Vidinis epitopų žymėjimas, kurį sąlygoja santykinis sekos išsaugojimo trūkumas | mokslinės ataskaitos

Vidinis epitopų žymėjimas, kurį sąlygoja santykinis sekos išsaugojimo trūkumas | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • CRISPR-Cas9 genomo redagavimas
  • Genetinė inžinerija
  • Zebrafish

Anotacija

Daugelis eksperimentinių metodų priklauso nuo specifinio baltymų atpažinimo ir griežto antikūnų surišimo. Tai nesunkiai galima pasiekti įdiegus epitopo žymą. Mes panaudojome metodą, kuris naudoja santykinį evoliucijos išsaugojimo trūkumą, kad būtų galima informuoti apie epitopo žymės vietos pasirinkimą, o po to sekė žymelę koduojančios sekos integracija į endogeninį zebrafish lokusą. Mes parodėme, kad vidinis epitopo žymėjimas yra prieinamas antikūnams surišti, o pažymėti baltymai išlaiko laukinio tipo funkciją.

Įvadas

Didelio pralaidumo eksperimentiniai metodai, tokie kaip chromatino imuninis nusodinimas ir imunoprecipitacinė masių spektrometrija, priklauso nuo tvirto ir labai specifinio dominančio baltymo atpažinimo naudojant antikūnus 1, 2 . Šiems eksperimentiniams metodams palengvinti buvo naudojami du metodai. Pirmasis yra antikūnų prieš dominantį baltymą generavimas. Deja, pasirinktinių antikūnų gaminimas užima daug laiko ir ne visada duoda pakankamos kokybės antikūnus. Net tada, kai susidaro patenkinami antikūnai, kiekvienam naujam antikūnui reikia optimizuoti paskesnes eksperimentines procedūras. Antrasis metodas yra išreikšti dominantį baltymą gerai apibūdintu epitopu, tokiu kaip V5, FLAG ar Myc 3 . Tai leidžia tyrėjams naudoti komerciškai prieinamus patvirtintus reagentus ir protokolus paskesnėms programoms. Istoriškai šio metodo trūkumas buvo tas, kad pažymėtas baltymas yra ekspresuojamas per negimdinės raiškos sistemą. Negimdinė išraiška beveik neišvengiamai lemia nefiziologinį išraiškos lygį, todėl tarp galimų baltymų ir baltymų arba baltymų ir DNR sąveikos gali atsirasti artefaktų. Be to, retai galima patikrinti, ar pažymėtas baltymas atitinka laukinio tipo analogo funkcijas esant normaliai ląstelių koncentracijai.

Šių tradicinių strategijų trūkumus galima pašalinti įterpiant epitopus koduojančią seką į endogeninį lokusą, kaip tai dažnai daroma mielėse 4 . Žymą turintis konstruktas išlieka natūraliojoje geno reguliavimo aplinkoje, išlaikant tinkamą ekspresijos lygį. Neseniai pasiekta tikslinių nukleazių, ypač CRISPR / Cas9, taikymo galimybė efektyviai įvesti tikslius pokyčius konkrečiuose lokusuose 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 .

Techniškai lygiai taip pat įmanoma įterpti epitopo žymą į N-galą, C-galą ar bet kurią kitą atviro skaitymo rėmo vietą. Vidinė epitopo žymens integracija suteikia svarbų pranašumą: kadrų perjungimo mutacijas galima išskirti lygiagrečiai su epitopų žymėjimu. Kartu jie gali būti naudojami apibūdinti fenotipo (-ų) netekimą (-us) ir nustatyti, ar baltymas, pažymėtas epitopu, yra laukinio tipo.

Tačiau viena didžiausių kliūčių yra susijusi su tuo, kaip tiksliai pasirinkti žymės integravimo į nurodytą baltymą vietą. Intuityviai tariant, epitopo žymė turėtų būti ant baltymo „išorės“, kad būtų galima prisijungti prie antikūnų nedenatūruotoje būsenoje. Be to, epitopo žymė neturėtų žymiai sutrikdyti dominančio baltymo lankstymo ar neigiamai paveikti kritinę baltymo ir baltymo sąveiką. Mes iškėlėme hipotezę, kad evoliucinis išsaugojimas gali būti naudojamas vadovaujantis vidiniais epitopų žymėjimo metodais. Manome, kad mažai tikėtina, kad regionai, kuriuose išsaugojimas yra gana žemas, nedalyvaus kritinėje baltymo funkcijoje. Evoliucinė biologija taip pat rodo, kad baltymų sekos indeliai dažniausiai atsiranda regionuose, kurie baltymo paviršiuje sudaro nestruktūrizuotas „kilpas“ 13 . Todėl mes iškėlėme hipotezę, kad įvairaus ilgio baltymų segmentai, be palyginti nedidelio išsaugojimo, būtų tinkamiausi vidinio epitopo žymėjimo taikiniai.

Rezultatai

Tikslinių vietų parinkimas epitopų integracijai

Savo principinio įrodymo eksperimentams pasirinkome du zebrafish genus, kuriems mutantiniai aleliai dar nebuvo būdingi: tcf21 ir tbx18 . Abu genai yra ekspresuojami besivystančiame proepikardo organe. Įdomu tai, kad dėl tcf21 per didelės ekspresijos padidėja tbx18 išraiška, nors neaišku, ar tai yra tiesioginis poveikis14. Be proepikardo organo, tcf21 yra ekspresuojamas mioblastų pirmtakuose filialų arkuose 15, 16, 17, 18, tuo tarpu tbx18 ekspresija ryškiausia besivystančiame krūtinkaulio pelekų pumpure 19 . Suaugusiems zebrafishams tcf21 yra ekspresyviai ekspresuojamas epikardyje , o tcf21 ekspresuojančių epicardo ląstelių abliacija praranda zebrafish širdies regeneracinius gebėjimus 20 . Priešingai, tbx18 nėra išreiškiamas suaugusiojo širdyje, bet yra padidintas epikardyje, reaguojant į sužalojimą 21 .

Norėdami nustatyti santykinai neišsaugotus regionus, mes suderinome zebrafish Tcf21 ir Tbx18 baltymų sekas su jų homologais iš fugu, afrikinės nagų varlės, vištienos ir žmogaus, apimančio platų stuburinių linijų spektrą, kuris išsiskyrė daugiau nei prieš 400 milijonų metų 22 . Mes nustatėme, kad Tcf21 baltymų sekos yra nepaprastai evoliuciškai išsaugotos, o DNR surišantys domenai yra beveik 100% vienodi (1a pav.). Mes taip pat pažymėjome aukštą N ir C galų išsaugojimo laipsnį: 8/9 N-galo ir 7/8 C-galo aminorūgštys yra identiškos tarp suderintų baltymų. Bendras Tbx18 baltymų išsaugojimo lygis nėra toks didelis kaip Tcf21 (1b pav.). Tačiau tiek N-, tiek C-galai yra labai konservuoti: pirmosios šešios aminorūgštys yra vienodos tarp zebrafish ir žmogaus, o 6/8 C-galo aminorūgštys yra tapačios tarp visų penkių analizuotų rūšių. Priešingai, vidinė baltymo dalis, išskyrus T-dėžutės DNR surišimo domeną, yra daug laisvesnė. Didelis sekos išsaugojimo laipsnis paskatino mus nesiimti klasikinių N- arba C-galinių epitopų žymėjimo. Be to, mūsų dominamų baltymų funkciniai domenai (išskyrus DNR jungiančius domenus) nėra tiksliai apibrėžti, todėl neįmanoma laikytis domenų žymėjimo metodo, pavyzdžiui, NLS žymėjimo 23 . Todėl mes nusprendėme sutelkti dėmesį į santykinį evoliucijos išsaugojimo trūkumą kaip pagrindinį principą renkantis žymų integravimo vietas. Mes taip pat taikėme du papildomus kriterijus savo tikslinėms svetainėms. Pirmiausia, kadangi norėjome sugebėti generuoti tikėtinus nulinius mutantus lygiagrečiai su epitopu pažymėtais aleliais, mes pasirinkome taikinio vietas, esančias prieš DNR rišantį domeną. Antra, norėdami palengvinti efektyvią ir tiesią CRISPR / Cas9 aktyvumo analizę, taip pat atkurtų mutantų genotipizavimą, pasirinkome tikslines vietas restrikcijos fermento vietoje arba šalia jos. Remdamiesi šiais kriterijais, mes pasirinkome įterpti epitopą po „Cys51“ Tcf21 ir po „Ser64“ Tbx18 (1c pav., D).

Image

a) Zebrafish, fugu, Xenopus, vištienos ir žmogaus Tcf21 baltymų sekų suderinimas. Visų rūšių aminorūgštys yra identiškos raudonai, mažiausiai trys iš penkių rūšių yra mėlynos spalvos. Nėra aminorūgščių (ilgio kitimas) yra paryškintos geltonai. Pasirinktas žymos integravimo tikslas parodytas mėlynu trikampiu. b) Zebrafish, fugu, Xenopus, vištienos ir žmogaus Tbx18 baltymų sekų suderinimas. ( c, d) tcf21 ( c ) tbx18 ( d ) taikinių vietų (viršuje) ir taisomųjų oligonukleotidų (apačioje) DNR sekos. sgRNR tikslinė seka yra paryškinta mėlynai, PAM seka paryškinta, Cas9 sukeltos DSB vieta parodyta raudona linija, restrikcijos fermento vieta yra pabraukta, homologinės rankos yra rausvai raudonos, o V5 žymos seka mėlyna. .

Visas dydis

Tyrimams pasirinkome V5 epitopą, nes vieno V5 epitopo pakanka stipriam antikūnų surišimui, prekyboje yra įvairių reagentų, įskaitant anti-V5 dengtas agarozės granules, o V5 epitopo žymė sėkmingai naudojama „ChIP-Seq“. eksperimentai su pele 24, 25 . Norėdami įterpti V5 epitopą taisydami pagal homologiją, nusprendėme pateikti viengrandį oligonukleotido šabloną su epitopą koduojančia seka, apjungta maždaug 20 nukleotidų ilgio homologinėmis rankomis, panašiomis į strategiją, naudojamą integruoti „loxP“ vietą į TALEN- sukeltas dvigubos stygos lūžis 26 .

SgRNR aktyvumo ir žymių integracijos į embrionus įvertinimas

Norėdami gauti sgRNR sintezės šablonus, mes panaudojome supaprastintą PGR metodą (išsamias procedūras žr. Papildomame protokole) 7, 27, 28 . In vitro transkribuotos sgRNR buvo sumaišytos su nCas9n mRNR 10 ir sušvirkštos į zebrafish embrionų trynius 1 ląstelės stadijoje, kaip aprašyta anksčiau 29, po to injekuojamas praskiestas oligonukleotidas. Dvidešimt sušvirkštų embrionų buvo sujungti ir paruošta DNR. Norint ištirti mutagenezę CRISPR / Cas9, sgRNR taikiniai buvo amplifikuoti PGR, po to PGR fragmentai suskaidomi BsrGI ir BstNI (2 pav.). Mes pastebėjome beveik visišką BsrGI vietos praradimą tcf21 tikslinėje vietoje, tai rodo labai efektyvią mutagenezę (2b pav.). Tbx18 tikslinės vietos mutagenezė pasirodė šiek tiek ne tokia efektyvi, kaip rodo didesnis BstNI restrikcijos fermento vietos susilaikymo laipsnis (2g pav.). Tačiau reikia pažymėti, kad BstNI restrikcijos fermento vietą nuo numatomos CRISPR / Cas9 vietos kompensuoja vienas nukleotidas. Tik potekstė indelių praras restrikcijos fermento vietą, todėl tikimasi, kad mūsų RFLP analizė nuvertins mutagenezės efektyvumą.

Image

( a, f) grafinis tcf21 (a) ir tbx18 (f) taikinių lokusų ir skirtingų PGR pradmenų, svarbių ( b - e ), vaizdas. ( b, g) CRISPR / Cas9 aktyvumo tyrimas praradus BsrGI ( b ) ir BstNI ( g ) restrikcijos fermentų vietas. PGR fragmentai, sukurti naudojant jungiamuosius pradmenis ir DNR, paruoštus iš embrionų, įpuršktų atitinkamu sgRNR ir V5 koduojančiu oligonukleotidu (+), ir embrionų, įpuršktų kontrolinės sgRNR ir V5 koduojančio oligonukleotido (-), buvo atskirti agarozės gelio elektroforeze arba nesumuliuoti (1, 2 juostos). ) arba po virškinimo tinkamu restrikcijos fermentu (3, 4 juostos). Iš abiejų pusių - „ThermoFisher“ mokslinio „GeneRuler“ DNR kopėčios. ( c, h) epitopo žymės integracijos tyrimas. PGR buvo atlikta naudojant flanšinius genominius ir V5 specifinius pradmenis. Žymelėms būdingi PGR fragmentai (raudonos brūkšninės dėžutės) buvo išpjaustyti iš gelio ir paeiliui parinkti. ( d, e, i, j) Specifinių PG fragmentų sekos nustatymas.

Visas dydis

Norėdami įvertinti žymos integraciją įšvirkštuose embrionuose, atlikome PGR reakcijas, naudodami žymės specifinius / genominius pradmenis. Abiem lokusais lengvai gavome numatyto dydžio PGR juostas (2c pav., H). PGR fragmentai buvo išgryninti geliu, o Sangerio sekos buvo atliktos tiesiai ant iškirptų PGR fragmentų, siekiant patvirtinti žymės integraciją (2d pav., E, i, j). Mes pastebėjome, kad sekosravimo kokybė smarkiai sumažėja šalia Cas9 supjaustytos vietos 5 ′ sankryžoje tarp žymės ir genomo sekos, bet ne 3 ′ sankryžoje. Kadangi PGR reakcijos buvo atliktos 20 įšvirkštų embrionų grupių, tikimasi, kad kiekvienas PGR fragmentas apims nemažai nepriklausomos integracijos įvykių. Todėl šis pastebėjimas rodo žymiai didesnį indelių dažnį etiketes koduojančios sekos 5 ′ gale.

Germalline etikečių integravimo įvykių perdavimas

Patikrinus mutagenezę ir žymių integraciją, likę sušvirkšti embrionai buvo prikelti iki pilnametystės, sukryžiuoti ir patikrinti, ar žymės integracijos įvykiai pernešti gemaline linija, ir ar nėra restrikcijos fermento vietų. Buvo tiriama dvidešimt keturių žuvų (dvylika kryželių) mutacijų perdavimo gemalo linijomis ir žymės integracija tcf21 . Aštuoniose grupėse susidarė PGR juostos, rodančios epitopo žymės integraciją. 5 'sankryžos tarp tcf21 ir V5 etiketės buvo sekos (3a pav.). Mažiausiai trys F0 žuvys pernešė tobulą etiketės integraciją (4, 7 ir 11 sankryžos), o dviejuose papildomuose intarpuose buvo netobula, bet tikėtina funkcinė žymės integracija: 12-oje kryželėje (trijų nukleotidų (vadinamų - 3) su papildomu pakaitalu arba be jo) ir Nr. 3 (–9, išlaikant pagrindinę V5 etiketės seką). Du skirtingi PGR produktai buvo gauti iš 3, 11 ir 12 grupių. Tai gali įvykti, jei abu tėvai nepriklausomai perduoda žymų integravimo įvykius arba jei vieno siųstančio tėvo daigumas buvo mozaikinis dviem skirtingais integracijos įvykiais.

Image

a) 5 ′ sankryžos fragmentų suderinimas tarp tcf21 ir V5 etikečių integracijos įvykių, perduodamų per lytinę liniją. PAM seka paryškinta, sgRNR taikinys paryškintas mėlynai, HDR oligoje esanti homologinė ranka yra rausvai raudona, V5 žymos seka mėlyna, o nesutapimai - raudonai. ( b) atkurto tcf 21-V5 alelio DNR ir baltymų seka, tokia pati, kaip parodyta kaip ( a ) inx12b. Raudona spalva rodo nukleotidų ir (arba) aminorūgščių pokyčius, palyginti su laukiama seka. c) 5 ′ sankryžos fragmentų suderinimas tarp tbx18 ir V5 etikečių integracijos įvykių, perduodamų per lytinę liniją .

Visas dydis

F1 žuvys iš tcf21, esančių 3, 7, 11 ir 12, buvo uodegos nukirptos ir išanalizuotos, kad būtų integruotos V5 žymės ir (arba) indeliai. Nei viena iš dvidešimt šešių, patikrintų 3 kategorijos F1 žuvų, nebuvo teigiama (−9) integracija, tačiau šešios (24%) buvo teigiamos dėl tapataus (−18) etiketės integracijos įvykio, todėl V5 žyma greičiausiai neatpažįstama. pagal anti-V5 antikūnus. Panašiai nė vienoje iš keturiolikos žuvų iš 7-os grupės Nr. 7 nebuvo nustatyta tiksli etikečių integracija, nors dvi (14%) teigiamai įvertino identišką (+20) etiketės integraciją. F1 žuvys, gautos iš 11-ojo maršruto, nebuvo galutinai patikrintos, ar jos nėra integruotos. Iš visos 12 F1 šeimos keturiolika žuvų (iš 23 patikrintų) buvo teigiamos, kad PGR žymės gali būti integruotos, todėl beveik 61 proc. Septynios buvo sekos, ir buvo nustatyta, kad visose yra identiška beveik visiška žymės integracija, trūkstant pirmojo V5 žymės kodono ir keičiant vieną Tcf21 baltymo aminorūgštį (3b pav.).

Šešiolika F0 žuvų buvo patikrinta, ar gemaline linija perduodamos žymos integracija į tbx18 : šeši intarpai ir keturi kryžmai. Keturi iš kryžių davė palikuonių, turinčių teigiamą poveikį gemalinės linijos epitopų žymėjimo integracijos įvykiams, du iš jų (tarp FG ir NM), turintys tikslią tikslią integraciją (3c pav.). Suaugusioms F1 žuvims iš FG šeimos buvo atliktas genotipas, kad būtų galima integruoti etiketes, o trijose iš keturiolikos (21%) buvo tiksli žymenų integracija.

Viduje epitopu pažymėtų baltymų funkcionalumas

Epitopo žymens pridėjimas gali turėti neigiamos įtakos baltymo transliacijai, sulankstymui ar stabilumui, trukdyti kritinei baltymo ir baltymo sąveikai ar pakeisti baltymo pasiskirstymą ląstelėse. Mūsų metodas leidžia lygiagrečiai atkurti funkcijų alelių praradimą ir leidžia epiteliu pažymėtą alelį papildyti.

Tikrindami F1 šeimas dėl epitopų integracijos ir mutacijų tcf21 , mes padarėme du pastebėjimus. Pirma, daugelyje F1 žuvų buvo mutavę abu aleliai, atitinkantys aukštą mutagenezės laipsnį, stebėtą injekuotose žuvyse. Tačiau visais atvejais vienas iš alelių buvo vidinis rėmo trynimas arba įterpimas (1 papildoma lentelė, papildomas 2 pav.). Antra, mažiausiai penki iš žymimųjų F1 teigiamų F1 teigia, kad antrojoje geno kopijoje įvyko rėmelių poslinkio mutacijos. Mes sukryžiavome F1s heterozigotinius žymenų integravimo variantus tarpusavyje, taip pat su kitomis F1 žuvimis, ir pastebėjome, kad kiekviename iš kryžių, kur abu tėvai buvo heterozigotiniai dėl rėmelio poslinkio mutacijos, maždaug 25% embrionų turėjo šakos arkos deformacijos fenotipą, nuoseklų. su neseniai paskelbtais tcf21 18 mutanto ir morfanto 17 fenotipais (4b, d pav.). Šie stebėjimai kartu parodo, kad Tcf21 baltymas su netobula, bet beveik visiška žymens integracija yra funkciškai laukinio tipo.

Image

( a – d ) Tcf21 pažymėtas vidinis epitopas yra visiškai funkcionuojantis ir papildo atitinkamas kadrų perjungimo mutacijas. 5 dpf zebrafish embrionų šoniniai ( a, b ) ir ventraliniai ( c, d ) vaizdai, kremzlės dažytos Alcian Blue. Embrionai, trans-heterozigotiniai V5-tcf21 ir tcf21 rėmelio poslinkio aleliui ( a, c ), ir trans-heterozigotiniai skirtingiems rėmelių poslinkio aleliams ( b, d ). ( e – h) V5 epitopu pažymėti Tcf21 ir Tbx18 baltymai yra aptinkami anti-V5 antikūnais. Baltymo ekspresijos, aptiktos imunohistochemija naudojant anti-V5 antikūnus ( e, g ), ir mRNR ekspresijos, aptiktos viso kalno in situ hibridizacijos ( f, h ), palyginimas.

Visas dydis

Panašiai, tbx18 , nustatėme du suaugusius žmones, kuriems buvo heterozigotinis pažymėtas alelis ir rėmo poslinkio alelė (2 papildoma lentelė). Tačiau heterozigotinių žuvų, susijusių su rėmelio poslinkio aleliais, procentai neatskleidė atviro fenotipo, ir mes sugebėjome sukurti suaugusiems homozigotinius (−11) rėmelio poslinkio alelius (duomenys nepateikti ir papildomas 3 pav.). Aktyvaus fenotipo nebuvimas iš esmės atitinka stebėjimą, kad tbx18 mutantės pelės gimsta gyvos ir santykinai normalios 30, 31, todėl mes negalėjome nustatyti, ar epitopu pažymėtas Tbx18 baltymas gali atlikti laukinio tipo funkcijas.

Prie vidinių epitopų žymių galima prieiti prie anti-V5 antikūnų

Remdamiesi prielaida, kad tokie segmentai yra labiau matomi baltymo trimatės struktūros paviršiuje, mes pasirinkome įterpti epitopo žymę į evoliuciškai įvairaus ilgio baltymo segmentą, todėl jie bus prieinami antikūniams surišti. net gimtojoje, nedenatūruotoje būsenoje. Todėl mes atlikome visą kalno imunohistochemiją, naudodami specifinius V5 antikūnus. Viduje epitopu pažymėtas Tcf21 buvo lengvai aptinkamas ekspresijos modeliu, atitinkančiu anksčiau paskelbtą mRNR raiškos modelį 15, 17, 18 (4e pav., F). Panašiai, viduje epitopu pažymėtas Tbx18 buvo lengvai aptinkamas kuriant pelekų pumpurus, atitinkančius mRNR raiškos modelį (4g pav., H). Šie rezultatai tvirtai rodo, kad vidinis V5 žymėtas Tbx18 sugeba teisingai sulankstyti, taip išvengdamas skilimo, ir kad V5 epitopas yra prieinamas antikūnams surišti.

Diskusija

Mūsų duomenys rodo, kad vietinis santykinis sekos išsaugojimo trūkumas gali būti naudojamas informuoti apie epitopų žymėjimo eksperimentus. V5 epitopo žymės, integruotos į mažai išsilaikančius, įvairaus ilgio baltymų regionus, yra prieinamos surišti antikūnus ir greičiausiai nedaro reikšmingos įtakos trečiajai baltymo struktūrai. Svarbiausia, kad vidinis V5 epitopas, pažymėtas Tcf21, visiškai gali atlikti laukinio tipo funkciją. Taip pat reikėtų pažymėti, kad Tbx18, ypač Tcf21, evoliuciniu požiūriu yra daug labiau konservuoti nei „vidutinis“ baltymas. Jei baltymai vystosi sparčiau, gali būti tikslingiau suderinti ortologus iš labiau susijusių taksonų. Be to, mūsų metodas nesiremia a priori eksperimentiniu įvairių funkcinių baltymų domenų identifikavimu ar turimais baltymų struktūros duomenimis.

Mūsų sukurta metodika yra labai paprasta ir neapima nė vieno klonavimo žingsnio. Laikas, reikalingas nuo eksperimento sumanymo iki nustatytos ir patvirtintos linijos, išreiškiančios dominančius baltymus, yra palyginamas su geriausiais Tol2 pagrindu paremtais transgenezės metodais, kurie šiuo metu naudojami 32, 33, 34, ir nepatiria apribojimų, kuriuos patiria daugybė transgeno kopijų, pozicijos poveikis ir per didelis, per mažas ar klaidingas dominančio baltymo raiška. Be to, lygiagretus funkcijų praradimo alelių atstatymas palengvina epitopu pažymėtų lokusų patikrinimą juos papildant.

Belieka įsitikinti, ar mūsų taisymo strategija, pagrįsta oligonukleotidais, gali būti naudojama integruoti ilgesnes ir pasikartojančias epitopų žymes, tokias kaip 3xFLAG, 3xHA ar 3xMyc, ar neseniai aprašytas struktūrizuotas žymes 35 . Tačiau čia aprašytą principą, pagrįstą sekos išsaugojimu, galima pritaikyti kartu su strategijomis, pagrįstomis plazmidėmis, geriau pritaikytomis didesnių transgenų, įskaitant fluorescencinius reporterius, integravimui 36, 37, 38 .

Nors mes pasiekėme gana aukštą lytinių taškų integracijos lytinių ląstelių perdavimo ir lytinių ląstelių mozaicizmo laipsnį, neatrodo, kad būtų akivaizdus ryšys tarp epitopo žymos integracijos uodegos užpakalinėje dalyje ir konkrečios F0 žuvies gemalo linijoje (duomenys nepateikti). Galimybė ekranuoti F0 žuvis uodegos užsegimu, o ne kirsti, mūsų metodą dar labiau padidins. Todėl gali būti verta ištirti baltymų pagrindu pagaminto Cas9 12 naudojimą, nes tai gali paskatinti redagavimo įvykius ankstyvesniame vystymosi etape ir sukelti didesnį somatinių audinių, tokių kaip uodega, ir lytinių taškų atitikimą.

Taip pat pažymime, kad pagrindinis principas, informuojantis apie etikečių integracijos vietos pasirinkimą, būtent baltymų sekos išsaugojimo regioninis trūkumas, gali būti naudojamas informuoti epitopą apie kitų stuburinių genomus tiek in vivo , tiek in vitro 39 .

Metodai

Patvirtinimas ir atitiktis

Visi aprašyti eksperimentai su gyvūnais buvo patvirtinti Templo universiteto IACUC komiteto ir atlikti laikantis ULAR gairių.

nCas9n mRNR sintezė

pT3TS-nCas9n 10 buvo linearizuotas naudojant XbaI ir perrašytas naudojant T3 mMessage mMachine in vitro transkripcijos rinkinį (ThermoFisher Scientific AM1348). Transkribuota mRNR buvo išgryninta naudojant „Qiagen RNeasy MinElute“ rinkinį („Qiagen 74204“), praskiestą iki 150 ng / μL RNazės neturinčiame vandenyje („ThermoFisher Scientific AM9937“) ir padaryti 2 μL alikvotai. Aliuminiai buvo laikomi –80 ° C temperatūroje.

sgRNR sintezė

Norėdami gauti sgRNR sintezės šabloną, mes panaudojome klonavimo neturintį PGR metodą, panašų į aprašytą anksčiau 7, 28 . Pirmiausia atlikome PGR naudodami Tcf21sg-F1 arba Tbx18sg-F1 (3 papildoma lentelė) ir M13F pradmenis DR274 40 šablone. Tuomet atlikome agarozės gelio elektroforezę ir išvalėme juostas naudodami „GeneJet Gel Extraction kit“ („ThermoFisher Scientific K0692“). Išgryninta DNR buvo naudojama kaip šablonas antrajai PGR reakcijai su sgT7 ir sgRNR-R pradmenimis. Gautas PGR fragmentas buvo išgrynintas naudojant GeneJet PGR gryninimo rinkinį (ThermoFisher Scientific K0702) ir buvo naudojamas kaip šablonas in vitro transkripcijai, naudojant MEGAshortScript T7 transkripcijos rinkinį (AM1354).

Po RNR sintezės, sgRNR koncentracija buvo įvertinta agarozės gelio elektroforezės būdu. Koncentracija buvo įvertinta lyginant su „RiboRuler“ RNR kopėčiomis („ThermoFisher Scientific SM1833“). Neišvalytas transkripcijos reakcijos mišinys buvo praskiestas maždaug iki 60 ng / μL ir pasidarė 8 μL alikvotinės dalys. Aliuminiai buvo laikomi –80 ° C temperatūroje.

Mikroinjekcija

Atšildyta 8 μL sgRNR alikvota ir sumaišyta su 2 μL nCas9n mRNR alikvota. Į 1 ląstelių zebrafish embrionų trynius buvo suleista 3 nL mišinio, kaip aprašyta anksčiau 29 .

Tinkamas V5 HDR oligonukleotidas (Tcf21V5-F1 arba Tbx18V5-F1) buvo praskiestas iki 50 μg / μL vandens, kuriame nėra RNazės, ir 1 nL buvo sušvirkštas į zebrafish embrionų trynius iškart po RNR injekcijos.

CRISPR aktyvumo injekcijose embrionuose tyrimas

3–5 dpf greičiu 20 embrionų buvo sujungti į standartinį mikrocentrifugos mėgintuvėlį. DNR buvo paruošta kaip aprašyta anksčiau 41 ir praskiesta iki 100 ng / μL. 25 μL tūrio kaip PGR reakcijų šablonas buvo naudojamas 1 μL praskiestos DNR. Visos PGR reakcijos buvo atliktos naudojant „ThermoFisher Scientific Rekombinantinis Taq“ polimerazę (EP0402) ir pasirenkamąjį (NH4) 2S04 turinčią PGR buferį. Mutacijos buvo ištirtos nustatant, ar nėra restrikcijos fermento vietos praradimo: PGR reakcijos buvo atliktos su Tcf21-F1 / Tcf21-R1 arba Tbx18-F1 / Tbx18-R1 pradmenimis ir suardomos taip, kaip aprašyta žemiau. Norėdami patikrinti žymos integraciją, PGR buvo atlikta su Tcf21-F1 / Tbx18-F1 ir V5-R1 pradmenimis arba su V5-F1 ir Tcf21-R1 / Tbx18-R1 pradmenimis. Po agarozės gelio elektroforezės PGR fragmentai buvo išgryninti naudojant „GeneJet Gel Extraction kit“ ir paeiliui parinkti naudojant tinkamus genomo pradmenis (Tcf21-F1, Tcf21-R1, Tbx18-F1 arba Tbx18-F1).

Restrikcijos fermento vietų praradimas

Norint ištirti restrikcijos fermentų vietų praradimą, 10 μL neišvalytos PGR reakcijos buvo sumaišytos su 15 μL restrikcijos fermentų mišiniu, kuriame yra 1, 5 μl atitinkamo 10X Naujosios Anglijos BioLabs buferio (# 2 + BSA BsrGI, # 3 + BSA BstNI), ir 1 μL restrikcijos fermento. Restrikcinis fermentas buvo virškinamas 4–16 valandų.

„Germline“ etikečių integravimo peržiūra

Embrionai iš F0, esančių per vidurį arba iš jų, buvo sujungti į 20 partijų. Iš kiekvienos poros buvo tiriamos trys partijos. Paruošta DNR ir pirmoji PGR reakcija atlikta naudojant Tcf21-F1 / R1 arba Tbx18-F1 / R2 pradmenų poras. Pirmoji PGR reakcija buvo praskiesta 100X vandenyje, panaudota 1 μL ir šablonas antrajai, įklijuotai reakcijai naudojant Tcf21-F2 / Tbx18-F2 su V5-R1 gruntu arba naudojant Tcf21-R2 / Tbx18-R1 su V5- F11. Visi pradmenys yra išvardyti 3 papildomoje lentelėje.

F1 Genotipų nustatymas

Suaugusios F1 žuvys buvo nukirptos. Genomo DNR buvo izoliuota ir patikrinta, ar netenkama restrikcijos fermento vietos, kaip aprašyta aukščiau. Žymos integracija buvo išbandyta atliekant PGR, naudojant pradmenų poras Tcf21-F1 / V5-R1, Tcf21-R1 / V5-F1, Tbx18-F1 / V5-R1 arba Tbx18-R2 / V5-F1. Kai kuriais atvejais V1-F11 buvo naudojamas vietoj V5-F1 F1 genotipui nustatyti.

Visa kalno imunohistochemija

Žuvų heterozigotinės V5-Tcf21 arba V5-Tbx18 žymenų integracijai buvo išbrauktos. 36 AG embrionai buvo dechoruoti, tada pritvirtinti 4% PFA. Visi plovimai buvo atlikti PBT, embrionai buvo dehidratuoti, po to rehidratuoti per metanolio seriją, kaip aprašyta 42 . Embrionai buvo inkubuojami su pirminiu antikūnu (ThermoFisher Scientific R960-25), po to fluorescenciniu antriniu antikūnu (ThermoFischer Scientific, A-21135), kiekvienas praskiestas santykiu 1: 500 FBS blokuojančiame buferyje.

Visa montavimo vieta hibridizacija

Hibridizacija in situ buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau 42 . tcf21 cDNR buvo amplifikuota naudojant Tcf21-5′UTR-F1 ir Tcf21-3′UTR-R2. tbx18 cDNR buvo amplifikuota naudojant Tbx18-5′UTR-F1 ir Tbx18-R10 (3 papildoma lentelė). Kiekvienas fragmentas buvo klonuotas į pGEM-T vektorių transkripcijai.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Burg, L. et al . Vidinis epitopų žymėjimas paaiškinamas santykiniu sekos išsaugojimo trūkumu. Mokslas. Rep. 6, 36986; „doi“: 10.1038 / srep36986 (2016).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.