekundę (išsamią informaciją žr. Papildomoje medžiagoje). Tai reiškia, kad galima manyti, jog pavieniai oligomerai eksperimento metu sąveikauja su ląstelės paviršiumi. Panašiai galima apskaičiuoti, kad vidutinė oligomero paviršiaus koncentracija srityje po pipete yra 5 pM. Ši oligomerų koncentracija yra tam tikru laipsniu, palyginti su oligomerų koncentracija, kuri, manoma, yra žmogaus CSS pacientams, sergantiems Alzheimerio liga, 0, 5 pM 12, ir suteikia pastebimą, bet nedidelį tarpląstelinio kalcio padidėjimą.

Image

( A ) 3 pav. Pateiktų duomenų analizė. Visas integruotas kalcis, patenkantis į astrocitą kaip oligomerų koncentracijos ląstelės paviršiuje funkcija per 10 minučių eksperimentą. Kontrolės ląstelėse sumažėjo integruoto kalcio kiekis dėl dažų ir fotobalinimo praradimo per 10 minučių eksperimentą. Tai buvo išmatuota kontroliniuose eksperimentuose ir buvo atimta iš visų duomenų. Klaidų juostos yra SEM. ( B, C ) Normalizuoti kalcio pėdsakai astrocitui, kurio olimomerų koncentracija 500 pM yra ląstelės paviršiuje, per 10 minučių eksperimentą, esant (n = 5), ( B ) ir neturint ( C ) 2 μg / ml klasterino. pipete (n = 5). Prieš pradedant dozavimą, oligomerai buvo inkubuojami su klasterinu 15 minučių. ( D ) Bendras integruoto kalcio kiekis ( B, C ) duomenims, pataisytas atsižvelgiant į fotobalinimą ir dažų praradimą. P vertė buvo 0, 016.

Visas dydis

Stebimi kalcio antplūdžiai yra sudėtingi, nes ląstelės gali reaguoti į oligomerų sukeltą kalcio antplūdį per 10 minučių eksperimentą, o skirtingų ląstelių atsakai labai skyrėsi. Šiuos duomenis išanalizavome pirmiausia įvertindami vidutinį visų ląstelių, dozuotų esant tam tikrai oligomerų koncentracijai, elgseną ląstelės paviršiuje. Vidutinis ląstelių atsakas parodė staigų eksperimentų pradžios (pirmąsias 100 sekundžių) padidėjimą, padidėjant oligomero koncentracijai ląstelės paviršiuje, o paskui kalcio lygio plokštumoje arba sumažėja vėliau, kai ląstelė reaguoja į didėjantį tarpląstelinis kalcis (3 pav.). Tada mes integravome normalizuotą kalcio antplūdį kiekvienoje ląstelėje per 10 minučių eksperimentą ir atlikome jų vidurkį, kad palygintume bendrą į ląstelę patenkančio kalcio kiekį esant tam tikrai oligomerų koncentracijai ląstelės paviršiuje (4 pav. A). Bendras kalcio kiekis, patenkantis į ląstelę, didėja, didėjant oligomerų koncentracijai, kol esant didelėms oligomerų koncentracijoms ląstelė reaguoja mažindama tarpląstelinį kalcį. Dėl to, kad ląstelės reaguoja į sumažintą oligomerų sukeltą kalcio antplūdį, bendras bendro kalcio padidėjimas nėra proporcingas oligomero koncentracijai, todėl 100 kartų padidėjęs oligomero paviršiaus koncentracija nuo 5 iki 500 pM padidėja tik dvigubai. kalcio patenka į ląstelę. Esant mažoms paviršiaus oligomerų koncentracijoms (5 pM), vis tiek yra statistiškai reikšmingas bendrojo kalcio kiekio padidėjimas per 10 minučių, palyginti su kontroliniu (p-vertė 0, 0197). Norėdami patvirtinti, kad mūsų pastebėtas poveikis yra dėl oligomerų, mes atlikome dozavimo eksperimentus, esant arba ne klasterino, tarpląstelinio chaperono, kurio, kaip mes parodėme, pirmenybę rišo 13, 23 oligomerai (4B – D pav.). Esant klasterinui, reikšmingo kalcio antplūdžio nepastebėta. Tai patvirtina, kad antpilas sukelia Aβ 42 oligomerus.

Norint patikrinti, ar ląstelės vis dar sugebėjo atsigauti pritaikius Aβ 42 oligomerus, pipete buvo pašalinta po 5 minučių iš ląstelės, kai paviršiaus paviršiaus koncentracija buvo 1250 pM oligomerų. Rezultatai buvo palyginti su eksperimentais, naudojant visą 10 minučių. 5 pav. Parodyta, kad astrocitai iš tikrųjų sugebėjo pašalinti kalcio perteklių ir atsigauti iki bazinio lygio. Tai rodo, kad bet koks membranos suskaidymas ar oligomerų suformuotos poros yra trumpalaikės. Jei ląstelės membranoje susidarytų nuolatinės poros, tikėtina, kad nutraukus oligomerų dozavimą, kalcio srautas ir toliau didės.

Image

Ląstelės 10 minučių kontroliniuose eksperimentuose arba pirmąsias 5 minutes buvo apdorotos 1250 pM Aβ 42 oligomerų vidutine paviršiaus koncentracija, o po to dar 5 minutes stebimos, kad būtų galima nustatyti, ar ląstelės atsigavo. Pėdsakai yra kelių atskirų ląstelių atsako vidurkis (n = 10 kontrolinių, n = 3 atsigavimas). Klaidų juostos SEM rodomos abiem pėdsakais kas 50 sekundžių.

Visas dydis

Eksperimentai su neuronais

Toliau mes pakartojome šiuos eksperimentus su neuronais, kai paviršiaus oligomerų koncentracija buvo 500 ir 1250 pM (6 pav. Ir papildomas S3 pav.). Neuronai parodė panašų atsaką į astrocitus esant 500 pM, bet žymiai mažesnį atsaką esant 1250 pM, nes neuronai reaguoja į dozuotus oligomerus mažindami tarpląstelinį kalcį. Šie duomenys rodo, kad Aβ 42 oligomerai daro panašų poveikį astrocitams ir neuronams, tačiau ląstelės skirtingai reaguoja į oligomerų sukeltą kalcio antplūdį ir kad neuronai reaguoja į tarpląstelinio kalcio sumažėjimą esant mažesnei oligomerų koncentracijai.

Image

Klaidų juostos yra SEM. P vertės buvo 0, 9995 500 pM duomenims ir 0, 0281 1250 pM duomenims, naudojant dvipusį ANOVA, parodantį, kad yra didelis skirtumas tarp astrocitų ir neuronų reakcijos į oligomerų dozes. Normalizuoti neuronų tarpląsteliniai kalcio pėdsakai parodyti papildomame S3 paveiksle.

Visas dydis

Kalcio antplūdžio su nanodalelėmis slopinimas

Vienas iš mūsų požiūrio pranašumų yra tas, kad jis gali būti panaudotas antikūnų ar nanodalelių, nukreiptų į Aβ, efektyvumui patikrinti mažinant oligomerų sukeltą kalcio antplūdį. Mes panaudojome nanodalelį Nb3, kuris jungiasi su Aβ 17–28 epitopu išmatuotu Kd monomerui 13 nM 24 . Šiuose eksperimentuose mes 15 minučių inkubuodavome sintetinius Aβ 42 oligomerus su 150 nM Nb3 ir tada atlikdavome nanopipetės dozavimo bandymus su astrocitais (7 pav.). Mūsų eksperimentai rodo, kad Nb3 yra labai efektyvus blokuojant kalcio antplūdį, kurį sukelia Aβ 42 oligomerai. Šį kalcio antplūdžio sumažėjimą greičiausiai lėmė nanodalelės, prisijungiančios prie oligomerų, mažinančios arba užkertančios kelią sąveikai su ląstelės membrana.

Image

( A ) Astrocitai buvo dozuojami vidutiniškai 500 pM Aβ42 oligomerų paviršiaus koncentracijos (n = 3) ir parodė kalcio patekimą. ( B ) Astrocitų vidutinė paviršiaus koncentracija buvo 500 pM Aβ42 oligomerų po išankstinio inkubavimo su 150 nM Nb3, turinčiu nanodalelį iki Aβ (n = 8). Išankstinio inkubavimo metu oligomerų koncentracija yra maždaug 3 nM, o monomerų - maždaug 500 nM. Buvo pastebėtas kalcio patekimo blokavimas. ( C ) Astrocitams buvo dozuota vidutinė paviršiaus koncentracija 500 pM Aβ 42 oligomerų po išankstinio inkubavimo su 150 nM alfa sinukleinui būdingo nanokūno, NbSyn87 (n = 3). Išankstinio inkubavimo metu oligomero koncentracija yra maždaug 3 nM, o monomero koncentracija - maždaug 500 nM. Nebuvo pastebėtas kalcio patekimo blokavimas. ( D ) Vidutinis integruoto kalcio kiekis, kai nėra ir nėra nanodalelių iki Aβ, pataisytas atsižvelgiant į fotobalinimą ir dažų praradimą. Klaidų juostos yra SEM. P vertė buvo 0, 0013.

Visas dydis

Bilayer eksperimentai

Norėdami toliau ištirti ląstelių pažeidimo molekulinį mechanizmą, atlikome eksperimentus su dviejų sluoksnių modeliais. Naudojant tirpalus, paruoštus iš to paties pradinio tirpalo, į stiklinį stiklelį arba į palaikomą lipidų dvisluoksnį (SLB) buvo dedama fluorescenciniu žymeniu pažymėta Aβ 42, kad būtų galima dar labiau išaiškinti mechanizmą, kuriuo Aβ įterpia arba kerta ląstelės membraną (8A, B pav.) ). Stiklinio stiklelio eksperimentams buvo naudojama 2, 5 nM Aβ 42 monomerų koncentracija su 15 pM oligomerais, tuo tarpu SLB eksperimentams buvo naudojama 100 kartų didesnė koncentracija, siekiant kompensuoti A42 42 prisijungimą prie SLB. Atskiras molekules buvo galima lengvai atskirti abiem atvejais, o oligomerai buvo atskirti nuo monomerų pagal jų intensyvumą ir jų fotobalinimo profilių žingsnių skaičių. Monomeras balina vienu žingsniu, o dimeris balina dviem etapais ir tt (8C pav., D). Molekulės, turinčios keturias ar daugiau balinimo stadijų, artėja prie eksponentinio balinimo profilio ir čia yra vadinamos „tetramerais ar didesniais“ oligomerais (8 pav. E).

Image

Fluorescencinės mikroskopijos vaizdai, kuriuose Aβ 42 -Alexa 647 monomerai ir oligomerai imobilizuoti ant ( A ) stiklo paviršiaus ir ( B ) POPC (neįkrauto) lipidų dvisluoksnio sluoksnio keturis kartus iš eilės. ( C – D ) Fluorescencijos intensyvumo pėdsakai, rodantys vienos ir dviejų pakopų dviejų skirtingų Aβ 42 -Alexa 647 molekulių stiklo paviršiaus balinimą, atitinkamai atitinkantį Aβ monomerą (apskritimas A ) ir dimerą (kvadratas A ). ( E ) Fluorescencijos intensyvumo pėdsakas, rodantis eksponentinį fluorescencijos signalo sumažėjimą iš Aβ42 -Alexa 647 didesnio oligometro lipidų dvisluoksnyje (apskritimas B raidėje).

Visas dydis

Bendras surišto Aβ 42 kiekis ant stiklo stiklelio buvo 1, 4 karto didesnis nei ant SLB. Stiklo paviršiuje mes suskaičiavome 77 ± 3% monomerų, 16 ± 3% dimerų, 2 ± 1% trimerių ir 6 ± 2% ar daugiau tetraimerų (vidutinė vertė ± vienas standartinis nuokrypis, apskaičiuotas pagal binominį n = 174 molekulių pasiskirstymą). Šie procentai greičiausiai skiriasi nuo mūsų konokalinio matavimo tirpale dėl tetramero ar didesnių oligomerų, jungiančių prie stiklo, kaip buvo pastebėta anksčiau 20 . Tačiau, nors tik mažesnė stiklo paviršiaus molekulių dalis buvo tetramerai arba didesni oligomerai, mes nustatėme, kad daugiau kaip 90 ± 3% lipidų dvisluoksnio sluoksnio molekulių buvo tetramerai arba didesni oligomerai (vidutinė vertė ± vienas standartinis nuokrypis apskaičiuotas pagal binominis n = 128 molekulių pasiskirstymas). Tai, kad SLB turi didesnę tetramerų ar didesnių oligomerų dalį nei stiklas, yra statistiškai reikšminga remiantis dviejų proporcijų z-testu (p vertė 10–49 ). Tiesą sakant, manoma, kad tikrasis tetramero ar didesnių oligomerų skaičius SLB yra artimas 100%, kai atsižvelgiama į Aβ 42 prisijungimą prie lipidų dvisluoksnio sluoksnio defektų. Tai buvo įvertinta, suskaičiavus SLB monimerų skaičių iki trimerių, esant skirtingoms Aβ 42 koncentracijoms vonios tirpale. Pastebėta, kad Aβ2 greičiau prisijungia prie stiklo nei SLB, taigi Aβ 42 pirmiausia jungiasi prie SLB skylių / defektų. Atlikus fotobalinimo etapo analizę, nustatyta, kad monomerų iki trimerų skaičius išlieka toks pats, kai koncentracija buvo pakeista nuo 2, 5 nM iki 250 nM (nuo 5 iki 13% bendro molekulių skaičiaus 250 nM mėginyje), tuo tarpu tetramerų ar didesnių oligomerų koncentracija padidėjo monotoniškai, kai bendra baltymų koncentracija. Kadangi vonios tirpale yra dviem laipsniais mažiau tetramerų arba didesnių oligomerų nei monomerų, tai taip pat paaiškina, kodėl norint gauti lipidų dvisluoksnio sluoksnio eksperimentus, norint gauti palyginamą surištų molekulių skaičių, kaip stikliniame stiklelyje, reikalinga didesnė Aβ 42 koncentracija vonioje. eksperimentai. Taip pat reikėtų pažymėti, kad pradinis intensyvumo padidėjimas, parodytas 8E pav., Nėra susijęs su A42 pridėjimu iš tirpalo, nes vonios tirpalas buvo pakeistas buferiniu tirpalu be Aβ 42, bet tai yra reiškinys, kurį matome visiems tetramerams ar didesniems. oligomerų SLB. Tai gali būti dėl fotoaparatūros „Alexa-647“ iš tamsiosios būsenos į šviesią trans būseną sužadinimo lazeriu 25 .

Iš eksperimentų su SLB mes taip pat galėjome atskirti, ar oligomerai linkę (i) jungtis ant lipidų dvisluoksnio sluoksnio, ar jie (ii) įterpia arba bando kirsti SLB. Pirmuoju atveju mes tikimės, kad bet kuris surištas Aβ 42 bus mobilus, nes lipidai, prie kurių prisijungia Aβ 42, yra mobilūs. Tačiau didžioji dalis surinktų Aβ 42 molekulių, esančių SLB, nekeičia savo padėties ir taip pat išlieka toje pačioje padėtyje po to, kai birus tirpalas keičiamas buferiniu tirpalu (žr. 8 pav. Ir 2 papildomą filmą). Tai rodo, kad arba Aβ 42 įterpiamas į SLB, tai įvyksta per <1 s, remiantis šių eksperimentų kadrų dažniu, arba bandoma peržengti lipidų dvisluoksnį sluoksnį. Jei Aβ 42 apima visą SLB arba bando jį perbraukti, tada, kai stiklinė atrama yra arti, Aβ 42 prilips prie paviršiaus. Atrodo, kad didžioji dalis tetramero ar didesnių oligomerų visiškai įterpiama į neįkrautą lipidų dvisluoksnį sluoksnį arba bandoma jį peržengti, priešingai nei beta 42 monomerai, kurie reikšmingai nesąveikavo su neįkrautais lipidais.

Apskritai šie duomenys rodo, kad tetramerai ar didesni oligomerai gali apjuosti ar perbraukti lipidinius dvisluoksnius sluoksnius - rezultatas atitinka mūsų ankstesnį pastebėjimą, kad oligomerai gali patekti į ląsteles esant 4 ° C 26, tai rodo, kad aktyvus procesas nėra būtinas.

Diskusija

Šiuose eksperimentuose mes naudojome SICM dozavimą, nes manėme, kad daugiau oligomerų per sekundę pasieks ląstelės paviršių, naudodamiesi vietine pipete, nei pilant vonią, taigi, esant mažesnei paviršiaus koncentracijai, turėtų būti stebimas kalcio antplūdis. Priežastis yra dėl to, kad vonioje dengiant oligomerų sluoksnį, esantis arti ląstelės paviršiaus, sumažėja, kai jis pipetėje patenka arti ląstelės paviršiaus. Tai patvirtino mūsų eksperimentai. Smegenyse CSF sąveikos su ląstele plotas padidėja 10–100 kartų, palyginti su dozavimu pipete, o tarpas tarp ląstelių yra tik 10–20 nm 27 . Didesnis oligomerų skaičius kiekvieną sekundę patektų į ląstelę, o kalcio antplūdis būtų didesnis. Tačiau papildomas smegenų veiksnys yra tas, kad tarpląsteliniame skystyje jau yra nemaža tarpląstelinių chaperonų koncentracija, kurie gali prisijungti prie oligomerų ir užkirsti kelią kalcio antplūdžiui. Jei, pavyzdžiui, 90–99% oligomerų yra atskirti, tada nepakeistų oligomerų koncentracija yra tik 1–10% visos oligomerų koncentracijos. Bendras rezultatas turėtų būti toks, kad oligomerų sukeltas kalcio antplūdis, kurį patyrė ląstelė smegenyse, yra 1–10 koeficiento, palyginti su srautu, kurį patyrė ląstelė mūsų in vitro eksperimentuose, naudojant vietinę pipetę. Todėl mes dirbame eksperimentiniu režimu, kuriame stebėjome pradinį oligomerų poveikį neuronų ląstelėms. Papildomas SICM dozavimo naudojimo pranašumas yra tas, kad reikia tik nedidelio tirpalo tūrio (10 μL), leidžiantį šiuos eksperimentus tiesiogine prasme išplėsti į AD pacientų žmogaus CSS mėginių dozavimą būsimuose tyrimuose.

Ankstesnis darbas rodo, kad pradinė Aβ oligomerų daroma žala yra 14, 20, 28 astrocituose, o ne neuronuose. Mūsų darbas rodo, kad kalcio antplūdis gali įvykti esant vidutiniškai oligomerų koncentracijai ląstelės paviršiuje iki 5 pM, panašiai kaip koncentracija. oligomerų, nurodytų žmogaus CSF, ir atsiranda tiek neuronuose, tiek astrocituose. Tačiau tarp šių dviejų eksperimentų vis dar yra reikšmingų skirtumų. Šiame darbe mes užblokavome mGlu5 sukeltus virpesius astrocituose, leisdami nustatyti lėtą kalcio antplūdžio padidėjimą tiek neuronuose, tiek astrocituose. Be to, mes turime daug didesnį susidūrimą tarp oligomerų ir ląstelės paviršiaus, naudojant nanopipetės dozavimą, kuris labiau atspindi situaciją smegenyse, todėl galime pastebėti aptinkamus pokyčius esant mažesnei oligomerų koncentracijai. Mūsų darbas rodo, kad ląstelė reaguoja į kalcio antplūdį, todėl padidėja bendras kalcio, patenkančio į ląstelę, kiekis, kai padidėja oligomero koncentracija, tačiau tai nėra tiesinė su oligomero koncentracija. Esant ribinei tarpląstelinei kalcio koncentracijai, atrodo, kad ląstelė reaguoja į kalcio antplūdį ir mažina tarpląstelinį kalcio kiekį, o neuronams ši riba yra žemesnė nei astrocitų.

Mūsų duomenys atitinka kalcio antplūdį, atsirandantį dėl atskirų oligomerų perėjimo iš ląstelės membranos, taigi, nutraukus dozavimą, sustabdomas kalcio antplūdis ir ląstelės gali sumažinti kalcio kiekį iki bazinio lygio. Dozavimo metu kalcio įleidimo greitis, tikėtina, yra greitesnis nei greitis, kuriuo ląstelė gali pašalinti kalcį, o tai sąlygoja bendrą padidėjimą, tačiau, nutraukus dozavimą, ląstelė gali atsigauti. Taip pat verta paminėti, kad stebimas kalcio antplūdis yra mažas - tai sudaro mažiau nei 10% viso „Fluo-4“ dinaminio diapazono, kai naudojamas sotus kalcio kiekis. Taigi oligomerai per 10 minučių sukelia mažą „kalcio nutekėjimą“, o ne greitą ir didelį kalcio pokytį, dėl kurio kalcio pompos greitai pašalintų kalcį. Ankstesniuose mūsų eksperimentuose šio kalcio patekimo į žemą lygį nebuvo galima nustatyti dėl kalcio virpesių. Galvos smegenyse, kur nėra mGlu5 blokatorių, mes tikimės, kad šis mažo lygio oligomerų sukeltas kalcio padidėjimas padidės kartu su kalcio virpesiais astrocituose. Dėl to atsiras kitų sujungtų astrocitų virpesiai platesnėse vietose, sukuriant papildomų problemų dėl kalcio homeostazės. Ilgesniam šių astrocitų virpesių efektui, kaip parodyta kitame darbe, gali būti transkripcijos pokyčiai ir astrocitų, skirtų skirtingoms / tam tikroms smegenų sritims, atrankinio kalcio signalizacijos priemonių rinkinio rekonstravimas, paaiškinantis, kodėl tam tikri smegenų regionai yra labiau linkę į žalą Alzheimerio liga 29 . Taip pat buvo atliktas vienas eksperimentas su Aβ oligomerų indukuotu ilgalaikio potencialo blokavimu, kuriam buvo užkirstas kelias pridedant mGlu5 30 blokatorių, nors šiuose tyrimuose buvo naudojama daug didesnė oligomerų koncentracija. Tai rodo, kad oligomerų sukelti kalcio virpesiai gali vaidinti svarbų vaidmenį Alzheimerio ligos vystymesi ir gali žymiai sustiprinti atskirų oligomerų poveikį astrocitams.

Konkrečių receptorių skaičius 1 μm 2 ląstelės membranos srityje, dozuojamas pipete, yra nedidelis. Oligomero afinitetas šiems receptoriams taip pat turi būti pikomoloriškas, kad įvyktų bet koks surišimas, kai dozuojamos pikomolinės oligomerų koncentracijos. Furthermore, if the affinity of the oligomer for the receptors was in the picomolar range then the off-rate would be expected to be very slow. This is inconsistent with our finding that the cells can recover within 10 minutes. Therefore we conclude that the calcium influx is caused by individual oligomers crossing the cell membrane, without any interaction with a specific receptor. However based on our work we cannot totally discount the possibility of a specific interaction with a receptor occurring. Previous work also supports the conclusion that no receptor is involved. Oligomers of Aβ 42 are ThT active 21, presumably due to their beta sheet structure, and hence have hydrophobic groups pointing into solution, which is why tetramers or larger oligomers cross the lipid bilayer in our experiment, and also why they will bind and cross the cell membrane. A previous study has found small oligomers bound to the cell membrane at near physiological concentrations of Aβ monomer 31 . Studies of the permeabilization of liposomes, at much higher concentrations of Aβ oligomers, also show that no interaction with any receptor is required for molecules to exit the liposome 32, 33 .

Our experiments do not allow us to determine the physical mechanism by which calcium enters the cell from the external media. This could be due to local disruption of the cell membrane or calcium ion entering at the same time that the oligomer crosses through the cell membrane. As calcium ions enter the cell, there will also be leakage of ATP from the cell into solution by the same mechanism. ATP leakage has been observed in other experiments at much higher acute oligomer concentrations 34, and may affect neighbouring cells leading to the release of pro-inflammatory cytokines. The amount of calcium influx occurring as the oligomer crosses will potentially depend on the oligomer size. While our study cannot address this point, there has been a previous study on entry of Aβ oligomers into oocytes using fluorescence imaging to detect the calcium influx 35 . Oocytes have no calcium pumps, making the calcium entry easier to detect. These data were analysed as if the oligomers formed permanent pores in the cell membrane that opened and closed. In the light of our experiments these data can be reinterpreted as different oligomers entering the cell by crossing at certain regions of the cell membrane and the wide range of different open times observed can be explained by the different transit times of the oligomers through the cell membrane. These transit times were fitted by a double exponential function with time constants of 5 and 16 ms and estimated conductance of 0.4–4 picosiemens. A small fraction of the oligomers, presumably large oligomers, were found to take longer to cross the cell membrane and allow more calcium to enter the cell. This reinterpretation of the data is consistent with our finding that only about 1 in 500 Aβ oligomers were capable of triggering astrocyte oscillations 20, presumably due to inducing a larger calcium influx. This could be due to the oligomer size or the composition of the membrane to which the oligomer binds or a combination of these two effects.

It is widely recognised that altered calcium homeostasis is a key feature of Alzheimer' disease. The fact that the calcium influx depends on the number of individual oligomers encountering the cell membrane means that the amount of disruption to calcium homeostasis that a cell will experience depends on the number of unsequestered oligomers in the CSF. Higher concentrations of oligomers or lower concentrations of extra-cellular chaperones will result in a larger disruption to calcium homeostasis in some neuronal cells, particularly astrocytes. This will ultimately lead to altered cell physiology and cell death and also adversely affect neighbouring neurons. This may explain why small increases in oligomer concentrations can be significant over long timespans. Furthermore, the effect of oligomer induced calcium influx in a fine structure, such as a synapse or fine protrusions, will be much more significant than at the cell body due to the smaller volume. This provides a possible explanation for the detrimental changes oligomers cause at the synapses of neurons at low concentrations, without the need for any specific interactions with any receptors.

Išvados

We have developed a method to study the initial events that lead to cellular damage in Alzheimer's disease. Our experiments suggest that as tetramers or larger oligomers cross the cell membrane of astrocytes or neurons, calcium enters. This calcium influx can be prevented by clusterin and by a nanobody targeting the mid-region of Aβ. There appears to be no receptor involved in these initial events. The presence of low picomolar concentrations of Aβ aggregates therefore leads to continual low levels of calcium influx altering calcium homeostasis. An increase in the number of aggregates or reduction in the level of clusterin, which sequesters the aggregates, will lead to an increased rate of calcium influx and consequential cellular damage and, over time, earlier disease onset.

Medžiaga ir metodai

Ląstelių kultūros

Astrocytes were from a rat mixed glial preparation, cultured for 14 days in 75 cm 2 flasks with Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) Medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% Penicillin and Streptomycin and 1% L-Glutamine (Life Technologies) in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 at 37 °C. Cells were passaged 2–3 times a week. For experiments the astrocytes were cultured to 40–70% confluence in 35 mm culture dishes with 14 mm glass microwell, number 1 thickness cover glass (MatTek). Experiments were performed 1–5 days after plating. Cells were loaded with 2.3 μM Fluo-4 AM (Life Technologies) for 10–15 minutes and washed twice with L15 (Life Technologies) afterwards.

42 aggregation

HiLyte Fluor 647 Aβ 42 (Cambridge Bioscience LDT) was purified on a Biosep SEC-s2000 size exclusion column (Phenomenex) using pH 7.4 SSPE (0.01 M Na 2 HPO 4, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA) as the running buffer. The peptide was kept in ice prior to purification, flash frozen immediately after and stored at −80 °C. For the cell experiments, the purified Aβ 42 was diluted to 500 nM in PBS and left shaking at 37 °C, 200 rpm for 5 hours. It was centrifuged at 14, 500 g for 10 minutes and then diluted to the required concentration in L15 medium. Clusterin was a gift of Professor Mark Wilson at the University of Wollongong and prepared using published proceedures 36 . The clusterin was used at with 2 μg/mL.

Aβ nanobody

The Aβ specific nanobody Nb3 was isolated from a llama ( Llama glama ) immunized with Aβ 40 and by the construction and selection of a phage-display library containing the VHH genes, amplified from the peripheral blood lymphocytes, as described previously 37 . The Nb3 gene was subsequently recloned in a modified pHEN vector (pHEN6) containing a sequence coding for six consecutive histidine residues at the C-terminus of the nanobody and the nanobody was subsequently expressed in the periplasm of Escherichia coli and purified using immobilized metal affinity chromatography and size-exclusion chromatography, according to published protocols 38 . The concentration of Nb3 was measured by UV absorbance spectroscopy using a molecular extinction coefficient, which was calculated based on the sequence of the protein at 280 nM of 21, 555 M −1 cm −1 . The K d of Nb3 for monomeric Aβ40 has previously been measured as 13 nM using a Biacore 3000 24 .

Synuclein nanobody

The α-synuclein specific nanobody, NbSyn87, was previously isolated by phage display selection following the immunization of a llama ( Llama glama ) with the A53T variant of the protein human α-synuclein 39 . The nanobody was subsequently recloned in a pHEN6 vector, expressed and purified according to an identical protocol as described above for the expression and purification of Nb3. The protein concentration of NbSyn87 was estimated by UV absorbance spectroscopy using a molecular extinction coefficient, calculated from the sequence of the protein, at 280 nm of 26, 025 M −1 cm −1 .

Single molecule confocal set-up

The same set-up and method was used to determine the oligomer concentration as previously described 20, 23 .

ThT imaging

The protein was aggregated as described above. ThT (Sigma-Aldrich) stock solution was prepared in DMSO (Sigma-Aldrich) at a concentration of approximately 1 M and diluted into pre-filtered PBS (0.02 μm filter, Whatman) to a final concentration of ~100 μM. The final concentration was determined from the absorbance at 412 nm with an extinction coefficient of 36, 000 M −1 cm −1 . The stock solution was prepared freshly and filtered (0.02 μm filter, Whatman) on a daily basis. Borosilicate glass coverslips (VWR International) were cleaned in an argon ion plasma for 1 hour and prepared for coating with a 20 mm × 20 mm Frame-Seal slide chamber (Bio-rad). The coverslips were coated with Poly-(L)-Lysine (PLK) (Sigma-Aldrich) for at least one hour. The PLK-coated surfaces were washed three times with PBS before the sample was applied. Aggregated Aβ 42 was used at a total monomer concentration of 1.25 nM in PBS with 5 μM ThT. Each sample was left on the coverslip for 10 minutes prior to imaging to ensure binding of the aggregates to the surface. The imaging was then performed with 5 μM ThT in PBS. The samples were imaged using a home-built total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope limiting the detectable fluorescence signal to within 200 nm from the coverslip. A 405 nm Laser (LBX-LD, Oxxius Laser Box) was aligned and directed parallel to the optical axis at the edge of a TIRF objective (APON60XO TIRF, Olympus) mounted on an inverted Olympus IX-73 microscope for ThT imaging. Fluorescence was collected by the same objective, separated from the returning TIRF beam by a dichroic (Di01-405/488/532/635, Semrock), and passed through an appropriate filter (BLP01-488R-25, Laser 2000). The images were recorded on an EMCCD camera (Evolve 512 Delta, Photometrics) operating in frame transfer mode (EMGain of 4.4 e /ADU and 250 ADU/photon). Each pixel was 207 nm. The distance between the 9 images measured in each grid was set to 350 μm, and was automated (bean-shell script, Micromanager) to prevent user bias. Images were recorded continuously for 100 frames with 50 ms exposure in the blue channel (ThT emission) with 405 nm illumination.. Images were recorded at 50 ms exposure with 100 frames for each field of view in the blue channel (ThT emission). Data analysis was done using custom written procedures using the GDCS SMLM plugin (Sussex University) for ImageJ (//imagej.nih./goc/ij). Briefly, the image stacks were averaged over the full set and the background was removed and the 2D Gaussian point-spread-functions (PSF) were fitted using PeakFit. The photon values for the histogram were calculated using EMGain from the extracted intensities.

SICM set-up

The SICM was built on an inverted Nikon Eclipse Ti-U. The microscope objective (Nikon, Plan Apo VC Water immersion ×60, MRD07601) was mounted in a piezoelectric drive (P-726, Physik Instrumente, UK) for this purpose, while the sample and nanopipette were positioned by XY (P-733.2DD) and Z (P-753) piezos, respectively. All piezos were controlled via a computer using an Ionscope controller.

Nanopipettes were fabricated using a Sutter Instrument Co. model P-2000 laser-based puller, pulling 10 cm length, 1 mm/0.50 mm outer/inner diameter fire-polished borosilicate glass capillaries with filaments (Sutter, via Intracel UK Ltd.) using the program Heat 350, Fil 3, Vel 30, Del 220, Pul, Heat 390, Fil 3, Vel 40, Del 180, Pul 255. The pull time range is 4.5–5.5 s. Typical nanopipette ion currents were 500 ± 1.5 pA pA for a 200 mV electrode bias. Calcium influx was monitored using an epifluorescence set-up using 488 nM laser excitation and an EMCCD camera (iXon DU 897, Andor) for detection.

Kalcio tyrimo eksperimentai

For these experiments cells were kept in L15 (Life Technologies) containing 1.26 mM Ca 2+ . 300 μM 2-Methyl-6-(phenylethynyl)pyridine (MPEP) (Sigma Aldrich), with a specific metabotropic glutamate receptor 5 (mGlu5) blocker, was added to the bath to prevent calcium oscillations. The pipette contained L15 (Life Technologies) plus different concentrations of Aβ 42 oligomers, with a total volume of 10 μL. 2 μM Ionomycin (Sigma Aldrich) added to the L15 for the positive control experiments. The computer-controlled nanopipette, mounted to the z-piezo, was positioned 300 nm above the cell. This distance was chosen by experience. It was far enough away to avoid mechanical stress to the cell, by activating mechanosensitive ion channels, and close enough to apply sufficient concentration to the cell. The pipette was kept in position using distance feedback control. Aβ 42 was released from the pipette by applying −200 mV and 15 kPa pressure to the pipette. We chose a negative voltage because of the fact that HiLyte 647 has a slight negative charge. After the pipette was in place over the cell, calcium imaging was started and pressure applied to start delivery. The maximum observed fluorescence signals were about one order of magnitude smaller than the full dynamic range of Fluo-4 and are thus expected to be linearly proportional to Ca 2+ flux. The data was normalised to the initial calcium fluorescence level, ΔF/F o, to take account of variation in Fluo-4 loading between cells. The normalised calcium traces were analysed using OriginPro 2015.

Bilayer experiments

The SLB consisted of 1 palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) lipids from Avanti Polar Lipids with 0.01 wt% of the fluorescently labelled lipid Oregon Green ® 488 1, 2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green ® 488 DHPE; Invitrogen, UK) to visualize the SLB in order to make sure there were no defects. After forming the SLB, Aβ labelled with HiLyte 647 was added to the dish. This was done at different concentrations (higher concentration leads to more binding), all in L15 media (from 2.5 nM to 250 nM). The binding of the Aβ was imaged with TIRF microscopy (with a HeNe laser operating at 633 nM) either with Aβ in the solution (at 1 s between frames) or after rinsing the solution to remove unbound Aβ (stream acquisition with 100 ms exposure time to measure single-step photobleaching).

Statistinė analizė

Analyses of differences between two groups were conducted using a standard unpaired Student's t test. For the data in Fig. 6 a two way ANOVA test (Sidak's multiple comparison test) was performed.

Papildoma informacija

How to cite this article : Drews, A. et al. Individual aggregates of amyloid beta induce temporary calcium influx through the cell membrane of neuronal cells. Mokslas. Rep. 6, 31910; doi: 10.1038/srep31910 (2016).

Papildoma informacija

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas filmas

  2. 2.

    2 papildomas filmas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.