Infekcinė bac genomo dna ekspresijos biblioteka: didelės talpos vektorių sistema funkcinei genomikai | mokslinės ataskaitos

Infekcinė bac genomo dna ekspresijos biblioteka: didelės talpos vektorių sistema funkcinei genomikai | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Funkcinė genomika
  • Molekulinė biologija

Anotacija

Genų dozavimas vaidina kritinį vaidmenį daugelyje ląstelių fenotipų, tačiau dauguma ląstelių ekspresijos sistemų naudoja heterologinius cDNR paremtus vektorius, kurie baltymus ekspresuoja gerokai virš fiziologinio lygio. Priešingai, genomo DNR ekspresijos vektoriai sukuria fiziologiškai svarbius genų ekspresijos lygius, gabendami visą geno genomo DNR lokusą, įskaitant jo reguliavimo elementus. Čia aprašome pirmąją genominės DNR ekspresijos biblioteką, sukurtą naudojant didelės talpos herpes simplex viruso-1 amplikono technologiją, siekiant viruso perdavimo būdu į ląsteles įnešti bakterijų dirbtines chromosomas (BAC). Infekcinėje BAC (iBAC) bibliotekoje yra 184 320 klonų, kurių vidutinis intarpas yra 134, 5 kb. Kinijos žiurkėnų kiaušidžių (CHO) ligos ląstelių linijos ir pelių embriono kamieninių (ES) ląstelių modelyje parodyta, kad ši biblioteka gali būti naudojama genetiniams gelbėjimo tyrimams įvairiose situacijose, įskaitant fiziologinį Ldlr trūkumo atkūrimą ir viruso receptorių ekspresiją. „IBAC“ biblioteka yra svarbi nauja genetinės analizės priemonė, atvira mokslinių tyrimų bendruomenei.

Įvadas

Nors DNR seka nustatė daugybę ligos genų kandidatų, daugeliui pacientų patogeniškų variantų neįmanoma patvirtinti vien jų DNR seka. Vienas iš ligos genų patvirtinimo būdų yra genetinis gelbėjimas, naudojant paciento gautas ląsteles in vitro . Ląstelių gelbėjimo eksperimentai paprastai atliekami naudojant cDNR ekspresijos konstruktus 1, 2, naudojant vektorius, turinčius stiprius heterologinius promotorius, kurie daro prielaidą, kad fenotipo genetinį išgelbėjimą galima pasiekti perdėta ekspresija, neatsižvelgiant į artefaktų potencialą ar ląstelių toksiškumą, neatsižvelgiant į reikalavimas cis reguliuojančių elementų, kurie gali būti reikalingi genui ekspresuoti tinkamame ląstelių kontekste arba apibrėžtoje ląstelės ciklo fazėje. Be to, cDNR vektoriai laikui bėgant gali būti nutildyti, jiems trūksta galimybių ekspresuoti visus geno suskaidymo variantus ir, kadangi jie dažnai yra konstruojami lentivirusiniame ar retrovirusiniame stubure, jie gali integruotis į genomą ir sukelti įterpimo mutagenezę 3, 4 . Genominės DNR ekspresijos vektoriai turi pranašumų tuo, kad juose gali būti visas genas ir reguliavimo elementai, kontroliuojantys jo ekspresiją 5, 6, 7 . Genų ekspresijos gavimas iš genominio lokuso yra sudėtingas įvykis, apimantis kelių promotorių, stiprintuvų ir slopintuvų elementų sąveiką, kad būtų pasiekta genų ekspresija, tinkamai sureguliuota vystymuisi ir specifiniam audiniui. Daugeliu atvejų elementai, reguliuojantys geno ekspresiją, nebuvo apibrėžti, todėl viso genomo lokuso pristatymas yra tinkamiausias būdas ekspresijos savybėms, kurios primena geno, esančio jo endogeniniame lokuse, gavimo būdą. Ankstesni tyrimai, kuriuose buvo palyginta ekspresija iš cDNR ir genomo DNR raiškos vektorių, pateiktų in vivo, parodė, kad transgeno ekspresija iš cDNR vektorių laikui bėgant mažėja, tuo tarpu genomo DNR vektoriai gali išlaikyti stabilų fiziologinės ekspresijos lygį keletą mėnesių po gimdymo 8, 9 . Be to, buvo parodyta, kad pateikus visą genomo lokusų grįžtamąjį ryšį, gali būti išlaikyta genų ekspresijos reguliacija; įvykis, lemiantis išraiškos tikslinimą, reaguojant į fiziologinius nurodymus. Genominiai DNR vektoriai taip pat gali leisti ekspresuoti alternatyvius nuorašus ir diferencinio promotoriaus naudojimą, pagrindinius genų reguliavimo mechanizmus fiziologinei kontrolei 10, 11 .

Genominiai DNR vektoriai paprastai yra paremti dirbtinėmis bakterijų chromosomomis (BAC), kurios yra labai stabilūs, žiediniai savaiminio replikacijos vektoriai, galintys nešioti įterpimus iki 300 kb DNR sekos 12, 13 . BAC vektoriai buvo plačiai naudojami graužikų transgenezėje ir buvo įrodyta, kad jie suteikia laikinai ir audiniams specifinę transgeno genų ekspresiją 14, 15 . Taigi BAC bibliotekos yra vertingas šaltinis, naudojamas atliekant funkcinius tyrimus, tačiau šiuo metu jos nepakankamai naudojamos in vitro, nes sunku efektyviai pristatyti BAC kultūros ląstelėse. Pristačius visas BAC bibliotekas į ląstelių kultūros sistemas, tokias kaip žmogaus paciento ląstelių linijos, turinčios genetinį sutrikimą, genų gelbėjimu būtų galima atrasti didelio našumo geną, kai pastebimas baisus fenotipas iš paciento ląstelių. Nors virusiniai vektoriai yra veiksminga priemonė genams pristatyti į kultūros ląsteles, dauguma virusinių sistemų neturi pakankamo transgeno pajėgumo, kad galėtų pernešti pilną genomo DNR lokusą. Išimtis yra herpes simplex viruso 1 tipo (HSV-1) amplikonų sistema, kurios transgeno talpa yra iki ~ 150 kb. Anksčiau mes sukūrėme infekcinę BAC (iBAC) sistemą, kuri remiasi HSV-1 amplikono technologija, kad tarpininkautų nepažeistų genominės DNR lokusų , gautų > 100 kb, tiekimu tiek in vitro, tiek in vivo 4, 16 . Čia aprašome genomo mastu užkrečiamų DNR amplikonų, turinčių iš HSV-1 gautas DNR sekas, biblioteką, leidžiančią vektorius supakuoti ir pristatyti per didelės talpos replikacijos deficitą turinčius HSV-1 amplikono vektorius 17 . IBAC vektorius taip pat neša Epšteino-Baro viruso išvestus EBNA-1 / oriP papildomus chromosomų susilaikymo elementus, užtikrinančius epizominį perkeltų lokusų palaikymą 18, 19, 20 . Apytiksliai apskaičiuota, kad 184 320 klonų bibliotekoje yra 90% autosomų. Jai būdingas galutinis sekos nustatymas ir nustatyta, kad vidutinis genomo DNR intarpas yra 134, 5 kb, o tai yra optimalus dydis HSV-1 amplikono pakuotėje 16 . Susidomėjimo klonai yra viešai prieinami ir mokslo bendruomenė juos gali lengvai atpažinti per „Ensembl“ naršyklę. Čia parodoma, kaip klonai iš „iBAC“ bibliotekos gali būti naudojami funkciniam gelbėjimui ląstelių linijose, turinčiose genetinių trūkumų.

Rezultatai

IBAC genominės DNR ekspresijos bibliotekos sudarymas ir analizė

Norėdami sukonstruoti „iBAC“ biblioteką, atlikome dalinį Mbo I virškinimą ant C3H / HeJ pelės genomo DNR ir subklonuodavome suskaidytus fragmentus į iBAC bibliotekos vektorių, naudodami unikalią BamHI klonavimo vietą (1a pav.). IBAC vektoriuje yra bakterijų replikacijos, papildomos chromosomų sulaikymo ir pakavimo į HSV-1 amplikonus sekos. Visą biblioteką sudaro 184 320 iBAC klonų (C3H), išdėstytų 480 × 384 šulinėlių plokštelėse.

Image

( a ) iBAC bibliotekos vektoriuje yra DNR elementai, skirti pakavimui į HSV-1 amplikono vektorius, ekstrachromosomų išlaikymas ir bakterijų replikacija. Genomo DNR fragmentai buvo klonuoti į unikalią „BamHI“ vietą. ( b ) „iBAC“ klonų intarpų dydžių dažnio pasiskirstymas, pagrįstas 62 825 klonų pabaiga. „IBAC“ bibliotekos klonams buvo atlikta BAC pabaigos seka, naudojant universalius pradmenis T7 ir SP6, ir sekos buvo pažymėtos pelės genome. Kiekviena juosta rodo iBAC klonų, esančių per + 10 kb intervalą, skaičių (ty 100 kb = visi klonai yra nuo 100 000 bp iki 109 999 bp).

Visas dydis

Mes suporuodavome 87 120 iBAC klonus, su kuriais galutinai sekveneravome, ir vienareikšmiškai pažymėjome 62 825 iBAC intarpus prie pelės genomo (m38), nustatydami vidutinį 134, 5 kb genomo DNR intarpo dydį (1b pav.), Kuris yra optimalus HSV-1 amplikono pakuotės dydis 16. . Kadangi „iBAC“ klonai, kurių vektoriaus dydis <80 kb, būtų supakuoti į dvi ar daugiau vektoriaus kopijų, skirtų HSV-1 viruso dalelėms 21, 22, 23, mes kiekybiškai įvertinome bendrą mažesnių nei 80 kb klonų skaičių ir nustatėme, kad tik 1557 iš Šiai kategorijai priklauso 62 825 „iBAC“ klonai, kurie sudaro tik 2, 5% bibliotekos.

62 825 klonai, identifikuoti ir surinkti pagal sekos nustatymą, suteikia 90, 2% autosomų vidutinį aprėptį 3, 3 karto gylyje (1 lentelė), o mes įvertiname 7–8 kartų genomo aprėpties gylį visoje 184 320 klonų bibliotekoje. Kad biblioteka būtų prieinama visuomenei, klonai gali būti rodomi Ensembl genome 24, įkeliant pateiktą .bed failą (papildomas S1 pav.).

Pilno dydžio lentelė

iBAC bibliotekos klono stabilumas E. coli

Toliau mes išanalizavome iBAC bibliotekos klonų stabilumą E. coli, atlikdami restrikcijos fermento skaidymo analizę, nes aukšto dažnio vektorių pertvarkymas trukdytų bibliotekos, kaip molekulinės priemonės, funkcionalumui. Atsitiktinai pasirinkome 22 „iBAC“ klonus, kurių intarpai buvo mažesni nei 150 kb, ir atlikome „Not I“ suvestinį, kuris, kaip tikimasi, išlaisvins genomo DNR intarpą dėl to, kad p7170.2 vektoriuje yra Not I vietų, besiribojančių su unikalia „Bam HI“ klonavimo vieta (pav. .1a). Tikėtinas fragmentų dydis buvo numatytas nubrėžus BAC galus į pelės genomą naudojant Ensembl naršyklę. Prognozuojamo dydžio fragmentai buvo identifikuoti 19 iš 22 klonų, atskleidžiant apskaičiuotą BAC vektoriaus pertvarkymo dažnį šia skiriamąja geba 13, 6% (2a, b pav.). Šis žemas bendro pertvarkymo dažnis atitinka anksčiau praneštų BAC bibliotekų 25 dažnį ir manome, kad mažai tikėtina, jog tai netrukdys naudoti „iBAC“ biblioteką funkciniams tyrimams, atsižvelgiant į autosomų aprėptį apytiksliai 7–8– gylyje. kartus (1 lentelė).

Image

( a ) Vektoriaus stabilumo analizė buvo atlikta atlikus 22 iBAC klonų Not I skaidymą, kurių genomo intarpas buvo mažesnis nei 150 kb. Juostos: M = vidutinės vertės I PFG žymeklis; 1–22 juostos = „iBAC“ bibliotekos klonai, aprašyti b punkte. ( b ) Numatomas iBAC bibliotekos klonų, pavaizduotų a punkte, fragmento dydis buvo gautas atvaizduojant BAC galus prie pelės genomo naudojant Ensembl. Vektorių pertvarkymas buvo nustatytas trijuose iš 22 klonų, tai rodo, kad persitvarkymo dažnis buvo 13, 6%. c ) schematiškai vaizduojami trys etapai, susiję su iBAC bibliotekos paruošimu ir pristatymu, būtent: vektoriaus DNR paruošimas, pakavimas į HSV-1 amplikonus ir viruso taikinių ląstelių perdavimas. ( d ) Genomo aprėptis buvo įvertinta naudojant STS žymeklio PGR trimis etapais, aprašytais c punkte, po paruošimo ir pristatymo į visos bibliotekos, sudarytos iš 184 320 klonų, ląsteles. Nebuvo pastebėtas reikšmingas skirtumas tarp skirtingų bibliotekos paruošimo etapų naudojant vienpusį ANOVA testą su Dunnett daugybinių palyginimų testu (palyginti su Maxiprep). Klaidų juostos reiškia +/− SEM.

Visas dydis

IBAC bibliotekos išlaikymas ruošiant ir pakuojant į HSV-1 amplikonus

Norėdami įvertinti iBAC bibliotekos išlaikymą per vektoriaus paruošimo procesą ir pristatyti biblioteką kultūros ląstelėms, mes ištyrėme bibliotekos genomo aprėptį DNR maxiprep (DNR paruošimas prieš pakuojant) stadijose, amplikono pakavimą (atliktą Vero 2.2 versijoje). ląstelės) ir vektoriaus transdukcija į žmogaus fibroblastus kultūroje (2c pav.). Šiai analizei atlikti atrinkome 94 PGR pradmenų poras, tolygiai paskirstytas pelės genome (papildomas S2a pav. 26 ) 26 ir panaudojome įdėto PCR protokolą, kad kiekviename procedūros etape būtų užtikrintas jautrus iBAC DNR aptikimas (papildomas S2b pav.)., c). Pradmenų poros buvo parinktos taip, kad būtų specifiškos pelėms, palyginus seką su žmogaus ir pelės genomais. Be to, pradmenų poros buvo parinktos taip, kad amplifikuotų sritis, kurios, kaip žinoma, yra polimorfinės tarp 129 (substratas 129S7 / SvEvBrd) ir C3H pelių, kad būtų lengviau identifikuoti C3H iBAC bibliotekos klonus gaunančiose pelių ląstelių linijose (pvz .: 129 embriono kamieno (ES) ląstelės). . Šiam eksperimentui mes pristatėme visą 184 320 klonų „iBAC“ biblioteką į žmogaus fibroblastus ir stebėjome vienodą bibliotekos išlaikymo lygį visos pakuotės ir pristatymo metu (2d pav.).

Mažo tankio lipoproteinų receptorių funkcijos nepakankamumo ląstelių linijos fiziologinė išraiška ir fenotipo korekcija naudojant atskirus iBAC bibliotekos klonus

Norėdami įvertinti iBACs funkcionalumą bibliotekoje, pasirinkome kloną, apimantį visą mažo tankio lipoproteinų receptorių ( Ldlr ) lokusą (klonas C3H-217h07) (papildomas S1 pav.). Ldlr transkripcijos reguliavimas cis- genominėmis DNR sekomis yra gerai apibūdinamas, todėl šis genas yra puikus kandidatas iBAC bibliotekai įvertinti kaip ekspresijos įrankis 11, 27 . „IBAC“ bibliotekos klonas C3H-217h07 buvo supakuotas į HSV-1 amplikonus, naudojant patobulintą pakavimo sistemą be helper-viruso (2c pav.) 17, ir panaudotas Ldlr trūkumų turinčioms CHO ldlr - / - a7 ląstelėms perduoti , kai MOI yra 10. Ldlr funkcija buvo ištirta naudojant fluorescenciškai pažymėtus mažo tankio lipoproteinus (DiI-MTL). „IBAC“ klonas C3H-217h07 teisingai atkūrė Ldlr aktyvumą Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ldlr - / - a7 ląstelėse iki laukinio tipo lygių, patvirtindamas genomo DNR sekų, įtrauktų į iBAC vektorių, funkcionalumą (3a pav.).

Image

( a ) „iBAC Ldlr“ klonas C3H-217h07 buvo supakuotas į HSV-1 amplikonus ir išgryninti HSV-1 amplikonai buvo naudojami Ldlr trūkumų turinčioms CHO ldlr - / - a7 ląstelėms perduoti . Ląstelės, užkrėstos C3H-217h07, rodo, kad Ldlr funkcija atstatoma iki laukinio tipo. Klaidų juostos reiškia +/− SEM. ( b ) CHO ldlr - / - a7 ląstelės buvo transfekuotos arba iBAC klonu (C3H-37f03 arba C3H-37g16), arba su pCMV-LDLR plazmidė p7113 ir inkubuojamos su simvastatinu 300 nM 48 valandas. Ldlr ekspresija buvo kiekybiškai įvertinta qRT -PGR ir normalizuota pagal transfekcijos efektyvumą. „iBAC Ldlr“ klonai rodo reikšmingą išraiškos padidėjimą 1, 5–2, 0 karto po gydymo statinais, tuo tarpu p7113 nepasižymi didesniu reguliavimu. Klaidų juostos reiškia vidurkį ± SEM. * P <0, 05, nustatytas nesusijusio dvipusio Studento t-testu.

Visas dydis

Norėdami ištirti, ar „iBAC“ bibliotekos klonai gali pasiekti fiziologiškai reikšmingą ekspresijos reguliavimą, toliau išsamiai išanalizavome du Ldlr klonus. Mes transfekavome CHO ldlr - / - a7 ląsteles arba iBAC klonu, turinčiu visą Ldlr genominės DNR lokusą (C3H-37f03 arba C3H-37g16), arba p7113, plazmidę, turinčią žmogaus LDLR cDNR geną, kontroliuodami tiesioginį ankstyvąjį citomegalo viruso (pCMV), taigi trūksta reikiamų reguliavimo elementų. Kadangi Ldlr ekspresija yra tiksliai kontroliuojama tarpląstelinio sterolio lygiu per neigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmą 11, 27, tada mes inkubuojame transfekuotas ląsteles su simvastatinu, nes yra žinoma, kad statinai, norėdami sumažinti ląstelių cholesterolio sintezę, skatina MTLR padidėjusį reguliavimą iš genomo lokuso 28 . Kaip parodyta 3b pav., Ldlr ekspresija iš C3H-37f03 ir C3H-37g16 iBAC klonų žymiai padidėja po inkubacijos su simvastatinu, tuo tarpu pCMV-LDLR vektorius, kaip ir tikėtasi, nesugeba sureguliuoti MTLR ekspresijos. Šie duomenys parodo genominės DNR iBAC bibliotekos naudojimo pranašumus, parodant sėkmingą fiziologinį genų ekspresijos reguliavimą iš genominės DNR bibliotekos klonų.

Fenotipo gelbėjimas ir ekstrachromosomų iBAC vektoriaus susilaikymas dalijamosiose ląstelėse

Norėdami įvertinti, ar klonai iš bibliotekos gali būti išlaikyti ir sėkmingai atpažįstami po atrankos proceso, kuris yra esminis ilgalaikių funkcinių tyrimų reikalavimas, pasinaudojome tyrimu, kurio metu ES 7.1 ląstelių transmisija retrovirusiniu būdu atlikta naudojant egotropinį pelių leukemijos virusą (MuLV). ) priklauso nuo funkcinio mCat-1 receptoriaus geno, užkoduoto Slc7a1 geno 29, 30, 31, ekspresijos . ES 7.1 ląstelių linija neišreiškia mCat-1 receptorių, nes yra integruotas retrovirusinis geno gaudyklės vektorius, turintis sujungimo-akceptoriaus vietą pasroviui po Slc7a1 2 egzono, taigi, nėra jautrus MuLV infekcijai 29 . ES 7.1 ląstelės buvo perneštos individualiu iBAC, apimančiu mCat-1 geną (C3H-17106), ir po keturiasdešimt aštuonių valandų ląstelės buvo superinfekuotos Puro / TK, MuLV retrovirusu, turinčiu puromicino atsparumo kasetę (4 pav. ) 29 . Po dvidešimt keturių valandų puromicinas / higromicinas buvo parinkti dvigubai, siekiant parinkti atitinkamai retrovirusą ir iBAC vektorių, o epizominė DNR iš ląstelių buvo ekstrahuota dvigubai atrenkant po 14 dienų. Išgelbėjus plazmidę, buvo nustatytas nepažeisto C3H-17l06 iBAC klono vektoriaus atstatymas į bakterijos šeimininką, o Slc7a1 egzonų PCR amplifikacija iš išgelbėto BAC plazmidės patvirtino klono tapatumą (4 pav.). Čia aprašytas eksperimentas parodo sėkmingą funkcinį mCat-1 trūkumo išgelbėjimą ir iBAC bibliotekos klono išlaikymą ekstrachromosominiu būdu, jei po 14 dienų vektorių neperskirstymas dalijant ląsteles kultūroje.

Image

Pelės ES 7.1 ląstelės yra neinfekuojamos MuLV retrovirusų, nes jose trūksta mCat-1 receptoriaus geno. Tačiau transdukcija su iBAC klonu C3H-17l06, turinčiu visą mCat-1 genomo DNR lokusą, leidžia sėkmingai atlikti MuLV retrovirusinį transdukciją. Po dvigubos infekcijos C3H-17l06 HSV-1 amplikonais ir Puro r MuLV retrovirusais, ląstelės buvo teigiamai parinktos higromicino ir puromicino, o epizominė mCat-1 iBAC DNR buvo išgelbėta atgal į bakterijas ir išanalizuota PGR bei impulsinio lauko gelio elektroforeze. (PFG) po ne virškinimo. PFG: 1 juosta = II intervalo PFG žymeklis; 2 juosta = 1 kb plius DNR kopėčios; 3 juosta = C3H-17106 DNR; 4–8 juostos = Išsaugoti „iBAC“. PGR: 1 juosta = HyperLadder 50 bp; 2–7 juostos = „ mCat-1“ 1, 3, 6, 9, 12, 15 egzonai.

Visas dydis

Diskusija

Norint geriau suprasti sudėtingą biologinę genomo funkciją ir mutacijų vaidmenį ligos procesuose, skubiai reikalingi nauji veiksmingi metodai. Ekspresijos bibliotekos yra patraukli platforma tiek į priekį, tiek atgaline funkcine analize, nes leidžia identifikuoti naujus genus, susijusius su dominančiu keliu, ir išsamiai analizuoti genų funkcijas 32 . Tarp skirtingų šiuo metu prieinamų ekspresijos bibliotekų, kurių pagrindą sudaro genomo DNR ekspresijos vektoriai, yra ypač perspektyvus funkcinių genomikos tyrimų įrankis dėl jų gebėjimo užtikrinti genų ekspresijos fiziologinį reguliavimą, panašų į natūralaus endogeninio lokuso 5, 6, 10, 11, 12, 33 . Ši patraukli savybė atsiranda dėl didelio BAC vektorių talpumo, kuris leidžia pristatyti visą dominančio geno genomo DNR lokusą 13 . Tačiau genominių DNR bibliotekų naudojimą funkciniams ekranams iki šiol trukdė mažas didelių vektorių, > 100 kb, pristatymo į ląsteles efektyvumas, nes tokių bibliotekų pristatymas nevirusiniais metodais yra labai neefektyvus. Virusiniai vektoriai yra patraukli alternatyva nevirusiniams metodams, tačiau daugeliui turimų virusų perdavimo sistemų būdingas ribotas transgeno pajėgumas.

Čia aprašome didelę techninę ir koncepcinę pažangą sukurdami pirmąją genomo DNR biblioteką, kuri gali būti perduodama viruso perdavimo būdu. „IBAC“ bibliotekoje yra sekos, leidžiančios vektorius supakuoti į HSV-1 amplikonus - viruso vektorių perdavimo sistemą, gautą iš plačiai paplitusio 1 tipo herpes simplex viruso 22 . HSV-1 amplikonai yra bakteriniai vektoriai, turintys HSV-1 litinę replikacijos pradą ( oriS ), o DNR skilimas / pakavimo terminalas kartojasi ir neturintys didžioji dauguma HSV-1 genomo, todėl leidžiantys maksimalų transgeno pajėgumą iki ~ 150 kb. Kadangi šie „žarnyno neturintys“ vektoriai turi tik keletą kilobazių HSV-1 DNR, norint supakuoti į HSV-1 amplikonus, reikia kartu transfinuoti tiek supakuojamą vektorių, tiek BAC, kuriame yra visas HSV-1 genomas, bet neturinčius pakavimo signalų, kurie užtikrina pagalbinę funkciją neužteršiant rekombinantiniais HSV-1 virusais 34 . HSV-1 amplikonai gali efektyviai užkrėsti daugybę dalijamųjų ir neskirstančiųjų ląstelių, todėl dideliu efektyvumu leidžia pristatyti į ląsteles BAC vektorius, didesnius kaip 100 kb. „IBAC“ biblioteką sudaro 184 320 klonų, kurių vidutinis intarpas yra 134, 5 kb, o tai yra idealus dydis HSV-1 amplikonams. Įvertinome „iBAC“ bibliotekos E. coli vektorių pertvarkymo dažnį ir patvirtinome aukštą stabilumo lygį, laikydamiesi anksčiau praneštų BAC bibliotekų 25 . Mes parodome, kad bibliotekoje yra bent 90% autosomų aprėpties numatomame 7–8 kartų gylyje, ir parodome tokios dangos išsaugojimą per etapus, reikalingus bibliotekos paruošimui ir pristatymui. Be to, mes parodome savo bibliotekos funkcionalumą, pasirinkdami „iBAC“ klonus per „Ensembl“ naršyklę ir panaudodami juos dviem skirtingais in vitro funkcinio gelbėjimo tyrimais, abiem atvejais parodydami, kad atskiri „iBAC“ klonai sugeba atkurti fiziologiškai reguliuojamą išraišką, stebėtą endogeniniai lokusai.

Svarbus iBAC bibliotekos bruožas yra EBV epizominių sulaikymo elementų buvimas, kurie leidžia pernešti ląsteles replikacijai ir extrachromosominei palaikymui. Įrodyta, kad EBV pagrįsti BAC vektoriai išsaugomi nesant atrankos. Efektyvumas yra 92–98% per ląstelių dalijimąsi 7, 18, 35, leidžiant sulaikyti vektorius ilgalaikio ląstelių auginimo metu, po to išskiriant ir identifikuojant vektorius. Plazmidiniai vektoriai, pagrįsti EBNA-1 / oriP sistema ir neturintys genominės DNR sekos, neatkartoja 20, 36 graužikų ląstelių, tačiau žinduolių genomo DNR fragmentų įtraukimas> 10 kb suteikia vektorių replikaciją kartą per ląstelę., dėl žinduolių dauginimosi kilmės 37, 38 . Nešant genominius DNR fragmentus, mes tikimės, kad „iBAC“ biblioteka galės replikuoti vektorių, ką įrodo sėkmingas vektoriaus išgelbėjimas po ilgo atrankos ekrano replikuojant ląstelių linijas (4 pav.). Ši savybė leidžia „iBAC“ biblioteką pritaikyti ilgalaikiams genetiniams ekranams.

Apibendrinant galima pasakyti, kad „iBAC“ genominės DNR ekspresijos biblioteka yra nauja priemonė funkciniams tyrimams, užtikrinant fiziologinę transgeno ekspresiją ir efektyvų pristatymą į ląsteles per HSV-1 amplikono sistemą. Mes manome, kad „iBAC“ biblioteka labai papildo naująją CRISPR technologiją, kuri, nors ir leidžia tiksliai modifikuoti endogeninius lokusus, yra daug darbo reikalaujanti ir atima daug laiko. Genominės DNR ekspresijos bibliotekos, tokios kaip „iBAC“ biblioteka, yra tinkamos analizuoti kelis laukinio tipo arba rekombinantinius genomo DNR transgenus efektyvesniu būdu. „IBAC“ biblioteka yra laisvai prieinamas šaltinis, o dominantys klonai yra viešai prieinami ir mokslo bendruomenė gali lengvai juos atpažinti naudodama šiame tyrime pateiktą .bed failą, todėl „iBAC“ biblioteka yra labai tinkama atvirkštiniams funkciniams tyrimams. Galiausiai, atsižvelgiant į ilgalaikį iBAC bibliotekos išlaikymą ekstrachromosominėje būsenoje ir be vektorių pertvarkymo, mes manome, kad biblioteka galėtų būti nauja molekulinė priemonė tolimesniems genetiniams ekranams.

Metodai

iBAC bibliotekos statyba

„IBAC“ bibliotekos vektorius p7170.2 yra pagrįstas pBACe3.6, pridedant šias sekas: HSV-1 orus ir pac sekas, skirtas pakuoti į HSV-1 virionus; EGFP reporterio genas, kurį kontroliuoja stiprus HSV-1 IE4 / 5 promotorius, kad būtų galima sekti vektoriaus pristatymą ir vektoriaus titravimą; ir EBNA-1 / oriP epizominės sulaikymo sistemos elementus iš Epšteino-Baro viruso kartu su atsparumo higromicinu genu ląstelių atrankai in vitro . Bibliotekos konstravimui C3H / HeJ pelės patino genominė DNR buvo iš dalies suvirškinta Mbo I, kad būtų suformuoti darnūs galai. Genominiai DNR intarpai buvo parinkti frakcionuojant dydį, naudojant impulsinio lauko gelio elektroforezę, kad būtų galima sukaupti maždaug 140 kb, optimalaus dydžio HSV-1 amplikono pakuotę, ir liguojami į Bam HI linijinį p7170.2 vektorių. Po transformacijos į „ElectroMax DH10B“ ląsteles buvo paimti 184 320 klonai ir sudėti į 480 × 384 šulinėlių plokšteles. „IBAC“ išraiškos biblioteka yra atvirai prieinamas šaltinis, o papildomos informacijos apie „iBAC“ gavimą galima rasti //www.sanger.ac.uk/form/-jfZxIjTNSYSlIfmEq0elKA.

„IBAC“ klono intarpų dydžių analizė

„IBAC“ bibliotekos klonai buvo galutinai surikiuoti, naudojant T7 ir SP6 pradmenų sekas, apimančias intarpus p7170.2. BAC pabaigos seka buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau 39 . Galinės sekos buvo susietos su pelės genomu (GRCm38 surinkimas) 40 . Sujungti klonai buvo surinkti iš suderintų galinių porų tikrinant kelis kriterijus, pavyzdžiui, patikrinant, ar atskyrimo atstumas tarp klono galų atitinka žinomą BAC intarpų dydžių diapazoną.

Perduotos iBAC bibliotekos genomo aprėpties įvertinimas naudojant PGR

Norint įvertinti iBAC bibliotekos genomo aprėptį rengiant biblioteką, pradinio poros iš anksčiau aprašyto „Sequenom“ platformos tyrimo, pasirinktas kaip polimorfinis tarp pelių padermių 129 (substratas 129S7 / SvEvBrd) ir C3H / HeJ 26, leido mums aptikti iBAC bibliotekų preparatuose ir perneštose ląstelėse. Kiekvieno pradmens specifiškumas pelės genomui buvo patvirtintas naudojant BLAST algoritmą tiek pelės, tiek žmogaus genomo duomenų bazėms, ir pradmenų poros buvo suprojektuotos taip, kad būtų galima gauti PGR produktą, kurio ilgis būtų nuo 200 iki 300 bp. Universalaus pradmenų M13 seka (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3 ′) arba atvirkštinė (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ′) buvo pridėta atitinkamai prie priekinio arba atvirkštinio pradmenų 5 ′ galo. Grunto sekos pateikiamos pagal užsakymą. Kiekviena pradmenų pora buvo optimizuota naudojant AmpliTaq Gold (Life Technologies), koreguojant magnio chlorido koncentraciją ir atkaitinimo temperatūrą. IBAC bibliotekos genomo aprėpties analizei naudojant sekos pažymėtas vietas (STS) buvo atlikti du PGR raundai. Pirmame raunde polimorfizmui būdingos pradmenų poros, turinčios M13 universalią pradmenų seką, buvo naudojamos identifikuoti STS ir pridėti M13 žymes ant PGR produkto galų. Antrame raunde priekinis ir atvirkštinis M13 pradmenys buvo naudojami toliau amplifikuoti produktą. IBAC bibliotekos DNR preparatai buvo atlikti iš 250 ml E. coli kultūrų, naudojant modifikuotą „Tip 500 Maxiprep Kit“ protokolą (Qiagen) 41 . DNR buvo išgauta iš amplikono preparatų, naudojant žinduolių „GenEluteTM“ („Sigma“) genominės DNR rinkinį. Bendra genomo DNR buvo ekstrahuota iš transdukuotų MRC-5V2 fibroblastų, pridedant lizės buferio (0, 65% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris.Cl, pH 8, 20 mM EDTA, 100 μg / ml proteinazės K) ląstelėms 10- cm lėkštė, ląstelių lizato inkubacija 16 val. 37 ° C temperatūroje, po to ekstrahuojama fenolio / chloroformo forma, DNR nusodinimas ir resuspensija TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA).

HSV-1 amplikono vektorių pakuotė

HSV-1 amplikonai buvo gaminami naudojant patobulintą pakavimo sistemą be viruso, kaip aprašyta anksčiau 17 . Paprastai supernatantas iš trijų 6 cm lėkščių buvo sukoncentruojamas ultracentrifuguojant 22 000 aps./min. 3 valandas SW41 rotoriuje (Beckman) ir vėl suspenduotas 250 μl DMEM, 10% FBS, P / S, L-glutamino. vidutinis atsargų kiekis, lygus 1–2 × 107 7 vienetų (tu) / ml. Amplikono titravimui į 24 šulinėlių plokštelės šulinį buvo pasėtos 4 × 105 G16.9 ląstelės ir po 24 val. Užkrėstos iBAC amplikonais. Dvidešimt keturias valandas po užsikrėtimo titras buvo nustatytas pagal GFP reporterio geno ekspresijos analizę.

Mažo tankio lipoproteinų receptorių (Ldlr) ekspresijos analizė

Ldlr funkcija buvo tiriama pagal DiI-MTL įsisavinimą 6 . 1x104 CHO laukinio tipo ir CHO ldlr - / - a7 ląstelės buvo sėjamos į 24 duobučių plokštelės duobutes ir po 24 val. Terpė buvo pakeista Ham's F12 terpe, papildyta 5% lipoproteinų deficito FBS (LPDS, Biomedical). Technologies, Inc, Stoughton, MA, JAV). Po keturiasdešimt aštuonių valandų ląstelės buvo persodintos HSV-1 amplikonais po daugybės infekcijų (MOI) praėjus 10 ir 24 valandoms. Infekcijos mišinys buvo pakeistas šviežiomis LPDS turinčiomis terpėmis. Po 72 val. Į ląsteles buvo pridėta terpė, kurioje buvo DiI-MTL (AbD Serotec, Kidlington, Oxford) ir kurios koncentracija buvo 10 μg / ml, ir ląstelės buvo inkubuojamos 5 valandas 37 ° C temperatūroje. Tada DiI-LDL mišinys buvo pašalintas, ląstelės vieną kartą plaunamos Ham F12 terpėje ir DiI fluorescencija buvo kokybiškai išanalizuota Eclipse TE2000-U (Nikon) apverstu mikroskopu. Kiekybinei analizei ląstelės po to du kartus plaunamos PBS su Ca2 + ir Mg2 +, turinčiais 0, 4% galvijų serumo albumino (BSA), ir tris kartus tik su PBS ir lizuojamos 0, 1% SDS / 0, 1 N NaOH. Ląstelės lizatoriaus fluorescencija buvo tiriama naudojant Jenway 6280 fluorimetrą, esant sužadinimo ir emisijos bangos ilgiui atitinkamai 520 ir 580 nm, o bendras baltymų kiekis nustatytas naudojant bicinchonino rūgšties testą (BCA, Sigma). Nespecifinis surišimas buvo nustatytas esant 50 kartų nepaženklinto MTL pertekliui (AbD Serotec, Kidlington, Oxford) ir atimtas iš bendro surišimo, kad būtų gautas specifinis surišimas.

Ldlr ekspresija po inkubacijos su simvastatinu buvo įvertinta kiekybiniu realaus laiko PGR (qRT-PGR). 3, 5 × 10 5 CHO ldlr - / - a7 ląstelės buvo pasėtos kiekviename 6 šulinėlių plokštelės šulinyje ir kitą dieną jos buvo perpiltos 452 ng iBAC (C3H-37F03 arba C3H-37G16) kiekvienoje duobutėje arba 113 ng p7113 (14, 2 kb vektorius, turintis CMV-LDLR kasetę ir HSV-1 amplikono pakavimo elementus) kiekvienoje duobutėje . Buvo nustatyta, kad panaudoti DNR kiekiai gali pasiekti palyginamą transfekcijos efektyvumą. Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, terpė buvo pakeista Ham F12 terpe, papildyta 5% LPDS. Po 24 valandų terpė buvo pakeista Ham's F12 terpe su 5% LPDS, papildyta simvastatinu (Sigma, S6196), kai galutinė koncentracija buvo 300 nM. Kadangi simvastatinas buvo pakartotinai suspenduotas absoliučiame etanolyje, kontrolinėse inkubacijose į terpę buvo įpiltas ekvivalentiškas kiekis etanolio. Po 24 valandų ląstelės buvo plaunamos PBS ir visa RNR buvo ekstrahuota naudojant „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen) ir apdorota DNR be RNase (Qiagen). cDNR buvo susintetinta iš 1 μg visos RNR, naudojant atsitiktinius pradmenis (Life Technologies) ir SuperScript III atvirkštinę transkriptazę (Life Technologies), esant 20 μl reakcijos tūriui. qPCR buvo atliktas, kaip aprašyta 42 punkte, naudojant: RNR-mldlr 2F (5′-GAGGAACTGGCGGCTGAA-3 ′) ir RNR-mLdlr 2R (5′-GTGCTGGATGGGAGAGGTCT-3 ′), kad būtų galima aptikti mldlr mRNR; p7113 1F (5′-GGATGACGTGGCGTGAAA-3 ′) ir p7113 1R (5′-TTAAACGGGCCCTCTAGACT-3 ′) CMV-LDLR mRNR ekspresijai nustatyti; ir galiausiai, EGFP 2F (5′-TATATCATGGCCGACAAGCA-3 ′) ir EGFP 2R (5′-GAACTCCAGCAGGACCATGT-3 ′) EGFP mRNR nustatyti. mldlr ir p7113 duomenys buvo normalizuoti iki EGFP, siekiant atsižvelgti į transfekavimo efektyvumo skirtumus tarp iBAC ir p7113 vektorių.

Retrovirusinių vektorių gamyba

Puro / TK MuLV retrovirusinių vektorių gamyba buvo atlikta naudojant stabilų, be pagalbininkų, retrovirusų gaminančių ląstelių liniją Phoenix Eco, kaip anksčiau aprašyta 29, 43 .

Išsaugoti ES 7.1 retrovirusinio transdukcijos atvejai , perduodant mCat-1 lokusą

ES 7.1 ląstelės nėra užkrėstos „MuLV“ retrovirusais, nes jose nėra ekspresuojamas Slc7a1 genas 29, kuris koduoja katijoninių aminorūgščių pernešėją, veikiantį kaip pelių ekotropinis leukemijos viruso 30, 31 receptorius. Anksčiau buvo pranešta apie šių ląstelių generaciją atliekant viso genomo intarpinę mutagenezę Blm deficito ES ląstelėse 29 . 1 × 10 4 ES 7, 1 ląstelės, kurių „ mCat-1“ nėra , buvo pasėtos į 24 šulinėlių plokštelės šulinėlį, o po 24 valandų ląstelės buvo persodintos „iBAC C3H-17l06 HSV-1“ amplikonais. Po 24 valandų infekcijos mišinys buvo pašalintas ir pakeistas šviežia terpe. Po 24 valandų į ląsteles buvo pridėtas infekcijos mišinys, susidedantis iš Puro / TK MuLV retrovirusinio preparato ir polibreno (heksadimetrino bromido; Sigma), kurio galutinė koncentracija buvo 10 μg / ml. Galiausiai, po dar 24 valandų, terpė buvo pakeista ir panaudota higromicino B (Life Technologies) ir puromicino (Life Technologies) atranka, kol atsirado izoliuotos kolonijos.

Epizominis higromicinui / puromicinui atsparių ES 7.1 ląstelių išgelbėjimas

Epizominė DNR buvo ekstrahuota naudojant šarminės lizės metodą, kaip aprašyta ref. 6 ir vėl suspenduotas 20 μl TE su 50 μg / ml RNazės A. 10 μl epizominio preparato buvo panaudota transformacijai elektroporacijos būdu atliktomis DH10B bakterijomis, kurios buvo padengtos ant LB agaro antibiotikais. Iš gautų bakterijų kolonijų buvo pagaminta plazmidinė DNR, suardyta Not I, ir skaidymai buvo išskaidyti impulsinio lauko gelio elektroforeze, naudojant šias sąlygas: V / cm = 6, veikimo laikas = 16 val., Pradinis jungiklis = 2 sek., Galutinis jungiklis. = 16 sek.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Lufino, MMP ir kt . Infekcinė BAC genomo DNR ekspresijos biblioteka: didelės talpos vektorių sistema funkcinei genomikai. Mokslas. Rep. 6, 28644; „doi“: 10.1038 / srep28644 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.