Integruota genomine analize nustatoma nereguliuojama jak / stat-myc-biosintezės ašis agresyvios nk-ląstelių leukemijos metu | ląstelių tyrimai

Integruota genomine analize nustatoma nereguliuojama jak / stat-myc-biosintezės ašis agresyvios nk-ląstelių leukemijos metu | ląstelių tyrimai

Anonim

Dalykai

  • Vėžio terapija
  • Ląstelių signalizavimas
  • Leukemija
  • Fosforilinimas

Anotacija

Agresyvi NK ląstelių leukemija (ANKL) yra reta NK ląstelių neoplazmos forma, labiau paplitusi tarp Azijos, Centrinės ir Pietų Amerikos žmonių. Paprastai pacientai miršta dienomis ar mėnesiais, net gavę greitą terapinį gydymą. Čia atlikome pirmąjį išsamų ANKL tyrimą, integruodami visą genomą, transkriptą ir tikslinę seką, citokinų matricą, taip pat funkcinius tyrimus. JAK-STAT kelio mutacijos buvo nustatytos 48% (14/29) ANKL sergančių pacientų, o tarpląstelinis STAT3 stimuliatorius IL10 padidėjo vidutiniškai 56 kartus ( P <0, 0001) visų tirtų pacientų plazmoje. Tarp papildomų dažnai mutavusių genų buvo TP53 (34%), TET2 (28%), CREBBP (21%) ir MLL2 (21%). Pacientų NK leukemijos ląstelės pastebimai suaktyvino STAT3 fosforilinimą, MYC ekspresiją ir transkripcijos aktyvumą keliuose metabolizmo keliuose. Funkciškai STAT3 aktyvacija ir MYC ekspresija buvo kritinė ANKL ląstelių dauginimuisi ir išgyvenimui. STAT signalizacija reguliavo MYC transkripcijos programą, ir norint palaikyti nukleotidų sintezės ir glikolizės aktyvavimą, reikėjo ir STAT signalizacijos, ir MYC transkripcijos. Bendrai kalbant, JAK-STAT kelias yra pagrindinis ANKL genomo pokyčių ir IL10 stimuliavimo taikinys. Ši naujai atrasta JAK / STAT-MYC biosintezės ašis gali suteikti galimybių kurti naujas terapines strategijas gydant šį leukemijos potipį.

Įvadas

Agresyvi NK ląstelių leukemija (ANKL) atsiranda dėl sisteminio neoplastinio natūralių žudikių (NK) ląstelių dauginimosi. ANKL rodo agresyvią klinikinę eigą, pasižyminčią savybėmis, kurios sutampa su pažengusia natūralių žudikių / T-ląstelių limfomos (NKTCL) stadija. Skirtingai nuo NKTCL, ANKL yra reta NK ląstelių neoplazmos forma ir labiau paplitusi tarp Azijos, Centrinės ir Pietų Amerikos žmonių 1 . Iki šiol visame pasaulyje anglų literatūroje aprašyta mažiau nei 300 ANKL atvejų.

ANKL sergantys pacientai pasireiškia visa apimančia klinikine eiga, įskaitant aukštą karščiavimą, pancitopeniją, hepatosplenomegaliją, daugybinio organo nepakankamumą, citokinų audrą ir hemofagocitinę limfohistiocitozę ir dažniausiai miršta dienomis ar mėnesiais, net gavę greitą terapinį gydymą 1, 2, 3 . Dėl ligos retumo ANKL gydymo strategija iš esmės buvo ekstrapoliuota iš kitų limfoidinių neoplazmų. Tačiau ne Hodžkino limfomos ir limfoblastinės leukemijos atveju įprasta chemoterapija paprastai būna silpna 3, 4 . Taigi, norint sukurti efektyvesnius gydymo metodus, būtina geriau suprasti ANKL patogenezę. Epstein-Barr viruso (EBV) seka beveik visada aptinkama ANKL sergančių pacientų neoplastiniuose audiniuose ir periferiniame kraujyje (PB) ir siūloma prisidėti prie šios ligos patogenezės 1, 2, 3 . Nors anksčiau buvo įrodyta, kad chromosomų prieaugis ir praradimai yra susiję su ANKL 5, pakartotiniai genetiniai ANKL sutrikimai nebuvo patvirtinti 3 . Čia atlikome pirmą išsamią ANKL genominę analizę (Papildoma informacija, S1 pav.). Mes nustatėme ir funkciškai patvirtinome IL10-JAK / STAT-MYC signalizacijos ašį, dalyvaujančią ANKL patogenezėje. Be to, šio kelio aktyvinimas sąlygojo reikšmingą metabolinį ANKL perprogramavimą nukleotidų sintezėje ir glikolizėje. Galiausiai, išaiškindami ANKL funkcinę priklausomybę nuo nustatyto onkogeninio kelio, pateiksime įžvalgas apie naujų terapinių strategijų, skirtų gydyti šį mirtiną leukemijos tipą, kūrimą.

Rezultatai

Genominis ANKL kraštovaizdis ir JAK-STAT kelio pokyčiai

Norint ištirti ANKL patogenezę pagrindžiančias genetines aberacijas, viso genomo sekos nustatymas (WGS) buvo atliekamas išgrynintoms CD56 + CD3 - NK ląstelėms ir jų suporuotiems normaliems granulocitams (papildoma informacija, S2 pav.) Iš 8 pacientų atradimų grupės (papildoma informacija)., S1 lentelė) su naujai diagnozuotu ANKL (1 pav. Ir papildoma informacija, S2, S3, S4 lentelės). Naudodamiesi „GVC-SNV“ GVC („Genomic Variant Caller“) 6 programoje, mes nustatėme 483 kandidatus somatinių vieno nukleotido variacijų (SNV) koduojančiuose regionuose, įskaitant 311 neskelbiamąjį SNV (289 missense ir 22 nonsense) ir 9 sujungimo vietos mutacijas. (1 pav. Ir papildoma informacija, S2 lentelė). Mes nustatėme 40 mėginių somatinių nesinoniminių mutacijų (diapazonas 16–59) vidurkį, kuris buvo panašus į NKTCL 7 ir daugelio rūšių solidinius navikus 8 ir aukštesnius nei difuzinė stambiųjų B ląstelių limfoma (DLBCL) 9 ir ūminė mielogeninė leukemija. (AML) 10 (papildoma informacija, S3 pav.). Aukšto lygio genominės EBV sekos buvo aptiktos leukemijos NK ląstelėse, bet ne izoliuotuose paciento granulocituose (papildoma informacija, S4 pav.).

Image

8 ANKL sergančių pacientų apyrašai. Kiekviename „Circos“ paveiksle pavaizduota normalių ir navikinių ląstelių genomo vieta, gylio pasiskirstymas (žalia trasa), somatinių kopijų skaičiaus padidėjimas (raudonas takelis) ir somatinių kopijų skaičiaus pokyčiai (raudona, kopijos padidėjimas; mėlyna, kopijos praradimas). Somatinės nesinoniminės mutacijos žymimos genų pavadinimais (raudoni taškai, mutacijų alelių dažnis); somatiniai struktūriniai pertvarkymai žymimi oranžinėmis linijomis.

Visas dydis

Norėdami numatyti ANKL genomo pokyčių funkcines pasekmes, ieškojome mutacijomis praturtinto kelio (-ų), naudodamiesi KEGG ir IPA analize, taip pat „HotNet“ algoritmu, kuris konstruoja genų tinklus pagal baltymų ir baltymų sąveiką 11 . Pažymėtina, kad visos trys strategijos nuosekliai nurodė JAK-STAT citokinų signalizaciją (įskaitant JAK2 , JAK3 , STAT3 ir STAT5B) kaip reikšmingiausiai praturtintą kelią analizuojant 313 mutavusių genų, atrastų 8 ANKL sergančių pacientų WGS (2A pav.; Papildoma informacija, pav.) S5 ir S6). Norėdami patvirtinti šį atradimą, mes panaudojome AmpliSeq tikslinei sekai sekti 29 ANKL sergančių pacientų grupėje (papildoma informacija, duomenys S1). Be pagrindinių JAK-STAT kelio komponentų, mes taip pat įtraukėme žinomus onkogenus ir naviko slopintuvus, mutavusius atradimo grupėje, taip pat tuos, kurie dažnai mutavo NKTCL (2B paveikslas). JAK-STAT kelio, ty STAT3 , STAT5B , STAT5A , JAK2 , JAK3 , STAT6 , SOCS1 , SOCS3 ir PTPN11 , mutacijos buvo viena kitą paneigiančios ir kartu pasikartojančios (48%) kombinuotoje atradimų ir patvirtinimo grupėje ( n = 29). Prie papildomų dažnai mutavusių genų buvo TP53 (34%), TET2 (28%), CREBBP (21%) ir MLL2 (21%) (2B paveikslas; papildoma informacija, S7, S8 ir S5 lentelės). Pabrėžėme, kad dažnai NKTCL mutavę genai, tokie kaip DDX3X (20%) ir BCOR (32%) 7, 12, mutavo ANKL sergantiems pacientams, kurių dažnis yra mažesnis (atitinkamai 7% ir 3%; 2B paveikslas ir papildomas paveikslas). informacija, S6 lentelė). Be to, mes pastebėjome, kad kiti paprastai mutavę NKTCL genai (būtent MLL2 , ARID1A , EP300 , ASXL3 ir MGA ) taip pat buvo pakeisti ANKL. Įdomu tai, kad šie genai buvo randami pacientams, turintiems mutacijų JAK / STAT kelyje, bet ne tiems, kurie ANTL turi TET2 mutacijas. Kartu šie rezultatai parodė, kad panašus genų rinkinys, susijęs su JAK / STAT keliu ir epigenetiniu reguliavimu, buvo mutavęs tiek ANKL, tiek NKTCL. Nors stebėtas ANKL mutacijos modelis skyrėsi nuo NKTCL (2B paveikslas ir papildoma informacija, S6 lentelė) 7, 12, negalima įsitikinti, ar tokie skirtumai yra susiję su neoplazmų pobūdžiu, ar atspindi tik skirtumus tarp skirtingų grupių. . Be to, didžioji dalis (7 iš 8) nustatytų STAT3 ir STAT5B mutacijų yra Src homologijos 2 (SH2) srityje (Papildoma informacija, S7 pav.), Kuri tarpininkauja STAT baltymų dimerizavimui ir, kaip pranešta, yra karštoji taškas, kuriame yra aktyvinančios T ląstelių stambiosios granuliuotos limfocitinės leukemijos (T-LGL) 13, 14, NKTCL 7, 15, T-ląstelių ūminės limfoblastinės leukemijos (T-ALL) 16, gama deltos T-ląstelių limfomos (γδTCL) 15, T ląstelių mutacijas prolimfocitinė leukemija (T-PLL) 17 ir uždegiminės kepenų ląstelių adenomos (IHCA) 18 . Dviem atvejais atlikta anksčiau apibūdinta aktyvinanti mutacija Y640F, dėl kurios atlikus konstitucinį fosforilinimą ir transkripciją aktyvus STAT3 baltymas buvo atliktas atliekant 14, 18 funkcinę analizę. Be to, atliekant Sangerio seką 19, vienam ANKL pacientui neseniai buvo rasta aktyvinanti mutacija, esanti STAT5 SH2 domene. Nors JAK2 chromosomų translokacija buvo užregistruota VISI 20, ANKL nenustatyta jokių JAK-STAT genų pertvarkymų.

Image

ANKL sergančių pacientų JAK-STAT kelio mutacijos, padidėjęs IL10 lygis ir STAT3 aktyvacija. (A) 313 genų, turinčių somatinių mutacijų, aptiktų WGS duomenyse, patobulinti kanoniniai keliai, ištirti atliekant išradingumo kelio analizę (IPA) ( P reikšmė ≤ 0, 01). Oranžinis taškas rodo mutavusių genų skaičiaus santykį su visu genų skaičiumi kelyje. (B) WGS nustatytų genų mutacijų 8 tiriamiesiems ir tikslinės sekos nustatymas papildomiems 21 tiriamajam su ANKL. Dešinėje pateiktas procentas tiriamųjų su mutacijomis. 34 ištirti genai yra suskirstyti į kategorijas, nurodytas kairėje. Taip pat parodyta, kad nurodytais 6 atvejais plazmos IL10 koncentracijos plazmoje pokyčiai, palyginti su sveikais donorais (2C pav.). (C) santykinis 20 uždegiminių citokinų kiekis plazmoje 8 ANKL sergantiems pacientams ir 3 sveikiems donorams. Statistinė analizė atlikta naudojant Studento t arba Studento t testą su Welcho pataisa. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 ir *** * P <0, 0001. Įtakoje parodyta koreliacija tarp plazmos IL10 baltymo ir IL10 mRNR išrūšiuotų NK leukemijos ląstelių lygmenyje. (D) Imunohistocheminis CD56 ir fosforilinto STAT3 (pSTAT3) dažymas kaulų čiulpų biopsijos mėginiuose. Parodyti reprezentatyvūs kontrolinių mėginių, JAK-STAT mutanto ANKL atvejų ir JAK-STAT laukinio tipo ANKL atvejų vaizdai (kairėje). Mastelio juosta, 20 μm. Parodyti ir palyginti 10 ANKL ir 21 kontrolinio mėginio pSTAT3 dažymo pusiau kiekybiniai imunoreaktyvumo histologiniai balai (H balai) (H balai) ( P <0, 0001; dešinėje). Nurodomi JAK-STAT mutanto (raudonos), laukinio tipo (mėlynos) ir nežinomos (juodos) mutacijos būklės atvejai. Juostos reiškia vidurkį ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant Mann-Whitney U testą.

Visas dydis

Be genominių mutacijų, citokinų ir augimo faktorių prisijungimas tarpląsteliniu ligandu gali sąlygoti JAK-STAT signalizacijos aktyvavimą. Didelė citokinų gamyba, vadinama „citokinų audra“, yra svarbi klinikinė ANKL sergančių pacientų savybė. Pasidomėję galimu funkciniu citokinų audros įsitraukimu į JAK-STAT signalizaciją, apžiūrėjome 20 uždegiminių citokinų grupę, kad būtų jų buvimas paciento plazmoje. Žinomas JAK-STAT priešakyje esantis stimuliatorius IL10 21 buvo dramatiškai padidėjęs vidutiniškai 56 kartus ( P <0, 0001, svyruoja nuo 7 iki 98 kartų) ANKL sergantiems pacientams, palyginti su sveikomis kontrolinėmis grupėmis (2 pav. C). Nuosekliai CD56 teigiamų NK ląstelių buvo gausu ANKL sergančių pacientų kaulų čiulpuose, kaip parodyta imunohistocheminės analizės būdu (2D pav.). STAT3 fosforilinimas, rodantis STAT3 aktyvaciją, buvo žymiai didesnis tiek JAK-STAT laukinio tipo, tiek mutavusių ANKL atvejų kaulų čiulpų ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (2D paveikslas ir papildoma informacija, S7 lentelė).

Nereguliuojami MNK ekspresijos programos transkriptografijos ir aberacijų bei metabolizmo keliai

Norint nustatyti pagrindinius transkripcijos centrus, kurių ekspresijos lygį reguliuoja identifikuotos genetinės mutacijos ir (arba) nepaprastai padidėjęs IL10, transkriptominė seka buvo atlikta srauto citometrijos būdu išrūšiuotoms piktybinėms arba normalioms CD56 + CD3 - NK ląstelėms (papildoma informacija, S2 pav.) Iš kaulų. 7 ANKL pacientų čiulpai (papildoma informacija, S1 lentelė) ir 4 sveiki donorai. Norėdami ieškoti susiejančių genų, jungiančių genominius ir transkriptominius duomenis, naudojome integruotos analizės įrankį TieDIE (Tied difuzija per sąveikaujančius įvykius) 22 . Pažymėtina, kad ši nešališka viso genomo analizė sukūrė tinklą, kuriame padidėjusi transkripcijos faktoriaus MYC ekspresija ANKL yra kontroliuojama JAK ir STAT genų mutacijų (3A pav.). Siekdami pagrįsti šį atradimą, mes nustatėme 7 aktyvuotus reguliatorius, įskaitant MYC ir jo sąveikaujančius baltymus MAX, MNT ir SIN3A, kartu su SATB1, HOXD10 ir HIC1 ( Z -core> 2, P <0, 05) visame nereguliuojamame ANKL transkriptome, naudojant IPA aukščiau esančių reguliatorių analizė (3B paveikslas). Nuosekliai stebint, kad MYC raiškos lygis buvo reikšmingai didesnis ANKL sergantiems pacientams, palyginti su sveikų kontrolinių grupių pacientais (2D ir 3F paveikslai; papildoma informacija, S9 pav.). ANKL paciento transkriptui buvo būdingi du žinomi MYC varomi ekspresijos signalai 23, 24, tačiau jiems trūko pranešto su STAT3 susijusio uždegiminio geno parašo 21 (3C pav.).

Image

JAK / STAT-MYC ir metaboliniai parašai ANKL sergantiems pacientams. (A) Integruota tinklo analizė, naudojant genominius pakitimus ir transkriptominius variantus su TieDIE. Paveiksle pavaizduoti keturi potinkliai, kuriuos numatė TieDIE 22 . Didžiausias potinklis (viršutinė kairė, užtemdyta sritis) jungia JAK ir STAT mutacijas su transkripciškai padidintu genu MYC . Deimantai rodo somatinius SNV, aptiktus naudojant WGS duomenis. Deimantų ir apskritimų spalvos rodo padidintą (raudoną) arba sumažintą (mėlyną) geno ekspresiją, palyginti su sveikais donorais. Kietosios linijos žymi transkripcijos reguliavimą, o punktyrinės linijos žymi reguliavimą po transkripcijos. (B) Buvo numatyta, kad septyni transkripcijos reguliatoriai (deimantai) bus suaktyvinti izoliuotose paciento NK leukemijos ląstelėse (papildoma informacija, duomenys S1). Jų potencialūs vartotojų tikslai parodomi kaip apskritimai. Deimantų ir apskritimų spalvos rodo padidintą (raudoną) arba sumažintą (mėlyną) geno ekspresiją, palyginti su sveikais donorais. Raudona ir mėlyna linijos rodo žinomą aktyvinantį arba slopinantį poveikį atitinkamai tarp reguliatoriaus ir jo taikinių. Juodos linijos rodo nežinomą poveikį. (C) Diagrama rodo anksčiau apibūdintų MYC ir STAT3 uždegimo parašų GSEA pirminėse ANKL leukemijos ląstelėse GSEA. P vertės buvo apskaičiuotos atliekant permutacijos testą, kai slenkstis P <0, 05. (D) Diagrama rodo praturtintų kelių procentinę dalį kiekvienoje iš šešių nurodytų KEGG funkcinių kategorijų ANKL ir įvairiuose navikuose ( P <0, 05). Praturtinimo analizei buvo naudojami diferencijuotai sureguliuoti genai, palyginti su įprastomis kontrolėmis. Transkripto duomenys buvo gauti iš šio tyrimo (ANKL) arba gauti iš viešųjų duomenų (papildoma informacija, duomenys S1). (E) Diagrama rodo praturtintus metabolizmo kelius, kurie atskleidė padidėjusį (raudoną) arba sumažėjusį (mėlyną) transkripcijos aktyvumą ANKL, MYC indukuojamų ląstelių linijoje (P493) ir papildomus navikus, kuriems būdingi metaboliniai ypatumai ( P <0, 01). Keliai yra suskirstyti į kategorijas, nurodytas kairėje. Spalvos kodas nurodo reikšmingumo lygį. Praturtintų metabolizmo būdų sąrašai pateikti papildomos informacijos S12 lentelėje. (F) Juostos diagrama (viršuje) rodo MYC mRNR ekspresijos lygį ANKL sergantiems pacientams ir sveikiems donorams. Žvaigždutės rodo MYC aktyvavimo būseną remiantis IPA analize ( P <0, 05, Z balas ≥ 2). Šilumos žemėlapis (viduryje) rodo su nukleotidų sinteze ir glikolize susijusių genų mRNR raiškos lygius, kurie buvo labai išreikšti ANKL sergantiems pacientams (FDR <0, 1). MYC tiksliniai genai buvo rodomi raudonu šriftu. Mastelio juosta žymi genų ekspresijos lygį. MYC CNV, taškų mutacijos JAK-STAT kelyje (JAK-STAT SNV) ir IL10 išraiškos kartų keitimas yra parodyti grafiko apačioje. Buvo nustatyta, kad vienu atveju buvo MYC lokuso amplifikacija (papildoma informacija, S21 pav.). BLCA, šlapimo pūslės urotelinė karcinoma; BRCA, invazinė krūties karcinoma; CNV, kopijos numerio variacija; COAD, storosios žarnos adenokarcinoma; DLBCL_OxPhos, difuzinė didelių B ląstelių limfoma su oksidaciniu fosforilinimo signalu; HNSC, galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinoma; KICH, inkstų chromofobas; KIRC, inkstų inkstų skaidri ląstelių karcinoma; KIRP, inkstų inkstų papiliarinių ląstelių karcinoma; LIHC, kepenų kepenų ląstelių karcinoma; LUAD, plaučių adenokarcinoma; LUSC, plaučių plokščialąstelinė karcinoma; NES, normalizuotas praturtėjimo balas; PRAD, prostatos adenokarcinoma; T-ALL, T-ląstelių ūminė limfoblastinė leukemija; THCA, skydliaukės karcinoma.

Visas dydis

Atsižvelgiant į MYC, kaip pagrindinio reguliatoriaus vaidmenį ląstelių metabolizme, 25, 26, 27, analizuojant MYC signalo genus, kurie buvo sureguliuoti ANKL, paaiškėjo funkcinis sodrumas nukleotidų sintezėje, baltymų metabolizme ir ląstelių junginių metabolizmo procesų keliuose (papildoma informacija, S10 pav.). Norėdami išsiaiškinti, ar metabolinės aberacijos yra bendras viso transkripto bruožas, analizavome diferencijuotai perrašytus genus. Atskirų pacientų NK leukemijos ląstelėse mes nustatėme 778 atnaujintus ir 1 788 sumažintus genus, palyginti su įprastomis kontrolinėmis medžiagomis (| Sulenkimo pokytis |> 2 ir FDR <0, 1) (papildoma informacija, S8 ir S9 lentelės). Keista, bet dauguma (13 iš 20, 65%) būdų, praturtintų atnaujintais genais, dalyvavo ląstelių metabolizme ( P <0, 05; 3D paveikslas ir papildoma informacija, S10 lentelė), įskaitant purinų ir pirimidinų sintezę, glikolizę, trikarboksirūgšties ( TCA) ciklas, oksidacinis fosforilinimas, aminorūgščių metabolizmas ir lipidų apykaita ( P <0, 01; 3E paveikslas ir papildoma informacija, S12 lentelė). Panašus metabolizmo būdų rinkinys buvo suaktyvintas MYC indukcijai gerai apibūdintoje MYC indukuojamoje sistemoje (3E paveikslas ir papildoma informacija, S12 lentelė) 28 . Atvirkščiai, ta pati transkriptų duomenų analizė galėtų aptikti tik ribotą kiekį T-ALL (glikolizės, nukleotidų sintezės ir aminorūgščių metabolizmo), reguliuojamų metabolizmo kelių, plaučių vėžio (LUAD: glikolizė, nukleotidų sintezė ir aminorūgščių metabolizmas), inkstų. vėžys (KIRC: glikolizė ir nukleotidų sintezė) ir OxPhos-DLBCL (oksidacinis fosforilinimas ir aminorūgščių metabolizmas; 3E paveikslas ir papildoma informacija, S12 lentelė), kurie iš esmės atitinka ankstesnius šių navikų apibūdinimus, naudojant izotopų atsekimo ir funkcinius tyrimus 29, 30, 31, 32 . Be to, signalo perdavimas (įskaitant NOTCH signalizavimą), specifiniai su vėžiu susiję keliai ir su imunine funkcija susiję procesai - tai visi ANKL reguliuojami genai (papildoma informacija, S11 lentelė). Įdomu tai, kad nenormalūs raiškos signalai ląstelių metabolizme, tokie kaip nukleotidų sintezės ir glikolizės keliai, parodė panašius modelius JAK-STAT mutavusių ir laukinio tipo mėginiuose (3F pav.). Nepriklausomai nuo JAK-STAT mutacijos būklės, visais 7 ištirtais atvejais buvo stebimas žymiai didesnis IL10 ir MYC lygis (3F pav.). Šie duomenys rodo, kad metabolinis nukrypimas nukleotidų sintezėje, glikolizė ir papildomi keliai yra ryškus ANKL transkripto bruožas.

STAT3 signalizacijos ir MYC ekspresijos bei metabolinės aberacijos nukleotidų sintezėje ir glikolizėje funkcinė analizė

Norėdami nustatyti mūsų integruotos genominės analizės funkcinį tinkamumą, mes panaudojome dvi ANKL iš paciento gautas ląstelių linijas, KHYG-1 ir NK-92 33, 34, kuriose nebuvo JAK-STAT mutacijų, kaip rodo mūsų egzono sekos analizė (duomenys nepateikti) ). Funkciškai IL10 galėtų stimuliuoti STAT3 fosforilinimą (4A paveikslas ir papildoma informacija, S11A paveikslas) ir reikšmingai skatinti šių ląstelių proliferaciją in vitro (4B paveikslas). Priešingai, STAT3 signalizacijos slopinimas naudojant Stattic, STAT3 fosforilinimo inhibitorių 35 žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą ir sukėlė apoptozę ANKL ląstelėse (4C ir 4D paveikslai; papildoma informacija, S11B ir S11C paveikslai). Šie radiniai rodo, kad ANKL ląstelės yra priklausomos nuo STAT3 signalizacijos, kad išgyventų, ir yra stipriai reaguojančios į IL10, norėdamos toliau indukuoti STAT3 fosforilinimą ir sustiprinti proliferaciją.

Image

STAT3-MYC ašis yra kritinė ANKL ląstelių dauginimuisi ir išgyvenimui. Atliktas Western blot tyrimas, siekiant nustatyti STAT3, fosforilinto STAT3 (pSTAT3) ir MYC baltymų ekspresijos lygius KHYG-1 ląstelėse, apdorotose nurodytomis IL10 (A) arba STAT3 inhibitoriaus Stattic (C) koncentracijomis . (B) IL10 arba IL18 apdorotų KHYG-1 arba NK-92 ląstelių santykinis ląstelių gyvybingumas. Duomenys rodo vidurkį ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant Studento t- testą. * P <0, 05, ** P <0, 01 ir *** P <0, 001. (D) Statiniu būdu apdorotų KHYG-1 arba NK-92 ląstelių santykinis ląstelių gyvybingumas. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SD. (E) KHYG-1 ląstelių, apdorotų DMSO kaip kontrole (CON) arba nurodytų JQ1 koncentracijų (kairėje), kolonijų skaičius. Duomenys rodo vidurkį ± SD. Statistinė analizė atlikta naudojant Studento t- testą; ** P <0, 01 ir *** P <0, 001. Reprezentaciniai kolonijų vaizdai pavaizduoti dešinėje. NS, nereikšminga.

Visas dydis

Atlikus genomo analizę, jungiančią JAK-STAT kelią ir MYC raišką (3A pav.), STAT3 signalizacijos aktyvinimas IL10 paskatino žymiai padidėjusį MYC ekspresiją KHYG-1 ir NK-92 ANKL ląstelėse (4A pav.; Papildoma informacija, S11A ir S12A paveikslai). STAT3 fosforilinimo slopinimas sumažino MYC ekspresiją (4C paveikslas; papildoma informacija, S11B ir S12B paveikslai). Be to, gydymas žinomu MYC inhibitoriumi JQ1 veiksmingai slopino ANKL ląstelių proliferaciją ir kolonijų formavimo galimybes (4E pav. Ir papildoma informacija, S13 pav.). Šie duomenys rodo, kad IL10-STAT3 signalizacija reguliuoja MYC raišką ir su MYC susijusią transkripcijos programą ANKL.

Norėdami ištirti, ar STAT3 signalizuota MYC ekspresija reguliuoja ekspresijos programą ir stebimą metabolinį aktyvavimą ANKL, mes atlikome transkripto seką dviem ANKL ląstelių linijomis. Nors su STAT3 susijusia uždegiminės raiškos programa 21 nepaveikta, abu žinomi MYC varomi signalai 23, 24 buvo žymiai sukelti arba slopinami atitinkamai IL10 arba Stattic abiejose ANKL ląstelių linijose (5A pav. Ir papildoma informacija, S14 pav.) ). Tarp 6 aktyvuotų medžiagų apykaitos būdų pirminėse ANKL ląstelėse (5B paveikslas ir papildoma informacija, S15 pav.), Tik transkripcinis nukleotidų sintezės ir glikolizės aktyvumas teigiamai ir nuosekliai reagavo į STAT3 aktyvumo moduliaciją IL10 ir Stattic KHYG-1 ir NK- 92 langeliai (5B paveikslas ir papildoma informacija, S15 paveikslas). Gydymas MYC inhibitoriumi JQ1, panašus į STAT3 inhibitorių Stattic, nulėmė nukleotidų sintezės ir glikolizės slopinimą ANKL ląstelėse (5B paveikslas ir papildoma informacija, S15 pav.).

Image

STAT3-MYC ašis yra atsakinga už metabolinį aktyvavimą ANKL. (A) Anksčiau apibūdintų MYC ir STAT3 uždegiminių parašų GSEA ANKL ląstelių linijoje (KHYG-1), apdorotame IL10, Stattic arba JQ1. P <0, 05 atliekant permutacijos testą. (B) Patobulinti metaboliniai keliai, kurie padidino (raudoną) arba sumažino (mėlyną) transkripcijos aktyvumą izoliuotose NK leukemijos ląstelėse (ANKL paciento NK ląstelės, PNKC) ir KHYG-1 (1) ir NK-92 (2) ląstelėse, apdorotose nurodyti agentai. Rodomi tik keliai, kuriuose yra kontrastingų pokyčių tarp JAK-STAT aktyvinančių (IL10) ir JAK-STAT slopinančių (statiškų) sąlygų (papildoma informacija, duomenys S1). Spalvos kodas nurodo reikšmingumo lygį. Išsamus praturtintų būdų sąrašas pateiktas papildomos informacijos S15 paveiksle. (C) Integruota transkripcijos ir metabolizmo duomenų analizė atskleidė kylančius narkotikų tikslus pacientams, sergantiems ANKL. Grafike pavaizduotas purino (kairėje) ir pirimidino metabolizmo kelias (dešinėje). Nereguliuoti genai (FDR <0, 1) ANKL sergantiems pacientams arba ANKL ląstelių linijoms (KHYG-1 ir NK-92), gydomiems IL10, buvo pažymėti raudona spalva. Apversti trikampiai rodo slopinimą „Stattic“ arba JQ1 (šviesiai mėlyna spalva). GSEA, genų rinkinių praturtinimo analizė; NES, normalizuotas praturtėjimo balas.

Visas dydis

Diskusija

Integruodami genominę, transkriptominę ir metabolinę analizes bei funkcinius tyrimus, mes parodėme, kad plazmos IL10 perprodukcija kartu su mutacijomis JAK-STAT kelyje yra pagrindiniai faktoriai, skatinantys ląstelių metabolizmą ANKL leukemijos ląstelėse (6 pav.). Identifikuotos mutacijos, tokios kaip STAT3 Y640F, galėtų skatinti STAT3 fosforilinimąsi ir MYC aktyvaciją pasroviui (papildoma informacija, S16 pav.). Svarbu tai, kad abejotinas STAT3 signalizavimas buvo stebimas ir JAK-STAT mutacijų neigiamais atvejais (2D paveikslas). JAK-STAT ir mutavusių pacientų NK leukemijos ląstelių, kurių mutacija nenustatyta, ląstelės parodė panašų ekspresijos modelį MYC varomose programose ir metabolinį aktyvavimą (3F pav.) Šie duomenys rodo, kad nepriklausomai nuo genetinių mutacijų, STAT3 signalizaciją gali suaktyvinti perprodukuotas IL10 arba papildomi nežinomi mechanizmai. Įdomu tai, kad gydymas IL10 pirmiausia stimuliavo JAK / STAT laukinio tipo ląsteles (4A pav. Ir papildoma informacija, S17 pav.), Bet ne STAT3 Y640F mutantines ANKL ląsteles, kad padidintų kelio aktyvumą ir ląstelių proliferaciją (papildoma informacija, S18 pav.), Teigdamas. kad IL10 padidėjimas vaidina svarbesnį vaidmenį JAK-STAT mutavusiems pacientams. Mechaniškai, vyraujantį per didelį IL10 ekspresiją greičiausiai sukelia EBER1 36, 37, EBV koduota RNR, kuri yra labai ekspresuojama paciento NK leukemijos ląstelėse (papildoma informacija, S19 ir S20 paveikslai), ir teigiami atsiliepimai dėl STAT kelio aktyvavimo. 21 . Remiantis mūsų išvadomis, JAK-STAT kelias gali būti aktyvuotas be JAK ir STAT genų mutacijų T-LGL pacientų pogrupyje 13 . Kartu nukreipimas į STAT3 signalizaciją ir nukleotidų metabolizmą gali pasiūlyti naujas gydymo strategijas tiek JAK-STAT laukinio tipo, tiek mutavusiems ANKL pacientams.

Image

Susiliejantis ANKL patogenezės modelis. IL10 stimuliuoja STAT3 signalizaciją tiek JAK-STAT mutavusiems, tiek laukinio tipo pacientams. JAK-STAT kelias, EBV gauta RNR ir papildomi mechanizmai (neparodyta) prisideda prie aukšto IL10 plazmos ekspresijos lygio. Aktyvuota STAT3 signalizacija veda į MYC valdomą transkripcijos programą, palaikančią nenormalų nukleotidų sintezės ir glikolizės aktyvavimą. JAK-STAT kelio mutacijos arba TET2 genai bendradarbiauja su JAK / STAT-MYC biosintezės ašimi ir pagreitina leukemogenezę ANKL. Buvo ištirti žinomi inhibitoriai, siekiant parodyti specifinių tikslinių genų ar kelių funkcinę svarbą.

Visas dydis

Papildomi mutavę genai taip pat gali vaidinti svarbų vaidmenį ANKL patogenezėje, ypač JAK-STAT laukinio tipo pacientams. Įdomu tai, kad TET2 mutacijos buvo praturtintos JAK-STAT mutavusiais pacientais (3 TET2 mutavę atvejai JAK-STAT mutacijų teigiamoje grupėje, palyginti su 7 TET2 mutavusiais atvejais JAK-STAT mutacijų neigiamose grupėse). Visos trys praneštos funkcijos praradimo TET2 mutacijos buvo JAK-STAT mutacijų neigiamoje grupėje (39 pacientų grupėje, duomenys nepateikti) 38, 39 . Neseniai buvo pranešta apie keletą funkcijų, susijusių su STAT signalizavimu ir TET2 praradimu, atliekant keletą hematologinių piktybinių navikų 40, 41, 42 . Kartu su STAT kelio aktyvinimu, TET2 praradimas palaiko mieloproliferacinius neoplazmas (MPN) ir pagreitina vėžio vystymąsi transgeninių pelių modeliuose ir pacientuose 41, 42, 43 . Mechaniškai STAT signalizacija skatina ląstelių dauginimąsi, o TET2 praradimas skatina leukemijos kamieninių ląstelių atsinaujinimą. Verta paminėti, kad STAT kelio aktyvacijos lygis yra kritinis veiksnys, lemiantis ligos fenotipą. Vien tik STAT kelias, kai jis suaktyvinamas tinkamu lygiu, yra „silpnas“ onkogenas, kuris sukelia MPN, kurio skvarba maža ir atidėtas. Drastiškesnį ligos fenotipą galima gauti toliau praradus TET2 40 . Šie stebėjimai atitinka mūsų modelį, kad ankstyvos stadijos STAT aktyvacija, sukelta IL10 perdėtos ekspresijos, nėra pakankama, kad visiškai transformuotų NK ląsteles, antriniam įvykiui (JAK / STAT arba TET2 / TP53 mutacijos) yra būtinos norint išvalyti pilnai išplitusią ligą (6 pav. ).

ANATL molekulinės patogenezės pagrindinė STATs-MYC biosintezės ašis yra unikali ir anksčiau nebuvo pripažinta jokiose kitose neoplazmose. Sergant daugybine mieloma, T-LGL ir įvairiais solidiniais navikais (krūties, prostatos, kiaušidžių, smegenų ir kasos vėžiu), JAK-STAT signalizacija skatina pro onkogeninius uždegiminius kelius, aktyvuodama ekspresijos signalą, kontroliuojantį ląstelių augimą ir išgyvenimą (ciklinas D1, MCL). -1 ir FGF2), angiogenezė (VEGFA), uždegiminiai veiksniai (CXCL12, CCL2) ir migracija arba invazija (MMP2 ir MMP9) 44 . T-LGL buvo akivaizdus pro-onkogeninio uždegimo signalo aktyvinimas. Tačiau ANKL ląstelės nesuaktyvino šios uždegimo programos ir turėjo aiškų MYC ekspresijos parašą (3C ir 5A paveikslai; papildoma informacija, S14 pav.). Kaip pagrindinis ląstelių metabolizmo reguliatorius, MYC aktyvacija dažnai atsiranda dėl genų amplifikacijos / translokacijos ir signalų perdavimo prieš srovę, įskaitant NOTCH, WNT-β-kateniną ir garso ežį-Gli 45 . Vienintelis įrodymas, kad JAK-STAT gali suaktyvinti MYC, yra atliktas in vitro tyrimas, kuriame teigiama, kad MYC promotorius buvo saistomas fosforilinto STAT3 (pSTAT3) 46 . Todėl ANKL yra pirmoji žmonių liga, kai STAT3 signalizacija veikia prieš srovę, tiesiogiai įjungdama MYC transkripcijos programą.

Mirtinas ANKL elgesys ir silpnas atsakas į dabartinę chemoterapiją daro ypač svarbų naujoviškų vaistų paieškų svarbą. Mūsų išvados rodo, kad tikslinė terapija, nukreipta prieš IL10, JAK-STAT signalizaciją, MYC ar nukleotidų sintezę / glikolizę, tikrai žada ANKL, todėl ateityje šių kelių tyrimai yra pateisinami (5C ir 6 pav.). Neseniai buvo atskleistas terapinis MYC slopinimo naudingumas NK ląstelių neoplazmose. Tai rodo, kad MYC aktyvacija gali būti įprastas ANKL ir NKTCL 47 patogenezės mechanizmas. Dabartinius klinikinius duomenis patvirtina ir hipotezė, kad gydymui turėtų būti naudojama nukleotidų sintezė. Konkrečiai, schemos, kuriose yra antimetabolitų, tokių kaip L-parazparaginazė, MTX ir gemcitabinas, yra veiksmingiausios skleidžiamai NKTCL, taip pat ribotais ANKL 4, 48 atvejais, siūlančios naujas ugniai atsparių NK neoplazmų gydymo galimybes, atkreipiant dėmesį į nukleotidų pažeidžiamumą. sintezė.

Medžiagos ir metodai

Pacientų ir mėginių aprašymas

Į šį tyrimą buvo įtraukti 39 pacientai, sergantys ANKL iš 10 medicinos centrų Kinijoje. Pagrindinės klinikinės charakteristikos pateiktos papildomos informacijos S1 lentelėje. WGS, CD56 + CD3 - NK ląstelės ir suderinti CD33 + CD14 - granulocitai iš 8 ANKL sergančių pacientų buvo išskirti, naudojant fluorescenciniu būdu aktyvuotą ląstelių rūšiavimą (FACS). Atliekant transkripto analizę, FACS buvo išskirtos 7 ANKL sergančių pacientų ir 4 sveikų donorų CD56 + CD3 - NK ląstelės. Rūšiavimo strategija parodyta Papildomos informacijos S2 paveiksle. 29 ANKL sergantiems pacientams buvo atlikta AmpliSeq 36 mutavusių genų seka. Tyrimą patvirtino Institucijų peržiūros taryba. Informed consent was obtained from each individual in accordance with the principles expressed in the Declaration of Helsinki.

Whole genome and transcriptome sequencing, and data analyses

We performed WGS for CD56 + CD3 NK cells and matched CD33 + CD14 granulocytes from 8 ANKL patients. We conducted a genome-wide analysis of somatic SNVs, copy number variations and structural variations using GVC utilities, including GVC-SNV 6, GVC-CNV and GVC-SV 6 . We performed RNA sequencing of both patient and cell line samples. Differentially expressed genes were identified using DESeq 49 and DEGseq 50 software. The pathways significantly enriched in differentially expressed genes were analyzed with the DAVID 51 and IPA tools. Enrichment analysis of the gene signatures was performed using GSEA software 52 . The raw sequence data reported in this paper have been deposited in the Genome Sequence Archive 53 in BIG Data Center 54, Beijing Institute of Genomics (BIG), Chinese Academy of Sciences, under accession numbers PRJCA000224, PRJCA000224 that are publicly accessible at //bigd.big.ac.cn/gsa. Detailed library construction and data analysis are described in Supplementary information, Data S1.

Integrative analysis of genomic and transcriptomic data by TieDIE

To construct biological networks, we used an integrative method called TieDIE for the genomic and transcriptional data. TieDIE 22 (Tied Diffusion through Interacting Events) is an integrative analysis method that employs a network diffusion approach to connect genetic perturbations (eg, somatic mutations) with transcriptional changes. We used 313 genes with non-synonymous mutations identified in 8 ANKL patients as the upstream of the input and 778 transcriptionally upregulated genes as the downstream of the input. The obtained networks using default parameters were drawn using Cytoscape (Figure 3A).

Significantly mutated network identified by HotNet2

We identified significantly mutated sub-networks using HotNet2 11, which uses a directed heat diffusion model to calculate the significance of mutations in individual genes and the local topology of interactions among the encoded proteins to overcome the limitations of pathway-based enrichment statistics. All 313 genes with non-synonymous SNVs and 24 filtered genes from CNA-containing regions were used in the analysis. The filtered genes must be in consistent CNAs of at least 5 patients, and the FPKM values of the gene must be larger than 0.1. The networks are shown in Supplementary information, Figure S6.

Mutation validation in ANKL patients using AmpliSeq

Ion Torrent AmpliSeq was used for targeted sequencing of 28 mutated genes identified in the WGS analysis of 8 ANKL patients and 8 frequently mutated genes in NKTCL 7, 12 . Based on ultrahigh-multiplex PCR, Ion AmpliSeq technology requires as little as 10 ng of input DNA from bone marrow smear samples to target sets of genes. The percentages of leukemia cells in bone marrow detected by flow cytometry of all included cases were between 8.0% and 76.0%, with an average of 29.4%. Only cases with over 10% leukemia cells were included. We designed primers for 36 target genes (Supplementary information, Table S5) for deep sequencing. We collected 34 samples from ANKL patients and 2 granulocyte samples in total. Five ANKL samples with targeted rates < 90% due to degradation were removed.

Cytokine chip array analysis

A custom-designed RayBio Sandwich-based Antibody Array (RayBiotech, Norcross, GA, USA) was spotted with specific antibodies against 20 inflammatory cytokines (IL-1α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, MIP-1α, TNFα, IFN-γ, TGF-β, CD163, IL-8, IFN-α, IFN-β, MCP-1, IL-3). The plasma cytokine levels were measured according to the manufacturer's instructions. Slides were scanned using an InnoScan 300 Microarray Scanner (Innopsys, France) at 532 nm with a resolution of 10 μm. Visi tyrimai buvo atlikti dviem egzemplioriais. Statistical analysis was performed with Student's t -test or Student's t -test with Welch's correction using GraphPad Prism 6.0c. Statistical significance was defined as P < 0.05.

Imunohistochemija

The immunohistochemical staining of CD56, STAT3 phosphorylation (pSTAT3) and MYC in the bone marrow biopsy specimens were performed in ANKL and control samples, respectively. Lymphoma patients without bone marrow involvement were used as controls. The method of immunohistochemistry is described in Supplementary information, Data S1.

Ląstelių linijos

KHYG-1 was obtained from the Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) cell bank. NK-92 was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). YT was a gift from Dr Kai Fu at the University of Nebraska Medical Center. All cell lines were authenticated by short tandem repeat (STR) analysis and tested negative for mycoplasma contamination by R&D MycoProbe Mycoplasma Detection Kit. The cell culture methods are described in Supplementary information, Data S1.

Ląstelių gyvybingumo tyrimai

Cells were seeded in 96-well plates in triplicate at a density of 1 × 10 4 cells/100 μL/well. For assays with Stattic (Sigma, Taufkirchen, Germany), the cells were treated with DMSO or the indicated concentrations of Stattic for 16 h. For assays with IL10 and IL18 (Life Technologies, USA), ANKL cell lines were pre-treated with a base dose of IL2 overnight and then stimulated with the indicated concentrations of IL10 or IL18 for 24 h. Cell viability was assayed with Cell Counting Kit-8 reagent (Dojindo, Japan), and the relative cell viability was calculated by normalizing to the vehicle control. The half-maximal inhibitory concentration (IC 50 ) values were calculated by non-linear regression curve fitting using GraphPad Prism 6.0c. For all assays, at least three independent experiments were performed.

Colony-forming assays

KHYG-1 cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells/500 μL/well and cultured in RPMI-1640, 1% methylcellulose (Sigma, Taufkirchen, Germany) and 10% FBS supplemented with 500 IU/mL IL2. The cells were maintained at 37 °C in a 5% CO 2 and a > 95% humidity atmosphere for 14 days. Colony numbers were counted using a microscope equipped with a 2× objective and a 10× ocular eyepiece. Visi tyrimai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

Statistinė analizė

The Mann-Whitney U -test and Student's t -test were used for comparison of the results and were calculated using R and GraphPad Prism 6.0c software. Selections of all statistical analysis methods meet the assumptions of the tests. Equality of variances between the groups was statistically compared.

Autoriaus įnašai

JZ, QW and Liang H designed the project. NW, YT and XM performed cytokine array analyses and cell sorting. YT, NW, Hui L, XH, LS, LZ and MX performed cell line assays. Liang H, YT, JZ and QW mainly analyzed the experiment data. DL, SL, JW and Lingtong H performed sequencing data analyses. LC, LD, XZ, PS, JH, SM and JY assisted sequencing data analyses. SL and Lingtong H performed the validation of variations. DW, YL, KZ and ZS collected clinical data. Hongs Z, QL, Hongy Z, JL, JJ, LF, WZ, JC and XD provided clinical samples and relevant information. GQ, Hud L, XL, GH and DM provided support for the project. QW, JZ, YT, DL, SL and Liang H wrote the manuscript.

Konkurencingi finansiniai interesai

Autoriai nedeklaruoja jokių konkuruojančių finansinių interesų.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija, S1 pav

    Strategies for the integrative analysis of ANKLs.

  2. 2.

    Papildoma informacija, S2 pav

    Isolation of granulocytes, leukemia NK cells and normal NK cells.

  3. 3.

    Papildoma informacija, S3 pav

    Frequency of somatic SNV of ANKL and 40 additional cancer types.

  4. 4.

    Papildoma informacija, S4 pav

    EBV reads number of leukemia NK cells and granulocytes from 8 ANKL patients.

  5. 5.

    Papildoma informacija, S5 pav

    KEGG pathway enrichment analysis of protein-altering somatic SNVs.

  6. 6.

    Papildoma informacija, S6 pav

    Functional enrichment analysis of genomic alterations with HotNet2.

  7. 7

    Papildoma informacija, S7 pav

    STAT3 and STAT5B mutations identified in ANKL patients.

  8. 8.

    Papildoma informacija, S8 pav

    TET2 mutations identified in ANKL patients.

  9. 9.

    Papildoma informacija, S9 pav

    Semi-quantitative immunoreactivity histological scores of MYC staining in bone marrow biopsy of ANKL and control samples.

  10. 10.

    Papildoma informacija, S10 pav

    Functional enrichment map for MYC-signature genes that were upregulated in ANKLs compared to healthy donors.

  11. 11.

    Supplementary information, Figure S11

    The effect of IL10 or a STAT3 inhibitor (Stattic) on the apoptosis of ANKL cell lines.

  12. 12.

    Supplementary information, Figure S12

    The effect of IL10 and the STAT3 inhibitor (Stattic) on the mRNA expression of MYC in ANKL cell lines.

  13. 13.

    Supplementary information, Figure S13

    The rate of EdU incorporation in JQ1-treated ANKL cell lines.

  14. 14

    Supplementary information, Figure S14

    Gene-set enrichment analysis (GSEA) of known MYC and STAT3 signatures.

  15. 15.

    Supplementary information, Figure S15

    Enrichment of metabolic pathways in primary ANKL leukemia cells and ANKL cell lines.

  16. 16.

    Supplementary information, Figure S16

    The effect of STAT3 Y640F mutant on the phosphorylation of STAT3 and mRNA expression of MYC target gene.

  17. 17.

    Supplementary information, Figure S17

    The effect of IL10 on the mRNA expression of MYC and MYC target genes in KHYG-1 cell line transfected with STAT3 Y640F mutant.

  18. 18.

    Supplementary information, Figure S18

    The effect of IL10 on STAT3 phosphorylation, MYC expressionand the proliferation of STAT3 Y640F-mutant ANKL cell line YT.

  19. 19.

    Supplementary information, Figure S19

    Quantitative analysis of the Epstein-Barr virus (EBV) load in ANKL patients and healthy donors with whole-transcriptome sequencing (WTS) data.

  20. 20.

    Supplementary information, Figure S20

    Expression of EBV-encoded small RNAs in primary ANKL leukemia cells.

  21. 21.

    Supplementary information, Figure S21

    A large gain across MYC and an inter-chromosomal translocation detected by GVC-CNV and GVC-SV in ANKL No.19.

  22. 22.

    Papildoma informacija, S1 lentelė

    Patient characteristics of ANKL.

  23. 23

    Papildoma informacija, S2 lentelė

    SNVs identified in ANKL NK leukemia cells.

  24. 24

    Papildoma informacija, S3 lentelė

    CNVs identified in ANKL NK leukemia cells.

  25. 25

    Papildoma informacija, S4 lentelė

    SVs identified in ANKL NK leukemia cells.

  26. 26

    Papildoma informacija, S5 lentelė

    AmpliSeq targeted sequencing results of ANKLs.

  27. 27

    Supplementary information, Table S6

    Comparison of the mutational profiles between ANKL and NKTCL 10, 11 .

  28. 28.

    Supplementary information, Table S7

    H-score of phosphorylated STAT3 and corresponding STAT mutation status of ANKL cases.

  29. 29

    Supplementary information, Table S8

    Differentially upregulated genes in ANKL leukemia cells in comparison with normal controls.

  30. 30.

    Supplementary information, Table S9

    Differentially downregulated genes in ANKL leukemia cells in comparison with normal controls.

  31. 31

    Supplementary information, Table S10

    KEGG pathway enrichment analysis of upregulated genes in ANKL leukemia cells.

  32. 32.

    Supplementary information, Table S11

    KEGG pathway enrichment analysis of downregulated genes in ANKL leukemia cells.

  33. 33.

    Supplementary information, Table S12

    IPA metabolic pathways analysis of ANKL and tumors that have known metabolic features.

  34. 34.

    Supplementary information, Table S13

    Sequencing depth information of 8 WGS ANKL patients.

  35. 35.

    Supplementary information, Table S14

    Primers for quantitative RT-PCR

  36. 36.

    Papildoma informacija, duomenys S1

    medžiagos ir metodai

    ( Papildoma informacija yra susieta su internetine straipsnio versija ląstelių tyrimų svetainėje.)