Kepenų citochromo p450 fermentų ir natrio / tulžies rūgšties kotransporterio slopinimas padidina leflunomido sukeltą hepatotoksiškumą | acta pharmaologica sinica

Kepenų citochromo p450 fermentų ir natrio / tulžies rūgšties kotransporterio slopinimas padidina leflunomido sukeltą hepatotoksiškumą | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Leflunomidas yra imuninę sistemą slopinantis agentas, parduodamas kaip ligą modifikuojantis vaistas nuo reumato. Bet tai sukelia sunkų šalutinį poveikį, įskaitant mirtiną hepatitą ir kepenų nepakankamumą. Šiame tyrime mes ištyrėme leflunomido ir jo pagrindinio metabolito teriflunomido metabolizmo kepenyse ir pernešimo įtaką leflunomido sukeltam hepatotoksiškumui in vitro ir in vivo .

Metodai:

In vitro buvo įvertinti leflunomido ir teriflunomido metabolizmas ir toksiškumas pirminiuose žiurkių hepatocituose. Leflunomido PK profilio nustatymui ir hepatotoksiškumui in vivo buvo naudojamos kepenų citochromo P450 reduktazės nulinės ( HRN ) pelės. Natrio / tulžies rūgšties kotransporterio (NTCP) ekspresija ir funkcija buvo įvertinta žiurkių ir žmonių hepatocituose ir NTCP perkeltose HEK293 ląstelėse. Po to, kai patinams Sprague-Dawley (SD) 4 savaites buvo duota teriflunomido (1, 6, 12 mg · kg −1 · d − 1, ig), buvo ištirti jų kraujo mėginiai.

Rezultatai:

Nespecifinis CYPs inhibitorius aminobenzotriazolas (ABT, 1 mmol / L) sumažino leflunomido IC50 vertę žiurkių hepatocituose nuo 409 iki 216 μmol / L, tuo tarpu kitas nespecifinis CYP inhibitorius proadifenas (SKF, 30 μmol / L) padidino ląstelių kaupimąsi. leflunomido iki 3, 68 karto per 4 val. Išgėrus vaisto (15 mg / kg), leflunomido ekspozicija plazmoje (AUC 0-t ) HRN pelėse padidėjo iki 3 kartų, palyginti su laukinio tipo pelėmis. Leflunomido (25 mg · kg –1 · d – 1 ) skyrimas 7 dienas reikšmingai padidino serumo ALT ir AST lygį HRN pelėms; kai dozė buvo padidinta iki 50 mg · kg −1 · d –1, visos HRN pelės mirė, eidamos d 6. Teriflunomidas reikšmingai sumažino NTCP išraišką žmogaus hepatocituose, taip pat NTCP funkciją žiurkių hepatocituose ir NTCP transfekuotus. HEK293 ląstelės. Keturias savaites vartojamas teriflunomidas reikšmingai padidino bendrojo bilirubino kiekį serume ir tiesioginį bilirubino kiekį žiurkių patelėse, bet ne žiurkių patinų.

Išvada:

Kepenų CYP vaidina lemiamą leflunomido detoksikacijos procesą, o pagrindinis metabolitas teriflunomidas slopina NTCP ekspresiją ir funkcijas, sukeldamas galimą cholestazę.

Įvadas

Leflunomidas (LEF) yra imuninę sistemą slopinantis agentas, kuris daugiausia slopina dihidroorotato dehidrogenazę - greitį ribojantį fermentą pirimidinų biosintezėje. 1998 m. LEF buvo parduotas kaip ligą modifikuojantis antireumatinis vaistas 1 . Tačiau buvo išleista daug pranešimų, kuriuose aprašytas jo šalutinis poveikis klinikinio taikymo metu, įskaitant mirtiną hepatitą ir kepenų nepakankamumą. Dėl šių klinikinių hepatotoksiškumo atvejų Maisto ir vaistų administracija (FDA) 2011 m. Pažymėjo LEF su juodosios dėžutės įspėjimu (//www.fda.gov/Safety/MedWatch/SafetyInformation/ucm228392.htm). Keletas citochromo P450 fermentų (CYP), tokių kaip CYP1A2, CYP2C19 ir CYP3A4, dalyvauja biotransformavus LEF į pagrindinį jo metabolitą teriflunomidą (TER) 2 . Viena klinikinė ataskaita parodė, kad pacientui kartu su LEF ir CYP3A inhibitoriumi itrakonazolu išsivystė mirtinas hepatitas 3 . Tačiau CYP indėlis į LEF sukeltą toksiškumą kepenims dar nėra visiškai išaiškintas, o riboti in vitro rezultatai yra prieštaringi. Pvz., Buvo pasiūlyta, kad LEF metabolitai gali būti toksiškesni kepenims, nes LEF sukeltą citotoksiškumą sumažino nespecifinis CYP inhibitorius ABT įamžintose žmogaus hepatocituose 4 . Kita vertus, kitame tyrime nurodoma, kad LEF citotoksiškumą padidino keli CYP inhibitoriai pirminiuose žiurkių hepatocituose 5 . Kiek mes žinome, tiesioginių in vivo tyrimų, tiriančių CYP reikšmę LEF sukeltam hepatotoksiškumui, nėra. Be to, nors gydymas TER žymiai padidino aminotransferazių kiekį, dėl kurio 6, 7, 8 klinikinių tyrimų metu gydymas buvo nutrauktas, nėra tyrimų apie LEF metabolito toksinį poveikį kepenims. Todėl verta ištirti TER sukelto toksinio poveikio kepenims mechanizmą ir jo įtaką LEF kepenų toksiškumui. Tuo pačiu metu buvo pranešta, kad ir LEF, ir TER yra didelio afiniteto atsparumo krūties vėžiui baltymo (BCRP) 9 afinitetai. Kadangi pranešta, kad yra daugybė antireumatinių vaistų, kurie yra BCRP 10, 11, 12 substratai, o pasikeitusi BCRP funkcija gali sukelti toksinį poveikį 13, reikėtų ištirti galimą vaistų ir vaistų sąveikos riziką, kurią sukelia BCRP ar kiti pernešėjai. . Todėl norime ištirti, ar nešiotojai yra susiję su LEF ir TER toksiškumu kepenims.

Šiame tyrime mes ištyrėme kepenų metabolizmo ir pernešimo įtaką LEF sukeltam hepatotoksiškumui. Mes patikrinome, ar LEF toksiškumą modifikavo CYP, naudodami nespecifinius CYP inhibitorius pirminiuose hepatocituose. Tada kepenų citochromo P450 reduktazės nulinės ( HRN ) pelės buvo naudojamos siekiant patikrinti CYP indėlį į LEF koncentraciją plazmoje ir jo toksinį poveikį kepenims. Atsižvelgiant į tai, kad nei LEF, nei TER reikšmingai nepakeitė BCRP mRNR ekspresijos nei žiurkės, nei žmogaus hepatocituose; ir TER galėtų žymiai sumažinti natrio / tulžies rūgšties kotransporterio (NTCP) ekspresiją žmogaus hepatocituose. Tiriant atrinktų pernešėjų indėlį į LEF ir TER hepatotoksiškumą buvo naudojami žiurkės hepatocitai ir NTCP perkeltos HEK293 ląstelės. Tada SD žiurkėms buvo geriama TER per 4 savaites, kad būtų galima dar labiau patvirtinti in vitro radinius apie galimą TER toksiškumo mechanizmą.

Rezultatai

LEF ir TER poveikis CYP ekspresijai pirminiuose hepatocituose

Po gydymo LEF ir TER (10 μmol / L) CYP1A1 / 2 ir CYP7A1 mRNR lygį žymiai padidino LEF pirminiuose žiurkių hepatocituose (2A paveikslas). TER tik žymiai padidino CYP1A2 ekspresiją maždaug 6 kartus. Pirminių žmogaus hepatocitų atveju LEF tik reikšmingai sukėlė CYP1A1 / 2 ekspresiją, o TER sukėlė ir CYP1A2, ir CYP7A1 ekspresiją (2B paveikslas). Tačiau mes nustatėme, kad nors ir LEF, ir TER žymiai padidino CYP1A2 mRNR lygį, tik LEF reikšmingai padidino CYP1A1 / 2 funkciją žmogaus hepatocituose (2C pav.).

Image

LEF ir TER poveikis genų ekspresijai ir CYP funkcijai. Žiurkės (A) ir žmogaus (B ir C) hepatocitai buvo gydomi LEF ir TER (10 μmol / L). Genų ekspresija buvo išmatuota ir parodyta kaip raukšlės indukcija (A ir B). CYP1A2 funkcija buvo matuojama naudojant zondą (C) - specifinį substratą fenacetiną (Phe 2 μmol / L). 3-MC (2 μmol / L) buvo naudojami kaip teigiama kontrolė. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD ( n = 3). b P <0, 05, c P <0, 01, palyginti su kontroline.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Kepenų CYP slopinimas sumažino LEF klirensą ir padidino LEF toksiškumą žiurkių hepatocituose

ABT (1 mmol / L) žymiai padidino toksinį LEF poveikį pirminiams žiurkių hepatocitams, stebint IC50 vertės sumažėjimą nuo 409 μmol / L iki 216 μmol / L (3A paveikslas). Priešingai, ABT neparodė jokio poveikio citotoksiškumui TER (3B pav.). Tuo pat metu SKF (30 μmol / L) sumažino vidinį LEF klirensą kepenyse, bet ne TER pirminiuose žiurkių hepatocituose: CL int, sumažintas LEF sumažėjo nuo 136 iki 73, 9 ml · min −1 · kg −1 po gydymo SKF. . Po 4 valandų inkubacijos LEF kaupimasis pirminiuose žiurkių hepatocituose po gydymo SKF padidėjo 3, 68 karto (3C ir 3D paveikslai). Nuosekliai LEF sumažino pirminių žiurkių hepatocitų mitochondrijų membranos potencialą (MMP) aiškiau nei TER (papildomas paveikslas S1).

Image

Nespecifinių CYP inhibitorių ABT (1 mmol / L) ir SKF (30 μmol / L) poveikis LEF ir TER citotoksiškumui ir metabolizmui. Ląstelių gyvybingumas po gydymo ABT buvo nustatytas MTT tyrimu (A ir B). LEF ir TER koncentracijos žiurkės hepatocituose po gydymo SKF buvo nustatytos LC – MS / MS (C ir D) būdu. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD ( n = 3 ir 6). b P <0, 05, c P <0, 01 (gydymas LEF + SKF, palyginti su LEF).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Farmakokinetiniai LEF profiliai WT ir HRN pelėms

Lyginant su WT pelėmis, LEF koncentracija plazmoje padidėjo (4A pav.). HRN pelių LEF plotas po laiko koncentracijos kreivės (AUC 0-t ) buvo 483 ± 470 ng · mL –1 · h, palyginti su 158 ± 110 ng · mL −1 · h WT pelėms, tuo tarpu generacijos metu TER (AUC 0-t ) sumažėjo, palyginti su WT pelėmis (73, 9 ± 39, 8 μg · mL −1 · h HRN pelėse, palyginti su 380 ± 296 μg · mL −1 · h WT pelėse) (4A ir 4B paveikslai). Tačiau reikšmingo skirtumo tarp HRN pelių ir WT pelių nepastebėta dėl didelių individualių skirtumų.

Image

LEF ir TER koncentracija plazmoje WT ir HRN pelėms. WT ir HRN pelėms buvo geriama 15 mg / kg LEF. Tada buvo paimti kraujo mėginiai ir nustatytos LEF (A) ir TER (B) koncentracijos plazmoje. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD ( n = 5).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

LEF toksiškumo įvertinimas WT ir HRN pelėms po nepertraukiamo vartojimo per burną

WT pelėms 50 mg / kg LEF grupėje nepastebėta nė vieno su gaminiu susijusios mirties (du gyvūnai žuvo per avarijas transporto priemonės kontrolinėje grupėje) (5A paveikslas). Kai buvo 25 mg / kg LEF, dvi HRN pelės išpjaustymo dieną turėjo žūties požymius. AST ir ALT lygis HRN pelių serume buvo žymiai padidėjęs, palyginti su kontroline grupe, tuo tarpu WT pelėms šios vertės nepadidėjo (5C pav.). Kai dozė padidėjo iki 50 mg / kg LEF, HRN pelių mirtis buvo pastebėta pradedant 4-ąja diena po išgerto vaisto, o visi gyvūnai mirė po 5 dienų (5B paveikslas).

Image

Lyginant LEF sukeltą hepatotoksiškumą WT ir HRN pelėms. Sušvirkštus daugkartinių LEF dozių (05 ir 50 mg / kg) 7 dienas, WT (A) ir HRN (B) pelių išgyvenamumas buvo registruojamas kiekvieną dieną. (C) AST ir ALT koncentracija serume buvo nustatyta prieš išpjaustymą 7-ą dieną 25 mg / kg LEF gydymo ir kontrolinėse grupėse. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD ( n = 6). b P <0, 05 (gydymas LEF prieš kontrolę HRN pelėms).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

LEF ir TER poveikis NTCP raiškai ir funkcijai

Nei LEF, nei TER reikšmingai nepakeitė pasirinktų pernešėjų, ty P-glikoproteino (P-gp), BCRP, tulžies druskos eksporto pompos (BSEP) ir NTCP, ekspresijos pirminiuose žiurkių hepatocituose (6A pav.). Pirminiuose žmogaus hepatocituose nei LEF, nei TER neturėjo įtakos BSEP ir BCRP ekspresijai, išskyrus reikšmingą NTCP ekspresijos sumažėjimą (6B pav.). Tačiau buvo nustatyta, kad tik TER, bet ne LEF reikšmingai sumažino d8-TCA įsisavinimą pirminiuose žiurkių hepatocituose ir NTCP perkeltose HEK293 ląstelėse (6C ir 6D paveikslai). Be to, LEF ir TER neturėjo įtakos d8-TCA tulžies ekskrecijos indekso (BEI) vertei sumuštiniu būdu auginamų žiurkių hepatocituose (SCRH) (papildomas paveikslas S2).

Image

LEF ir TER poveikis genų ekspresijai ir NTCP funkcijai. Žiurkės (A) ir žmogaus (B) hepatocitai buvo gydomi LEF ir TER. Buvo išmatuota genų ekspresija ir pateikta kaip raukšlės indukcija. Žiurkės hepatocitai (C) ir NTCP perkeltos HEK293 ląstelės (D) buvo apdoroti d8-TCA ir LEF arba TER, po to išmatuotas d8-TCA kaupimasis ląstelėse. Kaip teigiama kontrolė buvo naudojamas troglitazonas (Tro-20 μmol / L). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD ( n = 3). c P <0, 01, palyginti su kontroline.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Nuosekliai buvo nustatyta, kad ilgalaikis gydymas TER žymiai padidino TBILI ir DBILI lygį žiurkių patelių serume (2 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Keli tyrimai parodė, kad LEF yra arilo angliavandenilių receptoriaus (AhR) 21, 22, 23, kuris reguliuoja CYP1A1 / 2 ekspresiją, ligadas. Nuosekliai nustatėme, kad LEF reikšmingai sukėlė CYP1A1 / 2 ekspresiją tiek pirminiuose žiurkių, tiek žmogaus hepatocituose (2 paveikslas). CYP1A1 / 2 TER taip pat gali mažiau sukelti žmogaus hepatocitai. Tačiau atrodo, kad CYP slopinimas vietoj CYP indukcijos vaidina lemiamą vaidmenį LEF toksiškumo procese. Šiame tyrime nustatyta, kad nespecifiniai CYP inhibitoriai SKF ir ABT gali žymiai padidinti LEF kaupimąsi ir citotoksiškumą pirminiuose žiurkių hepatocituose (3 pav.). Shi ir kt. Teigė, kad CYP inhibitoriai gali padidinti tiek LEF, tiek TER toksinį poveikį kepenims pirminiuose žiurkių hepatocituose 5 ; tačiau mūsų duomenys atskleidė, kad CYP tik tiesiogiai prisidėjo prie su LEF susijusios, o ne su TER susijusios detoksikacijos pirminiuose žiurkių hepatocituose. Tiesą sakant, pirminių žiurkių hepatocitų mitochondrijų membranos potencialas buvo jautresnis LEF nei TER (papildomas paveikslas S1).

Daugybė ataskaitų parodė, kad kelių CYP, pvz., CYP1A2 ir CYP2C19, polimorfizmas gali paveikti LEF toksiškumą kepenims pacientams, sergantiems reumatoidiniu artritu. 24, 25, 26 . Tai gali būti netiesioginiai įrodymai, kad CYP vaidina lemiamą reikšmę detoksikuojant LEF. kūne. Mūsų tyrimai su HRN pelėmis yra pirmieji tiesioginiai in vivo įrodymai, kad kepenų CYP yra susiję su LEF klirensu ir toksiškumu. Nustatyta, kad LEN koncentracija plazmoje ir AUC 0-t vertė HRN pelėse buvo daug didesnė nei WT pelėse po vienkartinės LEF dozės (15 mg / kg), be to, šioms pelėms TER ekspozicija plazmoje taip pat buvo mažesnė (4 paveikslas). ). Netikėtai viena iš HRN pelių mirė praėjus 10 valandų po LEF vartojimo, tai gali būti priskirta dideliam LEF farmakokinetinių parametrų kintamumui, kaip buvo pranešta anksčiau 27 . Šis kintamumas taip pat gali paaiškinti šiame tyrime pastebėtus didelius LEF ir TER AUC 0-t vertės pokyčius. Šie rezultatai rodo, kad, išmetus CYP, LEF koncentracija plazmoje gali padidėti, o tai gali sustiprinti toksiškumą kepenims. Tiesą sakant, nuolat vartojant 25 mg / kg LEF, AST ir ALT koncentracija serume reikšmingai padidėjo tik HRN pelėms (5C pav.). Ir HRN pelių išgyvenamumas buvo žymiai mažesnis nei WT pelių, kai 7 dienas LEF dozė padidėjo iki 50 mg / kg.

Kadangi LEF ir TER yra didelio afiniteto BCRP 9 substratai, buvo ištirtas ir jų poveikis kepenų pernešėjų raiškai. Buvo nustatyta, kad jie neturėjo jokio poveikio atrinktų ištekėjimo pernešėjų (BCRP, BSEP) mRNR ekspresijai, išskyrus NTCP sumažėjusį reguliavimą žmogaus hepatocituose po 48 valandų gydymo (6B paveikslas). Pirminiai žiurkių hepatocitai ir NTCP perkeltos HEK293 ląstelės buvo naudojami toliau tiriant LEF ir TER įtaką NTCP funkcijai. Buvo nustatyta, kad TER, bet ne LEF, galėjo žymiai sumažinti d8-TCA kaupimąsi pirminiuose žiurkių hepatocituose, ir tai slopino d8-TCA kaupimąsi NTCP perkeltose HEK293 ląstelėse priklausomai nuo dozės (6C ir 6D paveikslai). Nei LEF, nei TER negalėjo tiesiogiai slopinti BSEP funkcijos (papildomas S2 paveikslas). Be to, tik TER reikšmingai padidino CYP7A1, kuris riboja fermentą tulžies rūgšties biosintezėje, ekspresiją maždaug 6 kartus žmogaus hepatocituose (2B paveikslas). Daugelis vaistų sutrikdo homeostatinius mechanizmus, tiesiogiai slopindami tulžies rūgšties pernešėjus, tokius kaip NTCP ar BSEP, sukeldami tulžies rūgšties sukeliamą hepatotoksiškumą 28, 29, 30 . Mūsų rezultatai rodo, kad TER gali turėti panašų poveikį tulžies rūgšties homeostazei.

Vrenken ir kt. (2008) pranešė, kad TER apsaugo žiurkių hepatocitus nuo tulžies rūgšties sukeltos apoptozės 31 . Mūsų duomenys gali pateikti alternatyvų paaiškinimą šiam pastebėjimui: apsauginis TER vaidmuo gali atsirasti dėl jo NTCP funkcijos slopinimo, dėl kurio sumažėja tulžies rūgšties kaupimasis hepatocituose ir mažiau apoptozės. Tačiau, žvelgiant iš kitos perspektyvos, sumažėjęs NTCP reguliavimas ir tulžies rūgšties cirkuliacija gali sukelti ilgalaikį toksinį poveikį kepenims 32, 33, 34 . Tiesą sakant, TER pusinės eliminacijos laikas yra maždaug 2 savaitės, manoma, kad tai sąlygoja ypač mažas kepenų klirensas ir enterohepatinis perdirbimas 27, 35 . Todėl toksikologinis TER poveikis NTCP ekspresijai ir funkcijai gali išlikti ilgą laiką. Iš tikrųjų TBILI ir DBILI lygis žiurkių patelių serume labai padidėjo po keturių savaičių gydymo TER (12 mg / kg) (2 lentelė). Ši išvada reiškė, kad TER gali turėti įtakos tulžies rūgšties cirkuliacijai, o tai gali sukelti cholestazę ir tulžies latakų sužalojimą 36 . Kadangi tulžies rūgštis yra tiesioginis cholestazės 37 biomarkeris, ateityje bus nustatytas tulžies rūgšties kiekis serume, kad būtų galima dar labiau patikrinti šią hipotezę. Be to, šis reiškinys nebuvo pastebėtas patinams, kurie gali būti siejami su specifiniais lyties skirtumais TER 27 pasiskirstymo audiniuose metu.

Apibendrinant galima pasakyti, kad CYP yra labai svarbūs LEF sukelto toksinio poveikio kepenims detoksikacijos procese. Inaktyvinti kepenų CYP reikšmingai padidina LEF koncentraciją pirminiuose hepatocituose ir HRN pelėse, padidindami LEF sukeltą hepatotoksiškumą. TER, kuris yra pagrindinis LEF metabolitas, sukeliamą toksinį poveikį kepenims vaidina ne tik CYP, bet ir nešiotojai. TER žymiai sumažina NTCP ekspresiją ir funkcijas, nes tai gali sutrikdyti tulžies rūgšties cirkuliaciją ir sukelti galimas su tulžies rūgštimi susijusias kepenų problemas.

Autoriaus indėlis

Lei-lei MA, Yang LUAN, Guo-yu PAN dalyvavo tiriant dizainą; Lei-lei MA, Jing WANG, Zhi-tao WU, Le WANG, Chen CHEN, Xuan NI, Yun-fei LIN, Yi-yi CAO atliko eksperimentus; Duomenų analizė atlikta Lei-lei MA, Zhi-tao WU, Xue-feng ZHANG; Lei-lei MA, Yang LUAN, Guo-yu PAN parašė rankraštį.

Santrumpos

ABT, aminobenzotriazolas; ALT, alanino aminotransferazė; AST, aspartato aminotransferazė; BSEP, tulžies druskos eksporto pompa; BEI, tulžies išsiskyrimo indeksas; BCRP, atsparus krūties vėžiui baltymas; CMC-Na +, karboksimetilceliuliozės natris; CYP, citochromo P450 fermentai; DBILI, tiesioginis bilirubinas; DDI, narkotikų ir vaistų sąveika; HRN , kepenų citochromo P450 reduktazės nulis; LEF, leflunomidas; 3-MC, 3-metilcholantrenas; P-gp, P-glikoproteinas; Phe, fenacetinas; SKF, proadifenas; SCRH, sumuštiniu būdu auginamų žiurkių hepatocitai; CL int, sumažinta, sumažinta vidinė klirensas; NTCP, natrio / tulžies rūgšties kotransporteris; TER, teriflunomidas; TMRE, tetrametilrodamino etilo esteris; TBILI, bendras bilirubino kiekis; Tro, troglitazonas.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

    LEF ir TER citotoksiškumas pirminiuose žiurkių hepatocituose.

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

    LEF ir TER poveikis d8-TCA išsiskyrimui su tulžimi per tulžį.

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomi metodai

    Mitochondrijų membranos potencialo matavimas (MMP)

    Papildomą informaciją galite rasti „Acta Pharmacologica Sinica“ tinklalapyje.