Insulino stimuliacija reguliuoja as160 ir tbc1d1 fosforilinimo vietas žmogaus skeleto raumenyse | mityba ir diabetas

Insulino stimuliacija reguliuoja as160 ir tbc1d1 fosforilinimo vietas žmogaus skeleto raumenyse | mityba ir diabetas

Anonim

Dalykai

  • Insulino signalizacija
  • Nutukimas
  • Skeletinis raumuo
  • 2 tipo diabetas

Anotacija

ĮVADAS:

Asmenys, sergantys nutukimu ir II tipo cukriniu diabetu (T2D), paprastai yra atsparūs insulinui, todėl sutrikusi skeleto raumenų gliukozės koncentracija. Gyvūnų ir ląstelių kultūros eksperimentai parodė, kad Rab-GTPazę aktyvinančių baltymų AS160 ir TBC1D1 specifinis fosforilinimas yra labai svarbus GLUT4 translokacijai, palengvinančiai gliukozės įsisavinimą, tačiau jų reguliavimas žmogaus skeleto raumenyse nėra gerai suprantamas.

METODAI:

Čia liesiems, nutukusiems ir T2D turintiems asmenims buvo atliktas euglikeminis-hiperinsulineminis spaustukas, o prieš ir po 30 ir 180 minučių po insulino infuzijos buvo gautos plaštakų biopsijos.

REZULTATAI:

Nutukę ir T2D tiriamieji turėjo didesnius kūno masės indeksus ir nevalgiusio insulino koncentraciją, o T2D tiriamieji parodė atsparumą insulinui. Remiantis spaustuko išvadomis, T2D tiriamiesiems buvo sutrikdytas insulino stimuliuojamas AS160 Thr 642 fosforilinimas - vieta, anksčiau įrodyta, kad svarbi graužikų gliukozės pasisavinimui. Įdomu tai, kad insulino stimuliuotas fosforilinimas TBC1D1 Thr 590 - vieta, kurią graužikams reguliuoja insulinas - padidėjo tik T2D tiriamiesiems, nors šio skirtumo funkcinė reikšmė nežinoma.

IŠVADA

Šie duomenys rodo, kad insulinas skirtingai reguliuoja AS160 ir TBC1D1 fosforilinimą žmogaus skeleto raumenyse. Sutrikęs insulino stimuliuojamas gliukozės vartojimas T2D tiriamiesiems lydimas AS160 ir TBC1D1 fosforilinimo skeleto raumenyse nereguliacijos, kas rodo, kad šie baltymai gali reguliuoti gliukozės pasisavinimą žmonėms.

Įvadas

Asmenims, sergantiems nutukimu ir II tipo cukriniu diabetu (T2D), sumažėja insulino stimuliuojamos gliukozės įsisavinimas į griaučių raumenis, dėl to sutrinka gliukozės metabolizmas. Gliukozės įsisavinimas raumenyse yra reguliuojamas GLUT4 perkėlimu į plazmos membraną, ir pacientams, kuriems nutukimas ir T2D, ir translokacijos procesas, ir insulino signalo perdavimas, lemiantis GLUT4 translokaciją, yra nepakankami. 1 Dabar yra gerai žinoma, kad insulinas, jungiantis prie jo receptorių, insulino receptorių substrato baltymų ir fospoinositido 3 kinazės baltymų, sukelia fosforilinimą ir Akt aktyvaciją, o Akt2 izoforma daugiausia dalyvauja transportuojant gliukozę. 1 Graužikų skeleto raumenyse Akt fosforilina 160 kDa (AS160 / TBC1D4) 2 ir TBC1D1 (tre-2 / USP6, BUB2, cdc16 domeno šeimos 1 nario) Akt substratą. 3 AS160 ir TBC1D1 yra labai homologiški Rab-GTPazę aktyvuojantys baltymai, skatinantys guanozino-5’-trifosfato hidrolizę į guanozino difosfatą GLUT4 turinčiose pūslelėse. Esant guanozino difosfatui, pūslelėms, kurių sudėtyje yra GLUT4, neleidžiama persikelti į ląstelės paviršių. Pozicija, kad vietai būdingas AS160 ir (arba) TBC1D1 fosforilinimas Akt ar kitomis kinazėmis moduliuoja Rab-GTPazę suaktyvinančio baltymo aktyvumą, atpalaiduodamas GLUT4 pūsleles, ir šių vietų reguliavimas yra būtinas norint kontroliuoti gliukozės įsisavinimą. 4 Graužikų skeleto raumenyse insulinas fosforilina AS160 pagal daugelį fosfo-Akt substrato (PAS) motyvų, 2, 3, 5 ir mutaciją keturiose reguliuojančiose AS160 PAS vietose, apsunkina insulino stimuliuojamo griaučių raumenų įsisavinimą. Žmogaus skeleto raumenyse T2D mažina AS160 PAS fosforilinimą 6, tačiau jis didėja, kai netenkama svorio 7, o mankšta sukelia vietos specifinį AS160 fosforilinimą. 8 Kritinė AS160 „Akt“ sutarimo vieta yra „Thr 642“, 14–3–3 baltymus jungianti vieta, reguliuojanti GLUT4 apyvartą ir jautrumą insulinui graužikų skeleto raumenyse. 9 5 'AMP suaktyvintos baltymų kinazės sutarimo vieta AS160 Ser 711 yra labai kontroliuojama insulino ir 5' AMP suaktyvintos baltymų kinazės. Tačiau fiziologinis insulino sukeltos AS160 Ser 711 fosforilinimo svarba ir tai, ar insulinui atsparūs asmenys turi AS160 Ser 711 fosforilinimo pokyčių, nėra žinomi. 10 Čia mes įvertinome, ar nutukę ir T2D sergantys asmenys šiose dviejose skeleto raumenų vietose turi sutrikusią insulino stimuliuojamą fosforilinimą.

TBC1D1 pirmą kartą buvo identifikuotas adipocituose kultūroje 11, tačiau yra labai ekspresuojamas griaučių raumenyse, o riebalų audinyje jis būna minimaliai ekspresuojamas. 3 Insulinas padidina TBC1D1 PAS fosforilinimą griaučių raumenyse, 3, 12, 13, tačiau skirtingai nuo AS160, TBC1D1 gali reguliuoti insulino stimuliuojamą gliukozės transportavimą per PAS nepriklausomą mechanizmą. Pratimai padidina žmogaus TBC1D1 fosforilinimąsi, 14 ir TB12D1 mutaciją ant R125W, kuri reguliuoja graužikų skeleto raumenų gliukozės transportavimą, sieja su moterų nutukimu. Akt nukreiptas motyvas TBC1D1 Thr 590, kuris yra pagrindinis TBC1D1 PAS fosforilinimo veiksnys, 3 yra labai fosforilintas po insulino stimuliacijos graužikų skeleto raumenyse ir ląstelių kultūroje. 3, 11, 13 Mes nustatėme, kad insulinas stimuliuoja TBC1D1 Thr 590 žmogaus skeleto raumenyse, ir ištyrėme, ar nutukimas ir T2D nekeičia TBC1D1 Thr 590 fosforilinimo. Šiame tyrime nustatėme insulino stimuliacijos poveikį AS160 Thr 642, AS160 Ser 711 ir TC1D1 Thr 590 fosforilinimui liesiems, nutukusiems ir T2D asmenims.

Medžiagos ir metodai

Dalykai

Buvo tiriami nutukę pacientai, sergantys T2D ( n = 10), nutukę normalios gliukozės tolerancijos tiriamieji ( n = 9) ir liesi normalios gliukozės tolerancijos tiriamieji ( n = 8). Normalus gliukozės tolerancijos ir diabeto statusas (pagal Amerikos diabeto asociacijos kriterijus) buvo nustatytas atliekant oralinio gliukozės tolerancijos testą ir apskaičiuojant Matsuda jautrumo insulinui indeksą, kaip aprašyta. Dviems T2D pacientams 2 dienas prieš užspaudimo procedūrą buvo nutraukta 16 sulfonilkarbamido darinių, kad būtų išvengta hipoglikemijos. Septyni asmenys, sergantys T2D, buvo kontroliuojami dietos. Tyrimą patvirtino Teksaso universiteto sveikatos mokslų centro ir Joslino diabeto centro institucinė apžvalgos taryba, o tiriamieji davė informuotą rašytinį sutikimą prieš dalyvaudami tyrime.

Periferinio jautrumo insulinui ir raumenų biopsijoms matavimas

Po nakties pasninko tiriamiesiems buvo atliktas 180 minučių trukmės euglikeminis-hiperinsulineminis (160 mU m –2 min – 1 ) spaustukas. Insulino stimuliuojama gliukozės apykaita (M) buvo nustatyta remiantis vidutiniu gliukozės infuzijos greičiu per paskutines 30 minučių spaustuku. Buvo atliktos 17 „ Vastus lateralis“ raumenų biopsijos prieš pradedant tyrimą, 30 min. Ir 180 min. Į gnybtą.

Audinių apdorojimas, imunoblotų nustatymas ir plazmos analizė

Sušaldytų raumenų biopsijos mėginiai buvo apdoroti, kaip aprašyta anksčiau. 3, 17 antikūnai prieš Akt, fosfo-Akt Thr 308, PAS, TBC1D1, AS160 Thr 642, AS160 Ser 711 ir TBC1D1 Thr 590 buvo iš Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, JAV). 10, 13, 18 anti-AS160 antikūnai buvo iš Millipore (Billerica, MA, JAV) ir Abcam (Kembridžas, MA, JAV). 10 insulino, plazmos gliukozės ir hemoglobino A1c (HbA1c) kiekis plazmoje buvo išmatuotas taip, kaip aprašyta anksčiau. 17

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± sem. Fosforilinimo padidėjimas išreiškiamas pradinių linijų liesų asmenų santykiu. Tiriamųjų pradinės charakteristikos buvo palygintos atliekant vienpusę dispersijos analizę. Grupės ir laiko tėkmės duomenys buvo analizuojami dvipusio dispersijos analizės būdu su pakartotinėmis priemonėmis. Keli palyginimai buvo atlikti naudojant Holm-Sidak post-hoc testą. Reikšmingumo lygis buvo nustatytas kaip P <0, 05.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Dalyko apibūdinimas

Palyginti su lieknais, T2D tiriamieji turėjo didesnį kūno masės indeksą, nevalgius gliukozės ir HbA1c plazmoje, bei padidino atsparumą insulinui, kaip nustatė homeostazės vertinimo modelis - atsparumas insulinui (HOMA-IR) ir nevalgiusiam insulinui (1 papildoma lentelė). Nutukę asmenys turėjo didesnį kūno masės indeksą ir parodė mažesnio Matsuda indekso ( P = 0, 1) tendenciją, palyginti su liesais asmenimis, ir tai rodo periferinį atsparumą insulinui (1 papildoma lentelė), tačiau nevalgiusiam insulino ( P = 0, 3) ir M vertę ( P = 0, 4) reikšmingai nesiskyrė nuo liesų asmenų.

Insulino stimuliacija padidina Akt Thr 308 ir PAS fosforilinimą

Akt yra pirminė prieš srovę esanti kinazė, reguliuojanti AS160 ir TBC1D1 fosforilinimą. 3, 5 Mes išmatuojome Akt fosforilinimą Thr 308, pagrindinėje fosforilinimo vietoje, kuri reguliuoja Akt aktyvumą, ir nustatėme, kad po 180 minučių stimuliacijos insulinu Akt Thr 308 fosforilinimas T2D tiriamiesiems žymiai sumažėjo, palyginti su lieknais tiriamaisiais (1a pav.). Šie duomenys atitinka ankstesnį tyrimą 6 ir rodo, kad T2D tiriamiesiems buvo sutrikusi proksimalinė insulino signalizacija. Norėdami įvertinti bendrą AS160 ir TBC1D1 fosforilinimą Akt substrato motyvais, mes panaudojome PAS antikūną. 3 Insulino stimuliavimas padidino PAS fosforilinimą maždaug dvigubai visose grupėse, o tai nerodo reikšmingo bendro PAS fosforilinimo skirtumo tarp tiriamųjų (1b pav.).

Image

Insulino reguliuojamas fosfo-Akt Thr 308 ir PAS fosforilinimas bei AS160 ir TB1D1 baltymų kiekis. a, b, c ir d : „Vastus lateralis“ raumenų biopsijos buvo atliktos prispaudimo procedūros metu (30) ir 180 min. Raumenų mėginiai buvo apdoroti ir imunoblotuoti naudojant Akt, anti-fosfo-Akt Thr 308 antikūnus ( a ) ir anti-PAS antikūnus ( b ). Visa Akt blot viršutinė juosta buvo nustatyta kaip Akt. AS160 ( c ) ir TBC1D1 ( d ) baltymų ekspresija buvo įvertinta imunoblotu. Po kiekybinio įvertinimo reikšmingų baltymų ekspresijos skirtumų grupėse raiščio metu nebuvo, todėl buvo surinkti trijų laiko taškų duomenys. * P <0, 05 vs bazinis laiko taškas toje pačioje grupėje, P <0, 05 vs T2D tiriamieji panašiu laiko momentu. Duomenys yra vidutiniai ± se; n = 8–10 vienoje grupėje.

Visas dydis

Kadangi T2D tiriamiesiems buvo sutrikusi insulino stimuliuojama GLUT4 translokacija ir gliukozės pasisavinimas, tačiau jų skeleto raumenų GLUT4 lygis buvo normalus, 19 mes taip pat išmatuojome, ar T2D tiriamieji nepakeitė AS160 ir TBC1D1 baltymų kiekio. Padidėjęs AS160 ir (arba) TBC1D1 baltymų kiekis (bazinėje būsenoje) gali būti Rab baltymų neaktyvus, su guanozino difosfatu sujungtas pavidalas, užkertantis kelią GLUT4 perkėlimui. AS160 ir TBC1D1 bendro baltymo ekspresija nesiskyrė tarp tiriamųjų nei prieš pradedant gydymą, nei spaustuko metu, todėl negalėjo atsižvelgti į insulino stimuliuojamos gliukozės vartojimo kitimą grupėse (1c ir d paveikslai). Šie duomenys leido mums nustatyti, ar sutrikęs gliukozės įsisavinimas T2D gali būti susijęs su specifinės vietos AS160 ir TBC1D1 fosforilinimo pokyčiais.

Insulino poveikis AS160 fosforilinimui

Norėdami nustatyti AS160 specifinį PAS fosforilinimą, mes imuninį nusėdimą atlikome naudodami AS160 antikūną. 10 Pradinis AS160 PAS fosforilinimas buvo panašus tarp grupių. Nors nutukusių asmenų fosforilinimo greitis buvo mažesnis, palyginti su liesų asmenų, po 30 minučių spaustuko, 180 min., Visoms grupėms AS160 PAS fosforilinimas padidėjo keturis kartus (2a paveikslas). Šie radiniai rodo, kad insulino stimuliuojamas AS160 PAS fosforilinimas nesiskiria nutukusiems ir T2D sergantiems asmenims; atvirkščiai, gali būti, kad bus pažeistas fosforilatono kiekis kitose fosforo vietose AS160 ir (arba) TBC1D1.

Image

Insulinas reguliuoja specifinę AS160 ir TBC1D1 vietos fosforilinimą. a, b, c ir d : iš bazinių ir insulino stimuliuotų raumenų mėginių imunoprecipifuota AS160 (250 μg baltymo lizato), o nuosėdos imunoblotuojamos anti-PAS antikūnais ( a ). Baziniai ir insulino stimuliuojami raumenų lizatai buvo imituojami naudojant anti-fosfo-AS160 Thr 642 antikūną ( b ), anti-fosfo-AS160 Ser 711 antikūną ( c ) ir anti-fosfo-TBC1D1 Thr 590 antikūną ( d ). Fosforilinimo lygio rezultatai (2b – d pav.) Buvo normalizuoti pagal AS160 arba TBC1D1 baltymų kiekį kiekviename atskirame mėginyje. Duomenys yra vidutiniai ± se; n = 8–10 vienoje grupėje. * P <0, 05 palyginti su baziniu laiko tašku toje pačioje grupėje.

Visas dydis

Išmatuojome insulino poveikį Akt bendro sutarimo vietoje AS160 Thr 642 . Insulino stimuliacija padidino fosforilinimąsi per 30 ir 180 minučių liesiems ir nutukusiems asmenims; tačiau tiriamiesiems, sergantiems T2D, šis poveikis reikšmingai pablogėjo (2b paveikslas). Pelėms lygiavertės fosfo-vietos AS160 Thr 649 mutacija slopino insulino stimuliuojamą gliukozės transportavimą. Visi šie duomenys leidžia manyti, kad AS160 Thr 642 gali būti pagrindinė fosforilinimo vieta žmogaus insulino stimuliuojamos gliukozės pasisavinime ir esminė fosfo vieta mažinant gliukozės pasisavinimą T2D tiriamiesiems.

Insulinas panašiai padidino AS160 Ser 711 fosforilinimą visiems tiriamiesiems po 180 min. (2c paveikslas). Pelėms insulinas stimuliuoja AS160 Ser 711 fosforilinimą jautriu wortmanninu, tačiau nepriklausomai nuo Akt2, sukeldamas reguliavimą viena ar daugiau priešakyje esančių kinazių. Šie duomenys rodo, kad insulino stimuliuojamas AS160 Ser 711 fosforilinimas yra reguliuojamas nepriklausomai nuo žmogaus skeleto raumenų Akt Thr 308 fosforilinimo. Be to, mūsų išvada, kad AS160 Ser 711 fosforilinimas nepakinta nutukimo ir T2D atvejais, kartu su ankstesniais darbais, įrodančiais, kad AS160 mutacija Ser 711 nesutrikdo insulino stimuliuojamos gliukozės įsisavinimo pelės griaučių raumenyse10 rodo, kad ši svetainė greičiausiai neprisidės. insulino stimuliuojamos gliukozės pasisavinimą žmogaus skeleto raumenyse.

Insulino poveikis TBC1D1 fosforilinimui

TBC1D1 Thr 590 yra numatoma Akt sutarimo vieta, kurią graužikų skeleto raumenyse fosforilina insulinas. 13 Dabartinio tyrimo metu pradinis TBC1D1 Thr 590 fosforilinimas buvo panašus tarp visų tiriamųjų, o insulino stimuliacija nepadidino TBC1D1 Thr 590 fosforilinimo liesiems ar nutukusiems asmenims spaustuko metu. Priešingai, insulino stimuliacija padidino Thr 590 fosforilinimą T2D tiriamiesiems per 30 ir 180 minučių (2d pav.). Šie žmonių radiniai skiriasi nuo kitų rūšių galbūt todėl, kad žmogaus skeleto raumenys išreiškia skirtingus TBC1D1 sujungimo variantus. 14 Nors tyrimai su pelių griaučių raumenimis ir adipocitais parodė, kad nuo Akt2 priklauso nuo insulino stimuliuojamas TBC1D1 Thr 590 fosforilinimas, 11, 13, ši fosfo vieta neatrodo esminė norint reguliuoti gliukozės įsisavinimą, galbūt dėl ​​to, kad joje nėra 14-3- 3 jungiasi, manoma, kad kritiškai svarbus įsisavinant gliukozę. 20 Taip pat TBC1D1 Thr 590 fosforilinimas gali turėti slopinamąjį poveikį, atsižvelgiant į tai, kad šios vietos fosforilinimas tik padidėjo T2D tiriamiesiems.

Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas pirmasis rodo, kad T2D tiriamiesiems sutrinka insulino stimuliuotų skeleto raumenų AS160 Thr 642 fosforilinimas, todėl gali sutrikti gliukozės įsisavinimas. Žmogaus skeleto raumenyse AS160 ir TBC1D1 specifinis fosforilinimas yra skirtingai reguliuojamas. Sutrikusi insulino stimuliacija AS160 Thr 642 fosforilinimu T2D gali būti naujas farmakologinis tikslas pagerinti sutrikusią skeleto raumenų gliukozės vartojimą nutukimo ir T2D atvejais.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

    Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Mitybos ir diabeto“ svetainėje (//www.nature.com/nutd)