Bioflavonoidų slopinamas mmp-3 aktyvumas ir invazinė mda-mb-231 žmogaus invazinė krūties karcinomos ląstelių linija | acta pharmaologica sinica

Bioflavonoidų slopinamas mmp-3 aktyvumas ir invazinė mda-mb-231 žmogaus invazinė krūties karcinomos ląstelių linija | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Stromelizinas 1 (matrikso metaloproteinazė 3; MMP-3) yra fermentas, žinomas dalyvaujantis navikų invazijoje ir metastazėse. Šiame tyrime buvo tiriami daržovių ir vaisių flavonoidai, tokie kaip kvercetinas, kaempferolis, genisteinas, genistinas ir daidzeinas, kad galėtų modifikuoti MMP-3 sekreciją ir aktyvumą MDA-MB-231 krūties vėžio ląstelių linijoje. Be to, mes ištyrėme in vitro flavonoidų poveikį MDA-MB-231 ląstelių invazijai.

Metodai:

Toksiškas flavonoidų koncentracijos diapazonas buvo įvertintas naudojant MTT tyrimą. MDA-MB-231 ląstelių gebėjimas įsiveržti buvo įvertintas naudojant modifikuotą Boydeno kameros sistemą. MMP-3 aktyvumas buvo nustatytas kazeino zimografija. MMP-3 sekrecija buvo įvertinta naudojant Western blotting, kazeino zimografiją ir patvirtinta ELISA metodu.

Rezultatai:

Kai kurie numanomi flavonoidai, ty kvercetinas ir kaempferolis (flavonoliai), reikšmingai slopino in vitro MDA-MB-231 ląstelių invaziją priklausomai nuo koncentracijos, atitinkamai, IC50 reikšmės buvo 27 ir 30 μmol / L. Kvercetinas ir kaempferolis taip pat sumažino MMP-3 aktyvumą priklausomai nuo dozės - atitinkamai IC50 vertės buvo 30 μmol / L ir 45 μmol / L. Nė vienas iš flavonoidų neturėjo reikšmingos įtakos MMP-3 sekrecijai.

Išvada:

Šie duomenys rodo, kad flavonolių kvercetinas ir kaempferolis turi didesnę antiinvazinę galią ir didesnį MMP-3 slopinantį aktyvumą nei izoflavonų genisteinas, genistinas ir daidzeinas. Priešingai, nei flavonoliai, nei izoflavonai neturi jokios įtakos MMP-3 sekrecijai.

Įvadas

Metastazavusi invazija yra pagrindinė pacientų mirštamumo priežastis progresuojant krūties vėžiui. Kad transformuota ląstelė galėtų metastazuoti iki tolimos kūno vietos, ji pirmiausia turi prarasti sukibimą, prasiskverbti ir įsiskverbti į aplinkinę tarpląstelinę matricą (ECM), patekti į kraujagyslių sistemą ir prilipti prie tolimų organų 1 . Vėžio ląstelių invazijos slopinimas buvo svarbi gydymo vėžio strategija 2 . Svarbus invazinių procesų žingsnis yra proteolitinis ECM ir bazinių membranų skaidymas 3 . Keletas tyrimų parodė, kad tarp fermentų, atsakingų už ECM skaidymą, matricos metaloproteinazės (MMP), atrodo, vaidina lemiamą vaidmenį 4, 5, 6 . MMP yra nuo cinko priklausomos endopeptidazės, kurios kartu gali skaidyti visas ECM sudedamąsias dalis. Remiantis jų struktūra ir substrato specifiškumu, jie gali būti suskirstyti į kolagenazių, stromelizinų, želatinazių, membraninio tipo MMP ir kitų MMP pogrupius 7 .

Krūties vėžys yra pagrindinė moterų, susijusių su piktybine liga, mirties priežastis visame pasaulyje. Tailande krūties vėžys yra antras pagal dažnumą vėžys tarp moterų ir jo paplitimas didėja 8 . Vėžio invazija ir metastazės yra pagrindinės pacientų, sergančių krūties vėžiu, sergamumo ir mirštamumo priežastys. Keli tyrimai parodė, kad MMP-1, -2, -3, -7, -9, -13 ir -14 padidėjimas yra susijęs su krūties vėžio ląstelių invazija 9, 10, 11 .

MMP-3, taip pat vadinamas stromelizinu 1, yra matricinų šeimos narys, kuris vaidina pagrindinį vaidmenį skaidydamasis ir rekonstruodamas ECM. MMP-3 skaido kelis ECM komponentus, tokius kaip fibronektinas, lamininas, IV, 12, 13, 14 tipo kolagenas ir proteoglikanai, ir, manoma, vaidina svarbų vaidmenį reumatoidinio artrito, 15, 16 osteoartrito, naviko ląstelių invazijos ir metastazių 17 atvejais. . Ankstesni tyrimai parodė, kad labiausiai invaziniai krūties vėžiai pasižymi aukščiausiu MMP-3 kiekiu, tuo tarpu ląstelėse, kurių vidutinis invaziškumo lygis, yra mažesnis MMP-3 ekspresijos lygis; neinvazinės žmogaus krūties vėžio ląstelės turi nenustatomą MMP-3 lygį. Neseniai eksperimentiniai įrodymai parodė, kad dėl specifinio MMP-3 sumažėjusio anti-senso genų reguliavimo sumažėja krūties vėžio invazija 18 . Be to, MMP-3 aktyvumo slopinimas sintetiniais inhibitoriais sumažina įvairių žmogaus piktybinių ląstelių linijų invaziją ir migraciją 19, 20 . Todėl kiekvienas MMP-3 ekspresijos ir aktyvumo reguliavimo lygis buvo laikomas galimu terapinės intervencijos taikiniu 21 .

Flavonoidai, 2-fenilbenzo-α-pironai, yra polifenoliniai junginiai, kurie visur aptinkami vaisiuose, daržovėse ir augaliniuose gėrimuose 22 . Šie junginiai turi bendrą fenilbenzopirono struktūrą (C6-C3-C6) su vienu ar daugiau hidroksilo pakaitalų (1 paveikslas). Jie skirstomi į kategorijas (pagal prisotinimo lygį ir centrinio pirano žiedo atidarymą) pirmiausia į flavonolius, flavonus, flavanolius, izoflavonus, flavononus ir flavanonolius. Šie polifenoliniai junginiai turi keletą biologinių savybių, įskaitant antimutageninį, antiproliferacinį ir antioksidantinį poveikį, taip pat dalyvauja ląstelių signalizavime, ląstelių ciklo reguliavime ir angiogenezėje 23 . Be to, vis daugiau in vitro ir in vivo tyrimų buvo atlikti dėl galimo flavonoidų antimetazinio aktyvumo įvairiose naviko ląstelėse, įskaitant žmogaus krūties vėžį. Pavyzdžiui, įrodyta, kad kvercetinas ir genisteinas sumažina žmogaus krūties vėžio ląstelių invaziją, nes sumažėja MMP-1, -2 ir -9 ekspresija 24, 25, 26 . In vivo tyrime, skiriant intraperitoniniu būdu kvercetiną singeniškoms pelėms, buvo reikšmingai slopinama plaučių kolonizacija priklausomai nuo dozės27. Be to, kaempferolis, genistinas ir daidzeinas slopino MDA-MB-231 ląstelių invaziją, kartu sumažindami ECM skilimo fermentų ekspresiją 28 .

Image

Branduolinė flavonoidų struktūra (A). Įvairių šiame tyrime išbandytų flavonoidų struktūra (B).

Visas dydis

Tačiau koreliacija tarp MMP-3 ir flavonoidų in vitro nėra aiški. Šiame tyrime buvo suprojektuoti eksperimentai, skirti palyginti flavonoidų (kvercetino ir kaempferolio) ir izoflavonų (genisteino, genistino ir daidzeino) pavidalo flavonoidų poveikį MMP-3 sekrecijai, MMP-3 aktyvumui ir MDA-MB- 231 žmogaus invazinės krūties vėžio ląstelės. Mūsų rezultatai rodo, kad flavonolių kvercetinas ir kaempferolis pasižymi didesne antiinvazinio potencija ir geresniu MMP-3 slopinančiu aktyvumu nei izoflavonai.

medžiagos ir metodai

Medžiagos

„Dulbecco“ modifikuotas erelio terpė (DMEM) su fenolio raudonuoju, penicilino-streptomicino ir tripsino-EDTA arba be jo buvo nupirkta iš GIBCO-BRL (Didžiojoje saloje, NY, JAV). Vaisiaus vaisiaus serumas buvo įsigytas iš „Hyclone“ (Logan, Juta, JAV). Antikūnas prieš MMP-3 buvo įsigytas iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Santa Krusas, Kalifornija, JAV). „Matrigel“ buvo įsigytas iš Becton Dickinson (Bedfordas, MA, JAV). 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), β-kazeinas, kvercetinas, kaempferolis, genisteinas, genistinas ir daidzeinas buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV) ).

Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos

MDA-MB-231, labai invazinė krūties karcinomos ląstelė, buvo auginta Leibovitz L-15 terpėje su 100 V / ml penicilino, 100 μg / ml streptomicino ir 10% šilumos inaktyvuotos FBS. Ląstelės buvo auginamos kaip monosluoksnis 37 ° C temperatūroje, drėgnoje atmosferoje be CO 2 . Neinvazinės krūties karcinomos ląstelės MCF-7 ir NIH3T3 fibroblastų ląstelės buvo auginamos DMEM, papildyta 100 V / ml penicilino, 100 μg / ml streptomicino ir 10% šilumos inaktyvuotos FBS. Kultūros buvo auginamos kaip monosluoksnis, esant 37 ° C, 5% CO 2 /95% oro atmosferoje.

MTT tyrimas ląstelių gyvybingumui nustatyti

Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas įprastiniu MTT redukcijos tyrimu, kaip aprašyta anksčiau 29 . Trumpai tariant, MDA-MB-231 ląstelės buvo inokuliuotos 5x103 ląstelių / duobučio tankiu 96 šulinėlių plokštelėse 24 valandas 100 μL DMEM su 10% FCS. Po pasėjimo kultūros supernatantas buvo pašalintas ir pridėta serumo neturinti DMEM terpė, kurioje yra įvairių koncentracijų kvercetino, kaempferolio, genisteino, genistino ir daidzeino, ir ląstelės buvo inkubuojamos 24 ir 48 valandas. Į kiekvieną duobutę buvo įpilta MTT dažų (10 μL, 5 mg / ml) ir plokštelė inkubuota dar 4 valandas. MTT-formazano absorbcija buvo matuojama naudojant mikroteklių skaitytuvą, esant 540 nm bangos ilgiui, kai etaloninis bangos ilgis buvo 630 nm.

Ląstelių invazijos tyrimas

Invazinis MDA-MB-231 ląstelių elgesys buvo patikrintas naudojant modifikuotą Boydeno kameros testą 30 . Polivinilpirolidono neturintys polikarbonato filtrai (Millipore, Co Cork, Airija) (8 μm porų dydžio) buvo padengti Matrigel (10 μg / filtras). Apatinėje kameroje buvo NIH 3T3 fibroblastų ląstelių, kuriose nėra serumo, kondicionuota terpė, kuri veikia kaip chemoattraktantas. MDA-MB-231 ląstelės (1, 25x105 ląstelių / kameroje) buvo dedamos į viršutinę kamerą su įvairiomis flavonoidų koncentracijomis arba be jų ir inkubuojamos 6 valandas 37 ° C, 5% CO 2 . Po inkubacijos neinvazinės ląstelės buvo pašalintos iš viršutinio membranos paviršiaus. Apatiniame membranos paviršiuje įsiskverbusios ląstelės buvo fiksuotos metanoliu 1 minutę ir 5 minutes dažytos mėlyna toluidino spalva. Ląstelės, kurios aktyviai migravo į apatinį filtro paviršių, buvo ištirpintos 20% acto rūgštimi ir netiesiogiai išmatuotos matuojant absorbciją esant 570 nm. Kontrolinis eksperimentas buvo atliktas be chemoattraktanto. Pakartotinių nepriklausomų eksperimentų rezultatai buvo suskaičiuoti vidurkiu atėmus foninius duomenis.

Kondicionuotos terpės paruošimas

MDA-MB-231 ląstelės (1 × 106 ląstelių) buvo pasėtos į 75 mm 3 T kolbą ir 24 valandas palaikytos DMEM su 10% FBS. Povandeninės ląstelių kultūros buvo inkubuotos 48 valandas su įvairiomis netoksiškomis flavonoidų koncentracijomis DMEM serume, kuriame nėra fenolio raudonojo. Po apdorojimo kultūros supernatantas buvo surinktas ir sukoncentruotas su Amicon-Ultra4 (Millipore, Co Cork, Airija) tolimesniems tyrimams.

Kazeino zimografija

Norint nustatyti MMP-3 aktyvumą kondicionuotoje terpėje, MDA-MB-231 ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 /95% oro atmosferoje be serumo DMEM be fenolio raudonojo. Kultūros supernatantas buvo surinktas ir sukoncentruotas su Amicon-Ultra4 (Millipore, Co Cork, Airija). Dešimčiai mikrogramų nešildyto baltymo iš koncentruotos kultūros supernatantų buvo atlikta elektroforezė nemažinančiomis sąlygomis, naudojant 0, 2% m / v kazeino turinčius 10% poliakrilamido gelius (PAGE), esant SDS. Geliai buvo plaunami du kartus 60 minučių 2, 5% Triton X 100, kad būtų pašalinta SDS, ir vėliau inkubuojami Tris buferyje (50 mmol / l Tris-HCl, 200 mmol / L NaCl, 10 mmol / L CaCl2, pH 7, 4), esant įvairių koncentracijų flavonoidų (0, 5, 25 ir 50 μmol / L) ir fenantrolino 50 μmol / L (teigiama kontrolė) 48 valandas 37 ° C temperatūroje. Geliai buvo nudažyti Coomassie Brilliant Blue R (0, 1% m / t ) ir nusodinti 30% metanolyje, 10% acto rūgštyje. Kazeinolitinis aktyvumas pasirodė kaip skaidri juosta mėlyname fone. Virškinimo juostos buvo kiekybiškai įvertintos naudojant „Bio 1 D“ programinę įrangą („Viber Lourmat“, Marne-la-Vallée, Prancūzija).

Norint įvertinti MMP-3 sekreciją kazeino zimografijos būdu, MDA-MB-231 ląstelės buvo inkubuotos DMEM serume be fenolio raudonojo, turinčio įvairių koncentracijų flavonoidų (0, 10, 20 arba 30 μmol / L). Dešimčiai mikrogramų nešildomų baltymų iš koncentruotos kultūros supernatantų buvo atlikta elektroforezė nemažinančiomis sąlygomis 0, 2% m / t kazeino turinčiuose / 10% poliakrilamido geliuose, esant SDS. Geliai buvo plaunami, dažomi ir pašalinami, kaip aprašyta aukščiau.

MMP-3 Western blot analizė

Norint ištirti flavonoidų poveikį MMP-3 sekrecijai, buvo atlikta Western blot analizė. Vienodas kiekis koncentruotos kontroliuojamos terpės baltymų iš kontrolinių ir apdorotų ląstelių buvo pakartotinai suspenduotas mėginio buferyje ir atskirtas SDS-PAGE, naudojant 10% akrilamido gelius. Po elektroforezės baltymai buvo išpūsti elektrolitiniu būdu į Hybond – C Extra nitroceliuliozės membraną (Amersham). Membrana 2 valandas buvo užblokuota kambario temperatūroje (RT) su 4% BSA TBST (20 mmol / L Tris, pH 7, 5, 150 mmol / L NaCl, 0, 3% Tween 20). Membranos buvo papildomai tiriamos pelės monokloniniu antikūnu prieš MMP-3 4% BSA TBST (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, JAV) per naktį 4 ° C. Blotai buvo plaunami TBST ir tiriami krienų peroksidaze konjuguota antivirusine IgG (1: 5000; Chemicon, Prancūzija). Po inkubacijos imunoreaktyvioji medžiaga buvo vizualizuota sustiprinta chemiliuminescencija ir 30–60 minučių veikiama rentgeno filmu (Kodak, Windsor, Koloradas, JAV).

MMP-3 ELISA

Norėdami dar labiau patvirtinti flavonoidų poveikį MMP-3 sekrecijai, žmogaus MMP-3 dvigubo sumuštinio ELISA buvo atlikta naudojant komercinius ELISA rinkinius pagal gamintojo protokolą (Calbiochem). Trumpai tariant, 50 μL standartinių rekombinantinių žmogaus MMP-3 skiedinių arba eksperimentinių kondicionuotų terpių ir biotinilinto detektoriaus monokloninio antikūno buvo padalijama į 96 šulinėlių mikrotitravimo plokštelę, padengtą pelės anti-MMP-3 monokloniniu antikūnu. Plokštelė uždaroma, inkubuojama 2 valandas kambario temperatūroje ir tris kartus plaunama 1x plovimo buferiu; Pridedama 100 µL praskiestos krienų peroksidazės, konjuguotos su streptavidinu, inkubuojama 30 min. Kambario temperatūroje ir po to tris kartus plaunama. Tada 100 μl spalvoto reagento 3, 3 ′, 5, 5′-tetrametilbenzidino (TMB) alikvotinės dalys buvo dedamos 30 min., Kad būtų mėlyna spalva, ir reakcija buvo sustabdyta pridedant 100 μL 2, 5 mol / l sieros rūgšties. . Spektrofotometrinis plokštelių skaitytuvas, kurio etaloninis bangos ilgis yra 595 nm, absorbcija buvo nuskaityta esant 450 nm.

Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta naudojant vienpusę ANOVA. P <0, 05 arba P <0, 01 buvo laikomi statistiškai reikšmingais. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant SPSS 13.0 programinę įrangą (SPSS, Čikaga, IL, JAV).

Rezultatai

Citotoksiškumo tyrimas in vitro

Flavonoidų poveikis ląstelių gyvybingumui buvo matuojamas MTT tyrimu. MDA-MB-231 ląstelės, apdorotos nurodytu kvercetino, kaempferolio ir daidzeino kiekiu (0–100 μmol / l) 48 valandas, parodė, kad nuo koncentracijos priklauso ląstelių proliferacijos slopinimas. Genisteinas ir genistinas neparodė ryškaus poveikio ląstelių gyvybingumui. Po 24 valandų inkubacijos MDA-MB-231 ląstelės gyvybiškai padidėjo aštuoniasdešimt procentų, kai buvo apdorotos bioflavonoidais, kurių koncentracija buvo mažesnė nei 60 μmol / L. IC50 vertės 48 valandų inkubacijos metu, apskaičiuotos pagal dozės efekto kreivę, buvo atitinkamai 44, 3 ± 21, 7, 60, 0 ± 16, 3, > 100, > 100 ir 65 ± 15 μmol / L kvercetino, kaempferolio, genisteino, genistino ir daidzeino atžvilgiu (pav. 2).

Image

Flavonoidų poveikis ląstelių gyvybingumui MDA-MB-231 ląstelėse. Ląstelės 24 ir 48 valandas buvo veikiamos nurodytu kiekvieno flavonoido kiekiu (0, 6, 25, 12, 5, 25, 50 ir 100 μmol / L). Gyvų ląstelių skaičius buvo nustatytas MTT tyrimu. Gyvybingos ląstelės buvo išreikštos kiekvienos linijos neapdorotų kontrolinių kultūrų procentine dalimi. Rezultatai rodo trijų skirtingų bandymų, atliktų trimis egzemplioriais, vidurkį ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant vienpusę ANOVA. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su 0 μmol / L.

Visas dydis

Flavonoidų poveikis invazijos veiklai

Ląstelių invazijos testai buvo atlikti su necitotoksinėmis bioflavonoidų koncentracijomis (10, 20 ir 30 μmol / l). Invazinis MDA-MB-231 elgesys buvo patikrintas naudojant modifikuotą Boydeno kameros tyrimą. MDA-MB-231 ląstelės turi galimybę įsiveržti per Matrigel. MDA-MB-231 ląstelės 6 valandas buvo gydomos kvercetinu, kaempferoliu, genisteinu, genistinu ir daidzeinu (0, 10, 20 ir 30 μmol / L). Kvercetinas ir kaempferolis reikšmingai slopino MDA-MB-231 ląstelių gebėjimą įsiskverbti į atstatytą bazinę membraną, o slopinamosios koncentracijos 50% kontrolinės (IC50) vertės buvo atitinkamai 27 ir 30 μmol / L. Priešingai, genisteinas, genistinas ir daidzeinas turėjo minimalų poveikį ląstelių invazijai net esant didelėms koncentracijoms (3 pav.).

Image

Flavonoidų poveikis MDA-MB-231 ląstelių invazijai. MDA-MB-231 ląstelės buvo pasėtos į „Matrigel“ dengtą filtrą, kuriame buvo kvercetinas, kaempferolis, genisteinas, genistinas ir daidzeinas, kaip nurodytos įvairios koncentracijos (0, 10, 20 ir 30 μmol / L), inkubuotos 6 valandas 37 ° C temperatūroje. . Ląstelės, kurios aktyviai migravo į apatinį filtrų paviršių, buvo kiekybiškai įvertintos, kaip aprašyta medžiagoje ir metoduose. Invazija buvo išreikšta procentine kontrole. Duomenys rodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant vienpusę ANOVA. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su 0 μmol / L.

Visas dydis

Flavonoidų poveikis MMP-3 aktyvumui MDA-MB-231 ląstelių linijose

Matricos metaloproteinazės yra pagrindiniai fermentai, dalyvaujantys vėžio ląstelių invazijos procese. Koncentruota terpė be serumo atskleidė suardytas juostas esant 57 ir 45 kDa, atitinkamai atitinkamai proMMP-3 ir aktyviajai MMP-3 (4 paveikslas). MMP-3 aktyvumą sumažino kvercetinas ir kaempferolis, kurių IC50 vertės buvo atitinkamai 30 ir 45 μmol / L. Priešingai, gydymas genisteinu, genistinu ir daidzeinu neturėjo įtakos MMP-3 aktyvumui.

Image

Flavonoidų poveikis MMP-3 kazeinolitiniam aktyvumui, nustatytas kazeino zimografijos tyrimu. MDA-MB-231 sąlyginės terpės buvo surenkamos, sukoncentruotos ir paveiktos elektroforeze. Geliai buvo plaunami, inkubuojami su įvairiomis flavonoidų koncentracijomis (0, 5, 25, 50 μmol / L) ir fenantrolinu 50 μmol / L (teigiama kontrolė) 48 valandas 37 ° C temperatūroje, nudažomi ir nusodinami, kaip aprašyta metoduose. Kazeinolitinis aktyvumas pasirodė kaip skaidri juosta mėlyname fone. 1: neigiama kontrolė; 2: 5 μmol / L; 3: 25 μmol / L; 4: 50 μmol / L; 5: fenantrolinas 50 μmol / L (teigiama kontrolė). Santykinis kazeinolitinis MMP-3 aktyvumas buvo išmatuotas naudojant „Bio 1D“ programinę įrangą („Viber Lourmat“, Marne-la-Vallée, Prancūzija), kur neapdorota grupė sudarė 100 proc. Duomenys rodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant vienpusę ANOVA. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su 0 μmol / L.

Visas dydis

Flavonoidų poveikis MMP-3 sekrecijai MDA-MB-231 ląstelių linijose

Siekiant išaiškinti flavonoidų poveikį MMP-3 sekrecijai, buvo atlikta Western blot analizė ir kazeino zimografija. MDA-MB-231 ląstelės (1 × 10 6 ląstelės) 48 valandas buvo inkubuotos su kvercetinu, kaempferoliu, genisteinu, genistinu ir daidzeinu 10, 20, 30 μmol / L greičiu. Gydymas flavonoidais neturėjo įtakos MMP-3 sekrecijai (5 pav.). Šiems rezultatams patvirtinti eksperimentas buvo pakartotas naudojant ELISA (duomenys nepateikti). Taikant tris metodus, visi tirti flavonoidai neturėjo įtakos MMP-3 sekrecijai.

Image

Flavonoidų poveikis MMP-3 sekrecijai MDA-MB-231 ląstelėse, nustatytas Western blot analize. (A) MDA-MB-231 ląstelės 48 valandas buvo apdorotos 0, 10, 20 ir 30 μmol / l kvercetino, kaempferolio, genisteino, genistino ir daidzeino, 48 valandas kondicionuota terpė buvo surinkta ir sukoncentruota MMP-3 nustatyti. Buvo pakrautas vienodas kiekis baltymų (80 μg / juosta). 1: neigiama kontrolė; 2: 10 μmol / L; 3: 20 μmol / L; 4: 30 μmol / L ir kazeino zimografija. (B) MDA-MB-231 sąlyginės terpės buvo surenkamos ir sukoncentruotos ir paveiktos elektroforeze. Geliai buvo plaunami, inkubuojami su įvairiomis flavonoidų koncentracijomis (0, 10, 20 ir 30 μmol / l) 48 valandas 37 ° C temperatūroje, nudažomi ir pašalinami, kaip aprašyta metoduose. Kazeinolitinis aktyvumas pasirodė kaip skaidri juosta mėlyname fone. 1: neigiama kontrolė; 2: 10 μmol / L; 3: 20 μmol / L; 4: 30 μmol / L. Gydymas kurkuminoidais 0–15 μmol / L buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. MMP-3 sekrecijos juostos intensyvumas abiem tyrimais buvo išmatuotas atliekant Bio 1 D (Viber Lourmat, Marne-la-Vallée, Prancūzija, kur neapdorotos grupės dalis buvo 100%. Duomenys rodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± SD). Statistinė analizė atlikta naudojant vienpusę ANOVA.

Visas dydis

Diskusija

Invaziškumas ar migracija per tarpląstelinę matricą (ECM) yra pagrindinė piktybinių vėžio ląstelių savybė. Įrodyta, kad padidėjusi skirtingų MMP išraiška yra susijusi su skirtingomis metastazavimo stadijomis, progresuojančiomis įvairių tipų navikus 31 . Mes nustatėme, kad MMP-3 lygis MDA-MB-231 (labai invazinėse krūties vėžio ląstelėse) buvo keturis kartus didesnis nei MCF-7 (silpnai invazinės krūties vėžio ląstelės), kas rodo, kad MMP-3 raiškos lygis koreliuoja su metastazavusiu vėžio ląstelių potencialu. Manoma, kad padidėjęs MMP lygis gali prisidėti prie naviko progresavimo. Visai neseniai paaiškėjo, kad kai kuriems MMP, pavyzdžiui, MMP-3 32, sudėtingas dvigubas vaidmuo naviko progresavime. Paskelbti prieštaringi rezultatai dėl MMP-3 vaidmens navikogenezėje ir metastazėse. Neseniai atliktas tyrimas parodė limfomos ląstelių, kurios konstituciškai ekspresuoja MMP-3, augimo pagreitį, kai ląstelės buvo švirkščiamos į intimitą pelėms 33 . Kita vertus, kiti tyrimai parodė, kad genetinis MMP-3 abliacija nedaro reikšmingos įtakos naviko augimui ir metastazėms MMTV-PyMT modelyje 34 . Kitų MMP ir specifinių jų inhibitorių transkripciniai pokyčiai MMTV-PyMT modelyje gali apsunkinti metastazavimą. Apskritai šie rezultatai leidžia manyti, kad vienos metaloproteinazės, stromelizino 1, ekspresijos nepakanka pieno adenokarcinomų progresavimui į invazinį ir metastazinį fenotipą. Tačiau matricos skaidymas MMP gali pakeisti pagrindinius ląstelių proliferacijos ir apoptozės procesus.

Cheminis prevencinis flavonoidų, flavonolių (kvercetino ir kaempferolio) ir izoflavonų (genisteino, genistino ir daidzeino) poveikis pastebėtas slopinant ląstelių proliferaciją 35, slopinant angiogenezę 36, slopinant invaziją 37 ir stimuliuojant apoptozę krūties karcinomos ląstelėse. 38 . Vėžio ląstelių invazijos slopinimas turi didelę reikšmę gydant vėžį. Apie MMP-3 ir flavonoidų sąveiką žmogaus krūties karcinomos ląstelėse mažai žinoma. Todėl, naudodami MDA-MB-231 ląsteles, mes ištyrėme flavonoidų poveikį MMP-3 sekrecijai, MMP-3 aktyvumui ir invaziniam aktyvumui.

Šiame tyrime buvo tiriamas flavonoidų poveikis invaziniam MDA-MB-231 elgesiui, naudojant modifikuotą Boydeno kameros tyrimą. Kaip parodyta 3 paveiksle, kvercetinas ir kaempferolis reikšmingai slopino MDA-MB-231 ląstelių gebėjimą įsiskverbti į atstatytą bazinę membraną. Priešingai, genisteinas, genistinas ir daidzeinas didelės koncentracijos ląstelių invazijai reikšmingos įtakos nedaro. Tai rodo, kad flavonoliai (kvercetinas ir kaempferolis) turi didesnę antiinvazinę galią nei izoflavonai (genisteinas, genistinas ir daidzeinas). Kadangi pranešta, kad MMP-3 vaidina svarbų vaidmenį migraciniuose ir invaziniuose vėžio procesuose, būtina nustatyti, ar flavonoidai gali slopinti naviko ląstelių invaziją. Mūsų rezultatai padeda išsiaiškinti, ar flavonoidai gali slopinti MMP-3 fermento aktyvumą MDA-MB-231 ląstelėse. Flavonoliai (kvercetinas ir kaempferolis) slopino MMP-3 aktyvumą. Priešingai, gydymas genisteinu, genistinu ir daidzeinu neturėjo įtakos MMP-3 aktyvumui (4 paveikslas). Be to, mes nustatėme, kad genisteinas gali slopinti MDA-MB-231 ląstelių invaziją, tačiau mažesniu mastu nei kvercetinas ar kaempferolis (3 paveikslas). Tačiau atrodė, kad tai neturi jokios įtakos MMP-3 aktyvumui (4 paveikslas). Galimi genisteino tarpininkaujantys MDA-MB-231 invazijos slopinimo mechanizmai yra MMP-2, MMP-9 ir MT1-MMP transkripcijos sumažėjęs reguliavimas ir metaloproteinazės-1 (TIMP-1) audinių inhibitoriaus padidėjęs reguliavimas. ) 39, 40 . Be to, Magee ir bendradarbiai 41 įrodė, kad kiti fitoestrogenai, įskaitant genisteiną, slopina MDA-MB-231 ląstelių invaziją, nepaveikdami ląstelių gyvybingumo. Remiantis mūsų išvadomis, bioflavonoidai, naudojami koncentracijose ląstelių invazijos tyrime (iki 30 μmol / L), neturėjo jokios įtakos ląstelių gyvybingumui.

MMP proteolitinis aktyvumas yra reguliuojamas trimis lygiais: transkripcija, proenzimo aktyvinimas ir slopinimas. Mes nustatėme, kad flavonoidai (tiek flavonoliai, tiek izoflavonai) neturėjo jokios įtakos MMP-3 sekrecijai (5 pav.). Remiantis šiais rezultatais, kvercetinas ir kaempferolis labai slopino kazeinolitinį MMP-3 aktyvumą ir slopino krūties vėžio ląstelių invaziją, kas rodo ryšį tarp metastazavimo potencialo ir MMP-3 aktyvumo. Iš tikrųjų buvo nustatyta, kad batimastatas (BB-94) ir marimastatas (BB-2516) - du specifiniai MMP inhibitoriai klinikinių tyrimų metu - mažina naviko metastazes 42 . Nustatyta, kad inostamycinas, citidino 5′-difosfato 1, 2-diacil-sn-glicerolio (CDP-DG, inozitolio transferazės) inhibitorius, slopina HSC-4 liežuvio karcinomos ląstelių invaziją, mažindamas pro-gelatinolitinį aktyvumą. MMP-9 ir pro-MMP-2 43 . Atsižvelgiant į tai, kad maiste esantys flavonoliai, tokie kaip kvercetinas ir kaempferolis, yra labai saugūs ir pasižymi priešvėžiniu veikimu prieš įvairius navikus, siūlome, kad jie taip pat gali būti naudojami slopinti metastazavusio proceso vystymąsi krūties karcinomos ląstelėse mažinant MMP-3 aktyvumą.

Autoriaus indėlis

Pornngarm LIMTRAKUL sukūrė tyrimą ir suteikė finansinę paramą; Kanokkarn PHROMNOI ir Supachai YODKEEREE atliko eksperimentus; Pornngarm LIMTRAKUL, Kanokkarn PHROMNOI ir Songyot ANUCHAPREEDA išanalizavo duomenis; Straipsnį parašė Pornngarmas LIMTRAKULAS ir Kanokkarnas PHROMNOI.