Žarnyno insulino signalizavimas koduoja du skirtingus molekulinius mechanizmus sutrumpintai grafeno oksido sukeltam ilgaamžiškumui gydant caenorhabditis elegans | mokslinės ataskaitos

Žarnyno insulino signalizavimas koduoja du skirtingus molekulinius mechanizmus sutrumpintai grafeno oksido sukeltam ilgaamžiškumui gydant caenorhabditis elegans | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ekotoksikologija
  • Medicininė toksikologija

Anotacija

Įrodyta, kad grafeno oksidas (GO) sukelia daugybinį toksiškumą įvairiems organizmams. Tačiau pagrindiniai molekuliniai mechanizmai, sukeliantys GO sukeltą sutrumpintą ilgaamžiškumą, vis dar nėra aiškūs. Mes panaudojome Caenorhabditis elegans, norėdami ištirti galimą insulino signalizacijos kelio dalyvavimą kontroliuojant GO toksiškumą ir jo pagrindinius molekulinius mechanizmus. Daf-2, amžiaus 1, akt-1 ar akt-2 geno mutacija sukėlė atsparų nematodų savybę GO toksiškumui, o daf-16 geno mutacija sąlygojo nematodų jautrumą GO toksiškumui, kas rodo, kad GO gali sutrikdyti DAF-2 / IGF-1 receptorių, AGE-1, AKT-1 ir AKT-2 tarpininkavimo kinazės kaskados ir DAF-16 / FOXO transkripcijos faktoriaus funkcijas. Genetinės sąveikos analizė parodė, kad kontroliuojant GO toksiškumą ilgaamžiškumui, DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 turi signalinę kaskadą. Be to, žarnyno RNR trukdžių (RNR) analizė parodė, kad GO sumažino ilgaamžiškumą paveikdamas DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 signalizacijos kaskados funkcijas žarnyne. DAF-16 taip pat galėtų reguliuoti GO toksiškumą ilgaamžiškumui, veikdamas prieš SOD-3, kuris koduoja antioksidacijos sistemą, kuri neleidžia kauptis oksidaciniam stresui. Todėl žarnyno insulino signalizavimas gali užkoduoti du skirtingus molekulinius mechanizmus, atsakingus už GO toksiškumą, sukeldamas sutrumpintą ilgaamžiškumą. Mūsų rezultatai pabrėžia svarbiausią insulino signalizacijos kelio vaidmenį kontroliuojant GO toksiškumą organizmams.

Įvadas

Anglies nanomedžiagos yra svarbių inžinerinių nanomedžiagų (ENM) šeima, turinti daugybę unikalių savybių ir galimą pritaikymą 1, 2 . Grafeno oksidas (GO) yra dviejų dimensijų anglies ENM, turinčių vieną sp 2 anglies atomų anglies atomų 3 sluoksnį, narys. Dėl savo cheminio stabilumo, aukšto šilumos laidumo koeficiento, amfipatiškumo, didelio paviršiaus ploto ir lengvo funkcionalumo, GO turi didelį panaudojimo potencialą vaistų tiekimui, biologiniam vaizdavimui, audinių inžinerijai ir biologinio tyrimo medžiagoms 1, 2 .

Atsižvelgiant į išskirtinius pažadus, susijusius su GO taikymu, buvo atlikta keletas tyrimų, daugiausia dėmesio skiriant GO toksiškumui 4 . Kai kurie tyrimai rodo citotoksiškumą ir keletą neigiamo poveikio gyvūnams aspektų, tokių kaip toksinis poveikis plaučiams ir imunotoksiškumas dėl GO poveikio 4, 5, 6, 7, 8 . Visai neseniai buvo paskelbtos kai kurios ataskaitos, kurių tikslas buvo išsamiau išaiškinti GO toksiškumo molekulinius mechanizmus 9, 10, 11, 12 . Vienas tyrimas parodė, kad rinkliavos tipo receptoriaus 4 (TLR4) signalizacijos aktyvavimas ir vėlesnė autokrininė TNF-α gamyba gali būti naudojama kontroliuojant GO toksiškumą makrofaguose 10 . Be to, GO paveiktose žmogaus HepG2 ląstelėse arba GLC-82 ląstelėse 9, 11, 12 buvo nustatytos nereguliuojamos mRNR, baltymai ir mikroRNR (miRNR).

Caenorhabditis elegans yra klasikinis gyvūnų modelis, siūlantis tyrimo sistemą, siekiant ištirti toksinių medžiagų, įskaitant ERM , in vivo toksikologinius mechanizmus 13 . C. elegans turi konservuotas pagrindinių žmogaus fiziologinių procesų, reagavimo į stresą ir molekulinių signalų perdavimo savybes 14 . Naudojant C. elegans , ankstesni tyrimai parodė GO toksiškumą tiek pirminių (tokių kaip žarnynas), tiek antrinių (tokių kaip neuronas ir reprodukciniai organai), tikslinių organų , funkcijoms . 15, 16, 17, 18 . Kalbant apie ląstelių GO toksiškumo mechanizmus, paskelbti duomenys rodo, kad GO toksiškumą gali lemti biologinis prieinamumas, reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) indukcija, padidėjęs žarnyno pralaidumas, sutrikdytas įgimtas imuninis atsakas ir ilgas nematodų defekacijos ciklo ilgis 16, 17, 19, 20 . Ankstesni tyrimai taip pat parodė, koks yra žarnyno biologinio barjero, sukeliančio GO toksiškumą, nematodų vaidmuo 17, 21 . Taip pat buvo pranešta, kad oksidacinio streso indukcija gali atlikti pagrindinį vaidmenį veikiant GO sukeltą sutrumpintą ilgaamžiškumą veikiamiems nematodams cheminiame mechanizme 15 . Tačiau GO toksiškumo sąlygoti sutrumpinto ilgaamžiškumo molekuliniai mechanizmai vis dar nėra žinomi.

Insulino / insulino tipo augimo faktoriaus (IGF) signalizacijos kelias buvo nurodytas kaip pagrindinis molekulinis mechanizmas, leidžiantis valdyti nematodų ilgį 22, 23 . Šis signalizacijos kelias taip pat vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant kitus svarbius biologinius procesus, įskaitant riebalų kaupimąsi, įgimtą imunitetą ir stresą 24, 25, 26 . Be to, mes anksčiau įrodėme, kad signalizuojantis insulinas reguliuoja C. elegans 26 su eismu susijusių kietųjų dalelių (PM 2, 5 ) dalelių toksiškumą. Sergant C. elegans , insulino ligandai jungiasi su DAF-2 / IGF-1 receptoriais (InR), aktyvina tirozino kinazės aktyvumą ir inicijuoja kelių kinazių kaskadą: AGE-1 / fosfatidilinozilitit-3-kinazės (PI3K), PDK-1 / Nuo 3-fosfoinositido priklausoma kinazė 1, AKT-1/2 / serino / treonino kinazė Akt / PKB ir SGK-1 / serinas arba treonino-baltymo kinazė 23 . AKT ir SGK-1 toliau fosforilina ir inaktyvuoja transkripcijos faktorių DAF-16 / FOXO, tokiu būdu blokuodamas taikinių genų, tokių kaip sod-3 genas, transkripciją 23, 27, 28, 29, 30 . DAF-18 / fosfatidilinozitolio 3, 4, 5-trifosfato 3-fosfatazės (PTEN) fosforilinimas AGE-1 apsaugo nuo DAF-16 fosforilinimo paskesnėse kinazėse . 23, 27, 29 . Specifinio audinio aktyvumo tyrimas parodė svarbias DAF-16 funkcijas reguliuojant ilgaamžiškumą žarnyne ir nematodų neuronuose 30 . Įdomu tai, kad mūsų ankstesnis tyrimas pasiūlė, kad sod-3 geno mutacija sąlygojo nematodų jautrumą GO toksiškumui gyvenimo trukmei, reprodukcijai ir judėjimo elgsenai bei sukėlė sunkesnį ROS produkcijos indukciją GO paveiktuose nematoduose 19, 21 . Šiame tyrime mes panaudojome in vivo C. elegans tyrimo sistemą, norėdami ištirti galimą insulino signalizacijos kelio dalyvavimą kontroliuojant GO toksiškumą ir jo galimus molekulinius mechanizmus. Mūsų rezultatai rodo, kad insulino signalizacijos kelias gali koduoti du skirtingus molekulinius mechanizmus sutrumpintai GO indukuotoms nematodoms. Šių molekulių, reguliuojančių GO toksiškumą, reguliavimas insulino signalizacijos keliu, tyrimas yra svarbus pagrindas toliau aiškintis molekulinius tinklus, susijusius su organizmo GO toksiškumo kontrole.

Rezultatai

Fizikinės ir cheminės GO savybės

GO dydžio pasiskirstymas K terpėje parodytas S1a pav. Didžioji dalis K terpėje esančių GO buvo 40–50 nm diapazone (S1a pav.). GO agregacijos dydis buvo 386 ± 75 nm (pav. S1a). GO pasirodė kaip lakštas, kurio topografinio aukščio storis buvo apie 1, 0 nm, o tai atitinka maždaug vieną sluoksnį (pav. S1b). GO (100 mg / l) zeta potencialas K-terpėje buvo –22, 5 ± 1, 7 mV. Ramano spektroskopijos matavimas parodė GO D juostos signalą po apdorojimo sieros rūgštimi ir KMnO 4, nurodant sutrikimo atsiradimą grafito sluoksnyje (S1c pav.). AG juosta ir D juosta buvo rasta atitinkamai 1589 cm – 1 ir 1336 cm – 1 (S1c pav.).

GO ekspozicija turėjo įtakos genų, koduojančių insulino signalizacijos kelią nematodų raidai, raiškai

Tarp genų, koduojančių insulino signalizacijos kelią C. elegans , GO ekspozicija (100 mg / L) sąlygojo reikšmingą daf-2, amžiaus 1, akt-1 ir akt-2 genų ekspresijos lygio padidėjimą, ir daf-18 ir daf-16 genų raiškos lygio sumažėjimas laukinio tipo nematoduose (1a pav.). Be to, atsižvelgiant į tai, kad insulino signalizacijos kelias gali reguliuoti kai kuriuos biologinius procesus, pavyzdžiui, ilgaamžiškumą, ribodamas DAF-16 branduolio lokalizaciją 29, mes postuliavome, kad GO ekspozicija taip pat gali paveikti DAF-16 branduolio lokalizaciją nematodų srityje. Pasitelkę transgeninę zIs356 padermę, pastebėjome reikšmingą DAF-16: GFP ekspresijos padidėjimą GO paveiktų nematodų branduoliuose, palyginti su kontrole (1b pav.). Taigi GO ekspozicija gali ne tik paveikti genų, koduojančių insulino signalizacijos kelią, transkripcinį aktyvumą, bet ir paveikti branduolio citoplazmos DAF-16 translokaciją nematodų srityje.

Image

a ) GO poveikis pakeitė kai kurių genų, koduojančių insulino signalizacijos kelią, ekspresijos lygius laukinio tipo nematoduose. ( b ) GO ekspozicija turėjo įtakos DAF-16 :: GFP branduolio perkėlimui. Rodyklių galvutės rodo DAF-16 raišką žarnyne. GO ekspozicijos koncentracija buvo 100 mg / L. Ilgalaikis L1 lervos poveikis buvo atliekamas jauniems suaugusiesiems. Juostos reiškia vidurkį ± SEM. ** P <0, 01 palyginti su kontrole.

Visas dydis

Daf-16 geno mutacija sukėlė nematodų jautrumą GO toksiškumui

Sergant C. elegans , daf-16 genas koduoja FOXO transkripcijos faktorių, kuris reguliuoja kelis biologinius procesus paveikdamas tikslinių genų funkcijas 23 . Ankstesni tyrimai parodė, kad judėjimo elgsena yra labai jautrus vertinamasis rezultatas, vertinant neigiamą ŠNM poveikį nematodams 31, 32. Lokomotyvo elgesys buvo įvertintas pagal galvos slankstelį ir kūno lenkimą nematodais 31, 32 . Po ilgo ekspozicijos mes nustatėme, kad praradus funkciją dėl daf-16 geno, GO paveiktų nematodų galvos smegenys ar kūno lenkimas smarkiau sumažėjo, palyginti su GO paveiktais laukinio tipo nematodais (2a pav.). Naudodamiesi gyvenimo trukme kaip baigtimi , mes taip pat pastebėjome, kad GO paveiktų daf-16 ( mu86 ) mutantų gyvenimo trukmė buvo žymiai trumpesnė, palyginti su GO paveiktų laukinio tipo nematodų (2b pav., S1 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad daf-16 geno mutacija sukelia didesnį C. elegans jautrumą GO.

Image

a ) Daf-16 arba daf-2 genų mutacijų poveikis lokalizacijos elgsenai nematodams, paveiktiems GO. b ) Daf-16 arba daf-2 genų mutacijų poveikis nematodų, paveiktų GO, gyvenimo trukmei. c ) 1- ojo amžiaus, akt-1, akt-2 arba daf-18 geno mutacijos turėjo įtakos GO toksiškumui dėl nematodų lokalizacijos. d ) 1- ojo amžiaus, akt-1, akt-2 arba daf-18 geno mutacijos turėjo įtakos GO toksiškumui nematodų gyvenimo metu. Nematodų lokomotyvų elgesys buvo vertinamas pagal galvos sumušimo ir kūno lenkimo galinius taškus. GO ekspozicijos koncentracija buvo 100 mg / L. Ilgalaikis L1 lervos poveikis buvo atliekamas jauniems suaugusiesiems. Juostos reiškia vidurkį ± SEM. ** P <0, 01 palyginti su kontrole (jei specialiai nenurodyta).

Visas dydis

Daf-2 geno mutacija sukėlė nematodų atsparumą GO toksiškumui

Sergant C. elegans , daf-2 genas koduoja insulino receptorius, atsakingus už signalų iš insulino peptidų gavimą 23 . Taikydami lokomotyvo elgseną, mes nustatėme, kad daf-2 ( e1370 ) mutantai buvo atsparūs GO toksiškumui tiek galvos, tiek kūno lenkime, palyginti su GO paveiktais laukinio tipo nematodais (2a pav.). Be to, GO paveiktų daf-2 ( e1370 ) mutantų gyvenimo trukmė žymiai padidėjo, palyginti su GO paveiktų laukinio tipo nematodų (2b pav., S1 lentelė). Todėl mūsų rezultatai rodo, kad daf-2 ( e1370 ) mutacija sukelia atsparumą GO toksiškumui.

1-ojo amžiaus, akt-1, akt-2 arba daf-18 genai buvo naudojami kontroliuojant nematodų GO toksiškumą

Sergant C. elegans , amžiaus 1, akt-1 ir akt-2 genai koduoja kinazės kaskadą tarp DAF-2 ir DAF-16, o DAF-18 veikia kaip insulino AGE-1 slopintuvas. signalinis kelias 23 . Naudodamiesi lokomotyvo elgsena ir gyvenimo trukme kaip pasekmes, mes nustatėme, kad amžiaus 1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) ir akt-2 ( ok393 ) mutantai buvo atsparūs GO toksiškumui dėl judėjimo elgsenos ar gyvenimo trukmės (2c, d pav.), S2 lentelė). Priešingai, daf-18 ( ok480 ) mutantai buvo jautrūs GO toksiškumui dėl judėjimo ar gyvenimo trukmės (2c pav., D, S2 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad AGE-1, AKT-1 ir AKT-2 sudaro kinazės kaskadą insulino signalizacijos keliui, kuris yra susijęs su nematodų GO toksiškumo kontrole.

Genų genetinė sąveika insulino signalizacijos kelyje reguliuojant GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui

Toliau mes ištyrėme genetinę daf-16 geno sąveiką su kitais insulino signalizacijos kelyje esančiais genais, reguliuodami GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui. Mes nustatėme, kad daf-16 geno mutacija gali veiksmingai sutrumpinti GO paveiktų daf-2 ( e1370 ), amžiaus 1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) arba akt-2 ( ok393 ) mutantų gyvenimo trukmę (pav. 3, S3 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad DAF-16 gali veikti pasroviui nuo DAF-2, AGE-1, AKT-1 ir AKT-2, kad sureguliuotų GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui.

Image

GO ekspozicijos koncentracija buvo 100 mg / L. Ilgalaikis L1 lervos poveikis buvo atliekamas jauniems suaugusiesiems.

Visas dydis

Mes taip pat nustatėme, kad daf-18 geno mutacija galėtų veiksmingai sutrumpinti GO paveiktų ( hx546 ) amžiaus mutantų gyvenimo trukmę (3 pav., S3 lentelė), o tai patvirtina DAF-18 slopinančiojo vaidmenį AGE-1 kontrolėje. GO toksiškumas nematodais.

DAF-16 specifinis audinių aktyvumas reguliuojant nematodų GO toksiškumą

Sergant C. elegans , daf-16 genas ekspresuojamas beveik visuose audiniuose, įskaitant žarnyną, neuronus, raumenis ir ryklę 23 . Taikydami lokomotyvo elgseną ir gyvenimo trukmę, mes nustatėme, kad daf-16 geno ekspresija neuronuose, raumenyse ar ryklėje nedaro reikšmingos įtakos lokalizacijos elgsenai ar gyvenimo trukmei GO paveiktų daf-16 ( mu86 ) mutantų (4 pav., S4 lentelė). Priešingai, mes pastebėjome, kad daf-16 geno raiška žarnyne efektyviai padidino sumažėjusį GO paveiktų daf-16 ( mu96 ) mutantų lokalizacijos elgesį ar sutrumpintą jų gyvenimo trukmę (4 pav., S4 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad daf-16 genas pirmiausia gali veikti žarnyne, norėdamas reguliuoti nematodų GO toksiškumą.

Image

a ) DAF-16 specifinis audinių aktyvumas reguliuojant GO toksiškumą nematodų lokalizacijos atžvilgiu. Nematodų lokomotyvų elgesys buvo vertinamas pagal galvos sumušimo ir kūno lenkimo galinius taškus. b ) DAF-16 specifinis audinių aktyvumas reguliuojant GO toksiškumą nematodų gyvenimo trukmei. GO ekspozicijos koncentracija buvo 100 mg / L. Ilgalaikis L1 lervos poveikis buvo atliekamas jauniems suaugusiesiems. Juostos reiškia vidurkį ± SEM. ** P <0, 01 palyginti su laukinio tipo.

Visas dydis

Žarnoms būdingi RNR trukdžiai (RNR), koduojantys insulino signalizacijos kelią, turėjo įtakos GO toksiškumui nematodų ilgaamžiškumui

Norėdami išsamiau ištirti kitų genų audinių specifinį aktyvumą insulino signalizacijos kelyje reguliuodami GO toksiškumą, mes atlikome žarnynui specifines RNR ant VP303 padermės 33 . Nematoduose mes nustatėme, kad daf-2, amžiaus 1, akt-1 ar akt-2 geno žarnynui būdingos RNR pailgina gyvenimo trukmę, tuo tarpu daf-16 arba daf-18 geno žarnynui būdingos RNR paskatino sutrumpinta gyvenimo trukmė (5 pav., S5 lentelė). Be to, po ilgo poveikio nematodų, turinčių daf-2, amžiaus 1, amžiaus-1 ar akt-2 geno žarnynui būdingų RNRi, metu buvo pastebėtas atsparumas GO toksiškumui, tuo tarpu jautrumas GO toksiškumui buvo pastebėta nematodų, kuriems buvo atliktas specifinis daf-16 arba daf-18 geno RNR žarnyne (5 pav., S5 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad insulino signalizacijos kelias gali veikti žarnyne reguliuodamas nematodų GO toksiškumą. Kadangi VP303 padermėje trūksta lokomotyvo elgesio, mes neištyrėme žarnynui būdingų RNR genų, koduojančių insulino signalizacijos kelią, lokalizacijos elgsenos GO paveiktų nematodų.

Image

GO ekspozicijos koncentracija buvo 100 mg / L. Ilgalaikis L1 lervos poveikis buvo atliekamas jauniems suaugusiesiems.

Visas dydis

GO toksiškumo reguliavimas pagal DAF-16 taikinį SOD-3

Sergant C. elegans, sod-3 yra svarbus daf-16 geno taikinys, jis koduoja mitochondrinę geležies / mangano superoksido dismutazę, reikalingą apsisaugoti nuo oksidacinio streso 23 . SOD-3 yra išreikštas galvos, žarnyno, raumenų, vulvos ir uodegos ryklėje 34 . Paprastai žarnyne tikimasi silpnos SOD-3 ekspresijos. Tačiau po ilgo poveikio, mes pastebėjome, kad GO gali žymiai padidinti SOD-3 raišką nematodų žarnyne, palyginti su kontroline (6a pav.).

Image

( a ) GO poveikio SOD-3 :: GFP raiškai. Kairėje pateikiami SOD-3 :: GFP ekspresijos vaizdai, o dešinėje - SOD-3 :: GFP santykinės fluorescencinės žarnos palyginimas nematodų žarnyne. Žvaigždutės nurodo nematodų žarnyną. b ) Sod-3 geno žarnynui būdingų RNR poveikis GO paveiktų nematodų gyvenimo trukmei. c ) Daf-16 geno padidėjusio žarnyno ekspresijos poveikis GO toksiškumui nematodų gyvenimo trukmei. d ) Sod-3 mutacijų poveikis GO paveiktų nematodų gyvenimo trukmei, perrašant nematodų daf-16 geną žarnyne. GO ekspozicijos koncentracija buvo 100 mg / L. Ilgalaikis L1 lervos poveikis buvo atliekamas jauniems suaugusiesiems. Juostos reiškia vidurkį ± SEM. ** P <0, 01 palyginti su laukinio tipo.

Visas dydis

Naudodami VP303 kaip žarnyno RNR įrankį, mes nustatėme, kad sod-3 geno žarnyno RNR sukėlė nematodų jautrumą GO toksiškumui nematodų ilgaamžiškumui (6b pav., S6 lentelė). Tačiau sod-3 geno žarnyno RNR nepaveikė nematodų gyvenimo trukmės, nesant GO (6b pav., S6 lentelė). Todėl SOD-3 taip pat gali veikti žarnyne, kad sureguliuotų GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui.

DAF-16 ir SOD-3 genetinė sąveika reguliuojant GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui

Norėdami toliau ištirti daf-16 geno ir sod-3 geno sąveiką reguliuojant GO toksiškumą, mes sukūrėme transgeninį Ex kamieną ( Pges-1-daf-16 ), kuriame daf-16 genas buvo per daug išreikštas. nematodų žarnynas. Žarnyno per didelis daf-16 geno ekspresija sukėlė gyvūnų atsparumą GO toksiškumui dėl ilgaamžiškumo (6c pav., S7 lentelė). Atvirkščiai, mes pastebėjome, kad transgeninio Ex ( padermės-1-daf-16 ) padermės atsparumą GO toksiškumui ilgaamžiškumui gali pastebimai slopinti sodod-3 mutacija nematoduose (6d pav., S7 lentelė). Normaliomis sąlygomis sod-2 ( gk235 ) mutanto gyvenimo trukmė buvo panaši kaip laukinio tipo N2, tuo tarpu sod-2 geno mutacija akivaizdžiai neturėjo įtakos ilgaamžiam nematodų fenotipui, kuris per daug ekspresuoja daf-16 geną žarnyne. (S2 pav., S7 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad DAF-16 gali toliau veikti prieš SOD-3, kad sureguliuotų GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui.

DAF-16 ir SOD-3 genetinė sąveika reguliuojant GO toksiškumą, sukeliant ROS gamybą

Galiausiai mes ištyrėme DAF-16 ir SOD-3 sąveiką reguliuodami GO toksiškumą skatinant nematodų žarnyno ROS gamybą. „ Sod-3“ geno mutacija arba per didelis daf-16 geno ekspresija žarnyne nesukėlė nemažų ROS gamybos nematodų, nesant GO poveikio (S3 pav.). Tačiau po GO ekspozicijos mes pastebėjome, kad padidėjęs daf-16 geno kiekis žarnyne reikšmingai slopino nematodų žarnyno ROS gamybos indukciją (S3 pav.). Priešingai, po GO poveikio, sod-3 geno mutacija sustiprino nematodų žarnyno ROS gamybos indukciją (S3 pav.). Be to, po GO poveikio, sod-3 geno mutacija dar labiau paskatino nematerialių žarnyno ROS produkcijos indukciją, perrašančią daf-16 geną žarnyne (S3 pav.).

Diskusija

Ankstesni tyrimai rodo, kad insulino signalizacijos kelias yra susijęs su biologinių procesų, tokių kaip įgimto imuniteto ir reagavimo į stresą nematodų, valdymu 25, 26 . Šiame tyrime mes taip pat pateikėme įrodymų, patvirtinančių insulino signalizacijos kelio dalyvavimą kontroliuojant specifinių ENM, tokių kaip GO, toksiškumą. Nematode GO ekspozicija esant 100 mg / l koncentracijai padidino daf-2, amžiaus 1, akt-1 ir akt-2 genų ekspresijos lygius, tuo tarpu sumažino daf-18 ir daf-18 ekspresijos lygius. 16 genų (1a pav.). Šie rezultatai rodo, kad bent jau tiriamoje koncentracijoje GO ekspozicija gali sutrikdyti DAF-2 / IGF-1 receptorių, AGE-1, AKT-1 ir AKT-2 tarpininkaujamos kinazės kaskados ir DAF-16 / FOXO funkcijas. transkripcijos koeficientas (7 pav.). Įdomiau, kad mes taip pat nustatėme, kad GO gali paveikti AGE-1 funkciją per žemai sureguliuodamas DAF-18 ekspresiją nematoduose (7 pav.).

Image

Visas dydis

Įrodymai, gauti iš genetinių mutantų, dar labiau patvirtino DAF-2, AGE-1, AKT-1, AKT-2, DAF-18 ir DAF-16 vaidmenį reguliuojant GO toksiškumą. Daf-2, amžiaus 1, akt-1 ar akt-2 geno mutacija sukėlė nematodų atsparumą GO toksiškumui; tačiau daf-18 arba daf-16 geno mutacija sukėlė nematodų jautrumą GO toksiškumui (2 pav., S1 ir S2 lentelės). C. elegans atveju buvo pranešta, kad daf-2, 1 metų, akt-1 ir akt-2 mutantai buvo atsparūs Pseudomonas aeruginosa infekcijai; tačiau P. aeruginosa užkrėstų daf-18 arba daf-16 mutantų gyvenimo trukmė buvo panaši kaip P. aeruginosa užkrėstų laukinio tipo nematodų 25 . Toliau buvo pranešta, kad PM 2.5 reikšmingai padidino daf-2 ir akt-1 genų ekspresijos lygius, tuo tarpu sumažino daf-18 ir daf-16 genų ekspresijos lygius 26 . Šie rezultatai rodo, kad insulino signalizacijos kelias gali reguliuoti skirtingus biologinius procesus per skirtingą nematodų signalizacijos kaskadą.

Genetinės sąveikos analizė parodė, kad pagrindinis DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 signalizacijos kaskadas gali vaidinti svarbą kontroliuojant GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui (3 ir 7 pav., S3 lentelė). . Taip pat įrodyta, kad DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 signalizacijos kaskadas yra susijęs su nematodų imuninio atsako kontrole, atsižvelgiant į P. aeruginosa infekciją 25 . Šie rezultatai leidžia manyti, kad DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 gali būti konservuota signalizacijos kaskada insulino signalizacijos kelyje reguliuojant biologinius įvykius, susijusius su įgimtu imunitetu, reakcija į stresą ir nematodų nanotoksiškumą.

Ankstesni tyrimai rodo, kad DAF-16 ekspresija žarnyne daugiausia lemia jo funkciją reguliuojant nematodų ilgaamžiškumą . Vis dėlto neaiškus DAF-16 specifinis audinių aktyvumas reguliuojant reakciją į stresą ar nanotoksiškumą. Be to, ankstesnis tyrimas parodė, kad kontroliuojant PM 2, 5 toksiškumą nematodų žarnyno vystymuisi ir funkcijai, yra kontroliuojamas PM 2, 5 toksiškumas 26 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad DAF-16 žarnynui būdingas aktyvumas reikalingas jo funkcijai reguliuojant GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui (4 pav., S4 lentelė). Įdomu tai, kad stebėjome, kad genų, koduojančių DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 signalinę kaskadą, žarnyno RNR taip pat turėjo įtakos GO toksiškumui nematodų ilgaamžiškumui (5 pav., S5 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad GO poveikis gali sumažinti ilgaamžiškumą, panaikindamas DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16, konservuoto signalizacijos kaskados, reikalingos ilgaamžiškumui kontroliuoti, signalizacijos kaskados funkcijas nematodų žarnyne 22., 23 . Kitaip tariant, žarnyno insulino signalizacija greičiausiai reguliuoja GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui. Mes hipoteze, kad pakitę signalizacijos apie insuliną gali būti vienas iš molekulinių mechanizmų, sukeliančių GO toksiškumą nematodų ilgaamžiškumui (7 pav.).

Šiame tyrime mes nustatėme, kad signalizacija apie insuliną gali prisidėti prie kito molekulinio mechanizmo, sukeliančio GO toksiškumą ilgaamžiškumui. Mūsų rezultatai rodo, kad DAF-16 veikė prieš SOD-3, kad reguliuotų GO toksiškumą ilgaamžiškumui (6d pav., S7 lentelė). Nematoduose sod-3 genas koduoja antioksidacijos sistemą nuo oksidacinio streso indukcijos. Esant GO paveiktiems nematodams, SOD-3 funkcija nuo oksidacinio streso dar buvo patvirtinta atliekant ROS gamybos tyrimą sod-3 mutante (S3 pav.). Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad sod-3 geno mutacija gali dar labiau paskatinti reikšmingą ROS produkcijos indukciją GO paveiktuose nematoduose, per daug išreiškiančiuose daf-16 geną žarnyne (S3 pav.). Šie rezultatai rodo, kad GO poveikis taip pat gali sumažinti ilgaamžiškumą, paveikdamas antioksidacijos sistemos funkcijas prieš oksidacinio streso indukciją. Mes hipotezuojame, kad tai yra dar vienas GO toksiškumo ilgaamžiškumui molekulinis mechanizmas, kuris priklauso nuo insulino signalizacijos ir jo svarbaus tikslinio geno sod-3 nematodų (7 pav.). Šis siūlomas mechanizmas taip pat suteikia pagrindą oksidaciniam stresui, sukeliančiam GO toksiškumą nematodams, kaip aprašyta anksčiau kitose ataskaitose 15 .

Sergant C. elegans , DAF-16 veikia kaip transkripcijos faktorius, suaktyvinantis tikslinių genų aktyvumą, kai DAF-16 perkeliamas į 22, 23 branduolį. Įdomu tai, kad pastebėjome, kad kartu su smarkiai sumažėjusia DAF-16 ekspresija buvo rastas tam tikras DAF-16 kiekis branduolyje (1b pav.). Šie rezultatai reiškia, kad bent tam tikras DAF-16 kiekis, perkeltas į branduolį, taip pat gali sukelti teigiamą grįžtamąjį ryšį tarp DAF-16 ir kitų signalų perdavimo komponentų nematodų.

Pabaigoje mes ištyrėme insulino signalizacijos kelio dalyvavimą kontroliuojant GO toksiškumą ilgaamžiškumui ir pagrindinius nematodų mechanizmus. Mes nustatėme DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 signalinę kaskadą insulino signalizacijos kelyje, kuris yra skirtas kontroliuoti GO toksiškumą ilgą laiką. Be to, mes nustatėme, kad ši signalizacijos kaskada pirmiausia veikė žarnyne, norėdama reguliuoti GO toksiškumą ilgą laiką. Remdamiesi mūsų rezultatais, mes hipotezuojame, kad vienas iš molekulinio GO toksiškumo mechanizmų yra tas, kad GO gali panaikinti DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 signalo kaskadą insulino signalizacijos kelyje. Be to, mes nustatėme, kad insulino signalizacijos kelias gali užkoduoti kitą molekulinį mechanizmą, mažinantį GO sukeltą ilgaamžiškumą. GO poveikis gali slopinti DAF-16 funkciją signalizuodamas apie insuliną ir tokiu būdu dar labiau slopinti SOD-3, kuris vaidina svarbų vaidmenį apsaugant nuo oksidacinio streso GO veikiamiems nematodams, funkciją. Išaiškinti insulino signalizacijos užkoduoti molekuliniai mechanizmai, skirti GO sukeltai sutrumpintai ilgaamžiškumui, pabrėžia galimą insulino signalizacijos kelio vaidmenį kontroliuojant GO toksiškumą organizmuose.

Metodai

Reagentai ir GO paruošimas

GO buvo paruoštas iš natūralių grafito miltelių, naudojant modifikuotą Hummerio metodą 35, 36 . Į 250 ml kolbą įpilta grafito (2 g) ir natrio nitrato (1 g). Pridėjus koncentruoto H2S04 (50 ml) ant ledo, į mišinį pridėta KMnO4 (7 g). Po to, kai mišinio temperatūra pašildyta iki 35 ° C, į pastą lėtai lašėjo 90 ml H2O. Maišant praskiestą suspensiją 70 ° C temperatūroje dar 15 min., Suspensija buvo apdorota 7 ml 30% H2O2 ir 55 ml H2O mišiniu. Gauta šilta suspensija filtruojama, norint gauti gelsvai rudą filtrą. pyragas, kuris buvo toliau plaunamas 3% HCl tirpalu, po to džiovinamas 40 ° C temperatūroje 24 valandas. GO buvo gautas ultragarsu apdorojant grafito oksidą vandenyje 1 valandą.

GO 30 minučių ultragarsu (40 kHz, 100 W) ir disperguotas K terpėje, kad gautų pradinį tirpalą (1 mg / L). Pradinis tirpalas praskiedžiamas K terpė iki panaudotos koncentracijos (100 mg / l) prieš pat veikimą. Ankstesnis tyrimas parodė, kad 100 mg / l koncentracijos GO gali sumažinti nematodų gyvenimo trukmę 16 . Visos kitos cheminės medžiagos buvo gautos iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV).

GO apibūdinimas

GO buvo būdinga perdavimo elektronų mikroskopija (TEM, JEM-200CX, JEOL, Japonija), atominės jėgos mikroskopija (AFM, SPM-9600, Shimadzu, Japonija), Ramano spektroskopija, naudojant 632 nm bangos ilgio sužadinimą (Renishaw Invia Plus lazerinis Raman spektrometras, Renishaw)., JK) ir „Zeta“ potencialą išanalizavo „Nano Zetasizer“, naudodamas dinaminį šviesos sklaidos metodą. Norėdami atlikti AFM matavimus, GO suspensija buvo pipetė ant Si substratų, o Si substratai buvo toliau džiovinami ore ir dedami po AFM antgaliu.

C. elegans kamieno paruošimas

Nematodai buvo palaikomi nematodų augimo terpės (NGM) plokštelėse, pasodintose Escherichia coli OP50, 20 ° C temperatūroje, kaip aprašyta anksčiau 37 . Nematodai, naudojami šiame tyrime, buvo laukinio tipo N2, daf-16 ( mu86 ), daf-2 ( e1370 ), amžiaus 1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ), akt-2 ( ok393 ), daf mutantai. -18 ( ok480 ), sod-3 ( gk235 ), daf-16 ( mu86 ); sod-3 ( gk235 ) ir daf-16- ( mu86 ); daf-2 ( e1370 ), ir VP303 / kbIs7 [ nhx-2p :: rde-1 ], zIs356 [P daf-16 :: daf-16a / b :: GFP ], daf-16 ( mu86 ) transgeninių padermių, pvz. (P ges-1-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P unc-14-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P myo -3-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P myo -2-daf-16 ), Ex (P ges-1-daf-16 ) ir Ex (P ges-1-daf-16 ); sod-3 ( gk235 ). Kai kurie panaudoti padermės iš pradžių buvo gauti iš Kaenorhabdito genetikos centro (finansuoja NIH tyrimų infrastruktūros programų biuras (P40 OD010440)). Graudūs nematodai buvo išplauti iš plokštelių į centrifugos mėgintuvėlius ir lizuojami balinamuoju mišiniu (0, 45 M NaOH, 2% HOCl). L1 lervų amžiaus sinchroninės populiacijos buvo paruoštos, kaip aprašyta anksčiau 38 . Ilgalaikis GO ekspozicija buvo atliktas iš L1 lervų jauniems suaugusiesiems 12 šulinėlių steriliuose audinių kultūros plokštelėse 20 ° C temperatūroje esant maistui (OP50). Neapsaugoti nematodai buvo naudojami toksiškumui įvertinti, naudojant galutinį tašką - gyvenimo trukmę, judėjimo elgseną ir ROS susidarymą.

Atvirkštinė transkripcija ir kiekybinė realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (qRT-PCR)

Bendros RNR buvo išgaunamos naudojant „RNeasy Mini kit“ („Qiagen“), po to transkribuotos atvirkščiai, naudojant „PrimeScript TM RT“ reagentų rinkinį (Takara, Otsu, Shiga, Japonija). Po cDNR sintezės realiojo laiko PGR buvo atlikta naudojant SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara) PGR produktų amplifikacijai. Kiekybinė atvirkštinės transkripcijos PGR buvo atlikta esant optimaliai atkaitinimo temperatūrai 58 ° C. Nustatytas tiriamų genų santykinis kiekybinis įvertinimas, palyginti su pamatiniu tba-1 genu, koduojančiu tubulino baltymą. Galutiniai rezultatai buvo išreikšti kaip santykinis ekspresijos santykis tarp taikinio geno ir pamatinio geno. Suprojektuoti tikslinių genų pradmenys ir pamatinis tba-1 genas buvo parodyti S8 lentelėje. Visos reakcijos buvo atliktos trimis egzemplioriais.

DAF-16 branduolinės translokacijos tyrimas

Atlikus transgeninį zIs356 kamieną GO, buvo įvertinta DAF-16 branduolio translokacija. Žarnyno DAF-16 :: GFP buvo įvertintas kaip branduolio lokalizavimas priekinėje kūno dalyje. Vaizdai buvo padaryti naudojant Zeiss Imager A2 fluorescencinį mikroskopą. Ištirti trys nepriklausomi eksperimentai su dešimčia nematodų kiekviename gydymo procese.

Toksiškumo įvertinimas

Gyvenimo trukmės tyrimas buvo atliktas iš esmės 20 ° C temperatūroje, kaip aprašyta 39 . Hermafroditai nematodai buvo pernešami kasdien pirmąsias 4 suaugimo dienas. Po to nematodai buvo tikrinami kiekvieną dieną. Nematodai bus įskaityti kaip negyvi, jei jie nejudėtų net po pakartotinių bakstelėjimų su rinkimu. Vieno gydymo metu buvo ištirta keturiasdešimt nematodų ir atlikti trys pakartojimai.

Nematodų lokomotyvų elgesys buvo įvertintas pagal galvos sumušimo ir kūno lenkimo galinius taškus, kaip aprašyta 40 . Galvos sumušimas buvo apibrėžtas kaip vidurio kūno lenkimo krypties pakeitimas. Kūno lenkimas buvo skaičiuojamas kaip nematodų dalies, atitinkančios ryklės užpakalinę lemputę, krypties pokytis išilgai y ašies, darant prielaidą, kad nematodas judėjo x ašimi. Vieno gydymo metu buvo ištirta dvidešimt nematodų ir atlikta dešimt pakartojimų.

ROS gamybos metodas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau 41 . Po veikimo nematodai buvo perkelti į 1 μM 5 ′, 6′-chlormetil-2 ′, 7′-dichlorodihydro-fluorescein diacetate (CM-H2DCFDA; Molecular Probes) 12 šulinėlių sterilioje audinių kultūros plokštelėje, kad būtų inkubuojami 3 valandas 20 ° C temperatūroje. ° C tamsoje nepridedant maisto. Nematodai buvo sumontuoti ant 2% agaro pagalvėlių, kad būtų galima ištirti esant 488 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 510 nm spinduliuotės filtrui lazeriu skenuojančiu konokaliniu mikroskopu (Leica, TCS SP2, Bensheim, Vokietija). Pusiau kiekybiškai įvertintas santykinis žarnyno fluorescencijos intensyvumas. Pusiau išmatuota ROS buvo išreikšta santykiniais fluorescencijos vienetais (RFU) ir normalizuota iki autofluorescencijos. Vieno gydymo metu buvo ištirta trisdešimt nematodų ir atlikti penki pakartojimai.

RNR

RNRi buvo atlikti šeriant nematodus E. coli paderme HT115 (DE3), ekspresuojančioje dvigrandinę RNR, kuri yra homologiška tiksliniam genui, kaip aprašyta 42 . E. coli HT115 (DE3), užaugintas LB sultinyje su ampicilinu (100 μg / ml) 37 ° C temperatūroje per naktį, buvo pasodintas ant NGM, kuriame yra ampicilino (100 μg / ml) ir izopropil-1-tio-β-D-galaktopiranozido (IPTG, 5 mM). L2 lervos buvo dedamos į RNRi plokšteles 2 dienas 20 ° C temperatūroje, kol nematodai pasidarė židiniai. Neapdoroti suaugusieji buvo perkelti į šviežias RNR ekspresuojančias bakterijų vejas, kad būtų galima dėti kiaušinius 2 valandas, kad būtų gaunama antroji RNR populiacija. Kiaušiniams buvo leista vystytis 20 ° C temperatūroje jauniems suaugusiesiems, kad būtų galima atlikti tolesnius tyrimus.

DNR konstrukcijos ir lytinių ląstelių transformacija

Norėdami sugeneruoti įėjimo vektorių, turinčią promotoriaus seką, buvo amplifikuotos specialiai žarnyne ekspresuojamo ges-1 geno promotoriaus sritys, neuronuose specialiai išreikštas unc-14 genas, raumenyse specialiai išreikštas mio-3 genas, o ryklėje specialiai išreikštas mio-2 genas. pagal PGR iš laukinio tipo C. elegans genomo DNR. Promootorio fragmentai buvo įterpti į pPD95_77 vektorių prasmės orientacija. daf-16 cDNR buvo amplifikuota PGR ir įterpta į atitinkamą įvedimo vektorių , turintį ges-1, unc-14, myo-3 arba myo-2 promotoriaus seką. Lytinių takų transformacija buvo atlikta, kaip aprašyta, įšvirkščiant tiriamąją DNR, kurios koncentracija yra 10–40 μg / ml, ir P lin-44 :: gfp arba unc-119 (+) žymeklio DNR, esant 60 μg / ml koncentracijai. nematodų gonados 43 .

Statistinė analizė

Visi šio straipsnio duomenys buvo išreikšti kaip vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida (SEM). Grafikai buvo sukurti naudojant „Microsoft Excel“ („Microsoft Corp.“, „Redmond“, WA). Statistinė analizė buvo atlikta naudojant SPSS 12.0 (SPSS Inc., Čikaga, JAV). Skirtumai tarp grupių buvo nustatyti naudojant dispersijos analizę (ANOVA). Tikimybės lygiai 0, 05 ir 0, 01 buvo laikomi statistiškai reikšmingais.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Zhao, Y. et al . Žarnyno insulino signalizavimas koduoja du skirtingus molekulinius mechanizmus sutrumpintam ilgaamžiškumui, kurį sukelia grafeno oksidas Caenorhabditis elegans. Mokslas. Rep. 6, 24024; „doi“: 10.1038 / srep24024 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.