Į žarnos liumeną išleistas žarnyno metrnlis veikia kaip vietinis žarnyno antimikrobinių peptidų reguliatorius | acta pharmaologica sinica

Į žarnos liumeną išleistas žarnyno metrnlis veikia kaip vietinis žarnyno antimikrobinių peptidų reguliatorius | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Metrnl yra naujas išskiriamas baltymas, tačiau jo fiziologiniai vaidmenys išlieka sunkūs. Šiame tyrime mes ištyrėme Metrnl audinių raiškos modelį žmonėms ir ištyrėme galimą jo fiziologinį vaidmenį audiniuose, kuriuose yra labiausiai išreikštas lygis.

Metodai:

Metrnl audinių ekspresijos modeliui ištirti buvo naudojamas žmogaus audinių mikrotraumas, kuriame buvo 19 audinių rūšių iš 69 donorų, o ekspresijos modelis dar buvo patikrintas šviežiuose žmogaus ir pelės audiniuose. Buvo sugeneruotos žarnyno epitelio ląstelėms būdingos Metrnl išmušimo pelės, kurios buvo naudojamos fiziologiniams Metrnl vaidmenims analizuoti.

Rezultatai:

Metrnl buvo labiausiai ekspresuojamas žmogaus virškinimo trakte, o specifiškai buvo ekspresuojamas žarnyno epitelyje. Atsižvelgiant į tai, Metrnl mRNR taip pat buvo labiausiai ekspresuojama pelių virškinimo trakte tarp 14 tirtų audinių. Žarnyno epitelio ląstelėms būdingose ​​Metrnl išmušimo pelėse Metrnl lygis žarnyno skystyje buvo žymiai sumažėjęs, tuo tarpu Metrnl koncentracija serume parodė tendenciją mažėti, tačiau šis pokytis nebuvo statistiškai reikšmingas. Šis ląstelėms būdingas Metrnl išbraukimas nepadarė įtakos kūno svoriui, suvartojamo maisto kiekiui, gliukozės kiekiui kraujyje, storosios žarnos ilgiui ir histologijai, žarnyno pralaidumui, gleivių turiniui ar mucin 2 raiškai fiziologinėmis sąlygomis, tačiau statistiškai sumažino antimikrobinių peptidų, tokių kaip regeneruojančios salelės, raišką. gautas 3 gama (Reg3g) ir laktotransferinas.

Išvada:

Metrnl yra labai ekspresuojamas žmonių ir pelių žarnyno epitelio ląstelėse, o tai daugiausia prisideda prie vietinio žarnyno Metrnl lygio ir mažesniu mastu veikia Metrnl kiekį kraujo serume. Metrnl vaidina svarbų vaidmenį palaikant žarnyno antimikrobinius peptidus.

Įvadas

„Metrnl“, dar žinomas kaip „Cometin 1“, „Subfatin 2“ arba „Interleukin 39 3“, neseniai buvo identifikuotas kaip išskiriamas baltymas, turintis 311 aminorūgštį su 45 aminorūgščių signalo peptidu. Iki šiol buvo tik keli tyrimai, tiriantys Metrnl 1, 4, 5, 6 funkciją.

„Metrnl“ atlieka panašią funkciją kaip ir vienintelis jo homologinis genas Meteorinas (Metrn), kuris yra naujas neurotrofinis faktorius 7 . Įrodyta, kad rekombinantinis Metrnl baltymas gali pagreitinti neuritų augimą ir neuroblastų migraciją in vitro ir parodyti neuroprotekcinį poveikį in vivo 1 .

Naujų adipokinų tikrinimo metu Metrnl nustatėme kaip naują adipokiną, parodydami, kad Metrnl yra gausiai poodiniame riebaliniame audinyje tiek žmonėms, tiek pelėms 2 . Metrnl raiška smarkiai padidėja adipogenezės metu ir baltuosiuose riebaluose nutukimo metu. Sukurdami specifinėms adipozėms pritaikytą Metrnl transgenišką perteklių ir nokautas peles, parodome, kad Metrnl gali sureguliuoti PPARγ; skatinti baltųjų adipocitų diferenciaciją, plečiamumą ir lipidų apykaitą; slopina riebalinį uždegimą; ir galiausiai antagonizuoti nutukimo sukeltą atsparumą insulinui 6 .

Taip pat buvo pranešta, kad „Metrnl“ padidėja baltojo riebalinio audinio metu, esant ūmiam šalčio poveikiui, ir raumenims - po ūmaus treniruotės kartu. Rekombinantinio Metrnl baltymo arba adenoviruso, koduojančio Metrnl geną, skyrimas skatina laikiną baltojo riebalinio audinio rudėjimą per eozinofilų priklausomą IL-4 ekspresijos padidėjimą ir alternatyvią (M2) makrofagų aktyvaciją 5, rodantį jo vaidmenį imuninės ir riebalinės sąveikos 5 . Neseniai atliktas tyrimas taip pat rodo, kad Metrnl dalyvauja tiek įgimtuose, tiek įgytuose imuniniuose atsakuose, nes Metrnl raiška yra padidinta reguliuojant kai kurias žmonių uždegimines ar su imunitetu susijusias ligas 3 .

Dėl ribotų „Metrnl“ funkcijos tyrimų, toli gražu nėra aišku, koks yra „Metrnl“ vaidmuo įvairiuose audiniuose. Be to, Metrnl audinių ekspresijos modelis žmonėms nebuvo ištirtas baltymų lygiu, nors anksčiau Metrnl audinių ekspresija buvo nustatyta RNR lygiu mūsų ir kituose tyrimuose 2, 3 . Šiame tyrime mes ištyrėme „Metrnl“ audinių raiškos modelį, naudodamiesi žmogaus audinių mikrotrauma ir nustatėme, kad Metrnl yra labai stipriai ekspresuojamas virškinimo trakto epitelinėse ląstelėse, ypač storosios žarnos epitelyje. Be to, mes sukūrėme žarnyno epitelio ląstelėms būdingas Metrnl išmušimo peles, norėdami ištirti pagrindinius Metrnl fenotipus žarnyno epitelio ląstelėse.

medžiagos ir metodai

Žmogaus daugelio organų audinių mikrotraumas

Komercinis audinių mikrotraumas (OD-NH-Com01-003) buvo įsigytas iš „Shanghai Outdo Biotech Co, Ltd“ ir buvo pagamintas iš formalinu pritvirtintų, parafinu įterptų žmogaus mėginių. Audinių mikrotraumas buvo paruoštas taškiniu būdu paskirstant 19 skirtingų tipų audinių iš 69 donorų. Išsami informacija apie pavyzdžius yra pateikta 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Visus tyrimus, kuriuose dalyvavo žmonės, patvirtino Antrojo karo medicinos universiteto medicinos etikos komitetas ir buvo gautas visų asmenų rašytinis informuotas sutikimas.

Imunohistocheminis dažymas Metrnl

Žmogaus ir pelės audinių dažymas imunohistocheminiu būdu naudojant Metrnl antikūną (Sigma) buvo atliekamas skaidrėse pagal anksčiau aprašytą protokolą 2, 6 . Trumpai tariant, stikleliai buvo inkubuojami 60 ° C temperatūroje 20 min. Po įprastinio parafinavimo ir rehidratacijos, stikleliai buvo iš anksto apdoroti 10 mmol / l natrio citrato buferiu (pH 6, 0) ir virinami 10 minučių antigenui paimti. Endogeninė peroksidazė buvo užgesinta pridedant vandenilio peroksido (3% H2O2 100% etanolyje) kambario temperatūroje 15 min. Po plovimo fosfatiniu buferiniu druskos tirpalu (PBS), stikleliai buvo užblokuoti 10% neimuniniu ožkos serumu. Tada stikleliai buvo inkubuojami per naktį su pirminiu Metrnl antikūnu (1: 100 skiedimais) ir plaunami Tris buferiniu druskos tirpalu. Tada skaidrės buvo inkubuojamos su krienų peroksidaze konjuguotu anti-triušio IgG (1: 1000) 15 min. Imunoreaktyvūs kompleksai buvo aptikti naudojant 3, 3′-diaminobenzideną (DAB, Sigma). Galiausiai skaidrės prieš mikroskopinę analizę buvo dažytos hematoksilinu.

Žarnyno epitelio ląstelėms specifinių Metrnl nokauto pelių generavimas

Visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti vadovaujantis Nacionaliniais laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo sveikatos institutais ir buvo patvirtinti Antrojo karo medicinos universiteto gyvūnų etikos komiteto. „Metrnl loxp / loxp“ pelės buvo generuojamos taip, kaip aprašėme kitur 6 . „Villin-cre“ pelės [B6.Cg-Tg (Vil1-cre) 1000Gum / J; JAX atsargos 021504] buvo naudojamos pelėms, gautoms iš žarnyno epitelio ląstelių, specifinių Metrnl išmušimo (Metrnl - / - ) pelių. Pelių Metrnl / / - veisimo strategija parodyta 2A paveiksle. Trumpai tariant, „Metrnl loxp / loxp“ pelės buvo sukryžiuotos su „Villin-cre“ pelėmis, kad būtų sukurtos „Metrnl loxp / wt“ „ Villin-cre“ pelės. ). Tada Metrnl - / - pelės buvo surūšiuotos su Metrnl loxp / loxp pelėmis, o jų palikuonims buvo atliktas genotipas atliekant genominės DNR polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizę. Metrnl loxp / loxp pelės, esančios pakratai, buvo naudojamos kaip atitinkamos laukinio tipo kontrolinės pelės.

Image

Metrnl loxp / loxp Villin-cre pelių (Metrnl - / - ) veisimas ir identifikavimas. (A) Metrnl sąlyginio išmušimo pelių veisimo strategija. (B) Metrnl-floxed pelių genotipų nustatymas. 243 bp PGR produktas yra amplifikuojamas iš sąlyginio flikso (fiksuoto flanšo) Metrnl alelio, o 131 bp PGR produktas yra amplifikuojamas iš laukinio tipo Metrnl alelio. (C) Pelių, turinčių teigiamą poveikį Cre, teigiamų pelių, įskaitant Metrnl loxp / wt Villin-cre ir Metrnl loxp / loxp Villin-cre pelėms, genotipo nustatymas. (D) Metrnl mRNR raiška Metrnl / / - ir laukinio tipo pelių audiniuose. WAT, baltas riebalinis audinys. GPGB, rudas riebalinis audinys. n = 6. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. ** P <0, 01. (E) Imunohistocheminis dažymas Metrnl Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių dvitaškiuose. Juosta, 100 μm.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Maisto suvartojimo ir gliukozės kiekio kraujyje nustatymas

Norėdami nustatyti suvartojamą maistą, pelės buvo sudėtos į porą narvuose ir 3 dienas stebėta, kaip jos vartoja maistą. Gliukozės kiekiui kraujyje nustatyti buvo naudojamas pelės uodegos kraujas, kad būtų galima išmatuoti gliukozės kiekį kraujyje esant bazinei būsenai ir 2, 4, 6, 8, 10 ir 12 val. Po badavimo naudojant „OneTouch“ gliukozės matuoklius (LifeScan), kaip aprašyta kitur. 8 .

Fluoresceino izotiocianato ir dekstrano tyrimas

Laukinio tipo ir Metrnl - / - pelės nevalgytos 4 valandas, po to davusios 10 mg fluoresceino izotiocianato (FITC) –dekstrano (molekulinė masė 3000–5000 Da arba 40000 Da; Sigma), kaip aprašyta kitur 9 . Po 4 valandų pelės buvo išnaikintos atlikus gimdos kaklelio išnirimą ir išpūstos širdies punkcija. Kraujas buvo centrifuguojamas 3000 x g greičiu 30 min., O serumas buvo paimtas fluorometrijai Ex / Em 485/528 nm bangoje, siekiant nustatyti fluorescencijos intensyvumą.

MRNR kiekybinis nustatymas realaus laiko PGR

Bendra RNR buvo ekstrahuota iš įvairių audinių naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen), o realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant ABI 7500 realaus laiko PGR sistemą (Applied Biosystems), kaip aprašyta anksčiau 2 . Į galutinį 20 μL reakcijos mišinį buvo įtraukta 10 μL SYBR Green, 2 μL cDNR šablonas ir 1 μL pradmenys. Vidutinis slenksčio ciklas (Ct) buvo nustatytas iš kartotinių reakcijų, tikslinio geno ekspresija buvo normalizuota iki GAPDH, o kiekybiniai matavimai buvo gauti naudojant ΔΔC T metodą. Visi pradmenys su jų seka išvardyti 2 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Histologinis dažymas

Periodinis dažymas rūgštimi – Schiffu (PAS) ir hematoksilinu bei eozinu (H&E) buvo dažomas, kaip aprašyta anksčiau, 10, 11 . Trumpai tariant, žarnyno mėginiai, naudojami histologinei analizei, buvo fiksuojami 4% fosfatu buferiniu paraformaldehidu 24 valandas ir įterpiami į parafiną. Paruoštos 4 μm storio sekcijos ir dažytos PAS arba HE. Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant „Leica“ mikroskopą. Pusiau kokybinė PAS dažymo analizė atlikta naudojant ImageJ programinę įrangą.

Žarnyno skysčių surinkimas

Žarnyno skysčių surinkimo metodas buvo atliktas pagal anksčiau aprašytą procedūrą 12 . Trumpai tariant, per naktį nevalgius, pelės buvo išnaikintos perdozavus pentobarbitalio natrio 13, ir pilvas buvo nedelsiant atidarytas, kad būtų galima akcizuoti identiškus 5 cm ilgio storosios žarnos. Pirmiausia gaubtinės žarnos mėginiai buvo inkubuojami su 8 ml PBS 10 min. Antra, švirkštas su nematoma adata buvo naudojamas PBS praplauti tris kartus iš proksimalinio ir distalinio gaubtinės žarnos galo. Tada PBS buvo surinktas ir centrifuguotas 12 000 x g 4 ° C temperatūroje 10 min. Supernatantas buvo surinktas ir filtruojamas naudojant „Amicon® Ultra-4“ išcentrinius filtrus (molekulinio svorio ribos 10 kDa, „Merck“). Koncentruotas skystis buvo šiek tiek sureguliuotas iki to paties tūrio naudojant PBS. Galiausiai Metrnl koncentracija buvo nustatyta naudojant „DuoSet Development Kit“ (R&D Systems).

Statistinė analizė

Visi duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM ir buvo išanalizuoti naudojant „Prism 5.0“ programinę įrangą („GraphPad Software“). Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas pagal dvipusį Studento t- testą. P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

Rezultatai

Didelė Metrnl ekspresija žmogaus virškinimo trakte

Norėdami ištirti Metrnl raiškos modelį skirtinguose žmogaus audiniuose, atlikome kelių organų žmogaus audinių mikrotraumą. Didžiąją dalį audinių sudarė keturi skirtingų donorų, skirtingo amžiaus, pavyzdžiai. Remiantis imunohistocheminio dažymo rezultatais, audinius galima suskirstyti į 4 laipsnius: neigiamus, silpnai teigiamus, teigiamus ir stipriai teigiamus. Kaip parodyta 3 lentelėje, mes nenustatėme Metrnl ekspresijos smegenyse, smegenėlėse, skeleto raumenyse, kiaušidėse, prostatoje, širdyje, kasoje ar gimdoje - tai atitiko mūsų ankstesnį tyrimą 2 . Metrnl išraiška kepenyse ir antinksčiuose buvo silpnai teigiama. Metrnl buvo išreikštas inkstuose, skydliaukėje, sėklidėse, blužnyje ir plaučiuose. Pažymėtina, kad Metrnl ekspresija virškinimo trakte ir odoje buvo stipriai teigiama ir dramatiškai didesnė nei kituose audiniuose (3 lentelė, 1A pav.).

Pilno dydžio lentelė

Image

Didelė Metrnl ekspresija žmonių ir pelių virškinimo trakte. (A) Atstovaujamų žmogaus audinių imunohistocheminis dažymas. Pastebėtas stiprus teigiamas storosios žarnos ir plonosios žarnos imuninis dažymas, vidutiniškai teigiamas skydliaukės ir inkstų imuninis dažymas, silpnas teigiamas imuninis dažymas kepenyse ir antinksčiuose, beveik neigiamas imuninis dažymas smegenyse ir griaučių raumenyse. Strypas, 50 μm. Metrnl dažymas žymimas geltona rodykle. (B) Metrnl išraiška žmogaus žarnyno epitelio ląstelėse. Juosta, 200 μm. (C) „Metrnl“ mRNR išraiška 14 audinių iš C57BL / 6 pelių, kurių didžiausia ekspresija gaubtinės žarnos, po jos plonojoje žarnoje ir skrandyje.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norint nustatyti, kurių tipų ląstelėse įvyko Metrnl ekspresija, buvo surinkta daugiau šviežių žmogaus žarnyno audinių ir nustatyta Metrnl ekspresija imunohistochemija. Rezultatai parodė, kad Metrnl daugiausia buvo ekspresuojamas žarnyno epitelio ląstelėse, bet ne kitų tipų ląstelėse (1B pav.).

Norėdami dar labiau išsiaiškinti, ar „Metrnl“ rodo panašų raiškos modelį pelėje, realiojo laiko PGR aptikome Metrnl raišką skirtinguose pelės audiniuose. Nuosekliai Metrnl ekspresija buvo labai didelė pelių virškinimo trakte, ypač storosios žarnos. Metrnl išraiška riebaliniame audinyje, plaučiuose, sėklidėse ir inkstuose buvo palyginti aukšta, tuo tarpu jos išraiška smegenyse, blužnyje ar kasoje buvo daug mažesnė (1C pav.).

Metrnl trūkumas žarnyno epitelio ląstelėse nesukelia matomų skirtumų

Norėdami suprasti „Metrnl“ vaidmenį žarnyno epitelio ląstelėse, sukūrėme žarnyno epitelio ląstelėms būdingas „Metrnl“ išmušimo peles, poruodami Metrnl loxp / loxp ir Villin-cre peles (2A – 2C pav.). „Metrnl“ nokauto efektyvumas buvo vertinamas tiek realiojo laiko PGR, tiek imunohistochemija. Metrnl išraiška sumažėjo 96% storosios žarnos ir neparodė jokių pokyčių širdies, kepenų, raumenų ir riebaliniame audinyje (2D paveikslas). Remiantis tuo, imunohistocheminis dažymas parodė, kad Metrnl baltymo ekspresija Metrnl - / - pelių storosios žarnos epitelio ląstelėse buvo daug mažesnė nei laukinio tipo pelių (2E pav.). Šie rezultatai patvirtino, kad Metrnl žarnyno epitelio ląstelėse buvo specialiai išmuštas Metrnl - / - pelėms.

Metrnl - / - ir Metrnl loxp / loxp pelių santykis atitiko Mendelio įstatymą, o pastebimų skirtumų tarp Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių nebuvo pastebėta. Metrnl - / - pelių kūno svoris ir suvartotas maistas nesiskyrė nuo laukinio tipo pelių (3A ir 3B paveikslai). Gliukozės kiekis kraujyje buvo panašus tarp „Metrnl“ / ir pelių pelių tiek šeriant, tiek nevalgius (3C pav.).

Image

Žarnyno epitelio Metrnl poveikis kūno svoriui, suvartojamo maisto kiekiui ir gliukozės kiekiui kraujyje. (A) Metrnl - / - pelių kūno svoris yra panašus į laukinių pelių, šeriamų įprasta čiau dieta, kūno svorį. (B) „Metrnl“ / - ir laukinių gyvūnų pelių, šeriamų įprasta čiau, dieta. n = 12. (C) Gliukozės kiekis kraujyje nurodytais laiko momentais buvo išmatuotas pasninkaujant Metrnl - / - pelėms ir laukinio tipo pelėms, šeriamoms įprastu šiaudais. n = 7. Vidurkis ± SEM.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Toliau išmatuojome storosios žarnos ilgį, kuris nepasikeitė Metrn1 - / - pelėse (4A pav.). Mes taip pat nestebėjome histologinių skirtumų tarp Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių žarnų, naudojant H&E dažymą (4B pav.). Be to, norint ištirti Metrnl įtaką žarnyno pralaidumui, buvo tiriamas FITC fluorescencijos intensyvumas serume po dozavimo FITC konjuguotu dekstranu skirtingo molekulinio svorio. Kaip parodyta 4C paveiksle, jokio skirtumo tarp Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių nebuvo rasta nei mažos molekulinės masės dekstrano grupėje, nei didelės molekulinės masės dekstrano grupėje.

Image

Žarnyno epitelio Metrnl poveikis storosios žarnos ilgiui, žarnų pralaidumui ir histologijai, Metrnl koncentracijai serume ir Metrnl lygiui žarnyno skystyje. (A) Metrnl - / - pelėms, palyginti su laukinio tipo pelėmis, storosios žarnos ilgis nesiskyrė. (B) storosios žarnos dažymas H&E Metrnl - / - ir laukinio tipo pelėse. Juosta, 200 μm. (C) FITC fluorescencijos intensyvumas serume yra panašus tarp Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių, po to, kai jos buvo gabenamos FITC konjuguotu dekstranu, esant nurodytam molekuliniam svoriui. (D) Metrnl koncentracija serume linkusi mažėti Metrnl - / - pelėse, palyginti su laukinio tipo pelėmis. n = 7. (E) Metrnl - / - pelėms Metrnl lygis žarnyno skysčiuose yra žymiai sumažėjęs. n = 7. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. * P <0, 05.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Metrnl trūkumas žarnyno epitelio ląstelėse sumažina Metrnl lygį žarnos skystyje

Atsižvelgiant į tai, kad Metrnl baltymas egzistavo tiek pūslelėse, tiek epitelio ląstelių citoplazmoje, jis galėjo būti išskiriamas į kraują ir per eksocitozę būti eksportuojamas į žarnyno skystį. Norėdami nustatyti, ar žarnyno epitelio ląstelės yra pagrindinis cirkuliuojančios Metrnl šaltinis, mes palyginome Metrnl koncentraciją serume tarp Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių, naudodamiesi ELISA rinkiniu. Kaip parodyta 4D paveiksle, Metrnl - / - pelėse Metrnl serumo lygis buvo linkęs mažėti, tačiau skirtumas nebuvo reikšmingas. Tačiau Metrnl - / - pelėms Metrnl koncentracija žarnos skystyje buvo žymiai sumažėjusi (4E pav.).

Metrnl trūkumas žarnyno epitelio ląstelėse nekeičia mucino gamybos, tačiau mažina antimikrobinių peptidų kiekį

Viena iš pagrindinių epitelio ląstelių funkcijų yra gleivių sekrecija 14, 15, 16, 17 . Norėdami išsiaiškinti, ar Metrnl epitelio ląstelėse reguliuoja mucino ekspresiją, buvo periodiškai dažomas rūgštis-Schiff, kuris parodė, kad Metrnl / / - pelėse gleivių kiekis epitelio ląstelėse nepakito (5A pav.). Mucinas 2 yra ypač ryškus žarnyne ir jį išskiria epitelio ląstelės 18, 19, 20, 21 . Taigi, mes toliau nustatėme „mucin 2“ ekspresiją realaus laiko PGR, nustatę, kad jos ekspresija taip pat nepakito (5B pav.).

Image

Žarnyno epitelio Metrnl poveikis gleivių gamybai ir antimikrobinių genų raiškai. (A) Periodinis storosios žarnos dažymas rūgštimi-Schiff Metrnl - / - ir laukinio tipo pelėse. Pusiau kiekybinė analizė atlikta naudojant ImageJ programinę įrangą. n = 5. Juosta, 200 μm. (B) „Mucin 2“ ir antimikrobinių genų santykinė išraiška Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių dvitaškiuose. n = 6. Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. * P <0, 05.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Žarnyno epitelio ląstelės, ypač Paneth ląstelės, gamina daugybę antimikrobinių peptidų, kad užkirstų kelią mikroorganizmų perkėlimui ir modifikuotų mikrobų populiacijas gleivinės paviršiuje 22, 23 . Taigi mes toliau įvertinome antimikrobinių peptidų raišką žarnyne. Kaip parodyta 5B paveiksle, priešingai nei Villin ekspresijos pokyčiai Metrnl / / - pelėse, daugumos antimikrobinių peptidų, tokių kaip regeneruojantis iš salų gaunamas 3 gama (Reg3g) 24, 25, 26 ir laktotransferrinas 27, ekspresija buvo žymiai sumažėjo. Kiti, tokie kaip serumo amiloidas A-3 (SAA3) 28 ir regeneruojantis iš salų gautas 3 beta (Reg3b) 25, 29, parodė mažėjimo tendenciją. Tai rodo, kad Metrnl vaidina tam tikrą vaidmenį reguliuodamas antimikrobinių peptidų ekspresiją.

Diskusija

Šiame tyrime mes parodėme Metrnl raiškos modelį įvairiuose audiniuose, ypač žmogaus audiniuose. Mes nustatėme, kad Metrnl buvo gausiai ekspresuojamas tiek žmogaus, tiek pelės virškinimo trakte. Imunohistochemijos rezultatai taip pat parodė, kad Metrnl daugiausia buvo ekspresuojamas žarnyno epitelio ląstelėse. Norėdami ištirti jo funkciją žarnyno epitelio ląstelėse, sukūrėme žarnyno epitelio ląstelėms būdingas Metrnl nokauto peles. Nebuvo pastebėtas skirtumas tarp Metrnl - / - ir laukinio tipo pelių. Metrnl - / - pelių kūno svoris, suvartotas maistas, gliukozės kiekis kraujyje, žarnos ilgis, žarnos pralaidumas ir gleivių sekrecija nepakito. Metrnl serumo lygis parodė mažėjimo tendenciją, tačiau reikšmingo skirtumo tarp Metrnl - / - pelių ir laukinio tipo pelių nepastebėta. Tačiau iš tikrųjų mes pastebėjome reikšmingą Metrnl lygio sumažėjimą žarnyno skystyje ir pastebimą antimikrobinių peptidų sumažėjusį reguliavimą Metrnl - / - pelių žarnyno audinyje.

Matuojant „Metrnl“ audinių raiškos modelį, mes nustatėme, kad Metrnl yra labai didelis ekspresijos lygis tiek žmogaus, tiek pelės virškinimo trakte. Taikydami imunohistochemijos metodą, mes toliau nustatėme, kad Metrnl buvo ekspresuojamas tik žarnyno epitelio ląstelėse. Remiantis mūsų išvadomis, ankstesniame tyrime buvo pranešta, kad Metrnl buvo labai ekspresuojamas barjeriniuose audiniuose 3 . Remdamiesi tuo, mes taip pat nustatėme, kad Metrnl raiška buvo gausi plaučiuose ir odoje. Pabaigoje šis tyrimas kartu su ankstesnėmis mūsų ir kitų laboratorijų 1, 2, 3, 6 ataskaitomis rodo, kad Metrnl ekspresija yra didžiausia virškinimo trakte ir odoje, santykinai didelė baltajame riebaliniame audinyje ir plaučiuose ir daug mažesnė. raumenyse, blužnyje, kasoje ir smegenyse.

Žarnyno epitelio ląstelės yra vienareikšmiškai ties lummeninės kommensalinės mikrobiotos ir žarnos žarnos 30, 31 riba . Sekretorinės žarnos epitelio ląstelės gali sekretuoti mucinus ir antimikrobinius baltymus, kad sudarytų fizinį ir biocheminį barjerą tarp bakterijų ir epitelio paviršių 22, 30 . Norėdami ištirti Metrnl funkciją žarnyno epitelio ląstelėse, sukūrėme žarnyno epitelio ląstelėms būdingas Metrnl nokauto peles. Šių pelių kūno svoris, suvartojamo maisto kiekis ir gliukozės kiekis kraujyje nepakito, o tai rodo, kad Metrnl fiziologinėmis sąlygomis neturi reikšmingos įtakos maisto medžiagų absorbcijai žarnyne. Metrnl nokauto pelėms taip pat nepakito žarnos ilgis, pralaidumas ir histologija. Tai rodo, kad Metrnl neturi įtakos žarnyno vystymuisi ir struktūrai. Gleivių kiekis ir mucin 2 ekspresija epitelio ląstelėse ir gaubtinėje žarnoje taip pat buvo panašūs tarp Metrnl išmušimo ir laukinio tipo pelių. Taigi Metrnl neturi įtakos žarnyno gleivių sekrecijai. Tačiau mūsų tyrimas pastebėjo, kad Metrnl abliacija smarkiai sumažino kelių antimikrobinių peptidų, tokių kaip Reg3g ir laktotransferrin, ekspresiją, ir tai rodo, kad Metrnl gali reguliuoti antimikrobinių peptidų gamybą ir gali turėti įtakos šeimininkų ir mikroorganizmų sąveikai. Kadangi Metrnl yra sekretuojamas baltymas, neaišku, ar Metrnl tiesiogiai ar netiesiogiai keičia antimikrobinio peptido raišką. Taigi specifinį mechanizmą dar reikia toliau tyrinėti.

Atsižvelgiant į tai, kad Metrnl raiška buvo didžiausia žarnyno epitelyje tarp vertinamų audinių, pasidomėjome, ar tai yra pagrindinis Metrnl kraujo šaltinis sisteminėje kraujyje. Metrnl serumo lygis nebuvo statistiškai reikšmingai sumažėjęs Metrnl - / - pelėse, palyginti su laukinio tipo pelėmis, o tai nepatvirtina teiginio, kad iš žarnyno epitelio ląstelių išsiskiriantis Metrnl yra pagrindinis Metrnl kraujo šaltinis. Atitinkamai, Metrnl lygis žarnyno skystyje buvo žymiai sumažėjęs, tai rodo, kad žarnyno epitelio ląstelėse ekspresuotas Metrnl dažniausiai buvo eksportuojamas į žarnos skystį. Šie rezultatai atitinka Metrnl imunohistochemijos rezultatus žarnyne, parodantį, kad Metrnl, atrodo, egzistuoja daugiausia egzocitinėse pūslelėse (2E pav.).

Reikia toliau ištirti Metrnl funkciją žarnyno epitelio ląstelėse ar kitose gleivinių liaukose. Šiame tyrime mes parodėme, kad Metrnl reguliavo antimikrobinių peptidų raišką. Taip pat buvo pranešta, kad Metrnl yra padidėjęs uždegiminės ligos reguliavimas ir reguliuoja imuninių ląstelių agregaciją bei uždegiminio faktoriaus išsiskyrimą 3, 5 . Visi šie rezultatai kartu su vietinio žarnyno Metrnl lygio reguliavimu rodo, kad Metrnl gali dalyvauti gleivinės imuniteto homeostazėje ir vystytis uždegiminiam žarnyno susirgimui, kuriuos reikia ištirti toliau.

Pabaigoje parodome, kad Metrnl yra labai ekspresuojamas žmonių ir pelių žarnyno epitelio ląstelėse. Metrnl gali būti išskiriamas iš žarnyno epitelio ląstelių, o tai daugiausia prisideda prie vietinio Metrn1 lygio žarnyne ir turi mažiau įtakos sisteminiam Metrnl cirkuliacijos lygiui. Atrodo, kad „Metrnl“ neturi lemiamo vaidmens žarnyno vystymuisi, maistinių medžiagų įsisavinimui ar gleivių sekrecijai. Tačiau Metrnl gali reikšmingai reguliuoti antimikrobinių baltymų gamybą žarnyne.

Autoriaus indėlis

Chao-y MIAO sukūrė tyrimą ir peržiūrėjo rankraštį; Zhi-yong LI ir Mao-bing FAN parašė rankraštį; Eksperimentus atliko „Zhi-yong LI“, „Mao-bing FAN“, „Sai-long ZHANG“, „Yi QU“, „Si-li ZHENG“ ir „Jie SONG“.