Interferono sukeltas transmembraninio baltymo-3 genetinis variantas rs12252-c susijęs su sunkiu gripu kinams | gamtos komunikacijos

Interferono sukeltas transmembraninio baltymo-3 genetinis variantas rs12252-c susijęs su sunkiu gripu kinams | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Genetinė variacija
  • Gripo virusas
  • Interferonai
  • Virusinė epidemiologija

Anotacija

SNP rs12252-C aleliai keičia interferono sukelto transmembraninio baltymo-3 funkciją, padidindami gripo viruso infekcijos sunkumą kaukaziečiams, tačiau alelis yra retas. Tačiau rs12252-C yra daug labiau paplitęs Hanų k. Čia pranešame, kad CC genotipas nustatytas 69% kinų pacientų, sergančių sunkia pandeminio gripo A H1N1 / 09 viruso infekcija, palyginti su 25% pacientų, sergančių lengva infekcija. Konkrečiai buvo įvertinta, kad CC genotipas sukelia šešiskart didesnę sunkios infekcijos riziką nei CT ir TT genotipai. Svarbiau yra tai, kad rizikos genotipas pasitaiko taip dažnai, kad jo poveikis išauga į didelę populiacijos priskiriamą 54, 3% sunkios infekcijos riziką tirtoje Kinijos populiacijoje, palyginti su 5, 4% šiaurės europiečių. Todėl interferono sukeltos transmembraninio baltymo-3 genetiniai variantai gali turėti stiprią gripo epidemiologiją Kinijoje ir kinų kilmės žmonėms.

Įvadas

Yra tvirtų įrodymų, kad interferono sukeltas transmembraninis baltymas-3 (IFITM3) yra viruso restrikcijos faktorius, tarpininkaujantis ląstelių atsparumui gripo virusams ir kitiems virusams, kurie į ląsteles patenka per rūgštinę endosomą 1, 2, 3 . IFITM3 svarbą gripo viruso infekcijoje nustatė Everitt ir kt. 4, kurie parodė, kad gripo viruso infekcijos sunkumas žymiai padidėjo IFITM3 nokautuotoms pelėms, palyginti su laukinio tipo gyvūnais. Žmonėms retas IFPM3 SNP rs12252-C alelis sutraukia baltymą, todėl sumažėja viruso replikacijos in vitro apribojimas 4, 5 . Šiaurės Europos pacientams, užsikrėtusiems ir paguldytiems į sezoninio gripo ar pandeminio gripo A (H1N1) pdm / 09 (pH1N1 / 09) virusą, IFITM3 padidėjo SNP rs12252 nedidelio C alelio homozigotiškumas (5, 7 palyginti su 0, 3%, n = 53). Tai buvo pirmieji tiesioginiai šeimininko genetinės įtakos žmonių gripo sunkumui įrodymai. Tačiau dėl Šiaurės Europos kilmės žmonių jautrumo alelio (nedidelio alelių dažnio = 0, 034) retumo bendras poveikis pandeminio ar sezoninio gripo viruso sunkumui yra tikėtinas mažas. Tačiau žinoma, kad Hanit kinų IFITM3 rs12252 jautrumo alelio dažnis yra daug didesnis (mažas alelių dažnis = 0, 5). Čia išnagrinėsime šio polimorfizmo įtaką gripo A viruso infekcijos sunkumui pacientams iš Kinijos. 2009 m. Pandemijos H1N1 virusu užsikrėtę pacientai Kinijoje nustatė stebėtinai didelį CC genotipo dažnį, palyginti su lengva infekcija ir sveikais hainais. Tai reiškia, kad IFITM3 geno variantas daro įtaką ligos sunkumui, o ne jautrumui infekcijai. Be to, naudodamiesi statistinės analizės priemonėmis, mes apskaičiavome, kad pacientams, turintiems CC genotipą, yra šešiskart didesnė sunkios infekcijos rizika, palyginti su pacientais, kuriems nustatytas CT ir TT genotipas. Dėl daug aukštesnio CC alelio lygio gyventojų Han Han kinuose, palyginti su kaukaziečiais, kinams gali padidėti sunkios ligos rizika užsikrėsti gripu.

Rezultatai

Tiriamųjų klinikinės ir laboratorinės charakteristikos

2009 m. Pandemijos metu Kinijos ligoninės priėmė pacientus, sergančius sunkia infekcija, taip pat neįprastai pacientais, sergančiais lengva infekcija, kuriems įprastomis sąlygomis nereikia hospitalizuoti. Ši „atvirų durų“ politika suteikė unikalią galimybę užfiksuoti palyginti nepasirinktą pacientų grupę, kurios rezultatai skiriasi, stebimi ir tvarkomi panašiomis klinikinėmis sąlygomis. Šioje grupėje 83 pacientai atitiko įtraukimo kriterijus (gripo pdmH1N1 / 09 infekcija, patvirtinta viruso genomo PGR tyrimu, galinčiu duoti pagrįstą sutikimą) ir pašalinimo (kortikosteroidų ar kitų imunosupresantų vartojimas 1 mėnesį prieš imant mėginius ar jų metu, kartu gydomų ligų) kriterijus., nėštumas, teigiamos bakterijų kultūros iš kvėpavimo takų sekreto / skreplių ar kraujo bet kuriame priėmimo ligoninės taške). Kraujas buvo imamas praėjus 2 ar 3 dienoms po priėmimo ir pacientų progresas buvo stebimas visą jų buvimo ligoninėje laiką. Išleidimo metu pacientai buvo suskirstyti į pacientus, sergančius „lengva“ ir „sunkia“ liga, atsižvelgiant į klinikinius duomenis per visą jų buvimo laiką. Nelengva liga ( n = 51) buvo apibūdinta kaip tik tie, kuriems pasireiškė simptomai (karščiavimas, kosulys, galvos skausmas ir letargija) ir kurių kraujyje cirkuliuojančių leukocitų profilis (bendras leukocitų, limfocitų ir neutrofilų kiekis) buvo normalus visos buvimo ligoninėje metu. Pacientai, sergantys sunkia liga ( n = 32), buvo tie, kurie pranešė apie aukščiau aprašytus simptomus, tačiau pablogėjo ir išsivystė pneumoninis konsolidacija ir (arba) dvišaliai infiltratai krūtinės ląstos rentgenogramoje su kvėpavimo nepakankamumu ar be jo (apibrėžta kaip PaO 2 / FiO 2 <200 mm Hg). arba kvėpavimo nepakankamumas su išplitusiu kraujagyslių koagulopatija ar inkstų nepakankamumu (tik 1 iš 32 pacientų). Visi sunkios grupės pacientai (32/32) vartojo Oseltamivir, o 38/51 pacientų, sergančių lengvos grupės pacientais, skyrė Oseltamivir. Nei vienam pacientui nebuvo pleuros ar emfemijos. Šeši pacientai buvo mechaniškai vėdinami, ir jie visi buvo tarp trylikos stipriai užkrėstų pacientų, kurie mirė. Demografiniai duomenys pateikti 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

C alelis SNP 12252 buvo susijęs su ligos sunkumu

Šiems 83 pH1N1 / 09 infekuotiems žmonėms mes sukūrėme 300 bazinių IFITM3 lokuso porų, apimančių SNP rs12252, seką. Iš jų 42, 17% turėjo CC genotipą - didesnį dažnį nei Hanų kinai 1000 genomo sekų duomenų bazėje (25, 38% CC genotipo; ( P = 0, 0001, χ 2 -testas)) (2 lentelė, 1a ir b pav.) ). Remdamiesi klinikiniu vertinimu, hospitalizavome pacientus į lengvus ir sunkius (1 lentelė). Lengvai sergantiems asmenims alelių dažnis nebuvo reikšmingas, palyginti su Hano kinų populiacija ( P = 0, 36, χ 2- testas). Sunkiai sergantiems pacientams alelių dažnis buvo žymiai skirtingas, palyginti su lengvais atvejais ( P = 0, 000007, χ 2 testas), ir palyginti bendrą Han kinų populiaciją ( P = 0, 000005, χ 2 testas). Žymiai didesnis homozigotinio CC genotipo dažnis buvo nustatytas pacientams, kuriems išsivystė sunki liga (68, 75%, P = 0, 0001) (2 lentelė, 1b ir c pav.). Dešimt iš trylikos mirusių pacientų turėjo CC genotipą.

Pilno dydžio lentelė

Image

a ) Alelių dažnis buvo gautas vykdant 1000 genomų projektą: alelių dažnis skirtingose ​​populiacijose labai skiriasi. b ) Alelio dažnis, gautas iš gripo A pH1N1 / 09, patvirtintas pacientams iš Pekino You'an ligoninės. c ) pacientų, sergančių CC ar CT / TT genotipu ir turinčių patvirtintą gripo A gripo pH1N1 / 09 infekciją, procentas nuo Pekino You'an ligoninės.

Visas dydis

Recesyvinis modelis turi didžiausią šansų santykį

Mes išanalizavome rs12252 ryšį su sunkia infekcija, palygindami su silpnai užkrėstais asmenimis, darant prielaidą, kad skirtingi genetiniai modeliai (3 lentelė). Galėtume aiškiai įvertinti, ar viena (dominuojanti), ar dvi C alelio kopijos (recesyviniai) padidina sunkios infekcijos riziką, taip pat ar rizikos padidėjimas yra reikšmingas darant prielaidą, kad dauginantis (CT padidėja r , CC padidėja r, 2 - CC). arba priedų modeliai ( r padidėjimas CT, 2 r padidėjimas CC genotipui). Visi modeliai, išskyrus dominuojantį modelį, rodo reikšmingą ryšį su sunkia infekcija su recesyviniu modeliu, kurio šansų santykis yra didžiausias. Visų pirma, taikant daugybinį modelį, C alelio nešiotojai parodė trigubai padidėjusią sunkios infekcijos riziką, palyginti su T alelio nešiotojais (dauginamasis modelis P - reikšmė = 7, 936 × 10 −4, šansų santykis = 3, 42, 95%). pasitikėjimo intervalas 1, 63–7, 17). Remiantis recesyviniu modeliu, nustatyta, kad C alelio homozigotai turi didesnę, šešiskart didesnę sunkios infekcijos riziką, palyginti su T alelio heterozigotais ir homozigotais (recesyvusis modelis P - vertė = 2, 01 × 10 −4, šansų santykis = 6, 43). 95% pasikliautinasis intervalas 2, 42–17, 1).

Pilno dydžio lentelė

Padidėjęs monocitų chemotaktinio baltymo-1 kiekis serume pacientams, sergantiems CC genotipu

Kartu šie tyrimai leidžia manyti, kad CC variantas nedidina pradinės virusinės infekcijos tikimybės, bet yra susijęs su ligos sunkumu, nors norint tai įrodyti, reikia atlikti didesnį tyrimą su kita populiacija. Citokinų monocitų chemotaktinis baltymas-1 (MCP-1) yra padidėjęs sergant keliomis virusinėmis infekcijomis, o IFTIM3 išmuštų pelių plaučiuose padidėjo po gripo viruso infekcijos 4 . Suskirstę pacientus pagal IFTIM3 genotipą, pacientų, kuriems nustatytas CC genotipas, MCP-1 koncentracija kraujo serume buvo žymiai padidėjusi, palyginti su pacientais, sergančiais CT ar TT genotipu ( P = 0, 002) (2a pav.). Taip pat pacientams, kuriems nustatytas CC genotipas ( P = 0, 04), nustatėme aukštesnį gripo A pH1N1 / 09 specifinių antikūnų lygį (2b pav.). Šie duomenys rodo, kad CC genotipas yra susijęs su atviresniu imuniniu atsaku, kurį gali sukelti didesnė viruso (antigeno) apkrova. Tarp pacientų, turinčių CC genotipą ir be jo, reikšmingų T-ląstelių atsakų skirtumų, matuojant gama interferono ELISpot tyrimais su peptidais, apimančiais visą viruso proteomą, nepastebėome. (2c pav.)

Image

a ) serumo MCP-1 lygis pacientams, kuriems nustatytas CC ir CT / TT genotipas. b ) A gripo viruso (H1N1) pdm / 09 specifinių antikūnų kiekiai pacientams, kuriems nustatytas CC genotipas ir CT / TT genotipas. ( c ). Bendras A gripo viruso (H1N1) pdm / 09 specifinių T ląstelių atsakas pacientams, kuriems nustatytas CC genotipas ir CT / TT genotipas.

Visas dydis

Diskusija

Mūsų duomenys rodo, kad IFITM3- SNN rs12252 Kinijos populiacijoje yra susijęs su ligos sunkumu po gripo viruso infekcijos. IFITM3 riboja gripo viruso infekcijos dauginimąsi žmonėms ir pelėms; tačiau IFITM3 CC homozigotai labiau kenčia nuo sunkios kvėpavimo sistemos patologijos tiek JK baltaodžių, tiek kinų kinų tarpe . Skubiai reikia atlikti didesnio masto tyrimus, kad būtų galima nustatyti, ar IFITM3-sn12252 genotipas Hano kinų ir kitiems Azijos pacientams, užsikrėtusiems gripo virusu, gali numatyti tuos, kuriems ankstyva infekcija gali progresuoti iki sunkios ligos. Jomis gali būti įmanoma pagerinti jų prognozę, anksti sustiprinant jų gydymą. Be to, renkantis pacientus klinikiniams tyrimams ir gripo viruso infekcijos tyrimams turėtų būti atsižvelgiama į genotipo nustatymą, ypač tiems, kuriems virusas sukelia mažai patogeniško viruso. SNP spausdinimas Kinijoje kainuoja ~ 8 USD už mėginį, ir tai galima būtų padaryti daugelyje didelių ligoninių laboratorijų.

IFITM3 poveikis nepriklauso nuo gripo viruso potipio, ribojantis A ir B gripo virusus 4 . Šiame tyrime parodytas poveikis mažai patogeniško A gripo viruso sunkumui žmonėms. Patogeniškesniam virusui, tokiam kaip paukščių H5N1 gripo virusas, kurio mirtingumas yra didelis (59%) 6, gali būti, kad CC genotipas gali sustiprinti ligą arba kad virulentiškas virusas nusveria įprastą apsauginį CT ir TT poveikį. genotipai. Tai reikės toliau tirti. Būsimuose tyrimuose taip pat bus klausiama, ar ligos eiga skiriasi sunkiai užsikrėtusiems pacientams, kuriems nustatytas CC genotipas, ir tiems, kurie turi CT ar TT genotipus.

Įdomu, kad CC 4 genotipas yra retas šiaurės europiečių ir paplitęs Azijos populiacijose. Kadangi IFITM3 in vitro riboja daugelį kitų virusinių infekcijų, įskaitant sunkų ūminio kvėpavimo sindromo (SARS) koronavirusą, Dengue viruso virusą ir Vakarų Nilo virusą 1, 7, aukštą populiacijos alelių dažnį galėjo paveikti sudėtingas viruso poveikis.

Įvertinimas, kiek asmenų susirgs sunkia infekcija būtent dėl ​​jų CC genotipo, yra apskaičiuojamas pagal populiacijai priskirtiną riziką (PAR). Tai labai priklauso nuo rizikos genotipo dažnio populiacijoje. Kadangi rizikos genotipas Kinijos populiacijoje pasitaiko labai dažnai, jo poveikis pasireiškia dideliu PAR, kuris sudaro 54, 25% sunkios infekcijos. Tai yra daug daugiau nei atitinkamas 5, 39% PAR europiečiams ir tai reiškia, kad sunkios gripo infekcijos paplitimas kinų kinų gali būti didesnis nei šiaurės europiečių. Tai turėtų būti išnagrinėta atliekant būsimus epidemiologinius tyrimus.

Apibendrinant, mūsų duomenys aiškiai pratęsia ankstesnį Europos kohortos pastebėjimą, kad IFTM3-rs12252CC genotipas yra reikšmingai susijęs su gripo sunkumu. Tai pirmiausia siejama su ligos sunkumu, o ne su jautrumu infekcijai, nors norint įrodyti šią specifinę asociaciją, reikia atlikti didesnius tyrimus. IFITM3 gali atlikti svarbų vaidmenį viruso replikacijoje ir skleidime po pirminės infekcijos. Dėl daug aukštesnio Han genotipo CC genotipo lygio, palyginti su kaukaziečiais, kinams gali kilti didesnė rizika susirgti gripu dėl gripo. Nežinoma, ar tie, kurie sunkiau užsikrėtę gripo virusu, yra linkę plisti. Tokiu atveju didelis C alelio dažnis Azijos populiacijose gali įtakoti gripo epidemiologiją.

Metodai

Dalykai

Pacientai buvo įdarbinti iš Pekino You'an ligoninės Pekine nuo 2009 m. Birželio mėn. Iki 2010 m. Sausio mėn. Tyrimą patvirtino Pekino You'An ligoninės institucinė apžvalgos taryba. Iš visų pacientų buvo gautas informuotas rašytinis sutikimas.

Rs12252 sekos nustatymas ir genotipas

Genominė DNR buvo išgauta iš periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių, naudojant „PureGene“ DNR išskyrimo rinkinį („Gentra Systems“, Mineapolis, MN, JAV). Regionas, apimantis žmogaus IFITM3 rs12252 sekas, buvo amplifikuotas polimerazės grandinine reakcija. Amplifikacija buvo atlikta naudojant šiuos priekinius ir atvirkštinius pradmenis: 5′-GGAAACTGTTGAGAAACCGAA-3 ′ ir 5′ – CATACGCACCTTCACGGAGT-3 ′ (Pekino genomikos institutas (BGI), Šendženas, Kinija). PGR produktai buvo išgryninti ir padalinti sekvencija naudojant „Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer“ (GATC Biotech). Vieno nukleotido polimorfizmai buvo nustatyti naudojant „Chromas“ (Technelysium Pty Ltd) BGI, Šendženas, Kinija.

MCP-1 kiekybinis įvertinimas

Iki analizės EDTA atskirtas serumas buvo laikomas –80 ° C temperatūroje. MCP-1 buvo išanalizuotas naudojant žmogaus citokinų daugialypį testą (Bio-Rad, JAV) ir Luminex daugiaanalitinio profiliavimo technologiją (Bio-Rad, JAV) pagal gamintojo instrukcijas, kaip aprašyta anksčiau 8 . Trumpai tariant, serumo mėginiai buvo praskiesti santykiu 1: 4 mėginio skiedikliu, o etalonai buvo paruošti standartiniame skiediklyje. Standartai ir mėginiai inkubuojami su magnetinėmis granulėmis 96 šulinėlių plokštelėje 30 min. Kambario temperatūroje. Po to į kiekvieną šulinėlį buvo dedama aptikimo antikūnų ir inkubuojama kambario temperatūroje dar 30 min. Streptavidin-PE buvo naudojamas kaip fluoro chromas aptikti antikūnus. Naudojant „Bio-Plex Manager“ programinės įrangos versiją 6.0, buvo atliktos standartinės „Luminex“ priežiūros procedūros, o sistemai kalibruoti buvo naudojamos „Bio-Plex CAL1“ ir „CAL2“ granulės.

Hemagliutinacijos slopinimo tyrimas

Antikūnų titrai serumo mėginiuose buvo nustatyti atliekant hemagliutinacijos slopinimo testą, kaip aprašyta anksčiau 9 . Trumpai tariant, serumo mėginiai buvo gydomi receptorių, naikinančio fermentą iš Vibrio cholerae, praskiedžiant vieną serumo dalį trijų dalių fermentu, ir buvo inkubuojami per naktį 37 ° C vandens vonioje, po to 30 min. Buvo inaktyvuojami termiškai 56 ° C temperatūroje. PSO (Pasaulio sveikatos organizacijos) standartinė procedūra. Serumo mėginiai buvo praskiedžiami dvigubais praskiedimais nuo 1:20 iki 1: 640, o po to sumaišomi su 1% vištienos raudonųjų kraujo kūnelių suspensija ir keturiais hemagliutinuojančiais vienetais vietinio izoliuoto viruso A / California / 07/2009 viruso kamieno.

Sintetiniai peptidai

Iš viso buvo susintetinti 893 15–18 merų peptidai, persidengiantys 10 aminorūgščių liekanų ir apimantys visą 2009 m. Epidemijos H1N1 gripo viruso proteomą (PEPscreen; Sigma-Aldrich), naudojant A / California / 04 / 2009 (H1N1) kamienai. Buvo sukurti šeši persidengiantys peptidų fondai, vaizduojantys aštuonis vidinius baltymus.

Ex vivo interferono-γ ELISpot tyrimas

12–16 h interferono-γ ELISpot tyrimai buvo atlikti naudojant kriofiziškai konservuotas periferinio kraujo mononuklearines ląsteles (PBMC), kaip aprašyta anksčiau 10 . Kiekviename ELISpot šulinyje buvo naudojami du lakiai penkiasdešimt tūkstančių PBMC, kurių galutinis tūris buvo 100 μl. Galutinė peptido koncentracija kiekviename šulinyje buvo 2–3, 5 μM tiriant peptidų telkinius ir 2 μM tiriant atskirus peptidus. Neigiamai ir teigiamai kontrolei PBMC buvo inkubuoti atitinkamai su terpėmis ir atitinkamai su fitohemagliutininu (Wellcome). Taškų formavimo vienetai (SFU) buvo suskaičiuoti naudojant automatinį ELISpot skaitytuvą (AID). Atsakymai buvo laikomi teigiamais, kai SFU skaičius viename šulinyje buvo didesnis nei tris kartus didesnis už vidutinę neigiamos kontrolinės vertės reikšmę duotame tyrime ir keturis kartus viršija vidutinę neigiamą kontrolinę vertę, gautą atlikus visų dalyvių atranką peptidų fonde. Pakoreguotas SFU, atėmus vidutines neigiamas vertes, buvo išreikštas kaip SFU / 1 000 000 PBMC.

Statistinė analizė

Statistinė genetinių duomenų analizė buvo atlikta naudojant χ 2 testą ir R statistų biblioteką R statistikos pakete 11 . Asociacijos tyrimams pagal skirtingus genetinius modelius papildomai buvo naudojamas tikslus Fišerio testas, nes χ 2 apytikslė vertė gali neatitikti mažų mėginių. Asociacijos pagal priedų genetinį modelį bandymui buvo naudojamas „Cochran-Armitage“ tendencijos testas. Rs12252 ryšys su sunkia infekcija buvo įvertintas analizuojant sunkiai užkrėstus asmenis nuo lengvai užkrėstų asmenų. Pastarieji neparodo reikšmingų skirtumų su Hano populiacija, palyginti su 1 000 genomų projektu, ir yra geriau suderinta populiacija pagal sunkiai užkrėstų mėginių grupę.

Nelyginis santykis, apskaičiuotas tam tikros rizikos aleliui (arba genotipui) susieti, atspindi santykinį rizikos alelio pavojų, atsižvelgiant į tai, kad sunkios infekcijos dažnis yra pakankamai mažas. PAR buvo įvertinta remiantis prielaida, kad silpnai infekuotų asmenų rizikos genotipo (CC) dažnis atspindi genotipo populiacijos dažnį. PAR skaičiavimui naudojama formulė:

PAR% = 100 × p (RR − 1) / [ p (RR − 1) +1], kur p žymi rizikos genotipo dažnį populiacijoje, o RR žymi santykinę rizikos genotipo (CC) riziką. Skaičiuojant PAR šiaurės europiečiams, buvo naudojamas hospitalizuotų pacientų ir Šiaurės Europos gyventojų genotipų skaičius iš 1000 genomų projekto, kaip nurodyta Everitt et al . 4

Visos kitos statistinės analizės buvo atliktos naudojant „GraphPad Prism v 5“ („GraphPad Software“, San Diegas, CA). Siekiant palyginti hemagliutinacijos slopinimo lygius, amžių, baltųjų kraujo kūnelių kiekį, neutrofilų skaičių ir tt tarp lengvos ir sunkios ligos, buvo naudojami nepriklausomi mėginiai t- testas, kur duomenys buvo paskirstyti paprastai (vertinant pagal Kolmogorovo – Smirnovo testą); Manno – Whitney testas buvo naudojamas ten, kur duomenys paprastai nebuvo paskirstomi (MCP-1). Chi-kvadrato testai buvo naudojami norint įvertinti lyties, gretutinių ligų, pneumonijos ir kvėpavimo nepakankamumo skirtumus tarp lengvų ir sunkių grupių.

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį: Yong-Hong Zhang ir kt. Interferono sukeltas transmembraninio baltymo-3 genetinis variantas rs12252-C yra susijęs su sunkiu gripu Kinijos asmenims. Nat. Bendruomenė. 4: 1418 doi: 10.1038 / ncomms2433 (2013).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.