Il1rapl1 geno įterpimas į distrofino geno dubliavimo jungtį | žmogaus genetikos žurnalas

Il1rapl1 geno įterpimas į distrofino geno dubliavimo jungtį | žmogaus genetikos žurnalas

Anonim

Anotacija

Vieno ar kelių distrofininio geno egzempliorių dubliavimosi atvejai yra antra dažniausia distrofinopatijų mutacija. Nors siūloma, kad dubliavimosi atvejai būtų sudėtingesni, nei manyta anksčiau, jie buvo laikomi intrageniniu įvykiu. Čia mes pranešame apie IL1RAPL1 (interleukino-1 receptoriaus, papildančio baltymą, pavyzdžiui, 1) geno dalies įdėjimą į dubliavimo jungties vietą. Ištyrus distrofino mRNR, tiriant tikrąją egzono jungtį, atliekant 15 distrofino geno dubliavimosi mutacijų, buvo nustatyta, kad vienam pacientui nežinomas 621 bp įterpimas egzonų kopijavimo sankryžoje nuo 56 iki 62. Netikėtai rasta įterpta seka. visiškai identiškos IL1RAPL1 geno 3–5 egzonų sekoms, kurios yra beveik 100 kb atstumu nuo distrofino geno. Atitinkamai buvo patvirtintas IL1RAPL1 3–5 egzonų įterpimas tarp distrofino 62 ir 56 egzotonų genomo sekos lygiu. Viena jungtis tarp IL1RAPL1 5 introno ir distrofino 55 introno buvo nustatyta Alu seka. Šie rezultatai parodė, kad IL1RAPL1 geno fragmentas buvo įterptas į distrofino geno dubliavimo jungtį ta pačia kryptimi kaip distrofino genas. Tai rodo naują galimybę kartu patirti sudėtingus genominius persitvarkymus distrofinopatijoje.

Įvadas

Duchenne ir Becker raumenų distrofijos (DMD / BMD) yra dažniausiai paveldimos raumenų ligos, kurias sukelia distrofino geno mutacijos. Šis genas susideda iš 79 egzonų ir yra antras pagal dydį žmogaus genas, kurio Xp21.2 talpa viršija 2, 5 Mb. Jis apibūdinamas daugybe didelių intronų ir mažiausiai aštuoniais alternatyviais promotoriais / pirmaisiais egzonais, išsibarsčiusiais tarp intronų. 1, 2 dubliavimosi, kuriuose yra vienas ar daugiau distrofino geno egzonų, yra antras pagal dažnumą žmonėms mutacija, sudaranti maždaug 5–10% distrofinopatija sergančių pacientų, o delecijos užima beveik 60% 3, 4, 5 mutacijų. tikslus dubliuotų egzonų organizavimas daugeliu atvejų nėra ištirtas, manoma, kad tokius dubliuotus pertvarkymus sudaro paprastas tandemo dubliavimasis nuo galvos iki uodegos distrofino gene. Ši hipotezė buvo priimta siekiant paaiškinti DMD arba BMD fenotipus remiantis plačiai priimta skaitymo rėmo taisykle. 6

Tačiau pranešta apie vieną dubliavimą, kuris nėra kartu, 5 teigdamas, kad aukščiau pateikta hipotezė ne visada yra teisinga. Be to, buvo nustatyta, kad dubliuoti egzonai egzistuoja atskiruose distrofino geno regionuose. 5, 7 Neseniai, analizuojant distrofino mRNR, buvo nustatyta, kad du atskiri dubliuoti distrofino egzonai susideda iš dviejų tandemų nuo galvos iki uodegos dubliavimų. Šie pastebėjimai rodo, kad dubliavimosi mutacijos kartais būna sudėtingos. Iki šiol visos dubliavimosi atvejai buvo pranešti apie intrageninius įvykius.

IL1RAPL1 (į interleukino-1 receptorių priedą panašus baltymas-1) genas, atsakingas už su X susijusį protinį atsilikimą, Xp22.1 yra 1, 36 Mb, beveik 100 kb atstumu nuo distrofino geno. Buvo nustatyta, kad tiek distrofino, tiek IL1RAPL1 genai yra identiškoje bendroje trapioje vietoje (FRAXC). 10 Vis dėlto mažai dėmesio buvo skiriama IL1RAPL1 geno mutacijai distrofinopatijoje, net jei beveik trečdaliui DMD sergančių pacientų stebimas protinis atsilikimas. Buvo pranešta apie šių dviejų genų mutacijų kartu su gretimų genų delecijos sindromu, kuriam įtakos turi tiek distrofino, tiek IL1RAPL1 genai, deleciją, kuri prasideda ir baigiasi šiuose genuose 11, 12, 13, todėl manoma, kad nežinomas mechanizmas vienu metu mutavo šiuos du atskirtus genus. Neseniai buvo pasiūlytas šakės sustojimo ir šablono perjungimo mechanizmas (FoSTeS) kaip naujas dviejų mutacijų mutacijos mechanizmas. 14, 15, 16 Tačiau, kaip mes žinome, FoSTeS nenustatė jokios distrofino geno mutacijos.

Čia mes pranešame apie anksčiau neapibūdintą distrofino geno dubliavimąsi, kurį apsunkina įdėjus dubliuotą IL1RAPL1 geno dalį į distrofino dubliavimo vietą. Šis sudėtingas pertvarkymas iškelia naują galimybę, kad net distrofinopatijoje yra dviejų genų mutacijų.

Rezultatai

Atlikus 15 distrofino geno dubliavimų, faktinės egzono jungtys buvo atskleistos atliekant atvirkštinės transkripcijos-PGR produkto seką, apimančią jungties sritį, ir visos, išskyrus vieną, parodė jungčių sekas, suderinamas su genomo rezultatais (duomenys nepateikti). Pacientui, sergančiam indeksu, distrofino geno daugialypės ligacijos priklausomos zondo amplifikacijos analizė parodė dvigubai didesnį produktų kiekį 7 egzonams, kuriuos sudaro 56–62 egzonai, o kiti egzonai išliko normalūs (duomenys nepateikti). Remiantis įprastu supratimu apie daugialypės jungties priklausomą zondo amplifikacijos analizę, buvo manoma, kad 56–62 egzonai gali būti dubliuojami nuo galvos iki uodegos, o 7 dubliuoti egzonai yra įterpti tarp 62 ir 63 egzonų paciento distrofine. mRNR. Taikant šią prielaidą transliaciniam skaitymo rėmui, įterpto 56 egzono sekoje atsirado priešlaikinis sustabdymo kodonas. Todėl paciento genotipas atitiko sunkų DMD fenotipą.

Norėdami nustatyti dubliuotų sričių orientaciją ir vietą, ištirta distrofino mRNR egzono struktūra. Fragmentas, apimantis jungtį tarp 62 ir 56 egzonų, buvo atvirkštinės transkripcijos PGR amplifikuotas, naudojant atitinkamai pradmenų porą, priekinį ir atvirkštinį pradmenis, skirtus 61 egzonui, ir papildomus 59 egzonu (1 lentelė). Dėl to amplifikacijos produktas buvo gautas iš paciento skeleto raumenų RNR, bet ne iš normalaus kontrolinio asmens (1 paveikslas). Netikėtai produkto dydis (1287 bp) buvo didesnis nei tikėtasi - 666 bp. Tiesioginis produkto seka nustatė naują transkriptą: 61 ir 62 egzonų sekos buvo seka nežinoma 621 bp ilgio seka, po kurios atsirado 56, 57, 58 ir 59 egzonų sekos (1 paveikslas). Abi distrofino egzonų sekos ir sankryžos buvo nepažeistos. Remdamiesi distrofino mRNR nustatytų egzonų tvarka, padarėme išvadą, kad 56–62 egzonai buvo tandemas nuo galvos iki uodegos, paliekant 621 bp intarpą nenustatytą.

Image

Distrofino 62 ir 56 egzonų dubliavimo jungties tyrimas. A ) Numatomo distrofino transkripto tiriamojo regiono scheminis aprašymas. Dėžutės žymi egzonus, o skaičiai dėžutės viduje nurodo egzono skaičių. Kopijuoti egzonai (56–62 egzonai) yra pažymėti šešėliais. Horizontalios rodyklės rodo pradmenų, kurie buvo naudojami atvirkštinės transkripcijos (RT) -PCR amplifikacijai, vietas ir kryptis. b ) RT-PGR amplifikuotas produktas. Parodytas RT-PGR produktas, apimantis distrofino 61–59 egzonus. Produktas (1287 bp) buvo gautas iš indekso paciento (dešinėje), tačiau produkto dydis buvo didesnis nei tikėtasi 666 bp. Tačiau iš kontrolinės (kairėje) amplifikuoto produkto nepavyko gauti. Dešinėje pusėje pavaizduotas sustiprinto fragmento egzono organizacijos scheminis vaizdas. Tarp distrofino 62 ir 56 egzonų (viršutiniai) yra nežinomas 621 bp intarpas; buvo nustatyta, kad nežinoma seka susideda iš IL1RAPL1 3–5 (žemesnių) egzonų. c ) Jungčių tarp distrofino egzonų ir įterpto fragmento seka. Parodyta amplifikuoto produkto sekos dalis. 3-ojo galinio egzono 62 seka (CAA) sujungta su nežinomos sekos (CCG) 5 ′ galu, o nežinomos sekos 3 ′ galas (CAG) - tada sujungta su 56 egzono sekos 5 ′ galu. (GAC). Pabraukta parodo sustabdymo kodoną (TGA).

Visas dydis

Atlikus 621 bp sekos BLAST paiešką, paaiškėjo, kad seka buvo visiškai identiška IL1RAPL1 geno cDNR sekos daliai („GenBank NM_014271“ bazės 713–1333 bazės). Buvo nustatyta, kad įterpta 621 bp seka susideda iš IL1RAPL1 geno 3, 4 ir 5 egzonų ir buvo įterpta ta pačia kryptimi kaip distrofino egzonai (1 paveikslas). Šie rezultatai parodė, kad indeksuotam pacientui buvo gautas naujas chimerinis distrofino- IL1RAPL1- distrofino nuorašas, kurį sudaro distrofino 1–62 egzonai, IL1RAPL1 3–5 egzotrai ir 56–79 distrofino egzonai. Šis stenograma užkodavo TGA sustabdymo kodoną penktame kodone įterptoje sekoje, atitinkantį sunkų DMD fenotipą (1 paveikslas).

Paciento IL1RAPL1 mRNR buvo ištirta fragmento, apimančio IL1RAPL1 geno 1–9 egzempliorius , atvirkštinės transkripcijos-PGR amplifikacija. Keista, bet po šio amplifikavimo buvo gautas produktas, kurio laukiamas dydis (1289 bp) ir visiškai normali seka, įskaitant 3–5 egzonus (2a pav.). Todėl mes padarėme išvadą, kad IL1RAPL1 genas buvo nepažeistas paciento genome.

Image

IL1RAPL1 geno analizė. a ) IL1RAPL1 nuorašo atvirkštinės transkripcijos (RT) -PCR amplifikacija. Parodyti RT-PGR produktai, apimantys 1–9 IL1RAPL1 egzonus . Pacientui, kuriam taikoma rodyklė, ir kontroliniam (kairysis skydelis) buvo nustatytas vienas skaidrus to paties dydžio produktas (1289 bp). Išplėsto produkto egzono sudėtis aprašyta schematiškai dešinėje. Horizontalios rodyklės rodo pradmenų, kurie buvo naudojami RT-PGR amplifikacijai, vietas ir kryptis. b ) IL1RAPL1 egzonų kiekybinis įvertinimas . Parodyti PGR produktų kapiliarų elektroforezės modeliai. Šeši genomo regionai, sutelkti vienoje PGR reakcijoje, buvo atskirti naudojant kapiliarinę elektroforezę. Skaičiai virš smailių rodo IL1RAPL1 2, 3, 4, 5 ir 6 egzzonus ir distrofino geno 22 egzzonus . 3, 4 ir 5 egzonų smailės sritis pacientui yra beveik dvigubai didesnė, tačiau 2 ir 6 egzonams normali (dešinėje). Apverstas trikampis ir IS nurodo atitinkamai 15 ir 1500 bp žymenis.

Visas dydis

Remiantis aukščiau pateiktais duomenimis, mes manėme , kad paciento genome buvo papildoma IL1RAPL1 geno 3–5 egzonų kopija. Todėl mes ištyrėme IL1RAPL1 geno egzonų egzempliorių skaičių pusiau kiekybine PGR. Iš IL1RAPL1 geno 3, 4 ir 5 egzonų amplifikuotų produktų kiekis buvo beveik dvigubai didesnis nei kontrolinės, bet toks pat ir 2 ir 6 egzonams - tai rodo dvi IL1RAPL1 geno 3–5 egzempliorių kopijas paciento genome ( 2b paveikslas). Kartu su aukščiau pateiktais rezultatais mes padarėme išvadą, kad distrofino genas įsigijo papildomą IL1RAPL1 geno kopiją tarp 62 ir 56 egzonų ta pačia kryptimi kaip distrofino genas.

Siekiant patvirtinti IL1RAPL1 geno įterpimą į distrofino geną genomo lygiu, buvo ištirti įterpimo taškai. Iš pradžių, jungiant distrofino introną 62 ir IL1RAPL1 2- ąjį introną, buvo susiaurinta pakartojant pusiau kiekybinius introninių sričių PGR amplifikacijas (papildoma informacija). Galiausiai, mes bandėme PGR amplifikuoti jungimosi fragmentą tarp distrofino introno 62 ir IL1RAPL1 2 introno. Nors pradmenų surišimo vietos būtų per toli, kad amplifikacija vyktų kontrolėje, pradmenys turėjo būti pakankamai arti, kad amplifikacija vyktų. pacientas (3 pav.). Iš paciento buvo gautas vienas 995 bp produktas. Kaip ir tikėtasi, produkto sekos nustatymas atskleidė jungimo seką tarp distrofinino 62 introno ir IL1RAPL1 2 introno; daugybinis sekos derinimas parodė, kad 62 introno seka baigėsi ties 29066747 („GenBank NT_011757“) ir prisijungė prie IL1RAPL1 geno 2 introno nt 26840485 („GenBank NT_011757“) (3 paveikslas). Tai parodė, kad distrofino 62 intronas buvo sutrumpintas iki 56, 7 kb nuo 62, 6 kb, o IL1RAPL1 2 intronas - iki 242, 3 kb nuo 251, 3 kb.

Image

Jungtis tarp distrofinino 62 introno ir IL1RAPL1 2 introno. Normalios distrofinino 62 introno ir IL1RAPL1 2 introno sekos yra išlygintos atitinkamai 5 ′ - 3 ′ (kairėn į dešinę) viršuje ir apačioje. Viduryje parodyta sankryžų seka. Vertikalios linijos žymi nukleotidų atitiktis. Tarpai žymimi brūkšneliais, o sankryžoje įterptas nukleotidas yra paryškintas. Vertikalios rodyklių galvutės nurodo nukleotidų skaičių X-chromosomoje („GenBank NT_011757“). Nebuvo rasta reikšmingos sekos homologijos aplink lūžio tašką. 1-ojo G-distrofino egzonas 62-ajame distrofino introne yra dėžutėje. „GC“ dėžutė yra pabraukta.

Visas dydis

Pažymėtina, kad šioje intronų sankryžoje buvo rastas vienas C-nukleotidas, neatitinkantis nė vienos intronų sekos (3 pav.). Nors intronų sekos šalia sankryžos buvo toliau tiriamos, nebuvo nustatyta nei reikšmingos sekos homologijos tarp dviejų intronų, nei specifinių struktūrų, tokių kaip topoizomerazės sutarimo skilimo vieta. Šios savybės parodė, kad persitvarkymą lėmė nehomologinė rekombinacija. Įspūdinga, kad buvo nustatyta, kad 62 introno lūžio taškas iš tikrųjų buvo pirmajame G-distrofino, distrofino izoformos, perrašytos iš alternatyvių promotorių, egzone. Tokiu būdu 194 bp ilgio pirmasis egzonas buvo suardytas 40-ajame nukleotide (3 paveikslas). Be to, iš 62 introno buvo ištrinta 15 bazių (5′-CGGAGCCCGACACGG-3 ′) (pvz., 29066825 iki 29066810), 65 bp prieš sankryžą. Vietoje to, šioje delecijos vietoje buvo įterptas vienas T-nukleotidas. 15 bp delecija pašalino 10 bp vienos GC dėžutės 3 'dalies, sudarančios G-distrofino promotoriaus sritį (3 paveikslas).

Buvo amplifikuoti regionai, apimantys distrofinino 62 introno ir IL1RAPL1 2 introno sankryžas. Iš kiekvieno atvejo, taip pat iš įprastos kontrolės buvo gautas vienas PGR amplifikuotas produktas, būdingas kiekvienam regionui. Produktų seka atskleidė visiškai nepažeistas sekas, rodančias, kad nėra genomo pokyčių, darančių įtaką pertvarkymui. 15-bp delecija, atpažinta prieš rekombinacijos vietą 62-ajame introne, buvo tik jungties vietoje, o ne nekombinuotoje introne. Todėl delecija atrodė kaip papildomas genomo pertvarkymas, apsunkinantis dubliavimo mutaciją. Tiesą sakant, šiam pacientui, kaip ir kontrolei, buvo nustatytas G distrofino nuorašas su normaliu egzono kiekiu, rodantis nepažeistą introną 62 (duomenys nepateikti).

Kadangi viena sankryža buvo aiškiai atskleista, mes manėme, kad turėtų būti jungtis tarp IL1RAPL1 5- ojo introno ir distrofino-55- ojo introno. Taikant tą pačią strategiją, kaip aprašyta aukščiau (papildoma informacija), sankryžos fragmentas buvo klonuotas. Galiausiai jungties fragmentas buvo PGR amplifikuotas, naudojant pradmenis ant IL1RAPL1 5 introno ir distrofino 55 introno, ir gautas vienas amplifikuotas produktas (4 paveikslas). Šio produkto sekos parodė rekombinacijos vietą tarp IL1RAPL1 ir distrofino genų; daugybinės sekos derinimas atskleidė, kad IL1RAPL1 5- ojo introno seka baigėsi nt 27199486 (GenBank NT_011757) ir prisijungė prie nt distrofino 55 introno sekos nt 29310447 (GenBank NT_011757) (4 paveikslas). Tarp šių dviejų vietų 10 nukleotidų liko neskirstyti į kategorijas bet kurioje sekoje dėl nukleotidų neatitikimo. Todėl tikslaus sankryžos lūžio taško nepavyko nustatyti. Pažymėtina, kad sankryža buvo Alu pasikartojančiame elemente abiejuose vidiniuose elementuose; Alu Sg elementas IL1RAPL1 geno 5 introne ir Alu Y elementas distrofino geno 55 introne (4 paveikslas). Šie du Alu elementai savo sekomis skyrėsi vienas nuo kito 17, 7%. Mes nusprendėme, kad ši sankryža atsirado dėl homologinės rekombinacijos tarp dviejų Alu pakartotinių sekų. Norėdami pamatyti bet kokius genomo pokyčius nepažeistų intronų sankryžose, regionai, apimantys jungties vietą ant IL1RAPL1 5- ojo introno ir distrofinino-55- ojo introno, buvo PGR amplifikuoti iš paciento genominės DNR. Amplifikuotų produktų sekos buvo visiškai normalios aplink dviejų intronų sankryžą.

Image

Jungtis tarp IL1RAPL1 5-ojo intro ir distrofino 55- ojo introno. Normalios IL1RAPL1 5- ojo introno ir 55- ojo distrofino-introno sekos parodytos atitinkamai antroje viršutinėje ir antrojoje apatinėse eilutėse. Viduryje parodyta seka tarp intarpų jungties tarp IL1RAPL1 5- ojo introno ir distrofino-55- ojo introno. Alu Sg ir Alu Y Alu sutarimo sekos parodytos atitinkamai viršutinėje ir apatinėje eilutėse. Vertikalios linijos žymi nukleotidų atitiktis. Tarpai nurodomi brūkšneliais. Prieš pasireiškiant nesutapimui, IL1RAPL1 5 intronas ir 62 distrofino intronas yra visiškai identiški jungčių sekoms. Tačiau 10 bp, įskaitant du neatitikimus, nerandami nė vienoje iš sekų. Vertikalios rodyklių galvutės rodo persitvarkymo vietą su skaičiais X-chromosomoje („GenBank NT_011757“).

Visas dydis

Šie rezultatai aiškiai parodė, kad dalis IL1RAPL1 geno buvo įterpta distrofino geno dvigubos mutacijos sandūroje ta pačia kryptimi kaip ir distrofino genas. Apskaičiuota, kad distrofino geno dubliavimosi dydis yra 243, 7 kb. Apskaičiuota, kad įterpto IL1RAPL1 geno fragmentas yra beveik 359, 0 kb. Nustatyta, kad tiek paciento motina, tiek motinos močiutė turi šias dvi sankryžas savo genome, atlikdamos jungties fragmento PGR amplifikaciją (duomenys nepateikti), rodo, kad sudėtingas dubliavimasis buvo stabiliai paveldėtas. Iš viso 30 normalių moterų kontrolinių bandymų buvo neigiami kiekvienoje sankryžoje, tai rodo, kad nė viena pertvarkymo dalis nėra polimorfinė.

Kopijų egzempliorių tyrimas

Kai nustatėme papildomą trijų IL1RAPL1 geno egzonų kopiją (2 paveikslas), mes ieškojome sekos skirtumų tarp papildomos kopijos ir laukinio tipo. Regionas, apimantis tris egzonus, buvo amplifikuotas PGR ir tiesiogiai seka. Sekos buvo visiškai normalios ir heterozigotiškumas nerastas (duomenys neparodyti). Be to, buvo analizuojami visi dubliuoti egzonai ir polimorfiniai žymenys distrofino geno 59 ir 62 induose. Jų seka taip pat buvo visiškai normali ir heterozigotumo nebuvo nustatyta (duomenys nepateikti). Šie sekos nustatymo rezultatai aiškiai leido manyti, kad dubliuoti fragmentai buvo gauti iš to paties genomo šaltinio.

Apibendrinant, mes nustatėme sudėtingiausią distrofino dubliacijos mutaciją, apie kurią dar pranešta, kurią sudaro dubliavimo / intarpo mutacija. Rekombinacijos įvykis susideda iš dviejų skirtingų nehomologinės ir Alu medijuotos rekombinacijos mechanizmų ir buvo gautas chimerinis stenograma.

Diskusija

Pateikiame naują sudėtingą distrofino geno persitvarkymą, aptiktą analizuojant distrofino nuorašą. Mes nustatėme chimerinį distrofino- IL1RAPL1- distrofino nuorašą su IL1RAPL1 3–5 egzonais, įterptais tarp distrofino 62 ir 56 egzonų. Šį genomo lygio pertvarkymą galima apytiksliai apibendrinti kaip distrofino geno 56–62 egzonų, kuriuos lydėjo IL1RAPL1 geno 3–5 egzonų įterpimas. Viename tyrime su distrofino geno dubliavimais pranešta, kad viena iš 118 dubliavimų yra sudėtinga, apsunkinanti egzono ištrynimą. 5 Kiek mes žinome, mūsų atvejis yra antrasis sudėtingo distrofino geno dubliavimo pavyzdys, tačiau pats sudėtingiausias. Visų pirma, visos dubliavimosi atvejai buvo pranešti apie intrageninius įvykius. 5, 8, 26 Tai buvo pirmasis tyrimas, parodantis kitų genetinių elementų pasiryžimą sukelti distrofino geno dubliavimąsi. Nors dviem atvejais (Leideno raumenų distrofijos puslapiai, www.dmd.nl) buvo pranešta apie tapačius distrofino 56–62 egzonų dubliavimus, jų mRNR analizė nebuvo atlikta. Reikia išsiaiškinti, ar sudėtingas dubliavimasis yra išskirtinis įvykis.

Nors dubliavimosi atvejai yra antra dažniausia distrofino geno mutacija, dubliavimo jungties seka retai buvo išaiškinta genomo DNR lygiu. 5, 27 Šiuo atveju maža delecija ir keli nukleotidų pokyčiai apsunkina didelį įterpimo įvykį (3 ir 4 pav.). Manoma, kad introno 62 seka ar struktūra gali būti pažeidžiama sudėtingų pertvarkymų. 5 Atsižvelgiant į tai, kad 62 intronuose yra alternatyvus G-distrofino promotorius, šį introną turėtų lengvai pasiekti transkripcijos veiksniai (3 paveikslas). Galima įsivaizduoti, kad nežinomos struktūrinės savybės skatina sudėtingą šio introno pertvarkymą.

Stebėtina, kad į dubliavimo jungtį buvo rastas 359, 0 kb IL1RAP1 geno fragmentas, esantis 100 kb atstumu nuo distrofino geno (5 paveikslas). Buvo pateiktas didelio fragmento perkėlimo iš tolimos vietos į rekombinacijos vietą pavyzdys, susijęs su krešėjimo faktoriaus F8 genu, esančiu Xq28 chromosomoje, ir parodyta, kad 263 kb dubliuotas regionas atsirado 5, 2 Mb, išskyrus įterptą vietą. 28 Tai rodo, kad didelio genomo fragmento įterpimas į tolimą regioną gali būti ligos priežastis.

Image

Scheminis genomo pertvarkymo aprašymas pacientui, kuriam taikoma rodyklė. Distrofino ir IL1RAPL1 genai, susiję su šiuo pertvarkymu, aprašyti schematiškai. Šiuos du genus trumpąja X chromosomos ranka (viršutine dalimi) skiria beveik 100 kb. Distrofino genas transkriptuojamas iš centromero (cen) į telomerą (tel), tuo tarpu IL1RAPL1 genas transkriptuojamas priešinga kryptimi. 243, 7 kb fragmentas, apimantis distrofino 56–62 egzonus, yra dubliuojamas, o rekombinacijos vietoje įterpiamas dar vienas 359, 0 kb ilgio regionas, apimantis IL1RAPL1 geno 3–5 egzonus (apačia). Tarp distrofino introno 62 ir IL1RAPL1 intro 2 bei tarp IL1RAPL1 intro 5 ir distrofino introno 55 pertvarkymai vyksta atitinkamai per nehomologinę ir Alu meditaciją. Pertvarkymą iliustruoja numatoma jo tvarka ir kilmė (vidurys). Paryškintos horizontalios rodyklės rodo distrofino ir IL1RAPL1 genus ir jų transkripcijos kryptį. Pakartotinis regionas pažymėtas punktyrinėmis linijomis. Atviros, užtemdytos ir punktyrinės dėžutės rodo atitinkamai distrofino 56–62, IL1RAPL1 3–5 ir alternatyvų G-distrofino promotorių / pirmąjį egzoną (G1). Skaičiai virš juostų nurodo atitinkamų genų egzono numerį. Ovalai žymi Alu pakartojimo sekas ( Alu ). Skliausteliuose nurodomas regionų dydis. Dydis nėra masto. Vertikalios rodyklės žymi sankryžas.

Visas dydis

Atsižvelgiant į tai, kad tiek distrofino, tiek IL1RAPL1 genai yra toje pačioje bendroje trapioje vietoje (FRAXC) 10, pagrįsta atsižvelgti į šių dviejų genų 11, 12, 13 mutacijų kartu pasireiškimą. Tačiau chimerinio distrofinino - IL1RAPL1 nuorašo gamyba - buvo parodytas vienam DMD sergančiam pacientui, kurio delecija sudarė maždaug 1, 6 Mb iš IL1RAPL1 geno į distrofino geną. 12 Mūsų atvejis yra antras, parodantis chimerinio distrofino- IL1RAPL1 nuorašo gamybą (1 paveikslas). Pažymėtina, kad abu chimerinį distrofin- IL1RAPL1 nuorašą sukeliantys pertvarkymai įvyko IL1RAPL1 5 introno, esančio tik 50 kb atstumu, srityje.

Įrodyta, kad rekombinacijos mechanizmai, tokie kaip neallelinė homologinė rekombinacija ir nehomologinis galo sujungimas, yra pertvarkymai, sukeliantys genominius sutrikimus, 16, 29, buvusieji sudaro daugumą. Buvo manoma, kad distrofino geno dubliavimus pirmiausia sukelia nevienodas sesers ir chromatidų mainai. 30, 31 Tačiau kaip dubliavimosi priežastis buvo siūloma sintezei priklausanti nehomologinė galo jungtis, sukelianti tandeminį dubliavimąsi dvigubų stygų lūžio vietoje. 5 Didelės tandemo kopijos yra gerai žinomos žmogaus genetinės ligos priežastys. 32 Ypač Pelizaeuso – Merzbacherio ligos, turinčios su X susijusį dismylininizuojantį sutrikimą, atveju dažniausiai pasitaikančios dozėms jautraus PLP1 geno pakartotinis pakartojimas. Neseniai buvo pasiūlyta, kad sudėtingos proteolipidinio baltymo 1 ( PLP1 ) geno dubliavimosi priežastys yra replikacija paremtas liaudies sustojimo ir šablonų perjungimo (FoSTeS) mechanizmas, nes šiuos dubliavimus galima paaiškinti nei nealoniška homologine rekombinacija. nei paprastas nehomologinis galas, jungiantis rekombinacijos mechanizmą. 14 Mūsų atveju šią galimybę geriau apsvarstyti kaip pagrindinį sudėtingo genomo pertvarkymo mechanizmą (5 pav.).

Kadangi su X susijusiu protiniu atsilikimu buvo identifikuotos IL1RAPL1 geno mutacijos, 34, 35, 36, mūsų išvados, kad trys IL1RAPL1 geno egzonai buvo perkelti į distrofino geną, rodo, kad dėl jų ištrynimo gali būti susijęs X protinis atsilikimas. Atitinkamai, yra vienas literatūroje aprašytas trijų egzonų trynimo atvejis, sukeliantis protinį atsilikimą. 34 Todėl labai įtariame, kad tuo pat metu vykstančios IL1RAPL1 geno ir distrofino geno mutacijos lemia tiek DMD, tiek protinį atsilikimą. Tolesni tyrimai išaiškins abiejų šių genų mutacijas ir paaiškins, kodėl protinis atsilikimas yra komplikuojantis DMD sergančių pacientų veiksnys.

Papildoma informacija

„Powerpoint“ failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

  2. 2.

    Papildomos lentelės

    Papildoma informacija pridedama prie žurnalo „Žmogaus genetikos svetainė“ (//www.nature.com/jhg) dokumento.