Rasinės kontrolės nuo npm-alk-priklausomos limfomos vystymosi ir plitimo slopinimas | kraujo vėžio žurnalas

Rasinės kontrolės nuo npm-alk-priklausomos limfomos vystymosi ir plitimo slopinimas | kraujo vėžio žurnalas

Anonim

Dalykai

  • Klinikinė farmakologija
  • Limfoma

Anotacija

Nukleofosmino-anaplastinė limfomos kinazė (NPM – ALK) yra tirozinkinazės onkogenas, atsakingas už daugumos žmogaus ALK teigiamų limfomų patogenezę. Neseniai pranešėme, kad ji suaktyvino „Rac1 GTPazę“ esant anaplastinei stambiųjų ląstelių limfomai (ALCL), sukeldama aktyvios invadopodijos, reikalingos invazijai, formavimąsi nuo priklausomybės nuo rasės. Čia mes gilinomės į šio kelio tyrimą ir panaudojome Rac inhibitorių NSC23766, kad patvirtintume jo, kaip molekulinio taikinio, potencialą ALCL in vitro ir in vivo ksenografijos modelyje ir sąlyginiame NPM – ALK transgeninių pelių modelyje. . Mūsų duomenys rodo, kad Rac reguliuoja svarbius NPM – ALK sukeltų transformacijų efektorius, tokius kaip Erk1 / 2, p38 ir Akt. Be to, slopindamas Rac signalizaciją, pelės panaikina NPM-ALK sukeltą ligos progresavimą ir metastazes, išryškindamos mažų GTPazių ir jų reguliatorių galimybes kaip papildomus terapinius taikinius limfomose.

Įvadas

2p23 chromosomoje esančio anaplastinės limfomos kinazę ( ALK ) koduojančio geno translokacija sukelia chimeros baltymų (iki šiol būdingų apie 17) ekspresiją, susijusią su įvairiais ne Hodžkino limfomos atvejais, turintiems aukštą piktybinį naviką. Dažniausias perstatymas (2; 5) (p23; q35) abipusio persikėlimo metu sulieja N nukleofosmino 1 (NPM) N-galinę dalį prie ALK C-galinės dalies, kurioje yra katalitinis domenas, kad susidarytų NPM – ALK. sulietas baltymas, kuris sudaro tirozinkinazės aktyvumą ir virsta. 1, 2 Daugelis ALK translokacijų sukelia anaplastinio stambiųjų ląstelių limfomos potipio (ALCL) hematologinius piktybinius susirgimus, tačiau aprašyti difuzinės stambiųjų B ląstelių limfomos ir mieloproliferacinės leukemijos atvejai. 3, 4 ALK taip pat yra išreikštas pirminio kietojo vėžio pogrupyje arba dėl translokacijos, arba kaip viso ilgio nepažeisto ar mutavusio baltymo. Jis rastas esant uždegiminiams miofibroblastiniams navikams, nesmulkiems plaučių vėžiams, melanomai, krūties karcinomai ir nerviniams navikams (neuroblastoma, neuroektoderminiai navikai ar glioblastomos). 5 Kelios grupės ėmėsi molekulinių veiksnių, susijusių su ALK priklausoma navikogeneze, tyrimo. Buvo identifikuota ir apibūdinta daugybė moduliatorių, pasroviui taikomų efektorių ir susijusių onkogenų. NPM – ALK veikia kaip pastoliai, įdarbinantys daugiau kaip 40 baltymų „signalosomą“, dalyvaujančius proliferacinės ir antiapoptotinės reakcijos aktyvavime, kurie buvo išsamiai ištirti. 5, 6, 7 Dauguma ALK (+) ALCL diagnozuojama pažengusiuose III ir IV etapuose, pasireiškiant sisteminei ligai, turinčiai didelę polinkį į ekstranodalinį plitimą, ypač odoje ir minkštuosiuose audiniuose, pavyzdžiui, kepenyse, plaučiuose ar blužnyje, nustatant ALK (+) piktybinius susirgimus kaip labai invazinius navikus. 2, 8, 9, 10, 11 Supratimas apie ALK ir jo signalizacijos partnerių sinergiją turėtų palengvinti novatoriškų terapinių strategijų kūrimą.

Neseniai citoskeleto dinamikos reguliatoriai, tokie kaip Rho GTPazės Rac1 ir jo aktyvatorius, guanino-nukleotidų mainų faktorius (GEF) Vav3, p130Cas ir pp60 c-src, buvo įtraukti į NPM-ALK priklausomą invaziją. 8, 9, 12 Ambrogio ir kt. 13 parodė, kad Vav1 / Cdc42 signalizacijos kaskada reguliuoja NPM – ALK (+) ląstelių išgyvenimą ir migraciją. Rho GTPazės tarpininkauja daugeliui ląstelių biologijos aspektų, įskaitant proliferaciją, apoptozės / išgyvenimo pusiausvyros reguliavimą, poliškumą, sukibimą, membranų judėjimą ir judrumą. Didelis kai kurių iš jų (RhoA, RhoC, Rac1, Rac3 ir Cdc42) ar jų reguliatorių per didelis ekspresijos laipsnis žmogaus navikuose rodo, kad GTPazės yra svarbios kancerogenezės procese. 15 Tikslinės Rho GTPazės pelėms leido geriau suprasti jų fiziologinį vaidmenį in vivo . 16

Ankstesni mūsų tyrimai parodė Rac1 reikšmę tarpininkaujant nuo NPM ir ALK priklausomai ALCL ląstelių invazijai. 9 Svarbu tai, kad mes atskleidėme pagrindinį „Rac“ vaidmenį struktūrizuodami funkcinę invadopodiją, leisdami sekretuoti metaloproteinazę MMP-9 ir sukūrę CD44 / MMP-9 / Hsp90 kompleksą, kuris skatina tarpląstelinės matricos degradaciją ir NPM – ALK 3D migraciją. (+) ląstelės in vitro . 17 Čia mes siekėme ištirti, ar NSC23766, mažų molekulių inhibitoriaus, slopinanti „Rac“, įrodyta, kad pelėms atkuriant „Rac1“ ir „Rac2“ genetinį negaliojimą, gali paveikti NPM – ALK (+) ląstelių augliogeninį poveikį ir liga esant ksenografiniam ALCL modeliui ir NPM – ALK ekspresuojančioms transgeninėms pelėms.

medžiagos ir metodai

Reagentai ir antikūnai

Ląstelių kultūros reagentai buvo įsigyti iš „Invitrogen“ (Carlsbad, CA, JAV). WHI-154 ir NSC23766 buvo iš Calbiochem (San Diegas, CA, JAV). Aprotininas ir leupeptinas buvo iš „Euromedex“ (Souffelweyersheim, Prancūzija). Visos kitos cheminės medžiagos buvo iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV). Šiame tyrime buvo naudojami šie antikūnai: ALK (Sp8; Abcam, Cambridge, UK), B220 / CD45R (RA3-6B2; AbD Serotec, Colmar, Prancūzija), Rac1 (23A8; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)., fosfo-ALK-Y1604 (atpažįsta Y664 ant NPM – ALK), fosfo-p38-T180 / Y182, p38, fosfo-Erk1 / 2-T202 / Y204, Erk1 / 2, fosfo-STAT3-Y705, STAT3, fosfo-Akt -S473, Akt visi buvo iš Cell Signaling Technologies (Beverly, MA, JAV). Krienų peroksidaze (HRP) konjuguoti antriniai antikūnai buvo iš Promega (Madisonas, WI, JAV).

Pelės

Anksčiau buvo aprašyta transtageninių tTA / pBIL-NA pelių, ekspresuojančių NPM – ALK, generavimas naudojant tetraciklino reguliavimo sistemą. 18 NPM – ALK transgeno ekspresija buvo gauta pašalinant iš geriamojo vandens doksicikliną (100 μg / ml). Eksperimentuose naudojami gyvūnai buvo kraiko draugai. Patelės SCID (CB-17- Prkdc scid / lcrCrl) pelės, gautos iš 'Center d'Elevage Janvier' (Le Genest St Isle, Prancūzija), buvo naudojamos 7–12 savaičių amžiaus. Pelės buvo laikomos INSERM U1043 gyvūnų skyriuje (Purpano ligoninė, Tulūza, Prancūzija) tam tikromis patogenų neturinčiomis sąlygomis. Eksperimentai buvo atlikti pagal INSERM patvirtintus gyvūnų protokolus.

Ląstelių kultūros

Žmogaus ALCL ląstelių linijos „Karpas 299“ ir „Cost“ buvo auginamos Iscove modifikuotoje Dulbecco terpėje (IMDM), papildytoje 15% veršienos vaisiaus serumo, 100 V / ml penicilino, 100 μg / ml streptomicino, esant 37 ° C, 5% drėgnoje atmosferoje. anglies dvideginis. Išlaidų ALCL 19 ląstelių linija buvo gauta iš G Delsol (CRCT, Tulūza, Prancūzija). „Karpas 299 ALCL“ ląstelės buvo gautos iš DSMZ (Vokietijos mikroorganizmų ir ląstelių kultūros kolekcija, Braunšveigas, Vokietija). Ląstelių linijos du kartus per mėnesį buvo tikrinamos siekiant nustatyti Mycoplasma (MycoAlert Mycoplasma nustatymo tyrimas, Lonza, Bazelis, Šveicarija).

Imunoblotai

Bendri ląstelių baltymai buvo ekstrahuojami 50 mM Tris-bazės, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 1% nonidet P-40, 1 mM PMSF, 50 mM NaF, 1 mM Na 3 VO4, 10 μg / ml leupeptino ir 2 μg / ml aprotinino. Baltymai buvo analizuojami natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze, po to atlikus Western blot tyrimą ant Immobilon-P membranų (Millipore, Billerica, MA, JAV), naudojant atitinkamus antikūnus. Imunoreaktyvios juostos buvo aptiktos chemiliuminescencijos būdu naudojant „SuperSignal“ aptikimo sistemą (Pierce Chemical Co, Rokfordas, IL, JAV).

„Matrigel“ invazijos testai

„Matrigel“ invazijos tyrimas matuoja ALCL sugebėjimą įsibrauti į tankią Matrigel matricą („BD Biosciences“, Rockville, MD, JAV), imituojančią rūsio membranas. Iš viso 2 × 105 per naktį serumu sergančių ALCL ląstelės buvo pažymėtos 90 minučių 0, 5 μM CellTracker Orange CMTMR (Invitrogen). Po plovimo ląstelės buvo pasėtos į labteko kameras ir uždengtos Matrigel 5 mg / ml, +/− 40 μM NSC23766, kiekiu. Po 90 minučių 37 ° C temperatūroje buvo pridėta terpė, kurioje yra 15% veršelio vaisiaus serumo ir 1 μg / ml SDF1α. Po 24 valandų ląstelės buvo analizuojamos konfokaline mikroskopija (LSM510, Carl Zeiss, Oberkochen, Vokietija), naudojant 20x objektyvą. Optinės z sekcijos buvo imamos kas 2, 5 μm, pradedant nuo pagrindo ir tęsiantis 100 μm į Matrigel. Invazijai įvertinti buvo įdėtos CMTMR fluorescencinės ląstelės didesniuose kaip 20 μm skyriuose, o po to padalytos iš ląstelių sumos į visus z skyrius. Duomenys parodo 200 ląstelių kiekvienos būklės analizę. Trimatis vaizdavimas ir ląstelių kiekybinis nustatymas buvo atlikti naudojant „Imaris 6.4.2“ programinę įrangą (Bitplane AG, Ciurichas, Šveicarija).

In vivo tumorigeninio poveikio tyrimai

Prieš įšvirkščiant į poodį SCID pelėms (6x106 ląstelių vienam gyvūnui), „Karpas 299“ ląstelės buvo centrifuguotos ir pakartotinai suspenduotos 150 μl fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Navikams buvo leidžiama vystytis 7 dienas, tada pelės buvo gydomos du kartus per dieną, įpilant į pilvaplėvės ertmę PBS arba 2, 5 mg / kg NSC23766 dar 9 dienas. Naviko išsivystymas buvo įvertintas matuokliu. Tūris buvo apskaičiuotas pagal formulę: ilgis (mm) × storis (mm) × plotis (mm) × 0, 52. Rezultatai išreiškiami kaip naviko tūrio santykis kiekvienu laiko momentu prieš tūrį prieš gydymą. 10-ą dieną po gydymo pelės buvo nužudytos ir išpjaustytos. Navikai ir organai buvo fiksuoti 4% formalino ir įterpti į parafiną. Transgeninės tTA-pBIL-NA pelės (3 savaičių) buvo gydomos NSC23766 14 dienų, kaip aprašyta aukščiau.

Imunohistochemija

Audinių dalys buvo inkubuotos su šiais antikūnais: ALK (Sp8) arba B220 / CD45R. Vystymasis buvo aprašytas anksčiau. 18 Antikūnų surišimas buvo aptiktas naudojant „Impress Rabbit Kit“ (Vektorių laboratorijos, Burlingame, CA, JAV). Sekcijos buvo stebimos „Leica DMR“ mikroskopu (Leica, Solms, Vokietija) nurodytu padidinimu.

Statistinė analizė

Kiekvienam duomenų taškui buvo apskaičiuota vidutinė ± standartinė paklaida. Duomenys atspindi nuo trijų iki penkių nepriklausomų eksperimentų. Skirtumai tarp grupių buvo analizuojami pagal Studento vertes, visais atvejais P <0, 001.

Rezultatai

Rasas kontroliuoja NPM – ALK (+) ląstelių transformuojančias savybes in vitro

Anksčiau parodėme, kad dominuojančio neigiamo Rac1-T17N mutanto išraiška panaikino NPM – ALK (+) fibroblastų invaziją. 9 Mes panaudojome „Rac“ mažų molekulių inhibitorių NSC23766, norėdami ištirti jo poveikį NPM – ALK sukeltai invazijai in vitro NPM – ALK (+) ALCL ląstelių linijose „Cost“ (mažų ląstelių variantas) ir „Karpas 299“ (bendras tipas). 20 Naktinis gydymas 40 μM NSC23766 sukėlė Rac1-GTP įkrovimo blokavimą, o RhoA ir Cdc42 nepakito (papildomas 1 paveikslas).

Buvo pranešta, kad NPM – ALK daro įtaką įvairių tipų ląstelių morfologijai, adhezijai ir migracijai. ALCL ląstelėse, įsiveržiančiose į 3D-Matrigel, NPM – ALK transformacija paskatino aplink ląstelės kūną susidaryti dinamines membranos iškyšas, kurios rodo poliarizuotus judriojo aktino turinčius membranos išsikišimus link SDF1α gradiento. Tada mes įvertinome, ar NSC23766 paveikė nuo NPM-ALK priklausomą invaziją, naudodama tą pačią eksperimentinę sąranką. 1 paveikslas parodė, kad Cost ir Karpas 299 NPM – ALK (+) ALCL ląstelių gydymas 40 μM NSC23766 panaikino 3D-Matrigel invaziją, parodydamas, kad farmakologinis Rac slopinimas buvo panašus į klasikinį dominuojantį neigiamą požiūrį blokuoti nuo Rac priklausomų ląstelių. atsakai in vitro .

Image

Rasas reguliuoja nuo NPM ir ALK priklausomą invaziją in vitro . NPM – ALK (+) ALCL ląstelių, apdorotų PBS arba 40 μM Rac inhibitoriaus NSC23766, invazija į Matrigel. Įsibrovusios ląstelės buvo nudažytos CMTMR ir vizualizuotos konfokaline mikroskopija. Ląstelių, prasiskverbiančių į Matrigel į 20 μm ir didesnį gylį, skaičius buvo išreikštas procentais nuo bendro ląstelių skaičiaus gelyje.

Visas dydis

Onkogeninis ALK sintezės potencialas priklauso nuo jų hiperaktyvios tirozinkinazės aktyvumo, kuris aktyvuoja sujungtus signalizacijos kelius, būdingus daugeliui onkogeninių kinazių. 5, 11 Pavyzdžiui, ALK (+) ląstelių atsparumas apoptozei yra susijęs su JAK3 / STAT3 ir PI3 kinazės / Akt keliais, tuo tarpu padidėjęs proliferacija yra susijęs su Src šeimos kinazių, Grb2 / Sos / Ras, MAPK (Erk1) aktyvavimu. / 2, JNK ir p38 (nuoroda 5). Kaip buvo galima tikėtis, 2 paveikslas parodė, kad tie signalizacijos moduliai buvo griežtai priklausomi nuo ALK kinazės aktyvumo, nes Cost ir Karpas 299 gydymas WHI-154 inhibitoriumi paskatino jų inaktyvaciją. šie NPM – ALK taikiniai buvo apibūdinti kaip „Rac“ pasroviui priklausantys efektoriai, įvertinome jų fosforilinimo / aktyvacijos būklę gydymo NSC23766 metu. Pastebėjome p38, Erk1 / 2 ir Akt fosforilinimo sumažėjimą, panašų į tą, kuris buvo gautas slopinant ALK (2 paveikslas). Svarbu tai, kad NPM – ALK ir STAT3 aktyvinimas buvo negailimas, parodant, kad tik kai kurie keliai, žinomi kaip sukeliantys nuo ALK priklausomą transformaciją, buvo reguliuojami Rac.

Image

Rac yra susijęs su NPM – ALK tarpininkaujant signalizacijos kaskadų aktyvavimui. Serumo nenukentėjusios „Karpas 299“ arba „Cost“ ląstelės per naktį buvo apdorotos 15 μM WHI-154 arba 40 μM NSC23766. Po to lizatai buvo analizuojami atlikus imunoblotus su nurodytais specifiniais antikūnais. Antikūnai prieš ištirtus baltymus buvo naudojami kaip įkrovos kontrolė. Duomenys atspindi nuo trijų iki keturių nepriklausomų eksperimentų.

Visas dydis

„Rac“ skatina invaziją į NPM – ALK (+) ALCL in vivo

Pagrindinis selektyvaus farmakologinio inhibitoriaus naudojimo pranašumas yra jo gebėjimas naudoti gyvūnų modeliuose. Norint įvertinti Rac1 signalizacijos poveikį NPM – ALK transformacinėms savybėms in vivo , Karpas 299 ląstelės buvo poodyje implantuojamos į nusilpusias SCID peles. NPM – ALK (+) ląstelės per 7 dienas sukėlė greitai augančius navikus. Po to gyvūnams du kartus per dieną buvo švirkščiamos į pilvaplėvės ertmę 2, 5 mg / kg NSC23766 (pelės NSC23766) arba PBS (PBS pelės) dozės.

Pastebėjome, kad gydymas NSC23766 blokavo naviko vystymąsi (tūris = 34 ± 12 mm 3, praėjus 9 dienoms po gydymo), priešingai nei su PBS injekuotomis pelėmis, kai auglio augimas vis dar vystėsi (tūris = 436 ± 14 mm 3, 3a ir b paveikslai). . PBS pelių navikai turėjo neaiškias maržas ir keletą nekrozės židinių, būdingų greitai besivystančiai neoplazijai, tuo tarpu NSC pelių augliai buvo maži, su skirtingais kraštais. Imunohistochemija parodė, kad Karpas 299 formavosi abiejų tipų poodiniai navikai, parodantys būdingą didelių NPM – ALK (+) ląstelių fenotipą (4 pav.).

Image

Raso slopinimas mažina ksenografuotų NPM – ALK (+) Karpas 299 auglių augimą ir plitimą. Karpas 299 ląstelės buvo švirkščiamos po oda į SCID peles. Naviku buvo galima vystytis 7 dienas, prieš tai 9 dienas gydant NSC23766 (dvi intraperitoninės injekcijos per dieną, 2, 5 mg / kg). a ) Nespalvotos poodinių navikų masės nuotraukos po 9 dienų gydymo, brėžtas taškas, apibūdinantis navikus. ( b ) Naviko vystymasis buvo vertinamas matuojant apkabas. Duomenys pateikiami kaip naviko tūrio procentinė dalis nurodytu laiku per dydį, esant D0 (kai buvo pradėtas gydymas). Duomenys gauti iš penkių (PBS) ir septynių (NSC23766) pelių grupių. c ) Parodyta, kad su PBS arba NSC23766 gydytais krapais padidėjo blužnis. d ) histograma parodo blužnies dydžio vidurkį ± pus.

Visas dydis

Image

Rasų slopinimas neleidžia plisti poodiniams Karpas 299 navikams. Pelės buvo nužudytos po 9 dienų gydymo, augliai ir nurodyti organai buvo surinkti, pritvirtinti ir parafinas įterptas tolesnei imunohistocheminei analizei su anti-ALK (Sp8) antikūnu.

Visas dydis

Makroskopiniais organų stebėjimais po skrodimo nustatyta ryški splenomegalija ir limfadenopatija, leidžianti išsklaidyti Karpas 299 ląsteles iš pradinio poodinio naviko PBS pelėse. Pelių, gautų iš PBS, gausa siekė 2, 3 ± 0, 3 mm, o NSC23766 apdorotose pelėse jis buvo grąžintas į normalų 1, 4 ± 0, 1 mm dydį (3c ir d paveikslai). Siekiant geriau įvertinti sklaidos mastą, imunohistochemija su anti-ALK antikūnais buvo atlikta poodinio naviko, limfmazgio (LN), blužnies, plaučių ir kepenų audinių atkarpose, kurios atitinka metastazių vietas, dažniausiai aptinkamas žmogaus ligose. 4 pav. (Viršutinė plokštė) parodyta, kad Karpas 299 ląstelės buvo rasta visuose tirtuose organuose kontrolinėse PBS pelėse, parodydamos, kad po oda ksenografuotos ALCL ląstelės buvo labai invazinės. Atvirkščiai, nė vienoje iš NSC23766 įšvirkštų pelių nebuvo pastebėti ALK dažymo požymiai tolimuose organuose, tuo tarpu maždaug ketvirtadalyje jų (3 iš 11 pelių) vis dar buvo nedidelis LN įsiskverbimas į auglio įsodinimo pusę (4 paveikslas, apatinė panelė). ). Šie duomenys rodo, kad Rac kelias yra pagrindinis vaidmuo reguliuojant auglių augimą, taip pat NPM – ALK (+) ALCL ląstelių invaziškumas ksenografuotuose pelių modeliuose.

Farmakologinis Rac slopinimas sutrikdo transgeninių pelių limfomos vystymąsi

Norėdami geriau įvertinti nuo RAC priklausomo signalizacijos slopinimo poveikį ALK (+) patogenezei, pasinaudojome neseniai sukurtu sąlyginio transgeninio pelių ALK sukeltos limfomagenezės pelių modeliu, kuriame naudojama tetraciklinų reguliavimo sistema, kontroliuojama EμSrα stipriklio / promotoriaus. Šiame modelyje NPM – ALK ekspresija sukelia B ląstelių limfomą / leukemiją ir odos keratoakantominės formos pažeidimus, atsirandančius dėl nenormalios transgeno ekspresijos keratinocituose. 18 Nors šis modelis teisingai neatkuria žmogaus ligos, jis yra pagrindinis įrankis, tiriantis in vivo molekulinius mechanizmus, susijusius su ALK susijusiais sutrikimais, ir ištirti numatomus terapinius taikinius. Pelėms pasireiškus NPM – ALK kiekiui, paimant doksicikliną iš geriamojo vandens, jis gimsta maždaug po 3 savaičių amžiaus. Jam būdingas tipiškas odos sutrikimas, pažeidžiantis snukį ir letenas (5a paveikslas), augimo defektai (5b paveikslas) ir bendras limfoidinis piktybinis navikas su ryškia splenomegalija ir limfadenopatija (5c paveikslas), o mirtis įvyksta nuo 4 iki 5 savaičių. 18 Pelių (3 savaičių), kurios ką tik parodė pirmuosius ligos požymius, buvo gydomos NSC23766 arba PBS injekcijomis. 5 metų amžiaus, nors kontroliniai vados draugai mirė, NSC pelės buvo fiziškai aktyvios, priauga svorio ir per keletą gydymo dienų odos regresija regresuoja (5a ir b paveikslai). Atitinkamai, LN ir blužniai atgavo normalų dydį (5c paveikslas). Limfoidinės ligos regresija buvo patvirtinta imunohistochemija. 6 pav. Parodyta, kad tTA / pBIL-NA pelių LNs architektūra buvo išnaikinta infiltruojant auglio B kilmės ląsteles šiame modelyje, kaip parodyta teigiamu CD45R / B220 antikūno dažymu. Šios ląstelės taip pat išreiškė NPM – ALK. NSC23766 slopindamas Rac, atstatė normalią LN struktūrą ir žymiai sumažino NPM – ALK / B220 teigiamų limfomos ląstelių įsiskverbimą, kuris tapo panašus į tai, kuris buvo stebimas, kai onkogenas buvo slopinamas vartojant doksicikliną (6 pav.). Periferinių organų (blužnies, plaučių ir kepenų) analizė parodė pastebimą infiltruojančių limfomos ląstelių regresiją ar išnykimą (7 paveikslas). Iš viso šie duomenys rodo pagrindinį „Rac“ vaidmenį limfomagenezėje ir NPM – ALK piktybinių navikų plitime. NSC23766 poveikis yra pagrindas mažoms GTPazėms skirti nuo ALK priklausomų vėžių atvejais.

Image

NSC23766 gydytų NPM – ALK-ekspresuojančių tTA / pBIL-NA transgeninių pelių ligos regresijos makroskopinis stebėjimas. NPM – ALK transgeno ekspresija buvo paskatinta pašalinant doksą iš naujagimių transgeninių pelių geriamojo vandens. Po 3 savaičių pelės buvo gydomos du kartus per dieną, įpilant į pilvaplėvės ertmę PBS arba 2, 5 mg / kg NSC23766. a ) Juodos ir baltos pelių, pakratusių kraiko, nuotraukos, kuriose matomi sumažėję ir į keratoakantomą panašūs pažeidimai PBS kontrolinių pelių snukyje ir kojose. Gydymas NSC23766 pakeičia fenotipus. ( b ) NSC23766 administravimo sugeneruoti dydžio padidėjimai. c ) Rasų slopinimas panaikino tipišką blužnies ir LN padidėjimą, stebėtą transgeninėse pelėse.

Visas dydis

Image

Rasų slopinimas sukelia histohatologinius NPM – ALK transgeninių pelių limfmazgių pokyčius, panašius į onkogeno nutildymą, pakartotinai vartojant doksicikliną. 3 savaičių tTA / pBIL-NA pelės, ekspresuojančios NPM – ALK, 14 dienų buvo gydomos NSC23766, kaip aprašyta anksčiau. Pelės buvo nužudytos, o LN buvo surinktos, fiksuotos ir parafinas įterptas imunohistocheminei analizei su anti-ALK (Sp8) ir anti-B220 (B limfocitais) antikūnais. PBS pelių, sergančių visiškai išsivysčiusia liga, LN struktūrą išnaikino limfomos ląstelės, teigiamos tiek B220, tiek ALK. Sušvirkštus NSC23766 (pelės NSC23766), LN palaipsniui atkuria normalią architektūrą, sumažėjus ALK (+) ląstelių skaičiui ir padidėjus B- (B220 teigiamų) ir T-ląstelių (mėlynos zonos) panašiai kaip gydymas doksu (dox). .

Visas dydis

Image

Histopatologinis NPM – ALK transgeninių pelių organų tyrimas rodo, kad dėl raso inaktyvacijos regresuoja limfomos plitimas. Pelės buvo gydomos, kaip aprašyta anksčiau, nurodyti organai buvo surinkti, pritvirtinti ir parafinas įterptas imunohistocheminei analizei su anti-ALK (Sp8) antikūnu, kad būtų galima pamatyti invaziją iš ALK (+) ląstelių.

Visas dydis

Diskusija

Jei Rho GTPazių vaidmuo buvo gerai aprašytas prigludusių ląstelių fiziologijoje ir patvirtintas jų dalyvavimas solidiniuose navikuose, dar reikia daug ištirti jų vaidmenį hematopoezėje ir hemopatijose. Įrodyta, kad specifiniai keliai, kuriuos reguliuoja GTPazės, turi lemiamą reikšmę kraujodaros kamieninėms ląstelėms, T ir B ląstelių brendimui ir funkcijoms. Mažos GTPazės yra žinomi T- ir B-limfocitų efektoriai, kai jie dalyvauja aktyvavime per citoskeleto pertvarkymus, poliarizaciją ir imuninės sinapsės susidarymą, reikalingą efektyviam limfocitų atsakui. Šie stebėjimai paaiškina Rho GTPazių, susijusių su piktybinėmis hematologinėmis ligomis, tokiomis kaip leukemija, ne Hodžkino limfomos ar ALCL, reguliavimo panaikinimą, taip pat imunines patologijas. Nors jiems trūksta TCR / BCR ir daugumos stimuliuotų limfocitų signalinių relių, ALCL rodo aktyvuotų T- arba B-ląstelių fenotipą, o NPM – ALK onkogenezė apima kelius, susijusius su limfocitų aktyvacija. 22 Šiame kontekste mes ir kiti parengėme straipsnių seriją, parodančią Rac ir Cdc42 dalyvavimą citoskeleto pertvarkyme ir proliferacijoje, skatinančioje ALK (+) ALCL invaziją, tokiu būdu atveriant naujas gydymo perspektyvas. 9, 13, 17. Šiame tyrime mes parodėme, kad gydymas NSC23766 blokavo ALCL išvestų ląstelių linijų invaziją į 3D-Matrigel, identifikuodamas Racą kaip pagrindinę nuo NPM ir ALK priklausomų invazinių savybių esmę.

NSC23766 pasirodė kaip galingas įrankis, nes net po kelių savaičių kasdienio vartojimo pelėms jis nekelia reikšmingo toksiškumo. Todėl pelėmis, kurioms išsivystė poodiniai navikai, susidariusios iš žmogaus NPM – ALK (+) ALCL ląstelių linijos „Karpas 299“, NSC23766 paros dozėmis. Nors ir nepastebėjome jokio regreso, NSC23766 gydytų pelių auglių augimas ir plitimas buvo visiškai užblokuotas, palyginti su kontroliniais gyvūnais. Panašų eksperimentą atliko Chiarle grupė, kuri ištyrė Cdc42 vaidmenį augiant ir palaikant poodyje implantuotus ALK (+) navikus. Šiame tyrime jie nustatė Cdc42 kaip svarbų naviko vystymosi reguliatorių. Cdc42 slopinimas, kurį sukelia maža plaukų segtuko RNR arba „Secramine A“ inhibitorius, laikui bėgant sukelia ląstelių žūtį. Savo modeliuose neaptikome jokios apoptozės (neparodyta). Tai galima paaiškinti nuolatiniu STAT3 aktyvavimu pagal NSC23766, nors buvo panaikinta MAPK šeimos narių (p38 ir Erk1 / 2) ir nuo Akt NPM-ALK priklausanti aktyvacija. Kaip NPM – ALK taikinys, STAT3 vaidina svarbų vaidmenį ALCL navikogenezėje padidindamas antiapoptotinių veiksnių ir ląstelių ciklo reguliatorių, tokių kaip BCL-X L, ciklinis D3 ar C / EBPβ, transkripciją, kad padidėtų išgyvenamumas ir proliferacija. 24 Todėl gali reikėti jos inaktyvacijos, kad sukeltų NPM – ALK (+) ląstelių apoptozę.

Tada mes ėmėmės žingsnio į priekį naudodami naujai sukurtas sąlygines transgenines peles ALK sukeltai limfomagenezei pagal tetraciklinų reguliavimo sistemą. Šiame modelyje, kaip ir daugelyje kitų, sukurtų naudojant NPM – ALK, onkogeno ekspresija sukelia B ląstelių limfomas. Tai siūlo galingą įrankį, skirtą in vivo ištirti mechanizmus, susijusius su ALK sukelta transformacija, ir terapines galimybes, tai buvo parodyta kaip principo įrodymas naudojant ALK inhibitorių PF-02341066. 18 NSC23766 skyrimas transgeninėms pelėms, kurios pradėjo vystytis, blokavo limfoidinio piktybinio naviko vystymąsi ir žymiai sumažino į šį modelį pastebėtus keratoakantominės formos pažeidimus (2 papildomas paveikslas). Tikslinių organų metastazės buvo visiškai panaikintos, tai parodė, kad gydymas šiuo pirmosios kartos Rac inhibitoriumi turėjo didžiausią susidomėjimą ALK sukeltais piktybiniais navikais. Mes išbandėme kelis vaisto vartojimo būdus. Intraperitoninės injekcijos buvo atliekamos lygiagrečiai su Azleto osmosinių pompų (viena pompa, 50 m M NSC23766) tiekimu. Abu gydymo metodai davė tuos pačius rezultatus, nes intraperitoninis skyrimas buvo šiek tiek efektyvesnis, greičiausiai dėl trumpo NSC23766 gyvavimo laiko, kuris, tikėtina, neaktyvinamas, kai per pompas jis tiekiamas per 2 savaites kūno temperatūroje. Reikia pažymėti, kad NSC23766 jau įrodė, kad riboja lėtinės mieloidinės leukemijos BCR-ABL (+) vystymąsi, net ir ląstelėms, atsparioms terapijoje klasikiškai naudojamiems Abl inhibitoriams, imatinibui. Thomas ir kt. 23 parodė, kad kartu vartojant mažas NSC23766 ir imatinibo dozes, reikšmingai paveikta ligos raida. Šie duomenys aiškiai rodo, kad taikymas prieš Rac yra tinkamas pasirinkimas gydant įvairius hematologinius pažeidimus. Iš tiesų, ALK inhibitorius PF-02341066 (crizotinibas) ką tik pradėjo klinikinius tyrimus, skirtus EML4-ALK kinazei nustatyti nesmulkialąsteliniame plaučių vėžyje, ir ką tik buvo pranešta apie kinazės srities mutacijas, sukeliančias atsparumą gydymui. 25, 26 Šiame kontekste labai svarbu sugebėti įgyvendinti įvairaus taikymo terapiją, siekiant padidinti ligos išnaikinimo galimybes.

Apibendrinant galima pasakyti, kad šis darbas nustatė, kad „Rac1“ kelias yra svarbus skleidžiant ligą ir nustatant metastazes in vivo . Mūsų ir literatūros duomenys rodo, kad kraujo piktybiniai navikai yra Rho GTPazės. Tai pabrėžia faktą, kad šios šeimos baltymų inhibitorių kūrimas yra perspektyvus ir tinkamas pasirinkimas terapinei intervencijai tiek limfomos, tiek leukemijos atvejais.

Papildoma informacija

„Powerpoint“ failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos figūros Legendos

    Papildoma informacija pridedama prie Kraujo vėžio žurnalo svetainėje esančio dokumento (//www.nature.com/bcj)