Intersticinė fibrozė ir širdies mikrovaskulinė liga uremijoje: pagerėjimas kalcimimetiku | laboratorinis tyrimas

Intersticinė fibrozė ir širdies mikrovaskulinė liga uremijoje: pagerėjimas kalcimimetiku | laboratorinis tyrimas

Anonim

Anotacija

Pacientams, sergantiems lėtiniu inkstų nepakankamumu, širdyje vyksta rekonstrukcija, kuriai būdinga hipertrofija, fibrozė ir kapiliarų / miocitų neatitikimas. Šiame tyrime stebėjome kalcimimetinio agento R-568 poveikį širdies mikrovaskulinėms ligoms ir intersticinei fibrozei. Trijų mėnesių Sprague – Dawley žiurkių patinai buvo atsitiktinės atrankos būdu atlikti atliekant subtotalinę nefrektomiją (SNX) arba atliekant fiktyvią operaciją. Vėliau jiems buvo duota transporto priemonė arba R-568 pagal du eksperimentinius protokolus: vieną - 1 mėnesį, kitą - 3 mėnesius. Įvertinta echokardiografija, kapiliarų ilgio tankis, intersticinio audinio tūrio tankis, imunohistochemija ir vesterno blotai (kalcį jautrantis receptorius, I ir III kolagenas, transformuojantis augimo faktorius (TGF) - β , mitogenų suaktyvintos baltymų kinazės ir nitrotirozinas). Po SNX padidėjo kairiojo ir dešiniojo skilvelio svoris ir sienelių storis. Gydant R-568 širdies ir kūno svorio santykis bei tarpukario pertvaros storis nepakito. Kairiojo skilvelio frakcinis sutrumpėjimas (atliekant echokardiografiją) SNX buvo mažesnis; tai pagerino R-568. R-568 pagerino sumažintą kapiliarų ilgio tankį ir padidėjusią intersticinę fibrozę SNX. Tai taip pat sumažino TGF- β , I ir III kolageno ekspresiją. Kalcimimetikas padidino ERK-1/2 aktyvaciją, normalizavo p38 ir JNK signalizaciją ir užkirto kelią oksidaciniam stresui. Padarome išvadą, kad sumažėjęs parathormono poveikis kalcimimetiku žymiai pagerina širdies histologiją ir funkciją, bet ne kairiojo skilvelio masę SNX.

Pagrindinis

Širdies ir kraujagyslių ligos yra pagrindinė pacientų, sergančių lėtine inkstų liga, mirties priežastis. 1 Mažėjant glomerulų filtracijos greičiui, koronarinių reiškinių rizika staigiai padidėja. 2 Ureminiais pacientais pastebimas ryškus širdies rekonstrukcija. 3 Eksperimentinės uremijos metu stebimas kapiliarų / miocitų neatitikimas, turbūt sumažinant perfuzijos atsargas ir deguonies tiekimą. 4, 5

Antrinis hiperparatiroidizmas yra dažnas lėtinės inkstų ligos požymis. Manoma, kad nepalankesni širdies ir kraujagyslių sistemos padariniai pacientams, sergantiems didele paratiroidinio hormono (PTH) koncentracija, ir jo pagerėjimas atliekant 7, 8 paratiroidektomiją , paaiškinami ne tik poveikiu kalcemijai ir fosfatemijai. Taip pat buvo užfiksuotas tiesioginis neigiamas PTH poveikis 9, 10 širdies funkcijai ir širdies fibrozei, taip pat 11, 12 mikrovesselų ligai.

Kalcimimetikai veikia kalcio jutiklius (CaSR) ir mažesnį PTH, nedidindami kalcio lygio. 13 Šie maži junginiai allosteriškai moduliuoja CaSR, todėl jie reaguoja į Ca 2+ . Teigiamas kalcimimetikų poveikis širdies morfologijai, panašus į paratiroidektomijos, anksčiau buvo pasiūlytas atliekant eksperimentinę uremiją 14, tačiau informacijos apie širdies funkciją ir signalų kelius nėra. Anksčiau mes parodėme, kad kalcimimetikas R-568 sumažina subtinotiškai nefrektomizuotų žiurkių albuminuriją. 15

Todėl šio tyrimo tikslas buvo papildomai įvertinti kalcimimetiko R-568 poveikį širdies masei, susitraukiamumui, kapiliarų tankiui, intersticinei fibrozei ir patofiziologiškai reikšmingų molekulių raiškai subtotiškai nefrektomizuotose žiurkėse.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Gyvūnai ir tarpinė nefrektomija

Vietines eksperimentų su gyvūnais etikos komitetas patvirtino visas procedūras gyvūnams. Dvylikos savaičių „Sprague – Dawley“ žiurkių patinai (vidutinis kūno svoris 335 ± 79 g; Charles River Co., Sulzfeld, Vokietija) buvo laikomi pastovioje kambario temperatūroje (21 ± 1 ° C) ir drėgme (75 ± 5%)., ir veikiami 12 valandų šviesos įjungimo ir 12 valandų apšvietimo ciklo. Gyvūnai galėjo laisvai prieiti prie vandens ir buvo šeriami įprastu graužikų racionu (19, 0% baltymų, 4, 0% riebalų, 0, 90% kalcio ir 0, 70% fosforo; Ssniff, Vokietija). Po 7 dienų adaptacijos laikotarpio žiurkėms atsitiktine tvarka buvo paskirta arba dviejų pakopų nefrektomija (dešiniojo inksto pašalinimas ir kairiojo inksto žievės audinio pašalinimas pagal svorį - 66% viso kūno svorio). dešiniojo inksto) arba fiktyvi operacija (fiktyvus opas).

Ilgalaikis eksperimentas (12 savaičių, „ Ad Libitum“ )

Po operacijos SNX ir „sham-op“ gyvūnai buvo atsitiktinai paskirstyti šiems gydymams:

  1. „Sham-op“, apdorotas nešikliu („sham-op“ kontrolė, n = 16);

  2. SNX, apdorotas transporto priemone (SNX valdymas, n = 17); ir

  3. SNX, apdorotas R-568 (SNX + R568, n = 20).

Kalcimimetinis agentas R-568 (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, JAV) buvo ištirpintas 10% 2-hidroksipropil- β- ciklodekstrine (Sigma-Aldrich, Miunchenas, Vokietija) ir vartojamas kasdien (17 mg 1 kg kūno svorio). injekcija po oda, kaip aprašyta anksčiau. 15 Kontroliniai gyvūnai gavo tik transporto priemonę. Kūno svoris ir kraujospūdis (atliekant sąmoningų gyvūnų uodegos pletroskopiją 24 valandas po paskutinės dozės) buvo matuojami reguliariais intervalais. 4 ir 12 savaitę gyvūnai buvo laikomi metaboliniuose narvuose, kad būtų galima surinkti šlapimą visą parą.

Trumpalaikis eksperimentas (4 savaitės, maitinimas poromis)

Norėdami pašalinti galimą painų poveikį, kurį sukelia maisto vartojimo skirtumai, mes atlikome papildomą trumpalaikį eksperimentą. Po operacijos gyvūnai buvo maitinami poromis („Sham-op“, palyginti su „ SNX +“, palyginti su „ SNX + R-568“), ir atsitiktine tvarka paskirstomi šiam gydymui:

  1. „Sham-op“, apdorotas nešikliu ( n = 10);

  2. SNX, apdorotas transporto priemone ( n = 10); ir

  3. SNX, apdorotas R-568 ( n = 10).

R-568 buvo paskirtas taip, kaip aprašyta aukščiau. 4 savaitę buvo atlikta echokardiografija ir paimti 24 valandų šlapimo mėginiai albuminui nustatyti. Išmatavus aortos kraujospūdį ir paėmus kraujo mėginius, gyvūnai buvo paaukoti.

Šlapimo albuminų matavimai ir kraujo analizė

Šlapimo albumino išskyrimas buvo matuojamas naudojant žiurkėms specifinį sumuštinių ELISA. Kreatinino, kalcio ir fosforo kiekis serume buvo išmatuotas standartiniais laboratoriniais metodais, o serumo PTH - dviejų antikūnų metodu, naudojant žiurkės iPTH ELISA rinkinį (Immutopics Inc., San Clemente, CA, JAV). Angiotenzino II kiekis serume buvo matuojamas naudojant PAV rinkinį (Peninsula Laboratories LLC, San Carlos, CA, JAV).

Audinių paruošimas

Pilvo aortos kateterizacija atlikta anestezijos metu ketamino / ksilazino (atitinkamai 100 ir 3 mg / kg), buvo paimti kraujo mėginiai, kraujas išplautas naudojant 0, 9% NaCl ir eksperimentas buvo baigtas retrogradine aortos perfuzija 3% gliutaraldehidu morfometriniam tyrimui. ir stereologiniai tyrimai arba ledo šaltas 0, 9% NaCl molekuliniams tyrimams. Perfuzijos slėgis buvo pastovus - 120 mm Hg.

Po perfuzijos su gliutaraldehidu, širdys buvo pašalintos ir pasvertos. Atliekant vienodą atsitiktinį audinių ėmimą ir morfometriją, buvo naudojamas orientatoriaus metodas. Aštuoni kūriniai buvo įterpti į „Epon-Araldite“; pusiau plonos sekcijos (1 μm ) buvo supjaustytos, nudažytos metileno mėlyna / bazine fuksina ir ištirtos naudojant šviesos mikroskopiją panardinant aliejų ir fazių kontrastą (padidinimas x 1000).

Po perfuzijos su šaltu 0, 9% NaCl, širdelės buvo padalintos į horizontalias riekeles ir greitai užšaldytos skystame azote, kad būtų galima atlikti vakarų blotinimą, arba fiksuotos 4% formaldehidu imunohistochemijai.

Kiekybinė širdies stereologija

Miokardo struktūros kiekybiniam įvertinimui buvo naudojamas orientatoriaus metodas. Visi tyrimai buvo atlikti aklai (ty stebėtojas nežinojo apie gyvūnų grupes). Kapiliarų ilgio tankis (L v ) (ty kapiliarų ilgis audinio tūrio vienetui) ir širdies kapiliarų bei intersticinio audinio tankis buvo matuojami, kaip aprašyta anksčiau. 16, 18 atstumas tarp kapiliarų buvo apskaičiuotas pagal Henquell ir Honig formulę. 19

Bendras miokardo kolageno kiekis buvo išmatuotas pjūviuose, dažytuose 0, 1% Sirius raudona F3BA, prisotinta pikrino rūgštimi (procento Sirius raudona spalva dažyto kolageno ploto procentas nuo bendro miokardo ploto), naudojant pusiau automatinę vaizdo analizės programinę įrangą (Optimas 6.0; Optimas Corp ., Sietlas, WA, JAV).

Miokardo arterijų sienelių storis ir liumenų skersmuo (skersmuo: 20–200 μm ) buvo nustatyti planimetriškai, naudojant pusiau automatinę vaizdo analizės programinę įrangą (Optimas 6.0; Optimas Corp.), kaip išsamiai aprašyta kitur. 20

Imunohistochemija ir hibridizacija in situ

Imunohistocheminė analizė atlikta parafino atkarpose, naudojant antikūnus prieš CaSR (Affinity BioReagents, Golden, CO, JAV), kraujagyslių endotelio augimo faktorių (VEGF), transformuojantį augimo faktorių (TGF) - β 1, TGF- β receptorių 1 ir 2 tipus. („Santa Cruz Biotechnology“, Heidelbergas, Vokietija), 1 ir 2 tipų VEGF receptoriai (Abcam, Kembridžas, JK), I ir III tipo kolageno (BioTrend, Kelnas, Vokietija), nitrotirozinas (Aukštaitijoje, Niujorkas, NY, JAV) ) ir prolil-4-hidroksilazę (Acris antikūnai, Hiddenhauzenas, Vokietija), naudojant streptavidino-biotino metodą, kaip žymėjimo fermentą naudojant šarminę fosfatazę. Visų antikūnų specifiškumas buvo patikrintas žiurkėms, o optimali dažymo koncentracija buvo įvertinta bandomaisiais skirtingais skiedimais bandomojo tyrimo metu. Neigiama kontrolė buvo atlikta praleidus pirminį antikūną.

Neradioaktyvi CaSR hibridizacija in situ buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau. 21

Dėmėtę analizavo tyrėjas, aklas gyvūnų grupės atžvilgiu, naudodamas šią pusiau kiekybinę balų sistemą (0–4): 0, nėra išraiškos; 1, silpna išraiška; 2, vidutinio sunkumo išraiška; 3, stipri išraiška; ir 4, ypač stipri išraiška. Vidinio stebėjimo serverio paklaida buvo <5%.

Vakarų balinimas

Miokardo mėginiai iš 8–9 kiekvienos grupės gyvūnų buvo paruošti homogenizuojant, o baltymų koncentracija buvo įvertinta pagal Bradfordo metodą 22 (Protein Assay Kit; Bio-Rad Laboratories, Miunchenas, Vokietija). Vienodi baltymų kiekiai (100 μg ) buvo elektroforeguoti SDS-PAGE gelyje ir vėliau perkelti į „Immobilon-P“ membranas (Millipore Corp., Bedford, MA, JAV). Membranos buvo užkimštos 5% riebiu sausu pienu ir inkubuojamos su pirminiu antikūnu prieš CaSR, endotelio azoto oksido sintazę (eNOS, Affinity Bioreagentai), fosforilintu ERK-1/2 (p-ERK-1/2, Novus Biologicals)., Littleton, JAV), fosforilintas JNK (p-JNK) fosforilintas p38 (p-p38), I kolagenas, VEGF, TGF- β 1 („Santa Cruz Biotechnology“), indukuojamas NOS („iNOS“, „BD Biosciences“, Heidelbergas, Vokietija), šiluma „Shock Protein-70“ (Hsp-70, „Assay Designs“, Ann Arbor, JAV), hipoksijos sukeliamas faktorius-1 α (HIF-1 α , „Chemicon“, „Millipore“, Schwalbach, Vokietija), „Matrix“ metaloproteinazė (MMP) -1, MMP-2., metaloproteinazės (TIMP) -1, TIMP-2 (Calbiochem, Darmštatas, Vokietija) ir III kolageno (BioTrend) inhibitorius. Buvo naudojami krienų peroksidaze konjuguoti antriniai antikūnai („Santa Cruz Biotechnology“) ir buvo vizualizuojami naudojant ECL rinkinį („GE Healthcare“, Buckinghamshire, JK) pagal gamintojo instrukcijas. Konkrečios juostos buvo kiekybiškai įvertintos densitometrinėmis analizėmis, naudojant „Molecular Dynamics Personal Densitometer“ („EasyWin32“, „Herolab“, Vokietija).

Širdies funkcijos vertinimas in vivo

Kairiojo skilvelio (LV) funkcija buvo įvertinta atliekant transtoracinę echokardiografiją sąmoningiems poroms, maitintoms poromis 4 savaitę, naudojant 30 MHz zondą. Echokardiografas buvo aklas gydymo ir kontrolinės grupės atžvilgiu. Buvo gautas parasterninės trumposios ašies vaizdas LV M vaizdavimui papiliarinių raumenų lygyje. Trimis nepriklausomais M režimo atvaizdais buvo naudojami šeši matuojant KS vidurio diastolinį vidinį skersmenį (LVEDD), KS galinį sistolinį vidinį skersmenį (LVESD), tarpukario pertvaros storį ir KS užpakalinę sienelę (PWT) dviem iš eilės einantis ritmas. Amerikos echokardiografijos draugija. 23 Dalinis sutrumpėjimas (FS) buvo apskaičiuotas kaip FS% = [(LVEDD – LVESD) / LVEDD] × 100.

Statistika

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sd. Atliekant Western blot analizę, nešikliais apdorota fiktyvi op grupė buvo naudojama kaip atskaitos priemonė, o atskirų matavimų vidutinė vertė buvo nustatyta 100%. Kiekvieno gyvūno vertė buvo išreikšta referenciniu kolektoriumi. Išbandžius normalų pasiskirstymą, dispersijos analizei prireikus buvo naudojamas ANOVA arba Kruskal-Wallis testas. Skirtumams tarp grupių buvo naudojamas Duncan kelių diapazonų testas. Rezultatai buvo laikomi reikšmingais, kai P vertė buvo mažesnė nei 0, 05.

REZULTATAI

Ilgalaikis eksperimentas

SNX žiurkės 12 savaičių buvo gydomos R-568 arba nešikliu ir palygintos su nešikliais gydytomis fiktyviomis žiurkėmis.

Duomenys apie gyvūnus

Širdies ir KS svoris SNX buvo žymiai didesnis nei gyvūnų, kuriems pasireiškė fiktyvus op, ir gydymas neturėjo įtakos (1 lentelė). Kreatinino kiekis serume reikšmingai padidėjo visose SNX grupėse, palyginti su fiktyviu op, be skirtumų tarp gydymo grupių.

Pilno dydžio lentelė

Pasibaigus šiam tyrimui, 24 valandas po dozės atlikimo atliktas pletismografiškai išmatuotas sistolinis kraujospūdis visose SNX grupėse buvo didesnis nei gyvūnų, kuriems pasireiškė netikras gydymas.

Angiotenzino II koncentracija serume buvo žymiai didesnė SNX, gautame tirpikliu arba R-568, palyginti su fiktyviu op.

Albumino ekskrecija padidėjo visose SNX grupėse per 12 savaičių po operacijos, palyginti su ekspozicija, gauta su gyvūnais, kuriems pasireiškė fiktyvus op. Albuminurija buvo didžiausia tirpikliais gydytoje SNX grupėje, bet žymiai mažesnė SNX + R-568 grupėje.

Kalcio ir fosforo metabolizmas

Praėjus 24 val. Po dozės, reikšmingo kalcio koncentracijos serume skirtumo tarp grupių nebebuvo (2 lentelė). Fosforo koncentracija buvo žymiai didesnė SNX grupėje, gydomoje nešikliu, ir R-568, palyginti su fiktyvių gyvūnų grupėse. Tuo pačiu metu padidėjo kalcio fosfato produktas (Ca × P). Neapdorotos SNX grupės serume PTH koncentracija buvo žymiai padidėjusi, palyginti su gyvūnais, kuriems buvo nustatytas fiktyvus opusas, tačiau mažesnė SNX + R-568 grupėje.

Pilno dydžio lentelė

Sumažėjusi miokardo fibrozė ir kapiliarų retėjimas po gydymo R-568

Šiame 12 savaičių eksperimente kapiliarų ilgio tankis (L V ) buvo žymiai mažesnis, o vidutinis kapiliarų atstumas buvo žymiai didesnis, negydytiems SNX gyvūnams, nei gyvūnams, kuriems buvo nustatytas fiktyvus opas (1a ir b paveikslai), tačiau reikšmės buvo nesiskiria nuo 4 savaičių eksperimento, kuris rodo, kad širdies rekonstrukcija buvo sustabdyta. Panašiai kapiliarai L V buvo žymiai didesni, o vidutinis kapiliarų atstumas buvo žymiai mažesnis SNX gyvūnams, gydytiems R-568, nei negydytų SNX gyvūnams.

Image

a ) kapiliarų ilgio tankis, b ) vidutinis kapiliarų atstumas, c ) intersticio tūrio tankis ir d ) kolageno plotas 12 savaitę.

Visas dydis

Neapdorotų SNX gyvūnų intersticinės matricos ir fibrocitų tūrinis tankis vėl buvo žymiai didesnis nei tų, kurie buvo gydomi šampūnu ar SNX, gydytais kalcimimetiniais gyvūnais (1c paveikslas).

Bendras kolageno plotas (pateiktas kaip Siriuso raudonai teigiamas plotas) buvo žymiai didesnis SNX gyvūnais gydomų gyvūnų, palyginti su fiktyvių gyvūnų (1d pav.). Kolageno plotas buvo žymiai mažesnis SNX, gydomam R-568, nei tirpikliais gydytų SNX gyvūnų.

Padidėjęs CaSR ekspresija po gydymo R-568

Tiek CaSR baltymo ekspresija, įvertinta imunohistochemiškai, patvirtinta Western blot, tiek mRNR transkripto ekspresija, įvertinta hibridizacijos in situ metu, SNX + R-568 gyvūnams buvo reikšmingai didesnė nei atitinkamų gyvūnų, gydytų nešikliu (2 pav.).

Image

Reprezentatyvios CaSR spalvos dažymo nuotraukos a ) fiktyviame op, b ) SNX + nešiklyje, ( c ) ir SNX + R-568. Originalus padidinimas × 400. d ) CaSR imuninio dažymo kiekiai, e ) CaSR hibridizacija in situ ir f ) tipiški CaSR Vakarų blotai 12 savaitę.

Visas dydis

Fibrozės žymenys

Prolil-4-hidroksilazės, kolageno sintezuojančių ląstelių žymeklio, dažymas reikšmingai nesiskyrė tarp tiriamųjų grupių (balas: 0, 94 ± 0, 29 fiktyviame op, 1, 33 ± 0, 27 SNX + tirpiklyje ir 1, 36 ± 0, 44 SNX + R-568).

Neapdorotiems SNX gyvūnams I ir III kolageno nusėdimas miokardoje (3a ir b paveikslai) buvo žymiai didesnis nei gyvūnams, esantiems fiktyviai ir SNX + R-568.

Image

Reprezentatyvūs ( a ) kolageno I, b ) III kolageno, c ) MMP-1, d ) TIMP-1, e ) TIMP-2 ir ( f ) TGF- β 1 vakarų blotai 12 savaitę.

Visas dydis

MMP-1 ekspresija buvo žymiai mažesnė tirpikliais gydomiems SNX gyvūnams, palyginti su fiktyvia op, bet didesnė SNX + R-568 gyvūnams, palyginti su nešikliais gydytiems SNX gyvūnams (3c paveikslas).

TIMP-1 raiška buvo žymiai didesnė SNX, palyginti su nešikliais, ir, palyginti su fiktyvia op, bei žymiai mažesnė, SNX + R-568, palyginti su SNX +, nešiklio (3d pav.).

Tarp grupių nebuvo rasta skirtumo tarp TIMP-2 išraiškos (3e pav.).

TGF-β1 baltymų ekspresija buvo žymiai padidinta neapdorotame SNX, palyginti su gyvūnais, kuriems buvo nustatytas fiktyvus opas, ir tai sumažėjo apdorojant RX-568 SNX gyvūnams (3f pav.). Tie patys rezultatai buvo stebimi ir atliekant imuninį dažymą.

TGF-β receptorių 1 dažymas nesiskyrė (balas: 2, 57 ± 0, 71, naudojant „sham-op“, 2, 01 ± 0, 25, tiriant SNX +, ir 2, 56 ± 0, 54, naudojant SNX + R-568) ir TGF-β receptorių 2 (balas) : 1, 96 ± 0, 49 „sham-op“, 2, 15 ± 0, 73 SNX + transporto priemonėje ir 2, 12 ± 0, 75 SNX + R-568) tarp grupių.

Modifikuotas MAP kinazių aktyvavimas po gydymo R-568

Fosforilinto ERK-1/2 ( p-ERK-1/2 ) ekspresija buvo žymiai didesnė SNX žiurkėms, gydomoms R-568, nei ekspresijose ir nešikliais apdorotoms SNX žiurkėms (4a pav.).

Image

Reprezentatyvūs miokardo vakariniai botai ( a ) p-ERK-1/2, b ) p-p38 ir ( c ) p-JNK tirpalams 12 savaitę.

Visas dydis

Fosforilinto p38 ( p-p38 ) išraiška buvo žymiai didesnė SNX + R-568 ir fiktyviuose gyvūnuose nei SNX, gydytame nešikliu (4b paveikslas).

Fosforilinto JNK ( p-JNK ) ekspresija buvo žymiai mažesnė gyvūnams SNX +, nei nešiojamajam gyvuliui, ir tam buvo užkirstas kelias R-568 (4c paveikslas).

Endotelio disfunkcijos ir oksidacinio streso žymenys

Neapdorotų SNX ir SNX + R-568 dažymas VEGF buvo žymiai didesnis, palyginti su gyvūnais, kuriems pasireiškė netikras gydymas. Rezultatai buvo patvirtinti atliekant Western blotting (5a pav.).

Image

Reprezentatyvūs miokardo vakarų taškai ( a ) VEGF, b ) VEGF-R1 imuninio dažymo įvertinimas ir ( c ) VEGF-R2 12 savaitę. Reprezentatyvios VEGF-R1 dažymo nuotraukos ( d ) fiktyviame opume, ( e ) SNX + transporto priemonė ir ( f ) SNX + R-568 ir VEGF-R2 ( g ) „sham-op“, ( h ) SNX + transporto priemonė ir ( i ) SNX + R-568.

Visas dydis

1 tipo VEGF receptoriaus ( flt-1 ) raiška reikšmingų skirtumų tarp tiriamųjų grupių neparodė (5b paveikslas, d – f).

Neapdorotame SNX buvo pastebėtas žymiai silpnesnis VEGF 2 tipo receptorių ( flk-1 ) dažymas, palyginti su fiktyviu op (5c paveikslas, g – i). Gydymas R-568 padidino flk-1 dažymą SNX gyvūnams, palyginti su negydytu SNX.

Neapdorotame SNX, palyginti su gyvūnais, kurie buvo gydomi šampūnu, žymiai padidėjo nitrotirozino , oksidacinio streso žymens , dažymas, tačiau SNX + R-568, palyginti su negydytu SNX, žymiai sumažėjo (6 paveikslas).

Image

( A ) nitrotirozino imuninio dažymo įvertinimas 12-ą savaitę ir reprezentatyvios nuotraukos b ) fiktyviame op, c ) SNX + nešiklyje ir ( d ) SNX + R-568.

Visas dydis

„ ENOS“ ir „ iNOS “ išraiška buvo žymiai mažesnė SNX nešikliais gydomuose tiriamuose nei gyvūnams, kuriems pasireiškė netikras gydymas. Jų buvo žymiai daugiau SNX, gydytų R-568, nei tiriamųjų SNX tirpaluose (7a ir b paveikslai).

Image

Reprezentatyvūs miokardo vakariniai botai, skirti a ) eNOS, b ) iNOS ir c ) HIF-1 α 12 savaitę.

Visas dydis

HIF-1α ekspresija buvo žymiai mažesnė SNX, gydytame R-568, nei ekspresijos metu SNX ir nešiojamaisiais gyvūnais (7c paveikslas).

Tarp grupių reikšmingo šilumos šoko baltymo 70 ( Hsp-70 ) išraiškos skirtumų nepastebėta (duomenys nepateikti).

Trumpalaikis eksperimentas

Norint pašalinti painiavą dėl maisto suvartojimo skirtumų, trumpalaikiame eksperimente buvo lyginamos kalcimetamais ir nešikliais apdorotos SNX grupės.

Nepaisant R-568 gydytų SNX (331 ± 19 g), palyginti su nešikliais apdorotų SNX (375 ± 28 g) ir fiktyvių opų (386 ± 9 g), galutinė kūno masė buvo žymiai mažesnė ( P <0, 001). vienodas maisto suvartojimas. Širdies svoris ir širdies bei kūno svorio santykis reikšmingai nesiskyrė tarp SNX, gydytų R-568, ir su nešikliu (duomenys nepateikti). Jonizuotas kalcio kiekis serume 2 val. Po dozės buvo žymiai mažesnis ( P <0, 001) SNX + R-568 (1, 11 ± 0, 05 mmol / l) nei SNX + nešiklyje (1, 32 ± 0, 04) ir fiktyviame op (1, 38 ± 0, 05). ). Hematokritas reikšmingai nesiskyrė tarp R-568 (46, 5 ± 1, 4%) ir nešiklio (46, 9 ± 1, 8%) gydytų SNX grupių, ir reikšmingai ( P = 0, 022) mažesnis abiejose SNX grupėse, palyginti su grupiniu šampūnu (49, 6 ±). 3, 0%). Sistolinis kraujospūdis, matuojamas aortos ertmėje praėjus 2 valandoms po dozės, SNX + nešiklio (162 ± 16 mm Hg) reikšmingai ( P <0, 001) buvo didesnis nei kraujo plazmoje (144 ± 13) ir SNX + R-568 ( 132 ± 10). Šlapimo albumino išsiskyrimas SNX + R-568 (2, 1 ± 0, 9 μg / 24 val.) Buvo žymiai mažesnis ( P <0, 001) nei SNX + tirpiklyje (4, 5 ± 2, 2), tačiau vis tiek didesnis, lyginant su ekspozicija naudojant fiktyvius opus. (0, 5 ± 0, 3).

Echokardiografija parodė žymiai mažesnį FS% SNX + tirpale, palyginti su fiktyviu op. Tai nebuvo pastebėta SNX gydomu R-568 (8 pav.). Tarpukario pertvaros storis buvo žymiai didesnis SNX tirpalu (1, 67 ± 0, 09 mm) nei šampūnu (1, 44 ± 0, 14) ir reikšmingai nesiskyrė SNX + R-568 (1, 56 ± 0, 21), palyginti su tirpalu. dvi kitos grupės. Širdis buvo išsiplėtusi nešikliais apdorotame SNX (LVEDD 5, 07 ± 0, 84 mm, LVESD 1, 26 ± 0, 24 mm), palyginti su širma, veikiant „sham-op“ (LVEDD 4, 52 ± 0, 33 mm, LVESD 0, 89 ± 0, 14 mm) ir SNX + R568 (LVEDD 4, 28). ± 0, 79 mm, LVESD 0, 93 ± 0, 20 mm).

Image

Echokardiografija 4 savaitę: reprezentatyvios nuotraukos iš ( a ) fiktyvaus op, b ) SNX + transporto priemonės ir c ) SNX + R-568 ir ( d ) FS% verčių.

Visas dydis

Dešiniajame ir kairiajame skilveliuose kapiliarų L v buvo žymiai mažesnis, o vidutinis kapiliarų atstumas (kaip intersticinio audinio indeksas) SNX + nešiklyje buvo didesnis nei tas, kuris pasireiškė fiktyviame op. Šie pokyčiai buvo užkirsti kelią SNX gyvūnams, gydytiems R-568 (9 paveikslas).

Image

a ) kapiliarų ilgio tankis ir b ) tarpkapiliarinis atstumas poromis maitinamų gyvūnų dešiniajame (□) ir kairiajame (▪) skilvelyje 4 savaitę.

Visas dydis

Apibendrinant galima pasakyti, kad kalcimimetinis agentas R-568 sumažino kapiliarų deficitą (mikrovesselinę ligą) ir intersticijos išsiplėtimą (intersticinę fibrozę) miokarde, nepaisant to, kad jis neturėjo įtakos širdies hipertrofijai. Kapiliarų deficitas buvo stebimas SNX kairiojo ir dešiniojo skilvelio miokardo srityje ir pagerėjo po gydymo R-568. Be to, R-568 pagerino kairiojo skilvelio susitraukimo funkciją SNX. Padidėjęs kolageno nusėdimas miokardoje greičiausiai atsirado dėl sumažėjusio skaidymo, o ne dėl padidėjusios sintezės, o kapiliarų deficitas greičiausiai atsirado dėl atsparumo padidėjusiam VEGF.

DISKUSIJA

Šiame tyrime kalcimimetikas R-568 sumažino kapiliarų deficitą (mikrovesselinę ligą) ir intersticijos išsiplėtimą (intersticinę fibrozę) miokarde, nepaisant to, kad jis neturėjo įtakos širdies hipertrofijai. Kartu su širdies rekonstrukcijos prevencija, atliekant 24 valandas po dozės sušvirkštimą, SNM žiurkėms buvo išvengta širdies susitraukimo funkcijos pablogėjimo.

Nors praeityje buvo teigiama, kad kalcimimetikai daro įtaką širdies morfologijai, 14 nebuvo aišku, kokie mechanizmai buvo naudojami. Norėdami išspręsti šią problemą, mes ištyrėme kalcimimetiko R-568 poveikį širdies morfologijai ir pagrindinėms molekulėms subtiliškai nefrektomizuotų žiurkių kardiomiopatijos patogenezėje.

Mes nepastebėjome jokio kalcimimetiko poveikio LV hipertrofijai (LVH), o tai priešingai nei keli maži tyrimai, rodantys LVH sumažėjimą pacientams, sergantiems inkstų ligos pabaiga ir gydomiems mažinant PTH. 24 Neaišku, ar tai paaiškinta rūšių skirtumais, ar tyrimo protokolais. Tikėtina, kad kraujospūdis nėra pagrindinis klaidinantis. Atsižvelgiant į metodo ribas, intervencija neturėjo reikšmingos įtakos kraujospūdžiui. Kalcimimetikų poveikis kraujospūdžiui, kuris buvo pastebėtas šioje laboratorijoje naudojant telemetriją 25, nebuvo pastebėtas šiame tyrime naudojant uodegos pletismografiją (ilgalaikiame eksperimente), bet buvo pastebėtas atliekant aortos matavimą praėjus 2 valandoms po dozės suvartojimo. - termino nustatymas. Todėl poveikis BP yra akivaizdžiai trumpalaikis.

Kitas argumentas prieš lemiamą padidėjusio sisteminio kraujospūdžio vaidmenį stebint miokardo rekonstrukciją yra panašaus kapiliarų deficito ir tarpkapiliarinio atstumo stebėjimas negydyto SNX kairiajame ir dešiniajame skilveliuose. Kalcimimetikas vienodai užkirto kelią kapiliarų retėjimui ir intersticinės erdvės išplėtimui abiejuose skilveliuose.

Širdies hipertrofija prasideda kaip kompensacinė reakcija į išorinius stresorius. Kai stresoriai išlieka, kompensacinė hipertrofija lemia miokardo rekonstrukciją ir kontraktilinę disfunkciją. 26, 27 Mitogenu aktyvuota baltymo kinazės (MAPK) veikla vaidina svarbų vaidmenį širdies hipertrofijoje. 28 Holšteinas 29 parodė, kad suaktyvinus CaSR, suaktyvinamos ERK-1/2 kinazės. Buvo parodyta, kad ERK-1/2 signalizacija skatina adaptacinę hipertrofiją su normalizuotu sienų įtempiu ir kompensuoja padidėjusią apkrovą. 30, 31 Mūsų tyrimas dokumentavo, kad R-568 padidino ERK-1/2 aktyvaciją. Kadangi LVH nepakito, galima teigti, kad gydymas nesutrukdė širdies hipertrofijai, bet vietoj fibrozės nukreipė signalą link adaptacinio augimo. Tai patvirtina ir mūsų širdies funkcijos analizės rezultatai. Buvo parodyta, kad ERK aktyvacijos slopinimas padidina širdies žalą. 32 Sutikus su tuo pastebėjimu, padidėjęs ERK aktyvacija gydomiems gyvūnams, kartu pagerėjo širdies morfologija. Manoma, kad tiek ERK, tiek JNK kelių aktyvinimas apsaugo kardiomiocitus nuo apoptozės, nors p38 vaidmuo išlieka neaiškus. 28 Mes pastebėjome mažesnę fosforilinto JNK ir p38 išraišką nešikliu apdorotame SNX; tam sutrukdė R-568. Galima spėlioti, kad JNK ir p38 aktyvacijos normalizavimas kartu su ERK aktyvacija CaSR sukelia šio modelio kardioprotekciją. Buvo parodyta, kad p38 MAPK slopinimas pagerina širdies funkciją modeliuose su padidintu p38 aktyvinimu. 33, 34 Priešingai, JNK slopinimas turi priešingą poveikį. 34 Galima teigti, kad CaSR signalizacija pagerino širdies funkciją mūsų modelyje atkuriant pusiausvyrą tarp MAPK.

Pakartotinis ar užsitęsęs sužalojimas sukelia nuolatinį TGF- β perprodukciją, sukeliančią laipsnišką tarpląstelinės matricos nusėdimą ir audinių fibrozę. 35 Buvo parodyta, kad užblokuojant TGF- β signalus, tarpląstelinė matrica nesikaupia skirtinguose audiniuose. 35 Verta paminėti, kad TGF- β1 ekspresija buvo padidinta negydytame SNX ir iš dalies pakeista kalcimimetiko. Tiek 1, tiek 2 tipo TGF- β receptorių ekspresija uremijoje nepakito, atsižvelgiant į padidėjusį signalizaciją.

Padidėjęs kolageno skaidulų nusėdimas širdies intersticijoje turi svarbių funkcinių padarinių, ypač diastolinį sutrikimą ir elektros nestabilumą. Šiame modelyje padidėjęs I ir III tipo kolageno kiekis buvo dedamas į neapdorotą SNX, ir tai panaikino kalcimimetikas. Mažesnė MMP-1 išraiška ir didesnis TIMP-1 gausa nešikliais gydomuose SNX rodo lėtesnį kolageno skaidymąsi, kaip pastebėta pacientams, sergantiems hipertenzija ir lėtiniu širdies nepakankamumu. Gydymas R-568 normalizavo TIMP-1 ir MMP-1 ir tai gali paaiškinti fibrozės prevenciją mūsų modelyje. Nepasikeitusi prolil-4-hidroksilazės išraiška mūsų modelyje rodo, kad padidėjęs kolageno nusėdimas miokardoje atsirado dėl sumažėjusio skaidymo, o ne dėl sustiprintos sintezės.

Nors prieš tai buvo pastebėtas PTH vaidmuo intersticinės fibrozės genezėje, 11 jo vaidmuo kapiliarų regenerijos genezėje - turintis dar didesnę funkcinę reikšmę - iki šiol nebuvo vertinamas. Tikslūs mechanizmai, rodantys, kad trūksta kapiliarų augimo ir kardiomiocitų padidėjimo, kai vystosi ureminė kardiomiopatija, nėra žinomi. Šiame tyrime VEGF raiška buvo žymiai padidinta, o tai rodo, kad VEGF signalo perdavimas yra netinkamo kapiliarų augimo priežastis. Tai dar labiau patvirtino sumažėjęs VEGF receptoriaus flk-1 reguliavimas ureminių žiurkių miokarde. Šis paaiškinimas būtų panašus į Sasso ir kt. Pastebėjimus 37 pacientams, sergantiems cukriniu diabetu. Hipoksemija per HIF jutiklį yra galingas VEGF sintezės stimuliatorius. Neatrodo, kad tai lemia aukštą VEGF, nes ureminių gyvūnų HIF-1 α buvo dar mažesnis.

Neaišku, ar flk-1 sumažėjimas yra kapiliarų netekimo priežastis, ar jis atspindi sumažėjusį endotelio paviršių ureminių gyvūnų širdyse. Mūsų pastebėjimas, kad tiek flk-1, tiek eNOS išraiška buvo lygiagreti kapiliarų kiekiui miokardoje, rodo, kad šie pokyčiai yra antriniai, palyginti su endotelio paviršiaus pokyčiais. Priešingai, kito VEGF receptoriaus, flt-1, raiška nebuvo pakitusi, teigdama, kad paprastas endotelio masės pasikeitimas yra lemiantis VEGF receptorių ekspresiją.

Ureminės kardiomiopatijos širdies rekonstrukcijos genetiškai įvardijamas kaip padidėjęs oksidacinis stresas. 38 Oksidacinis stresas, kurį rodo nitrotirozino dažymas, padidėjo ureminių gyvūnų širdyje ir jį sumažino kalcimimetikas. Iki šiol buvo mažai žinoma apie kalcimimetikų poveikį širdies oksidaciniam stresui. Mes parodėme, kad gydymas kalcimimetiku sumažino nitrotirozino dažymą ir normalizavo eNOS ir iNOS raišką ureminių žiurkių širdyje.

Vienas galimas kalcimimetikų veikimą lemiantis veiksnys yra CaSR išraiškos lygis. 39 CaSR yra išreikšta kardiomiocitais. 40 Nors uremijoje CaSR išraiška sumažėja prieskydinės liaukos srityje, 41 ji nebuvo pakeista miokarde po SNX. Panašiai, kaip matoma prieskydinių liaukų srityje, šiame tyrime padidėjo CaSR ekspresija po kalcimimetiko skyrimo.

Pasikeitęs renino ir angiotenzino sistemos aktyvumas yra dar vienas galimas kalcimimetiko poveikio padarinys. Nors buvo nustatyta, kad kalcimimetikai sumažina renino išsiskyrimą in vitro , 43 mes nepastebėjome SNX gyvūnų, gydytų R-568, žemesnio sisteminio angiotenzino II lygio.

Apibendrinant galima pasakyti, kad hiperparatiroidizmo korekcija kalcimimetiku eksperimentinės uremijos metu nepašalino LVH, tačiau reikšmingai sutrikdė tiek intersticinės fibrozės, tiek mikrovelislinės ligos vystymąsi.