Pradinis genomo sekos nustatymas ir išsėtinės mielomos analizė | gamta

Pradinis genomo sekos nustatymas ir išsėtinės mielomos analizė | gamta

Anonim

Dalykai

  • Vėžio genetika
  • Mieloma
  • Sekavimas

Anotacija

Išsėtinė mieloma yra nepagydomas plazminių ląstelių piktybinis navikas, jos patogenezė yra mažai suprantama. Čia pateikiame informaciją apie masiškai lygiagrečią 38 naviko genomų seką ir jų palyginimą su normaliomis DNR. Somatinių mutacijų modelis duomenų rinkinyje pasiūlė keletą naujų ir netikėtų onkogeninių mechanizmų. Tai apima genų, dalyvaujančių baltymų transliacijoje, mutaciją (matoma beveik pusei pacientų), histonų metilinime dalyvaujančius genus ir kraujo krešėjimą skatinančius genus. Be to, platesnį, nei tikėtasi, NF-κB signalizacijos vaidmenį parodė mutacijos 11 NF-κB kelio narių. Galimos tiesioginės klinikinės svarbos aktyviosios kinazės BRAF mutacijos buvo pastebėtos 4% pacientų, o tai rodo BRAF inhibitorių vertinimą atliekant daugybinės mielomos klinikinius tyrimus. Šie rezultatai rodo, kad vėžio genomo sekų nustatymas didelėse mėginių kolekcijose suteiks naujų įžvalgų apie vėžį, kurio nenumatoma turimomis žiniomis.

Pagrindinis

Išsėtinė mieloma yra nepagydomas subrendusių B limfoidinių ląstelių piktybinis navikas, o jos patogenezė suprantama tik iš dalies. Apie 40% atvejų įvyksta chromosomų translokacijos, dėl kurių per daug išskiriami genai (įskaitant CCND1 , CCND3 , MAF , MAFB , WHSC1 (dar vadinamą MMSET ) ir FGFR3 ) per jų greta esančią imunoglobulino sunkiosios grandinės (IgH) lokusą 1 . Kitais atvejais pasireiškia hiperdiploidija. Tačiau šių anomalijų tikriausiai nepakanka piktybinei transformacijai, nes jie taip pat pastebimi esant piktybiniam sindromui, žinomam kaip neaiškios reikšmės monokloninė gamopatija. Piktybiniai progresavimo įvykiai apima MYC , FGFR3 , KRAS ir NRAS aktyvaciją ir NF-κB kelio 1, 2, 3 aktyvavimą. Pastaruoju metu taip pat pranešta apie funkcijų praradimą UTX histono demetilazės (dar vadinamos KDM6A ) mutacijomis 4 .

Galingas būdas suprasti molekulinį vėžio pagrindą yra sekti visą genomą arba baltymus koduojančią egzomą, palyginti to paties paciento naviką su normaliu, kad būtų galima nustatyti įgytas somatines mutacijas. Naujausiuose pranešimuose aprašyta, kaip iš vieno paciento ištisų genomų seka yra 5, 6, 7, 8, 9 . Nors ir informatyvūs, hipotezėme, kad didesnis atvejų skaičius leistų nustatyti biologiškai svarbius modelius, kurie kitu atveju nebūtų akivaizdūs.

Daugybinės mielomos mutacijų peizažas

Mes ištyrėme 38 pacientus, sergančius daugybine mieloma (1 papildoma lentelė), atlikdami viso paciento genomo sekos nustatymą (WGS) 23 pacientams ir viso egzomo sekos seką (WES; vertindami 164 687 egzonus) 16 pacientų, su vienu pacientu analizuodami abu metodus (papildoma informacija). . WES yra ekonomiškai efektyvi baltymus koduojančių mutacijų identifikavimo strategija, tačiau negali aptikti nekoduojančių mutacijų ir pertvarkymų. Mes nustatėme navikui būdingas mutacijas, palygindami kiekvieną naviką su atitinkamu normaliu, naudodamiesi algoritmų, skirtų aptikti taškinėms mutacijoms, mažiems intarpams / trynimams (indeliams) ir kitiems pertvarkymams nustatyti, seka (papildomas 1 pav.). Remiantis WGS, navikui būdingų taškinių mutacijų dažnis buvo 2, 9 milijono bazių, o tai atitinka maždaug 7 450 taškų mutacijų viename mėginyje visame genome, įskaitant vidutiniškai 35 aminorūgštis keičiančias taško mutacijas ir 21 chromosomų pertvarkymą, sutrikdantį baltymą. -koduojantys regionai (2 ir 3 papildomos lentelės). Nustatytas, kad mutacijų iškvietimo algoritmas yra labai tikslus, o tikroji teigiama 95% taškų mutacijų norma (papildomas tekstas, 4 ir 5 lentelės ir 2 papildomas paveikslas).

Mutacijų dažnis visame genome labai skyrėsi priklausomai nuo bazinės kompozicijos. CpG dinukleotidų mutacijos vyksta keturis kartus dažniau nei A arba T bazių mutacijos (papildomas 3a pav.). Be to, net atlikus bazinės kompozicijos pataisą, mutacijų dažnis koduojančiuose regionuose buvo mažesnis nei stebimas vidiniuose ir tarpgeniniuose regionuose ( P <1 × 10 –16 ; papildomas 3b pav.), Galimai dėl neigiamo selektyvaus slėgio prieš mutacijas, kurios trikdo kodavimo sekos. Taip pat yra mažesnis mutacijų dažnis vidiniuose regionuose, palyginti su tarpgeniniais regionais ( P <1 × 10 –16 ), o tai gali atspindėti transkripcijos susietą taisymą, kaip anksčiau buvo siūloma 10, 11 . Laikydamiesi šio paaiškinimo, mes pastebėjome mažesnį genų, išreikštų daugybine mieloma, mutacijų greitį, palyginti su tais, kurie nebuvo išreikšti (1 pav.).

Image

a, Intronic mutacijos dažnis, padalytas iš genų ekspresijos greičio, sergant daugybine mieloma. Genų ekspresijos greitis buvo įvertintas pagal Affymetrix Present (P) skambučių dalį 304 pirminiuose daugybinės mielomos mėginiuose. Klaidų juostos rodo ± 1 standartinį nuokrypį. NS, nereikšminga. b . Funkcinio svarbos (FI) balai buvo sugeneruoti visoms taškų mutacijoms ir padalyti į nesvarbių mutacijų (viršutinė histograma; n = 1, 019) ir reikšmingų mutacijų (apačia; n = 36) pasiskirstymus. Pasiskirstymas palyginamas pagal Kolmogorovo – Smirnovo statistiką.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Dažnai mutavę genai

Kitas dėmesys buvo skiriamas somatinių, nebylių baltymus koduojančių mutacijų pasiskirstymui. Mes įvertinome statistinį reikšmingumą, palyginti su foniniu mutacijų pasiskirstymu (papildoma informacija). Dešimt genų parodė statistiškai reikšmingus baltymus keičiančių mutacijų („reikšmingai mutavusių genų“) procentus, kai klaidingo atradimo dažnis (FDR) buvo ≤0, 10 (1 lentelė). Norėdami ištirti jų funkcinę svarbą, mes palyginome numatomą jų pasekmę (remiantis evoliucijos išsaugojimu ir aminorūgšties pokyčio pobūdžiu) su visų koduojančių mutacijų pasiskirstymu. Ši analizė parodė, kad dešimties reikšmingai mutavusių genų ( P = 7, 6 × 10 –14 ; 1b pav.) Funkcinės svarbos (FI) balai yra 12 (12), patvirtinantys jų biologinį svarbą. Net neįtraukus RAS ir p53 mutacijų, iškreipimas išliko reikšmingas ( P <0, 01).

Pilno dydžio lentelė

Mes taip pat ištyrėme reikšmingai mutavusių genų nesinoniminės / sinoniminės (NS / S) mutacijos greitį. Tikėtinas NS / S santykis buvo 2, 82 ± 0, 15, tuo tarpu stebimas reikšmingų genų santykis buvo 39: 0 ( P <0, 0001), dar labiau patvirtindamas atvejį, kad šie genai tikriausiai yra daugybinės mielomos patogenezės varikliai ir mažai tikėtina, kad paprasčiausiai būti keleivių mutacijomis.

Prie reikšmingai mutavusių genų yra trys anksčiau pranešti, kad turi daugybinės mielomos taškų mutacijas: KRAS ir NRAS (atitinkamai 10 ir 9 atvejai (50%), P <1 × 10 –11, q <1 × 10 –6 ) ir TP53. (3 atvejai (8%), P = 5, 1 × 10 –6, q = 0, 019). Įdomu tai, kad CCND1 ( ciklinas D1), kuris ilgą laiką buvo pripažintas chromosomų translokacijos taikiniu daugialypėje mielomoje , mes nustatėme dvi taškų mutacijas (5%, P = 0, 000027, q = 0, 086), tačiau taškų mutacijos nepastebėtos. anksčiau sirgo vėžiu.

Anksčiau nebuvo žinoma, kad likę šeši genai yra susiję su vėžiu ir rodo naujus išsėtinės mielomos patogenezės aspektus.

RNR perdirbimas ir baltymų homeostazės mutacijos

Įspūdingas šio tyrimo atradimas buvo dažnų genų, dalyvaujančių RNR perdirbime, mutacijų atradimas, baltymų transliacija ir išsiskleidęs baltymo atsakas. Tokios mutacijos buvo pastebėtos beveik pusei pacientų.

DIS3 (dar vadinamas RRP44 ) geno mutacijos pasireiškė 4 iš 38 pacientų (11%, P = 2, 4 × 10 –6, q = 0, 011). DIS3 koduoja labai konservuotą RNR egzonukleazę, kuri yra katalizinis egzosomų komplekso komponentas, dalyvaujantis reguliuojant visų RNR rūšių 13, 14 apdorojimą ir gausą. Keturios stebėtos mutacijos įvyksta labai konservuotose vietose (2a pav.) Ir grupėse RNB srityje priešais fermento katalizinę kišenę (2b pav.). Du įrodymai rodo, kad dėl DIS3 mutacijų prarandama funkcija. Pirma, trys iš keturių mutacijų turinčių navikų parodė heterozigotumo praradimą, išbraukdami likusį DIS3 alelį. Antra, dvi iš mutacijų buvo funkciškai apibūdintos mielėse ir bakterijose, kai jos praranda fermentinį aktyvumą, dėl kurio jų RNR kaupiasi 15, 16 . Atsižvelgiant į tai, kad pagrindinis egzosomos vaidmuo yra turimo turimo mRNR, kuriuos galima transliuoti 17, reguliavimas, šie rezultatai rodo, kad DIS3 mutacijos gali sutrikdyti baltymų transliaciją kaip onkogeninį mechanizmą išsėtinei mielomai.

Image

a, DIS3 žmogaus, mielių ir bakterijų RNB domeno suderinimas. Stebimų mutacijų padėtys nurodomos žmogaus seka. Mielių ekvivalentai yra atitinkamai S541, V568, G833 ir R847. b, mielių DIS3 vienmatės ir trimatės struktūros, kurių RNB sritis yra mėlynos spalvos, o mutacijų - raudonos. c, GSEA diagrama, rodanti ribosomų baltymų geno rinkinio praturtėjimą tarp genų, koreliuojančių su FAM46C ekspresija 414 daugybinių mielomų mėginiuose.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Tolesnis transliacijos kontrolės vaidmens išsėtinės mielomos patogenezėje palaikymas atsiranda stebint FAM46C geno mutacijas 5 iš 38 (13%) pacientų ( P = 1, 8 × 10 –10, q = 1 × 10 –6 ). Nėra paskelbtos FAM46C funkcinės anotacijos, o jos seka neturi aiškios homologijos su žinomais baltymais. Norėdami sužinoti apie jo ląstelių vaidmenį, mes ištyrėme jo genų ekspresijos modelį 414 daugybinių mielomos mėginių ir palyginome jį su 395 genų rinkinių, kuruojamų molekulinių parašų duomenų bazėje (MSigDB), ekspresija, naudojant GSEA algoritmą 18, 19, 20 . FAM46C išraiška buvo labai koreliuojama ( q = 0, 034 atlikus daugybinę hipotezės korekciją; 2c pav.) Su ribosomų baltymų, kurie, kaip žinoma, yra griežtai suderinti 21, rinkinio ekspresija. Panašiai buvo stebimas ir stiprus ryšys su eukariotų iniciacija ir pailgėjimo faktoriais, susijusiais su baltymų transliacija. Nors tiksli FAM46C funkcija vis dar nežinoma, ši ryški koreliacija suteikia svarių įrodymų, kad FAM46C yra tam tikru būdu susijęs su vertimo reguliavimu. Remiantis šiuo pastebėjimu, neseniai buvo parodyta, kad FAM46C veikia kaip mRNR stabilumo faktorius (M. Flemingas, pateiktas rankraštis).

Pažymėtina, kad nors jie nėra statistiškai reikšmingi, mes nustatėme mutacijas dar penkiuose genuose, susijusiuose su baltymo transliacija, stabilumu ir išsiskleidusiomis baltymų reakcijomis (6 papildoma lentelė), ir tai dar labiau patvirtina transliacijos kontrolės vaidmenį sergant išsėtine mieloma. Ypatingai įdomu, kad du pacientai turėjo išskleidžiamo baltymo atsako geno XBP1 mutacijas . Įrodyta, kad tam tikros XBP1 suskaidytos formos per didelis ekspresija sukelia pelėms į daugybinę mielomą panašų sindromą, nors XBP1 vaidmuo žmogaus daugybinės mielomos patogenezėje nebuvo aprašytas 22 .

Susiję interesai, LRRK2 geno mutacijos buvo stebimos 3 iš 38 pacientų (8%; 6 papildoma lentelė). LRRK2 koduoja serino-treonino kinazę, kuri fosforilina transliacijos inicijavimo faktorių 4E jungiantį baltymą (4EBP). LRRK2 geriausiai žinomas dėl savo vaidmens linkus į Parkinsono ligą 23, 24 . Parkinsono ir kitoms neurodegeneracinėms ligoms, tokioms kaip Huntingtono liga, iš dalies būdingos abejotinos išsiskleidusios baltymų reakcijos 25 . Baltymų homeostazė gali būti ypač svarbi sergant išsėtine mieloma, nes daugybinės mielomos ląstelės gamina didžiulį imunoglobulinų kiekį 26, 27, 28 . Išvada taip pat turi klinikinę reikšmę dėl to, kad sėkmingai vartojamas vaistas bortezomibo (Velcade), kuris slopina proteosomą ir pasižymi puikiu aktyvumu išsėtine mieloma, palyginti su kitais navikų tipais 29 .

Šie rezultatai kartu rodo, kad mutacijos, turinčios įtakos baltymų transliacijai ir homeostazei, yra ypač dažnos išsėtinės mielomos atvejais (mažiausiai 16 iš 38 pacientų; 42%), ir tai rodo, kad gali būti verta ištirti papildomus terapinius metodus, nukreiptus į šiuos mechanizmus.

Tapatios mutacijos rodo onkogenų funkcijos padidėjimą

Kitas būdas atpažinti biologiškai reikšmingas mutacijas yra ieškoti identiškų mutacijų, rodančių onkogenų funkcijos padidėjimo funkciją. Du pacientai turėjo identišką mutaciją (K123R) interferoną reguliuojančio faktoriaus IRF4 DNR rišančiame domene. Įdomu tai, kad neseniai atliktas daugybinės mielomos RNR interferencijos ekranas parodė, kad norint išgyventi daugialypę mielomą, reikia IRF4, atsižvelgiant į jo, kaip numanomo onkogeno, vaidmenį 30 . Šios mutacijos genotipas 161 papildomame daugybinės mielomos mėginyje nustatė dar du pacientus, kuriems nustatyta ši mutacija. IRF4 yra transkripcinis PRDM1 reguliatorius (dar vadinamas BLIMP1), o du iš 38 pacientų, kuriems seka, taip pat parodė PRDM1 mutacijas. PRDM1 yra transkripcijos faktorius, dalyvaujantis diferencijuojant plazmos ląsteles, kurių funkcijų praradimas vyksta difuzinėje didelėje B ląstelių limfomoje 31, 32, 33, 34, 35 .

Kliniškai veikiančios BRAF mutacijos

Kai kurios mutacijos nusipelno dėmesio dėl jų klinikinės svarbos. Vienam iš trisdešimt aštuonių pacientų pasireiškė BRAF kinazės mutacija (G469A). Nors BRAF G469A anksčiau nebuvo pastebėtas sergant išsėtine mieloma, žinoma, kad ši tiksli mutacija yra aktyvinanti ir onkogeninė 36 . Pagal 12 dažniausiai BRAF mutacijų genotipą nustatėme papildomai 161 pacientui, sergančiam daugybine mieloma, ir 7 pacientams (4%) mutacijų nustatėme. Trys iš jų buvo K601N, o keturi - V600E (dažniausia BRAF mutacija sergant 37 melanoma). Mūsų išvados, kad bendrosios BRAF mutacijos sergant daugybine mieloma, turi svarbių klinikinių reikšmių, nes tokiems pacientams gali būti naudingas gydymas BRAF inhibitoriais, kurių kai kurie rodo ryškų klinikinį aktyvumą 38 . Mūsų rezultatai taip pat patvirtina pastebėjimą, kad inhibitoriai, veikiantys pasroviui nuo BRAF (pavyzdžiui, MEK), gali būti aktyvūs išsėtinei mielomai 39 .

Genų rinkinio mutacijos: NF-κB kelias

Kitas būdas išsiaiškinti išsėtinės mielomos biologiškai svarbias mutacijas yra ieškoti ne atskirų genų mutacijų dažnio, o genų rinkinių.

Pirmiausia mes apsvarstėme genų rinkinius, pagrįstus turimais įžvalgomis apie išsėtinės mielomos biologiją. Pavyzdžiui, NF-κB kelio aktyvacija yra žinoma sergant daugybine mieloma, tačiau tokio aktyvavimo pagrindas suprantamas tik iš dalies. Mes stebėjome 10 taškų mutacijas ( P = 0, 016) ir 4 struktūrinius pertvarkymus, turinčius įtakos 11 NF-κB kelio genų (7 papildoma lentelė): BTRC , CARD11 , CYLD , IKBIP , IKBKB , MAP3K1 , MAP3K14 , RIPK4 , TLR4 , TNFRSF1A ir TRAF3 . Apibendrinant, mūsų išvados labai išplečia mechanizmus, kuriais NF-κB gali būti aktyvuotas sergant daugybine mieloma.

Genų rinkinio mutacijos: histoną modifikuojantys fermentai

Toliau ieškojome histoną modifikuojančių fermentų mutacijų praturtėjimo. Ši hipotezė kilo dėl mūsų pastebėjimo, kad homeotinės transkripcijos faktorius HOXA9 buvo labai išreikštas daugybinės mielomos pacientų, ypač tų, kuriems nėra žinomų IgH translokacijų, pogrupyje (papildomas 4a pav.). HOXA9 ekspresiją pirmiausia reguliuoja histono metiltransferazės (HMT), įskaitant MLL šeimos narius. Jautri polimerazės grandininė reakcija su atvirkštinės transkripcijos (RT – PGR) analize parodė, kad HOXA9 iš tikrųjų visur buvo ekspresuojama išsėtinės mielomos atvejais, daugeliu atvejų pasireiškianti biallelio išraiška, atitinkanti reguliavimą prieš HMT įvykį (papildomas 4b, c pav.). Atitinkamai mes ieškojome genų, žinomų tiesiogiai reguliuojančių HOXA9 , mutacijų. Mes nustatėme reikšmingą praturtėjimą ( P = 0, 0024) su MLL , MLL2 , MLL3 , UTX , WHSC1 ir WHSC1L1 mutacijomis .

Paprastai HOXA9 nutildo histon 3 lizino 27 trimetiliacijos (H3K27me3) chromatino žymės, kai ląstelės diferencijuojasi už hematopoetinės kamieninių ląstelių stadijos 40, 41 . Šis represinis ženklas buvo silpnas arba jo nebuvo HOXA9 lokuse daugumoje daugybinių mielomos ląstelių linijų (3a pav.). Be to, tarp H3K27me3 lygių ir HOXA9 ekspresijos buvo atvirkštinė koreliacija (3b pav.), Suderinta su HMT disfunkcija, prisidedančia prie nenormalios HOXA9 ekspresijos.

Image

a ) H3K27me3 sodrinimas HOXA9 promotoriuje CD34 ląstelėse, CD19 ląstelėse ir daugybinės mielomos ląstelių linijose, palyginti su H3K27me3 metilinimu BC vietoje, žinomas kaip hipometilintas visose ląstelėse. b . Santykinė HOXA9 išraiška prieš H3K27me3 praturtėjimą HOXA9 lokuse. c, GFP konkurencijos tyrimas daugybinės mielomos ląstelių linijose. Po lentivirusinės infekcijos septyniomis HOXA9 shRNR arba kontroline shRNR, nukreipta į luciferazę, GFP teigiamos ląstelės buvo stebimos srauto citometrijos būdu ir palygintos su GFP teigiamų ląstelių proporcija populiacijoje, praėjus 3 dienoms po užkrėtimo (pažymėta 0 diena). Klaidų juostos nurodo standartinę vidurkio paklaidą ir reiškia mažiausiai tris nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami nustatyti HOXA9 ekspresijos funkcinę reikšmę daugybinės mielomos ląstelėse, mes numušėme jo raišką septyniomis shRNR (papildomas 5 pav.). 11 iš 12 daugybinių mielomos ląstelių linijų HOXA9 turinčios ląstelės turėjo nepalankią konkurencinę padėtį (3c pav. Ir papildomas 6 pav.).

Šie eksperimentai rodo, kad abejotina HOXA9 ekspresija, kurią bent iš dalies sukelia su HMT susiję genominiai įvykiai, turi reikšmės išsėtinei mielomai ir gali būti naujas terapinis taikinys. Remdamasi HOXA9 kaip daugybinės mielomos onkogeno vaidmeniu, masyvo pagrindu atlikta lyginamoji genominė hibridizacija nustatė HOXA lokuso židinio amplifikaciją 5% pacientų (papildomas 7 pav.).

Naujų genų rinkinių mutacijų atradimas

Toliau paklausėme, ar be ankstesnių žinių būtų įmanoma atrasti mutacijų praturtinimo kelius. Atitinkamai mes ištyrėme 616 genų rinkinius „MSigDB Canonical Pathways“ duomenų bazėje. Vienas aukščiausio rango genų rinkinys sulaukė ypatingo susidomėjimo, nes jis nebuvo susijęs su genais, kurie, kaip žinoma, svarbūs sergant išsėtine mieloma. Šis genų rinkinys koduoja baltymus, dalyvaujančius fibrino krešulio susidaryme kraujo krešėjimo kaskadoje. Buvo 5 mutacijos 5 iš 38 pacientų (16%, q = 0, 0054), koduojančios 5 baltymus (8 papildoma lentelė). RT – PGR analizė patvirtino 4 iš 5 krešėjimo faktorių raišką daugybinės mielomos ląstelių linijose (papildomas 8 pav.). Krešėjimo kaskadoje yra keletas tarpląstelinių proteazių ir jų substratų bei reguliatorių, tačiau jų vaidmuo sergant išsėtine mieloma nebuvo įtariamas. Tačiau nustatyta, kad trombinas ir fibrinas veikia kaip mitogenai kitų tipų ląstelėse 42 ir yra susiję su metastaze 43 . Šie pastebėjimai rodo, kad krešėjimo faktoriaus mutacijas reikėtų išsamiau ištirti sergant žmogaus vėžiu.

Mutacijos nekoduojančiuose regionuose

Anksčiau nebuvo pranešta apie nekoduojančių genomo dalių analizę sergant vėžiu. Mes sutelkėme dėmesį į nekoduojančius regionus, turinčius didžiausią reguliavimo potencialą. Mes apibrėžėme 2, 4 × 10 6 reguliavimo potencialo regionus (papildomas 9 pav.), Vidutiniškai sudarant 280 bazinių porų (bp). Tuomet šiuos regionus traktavome taip, lyg jie būtų baltymus koduojantys genai, atlikdami tą pačią permutacijos analizę, kuri buvo naudojama egzoniniams regionams.

Mes nustatėme kelis nekoduojančius regionus, turinčius aukštą mutacijų dažnį, kurie suskirstyti į dvi klases (2 lentelė ir 9 papildoma lentelė). Pirmasis atitinka žinomos somatinės hipermutacijos sritis. Jos turi 1000 kartų didesnį nei tikėtasi mutacijų dažnį, kaip buvo tikimasi B-lytinių ląstelių po gemalo (9 papildoma lentelė). Šie regionai apima imunoglobuliną koduojančius genus ir limfoidinio onkogeno BCL6 5 ′ UTR, kaip pranešta 44 . Įdomu tai, kad penkiuose pacientuose taip pat aptikome anksčiau neatpažintų mutacijų tarpgeniškame regione, apimančiame BCL6 , ir tai rodo, kad somatinė hipermutacija tikriausiai vyksta regionuose, esančiuose už 5 ′ UTR ir pirmojo BCL6 introno (2 lentelė). Ar šios nekoduojančios BCL6 mutacijos prisideda prie daugybinės mielomos patogenezės, dar reikia išsiaiškinti .

Pilno dydžio lentelė

Antrąją klasę sudarė 18 nekoduojančių regionų, kurių mutacijų dažnis viršijo tai, ko tikimasi atsitiktinai ( q <0, 25) (2 lentelė ir 10 papildoma lentelė). Keturiuose iš 18 regionų atsirado genai, kuriuose taip pat buvo koduojamos mutacijos. Įdomu tai, kad 5 iš 23 pacientų (22 proc.), Nekoduojančių BCL7A , tariamo naviko slopintuvo geno, aptikto B ląstelių piktybinėje Burkitt 45 limfomoje ir kuris taip pat ištrinamas arba hipermetilinamas odos T- ląstelių limfomos 46, 47 . BCL7A funkcija nežinoma, o jo nekoduojančių mutacijų poveikis išsėtinei mielomai dar nėra nustatytas.

Preliminari nekoduojančių mutacijų analizė rodo, kad neegzoniškos genomo dalys gali būti anksčiau neišnaudotas įžvalgos apie vėžio patogenezę šaltinis.

Diskusija

Išanalizavus daugybinės mielomos genomus, paaiškėja, kad mechanizmai, kurie, kaip įtariama, turėjo reikšmės išsėtinės mielomos biologijoje (pavyzdžiui, NF-κB aktyvacija ir HMT disfunkcija), gali atlikti įvairius vaidmenis dėl mutacijų keliuose šių kelių dalyse. Be to, siūlomi galimi nauji transformacijos mechanizmai, įskaitant RNR egzonukleazės DIS3 ir kitų genų, dalyvaujančių baltymų transliacijoje ir homeostazėje, mutacijas. Reikia nustatyti, ar šios mutacijos būdingos tik išsėtinei mielomai, ar būdingos kitiems vėžiams. Be to, buvo pastebėtos dažnos onkogeninės kinazės BRAF mutacijos - toks išvada turi tiesioginį klinikinį poveikį.

Svarbu tai, kad didžioji dalis šių atradimų negalėjo būti atliekama sekosuojant tik vieną daugybinės mielomos genomą - dėl sudėtingų kelio disreguliavimo būdų reikėjo išanalizuoti kelis genomus. Viso egzomo sekos nustatymas atskleidė didžiąją dalį reikšmingai mutavusių genų. Tačiau atkreipiame dėmesį, kad pusė visų baltymus koduojančių mutacijų įvyko per chromosomų aberacijas, tokias kaip translokacijos, kurių dauguma nebūtų buvę aptinkama sekos nustatant vien egzomą. Panašiai būtų buvę praleista pasikartojančių taškų mutacija nekoduojančiuose regionuose, kai sekos būtų nukreiptos tik į koduojančius egzonus.

Čia aprašyta analizė yra preliminari. Norint nustatyti galutinį ligos genominį kraštovaizdį ir tiksliai įvertinti ligos mutacijų dažnį, reikės papildomų papilomos mielomos genomų. Čia aprašytus sekos duomenis bus galima rasti iš dbGaP saugyklos (//www.ncbi.nlm.nih.gov/gap), o duomenims palaikyti sukūrėme daugybinės mielomos genomikos portalą (//www.broadinstitute.org/mmgp). analizė ir vizualizacija.

Metodų santrauka

Remiantis Helsinkio deklaracija buvo gautas informuotas daugybine mieloma sergančių pacientų sutikimas. DNR buvo išgauta iš kaulų čiulpų aspirato (naviko) ir kraujo (normalaus). WGS bibliotekos (370–410 bp intarpai) ir WES bibliotekos (200–350 bp intarpai) buvo sukonstruotos ir sukomponuotos į iliuminatorių GA-II sekavimo įrenginį, naudojant atitinkamai 101 ir 76 bp porinius galus. Sekvencijos buvo apdorotos „Firehose“ vamzdynu, identifikuojant somatinių taškų mutacijas, indelius ir kitus struktūrinius chromosomų pertvarkymus. Po to buvo atlikta rankinė struktūrinių pertvarkymų, turinčių įtakos baltymus koduojančioms sritims, pašalinimas iš suderinimo artefaktų. Tikrosios teigiamos mutacijos dažnis buvo įvertintas atlikus atsitiktinai parinktų mutacijų Sequenom masės spektrometrijos genotipą. HOXA9 trumpų plaukų segtukų (sh) RNR buvo įvestos į daugybinės mielomos ląstelių linijas, naudojant lentivirusinę infekciją, standartiniais metodais.

Pilnas medžiagų ir metodų aprašymas pateiktas papildomoje informacijoje.

Prisijungimai

Pirminės prieigos

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE26760
  • GSE26849
  • GSE26863

Duomenų indėliai

Sekos duomenys buvo deponuoti „dbGaP“ saugykloje (//www.ncbi.nlm.nih.gov/gap), prisijungimo numeriu phs000348.v1.p1. Papildomi duomenys buvo pateikti „Gene Expression Omnibus“ (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) registracijos numeriais GSE26760 (GEP duomenys) ir GSE26849 (aCGH duomenys); abu duomenų rinkiniai taip pat derinami pagal prisijungimo kodą GSE26863. Taip pat sukūrėme daugybinės mielomos genomikos portalą (//www.broadinstitute.org/mmgp), skirtą palaikyti duomenų analizę ir vizualizaciją.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Byloje yra papildomi 1–14 paveikslai su legendomis, papildomais metodais ir 1–16 lentelėmis.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.