Tarpląsteliniai signalizacijos mechanizmai, reguliuojantys žmogaus eozinofilų aktyvaciją nauju th2 citokinu il-33: poveikis alerginiam uždegimui | ląstelių ir molekulinė imunologija

Tarpląsteliniai signalizacijos mechanizmai, reguliuojantys žmogaus eozinofilų aktyvaciją nauju th2 citokinu il-33: poveikis alerginiam uždegimui | ląstelių ir molekulinė imunologija

Anonim

Anotacija

Įrodyta, kad naujasis interleukinų (IL) -1 šeimos citokinas IL-33 suaktyvina T helperio 2 (Th2) limfocitus, stiebo ląsteles ir bazofilus, kad susidarytų priešuždegiminiai citokinai, taip pat tarpininkautų kraujo eozinofilijai, IgE sekrecijai ir hipertrofijai. kvėpavimo takų epitelio pelėms. Šiame tyrime apibūdinome žmogaus eozinofilų aktyvaciją IL-33 ir ištyrėme pagrindinius tarpląstelinius signalizacijos mechanizmus. IL-33 žymiai pagerino eozinofilų išgyvenamumą ir padidino adhezijos molekulės tarpląstelinės adhezijos molekulės (ICAM) -1 išraišką ant eozinofilų ląstelių paviršiaus, tačiau tai slopino ICAM-3 ir L-selektino poveikį. Be to, IL-33 yra reikšmingas priešuždegiminio citokino IL-6 ir chemokinų CXCL8 bei CCL2 išsiskyrimas. Mes nustatėme, kad IL-33 sąlygotas išgyvenimo stiprinimas, adhezijos molekulių indukcija ir citokinų bei chemokinų išsiskyrimas buvo skirtingai reguliuojami aktyvinant branduolio faktorių (NF) -BB, p38 mitogeno suaktyvintą baltymo kinazę (MAPK) ir tarpląstelinį signalą. reguliuojamos kinazės (ERK) keliai. Be to, mes palyginome aukščiau pateiktą IL-33 aktyvumą su dviem struktūriškai ir funkciškai susijusiais citokinais, IL-1β ir IL-18. IL-1β, bet ne IL-18, žymiai padidino ICAM-1 ląstelių paviršiaus ekspresiją. IL-1β ir IL-18 taip pat reikšmingai pagerino eozinofilų išgyvenamumą ir paskatino IL-6 bei chemokinų CXCL8 ir CCL2 išsiskyrimą suaktyvindami NF-κB, p38 MAPK ir ERK kelius. Taip pat pastebėtas sinergetinis poveikis IL-6 išsiskyrimui, gydant kartu su IL-1β, IL-18 ir IL-33. Apibendrinant, mūsų išvados suteikia įžvalgos apie IL-33 tarpininkaujantį eozinofilų aktyvavimą per diferencines tarpląstelinių signalų kaskadas alerginio uždegimo imunopatogenezėje.

Įvadas

Interleukinas (IL) -33 buvo atrastas kaip vienuoliktasis IL-1 šeimos, kuriai taip pat priklauso IL-1β ir IL-18, narys. 1, 2 Tai yra naujas T helper 2 (Th2) priešuždegiminis citokinas, gausiai ekspresuojamas žmogaus lygiųjų raumenų ląstelėse ir bronchų epitelio ląstelėse. IL-33 paskyrimas pelėms ne tik skatina IgE ir Th2 citokinų IL-5 ir IL-13 gamybą, bet ir sukelia patologinius pokyčius, įskaitant kraujo ir bronchoalveolinio plovimo skysčio eozinofiliją, kvėpavimo takų hiperjautrumą ir epitelinių ląstelių hiperplaziją bei hipertrofija. 1, 3, 4

Pacientams, sergantiems japonine kedro pollinoze, nustatyta žymiai didesnė IL-33 koncentracija serume nei sveikiems kontroliniams asmenims. Be to, įrodyta, kad IL-33 skatina žmogaus stiebo ląstelių brendimą ir išgyvenimą bei skatina jų citokinų IL-5 ir IL-13 sekreciją, kurie skatina eozinofilų išgyvenimą ir efektorines funkcijas. 6, 7, kartu su pelių modelių rezultatais, 1, 3, 4, šie rezultatai rodo, kad IL-33 gali vaidinti pagrindinį vaidmenį sukeliant alerginį uždegimą, kurį sukelia eozinofilų aktyvacija.

Parodyta, kad IL-33 gali signalizuoti per savo receptorių ST2 ir suaktyvinti pasroviui teikiančias signalines molekules, įskaitant inhibitorius kappa B (IκB) -α ir mitogenų suaktyvintas baltymų kinazes (MAPK), ir panaikinti IL-33 sukeltus IL-5 ir IL- 13 gamyba iš CD4 + T limfocitų, galbūt blokuojant branduolio faktoriaus (NF) -κB ir MAPK kelius. 1, 2, 8 Be padidėjusio NF-κB aktyvumo astma sergančių pacientų periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse, 9 ankstesni mūsų tyrimai taip pat parodė, kad NF-κB signalo perdavimas, p38 MAPK ir tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) keliai vaidino pagrindinį vaidmenį reguliuojant IL-3, IL-5 ir granulocitų makrofagų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus sukeltą tarpląstelinio adhezijos molekulės (ICAM) -1 ekspresiją ir Th17 citokinų sukeltą citokinų gamybą iš žmogaus eozinofilų. 10, 11

Bandydami toliau tirti IL-33 sukeltą eozinofilų aktyvaciją, išsiaiškinome tarpląstelinius signalizacijos mechanizmus, reguliuojančius IL-33 suaktyvintų eozinofilų išgyvenamumą, adheziją ir citokinų bei chemokinų išsiskyrimą, ir palyginome dviejų kitų poveikį struktūriškai. ir funkciškai susijusių IL-1 šeimos citokinų, IL-1β ir IL-18.

medžiagos ir metodai

Reagentai

Rekombinantinis žmogaus IL-1β, IL-18 ir IL-33 buvo nupirktas iš „PeproTec Inc.“ (Rocky Hill, NJ, JAV), MBL (Naka-ku Nagoya, Japonija) ir „R&D Systems Inc.“ (Mineapolis, MN, JAV)., atitinkamai. IκB-α fosforilinimo inhibitorius BAY11-7082, ERK inhibitorius U0126, c-Jun N-galo kinazės (JNK) inhibitorius SP600125, p38 MAPK inhibitorius SB203580, fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) inhibitorius LY294002 ir Janus kinazės (JAK) inhibitorius. iš „Calbiochem Corp.“ (San Diegas, CA, JAV). SB203580 buvo ištirpintas vandenyje, tuo tarpu U0126, LY294002, SP600125, AG490 ir BAY11-7082 buvo ištirpinti dimetilsulfokside (DMSO). Visų tyrimų metu DMSO koncentracija buvo 0, 1% (tūrio / tūrio).

Tirpalai, kuriuose nėra endotoksinų

Ląstelių kultūros terpė buvo nupirkta iš „Gibco Invitrogen Corp.“ (Carlsbad, CA, JAV), be aptinkamo lipopolisaharido (LPS, <0, 1 EU / ml). Visi kiti tirpalai buvo paruošti naudojant vandenį, kuriame nėra pirogenų, ir sterilius polipropileno plastikinius indus. Nei viename tirpale nebuvo aptinkamo LPS, nustatyto Limulus amebocitų lizės tyrimu (jautrumo riba 12 pg / ml; Biowhittaker Inc., Walkersville, MD, JAV).

Žmogaus kraujo eozinofilų išskyrimas iš bufido apvalkalo ir eozinofilų kultūros

Šviežias žmogaus bufetas, gautas iš sveikų Honkongo Raudonojo kryžiaus kraujo perpylimo tarnybos savanorių, buvo praskiestas santykiu 1: 2 su fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) 4 ° C temperatūroje ir centrifuguotas naudojant izotoninį „Percoll“ tirpalą (tankis 1, 082 g / ml; Amersham). „Pharmacia Biotech“, Upsala, Švedija) 30 minučių po 1000 g . Granulocitų, kuriuose gausu eozinofilų, frakcija buvo surinkta ir du kartus plaunama šaltu PBS, turinčiu 2% galvijų vaisiaus serumo (FBS) (Gibco Invitrogen Corp.). Tada ląstelės buvo inkubuotos su anti-CD16 magnetiniais rutuliukais (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Vokietija) 4 ° C temperatūroje 45 minutes, o CD16 teigiamos ląstelės buvo išeikvotos praleidžiant per LS + kolonėlę (Miltenyi Biotec) magnetiniame lauke. Naudojant šį preparatą, pratekančioje frakcijoje buvo ne mažiau kaip 99% grynumo eozinofilų, įvertintų Hemacolor greito kraujo tepinėlio dėme (E Merck Diagnostica, Darmštatas, Vokietija). Išskirti eozinofilai buvo auginami RPMI 1640 terpėje (Gibco Invitrogen Corp.), papildyta 10% FBS ir 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansulfonrūgšties (Gibco Invitrogen Corp.).

Apoptozės ir gyvybingumo tyrimas

Eozinofilų apoptozė ir gyvybingumas buvo įvertinti atliekant TACS aneksino V fluoresceino izotiocianatą (FITC) (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, JAV), naudojant eozinofilų srauto citometriją (FACSCalibur, BD Biosciences Corp., San Jose, CA, USA). atsižvelgiant į jų priekinį ir šoninį šviesos sklaidą, su ląstelių šiukšlėmis, kurios nebuvo įtrauktos į analizę. Gyvybingų ląstelių populiacijai buvo būdingas mažas aneksino V-FITC ir propidium jodido (PI) fluorescencijos intensyvumas (MFI).

IL-6, CXCL8 ir CCL2 kiekybinė analizė

Proinflammatorinio citokino IL-6 ir chemokinų CXCL8 bei CCL2 koncentracijos kultūros supernatantuose buvo tiriamos naudojant fermentais susietą imunosorbentų tyrimo (ELISA) rinkinius iš BD Pharmingen (San Diegas, CA, JAV).

Western blot analizė

Eozinofilai buvo plaunami lediniu PBS ir lizuojami 0, 2 ml lizės buferiu (20 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 120 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10 mM EDTA, 1 mM etilenglikolio tetraaceto rūgšties, 0, 05% 2). -merkaptoetanolis, 1X proteazės inhibitoriai). Ląstelių liekanos buvo pašalintos centrifuguojant 14 000 g 15 min., Ir supernatantas virintas Laemmli mėginio buferiu (Bio-Rad laboratorija, Hercules, CA, JAV) 5 min. Vienodais kiekiais baltymų buvo atlikta SDS – poliakrilamido gelio elektroforezė, prieš atlikdama blotinimą ant polivinilideno difluorido membranos („GE Healthcare“, Piscataway, NJ, JAV). Membrana uždengta 5% nugriebto pieno tirpalu su trimis buferiais su 0, 05% Tween 20, pH 7, 6, 1 valandą kambario temperatūroje ir tiriama naudojant triušio pirminius antihumaninius glicerraldehido-3-fosfato dehidrogenazę arba pelių antihumaninius ST2 antikūnus (R&D Systems) 4 ° kampu. C per naktį. Po plovimo membrana 1 valandą kambario temperatūroje buvo inkubuojama su antriniais ožkų antirazito arba avių antimouse antikūnais, sujungtais su krienų peroksidaze (GE Healthcare). Tada buvo aptikti antikūnų ir antigenų kompleksai, naudojant patobulintą chemiliuminescencijos aptikimo sistemą (GE Healthcare).

Imunofluorescencinis dažymas ir srauto citometrija

Norėdami nustatyti adhezijos molekulių ekspresiją ląstelės paviršiuje, ląstelės buvo išplautos ir pakartotinai suspenduotos šaltu PBS po ankstesnio apdorojimo. Po blokavimo 20% 4% C serume su 2% žmogaus serumu ir plaunant šaltu PBS, ląstelės buvo inkubuotos su FITC konjuguotais pelių antihumano ICAM-1, pelių antihumaniškais ICAM-3, pelių antihumaniškais L-selektyvino antikūnais ar pelių IgG1κ. izotipas (R&D Systems) 30 min 4 ° C temperatūroje tamsoje. Po plovimo ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos 1% paraformaldehide kaip fiksatorius ir tiriamos.

Norint nustatyti fosforilintų signalinių molekulių tarpląstelinę išraišką, ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu 10 minučių 37 ° C temperatūroje po ankstesnio apdorojimo. Po centrifugavimo ląstelės permeabiluojamos 30 minučių lediniame šaltame metanolyje ir po to dažomos FITC konjuguotais pelių antihumaniniais fosforilintais ERK1 / 2, fosforilintais p38 MAPK, fosforilintais IκB-α arba pelių IgG1 antikūnais (BD Pharmingen) 30 minučių 4 ° C temperatūroje. ° C tamsoje. Tada ląstelės buvo plaunamos, suspenduojamos ir analizuojamos. 10 000 gyvybingų ląstelių paviršiaus adhezijos molekulių ir tarpląstelinių fosforilintų signalinių molekulių ekspresija buvo analizuojama srauto citometrija (FACSCalibur, BD Biosciences) kaip MFI, į kurią įeina tiek tikslinės molekulės išraiškos pokyčiai atskirose ląstelėse, tiek ląstelių, išreiškiančių tikslines molekules, procentas. .

Statistinė analizė

Visi duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. Skirtumai tarp grupių buvo įvertinti naudojant vienpusį ANOVA. Manoma, kad tikimybė ( P ) <0, 05 buvo žymiai skirtinga. Kai ANOVA nurodė reikšmingą skirtumą, skirtumui tarp grupių įvertinti buvo naudojamas Bonferroni post hoc testas. Visos analizės buvo atliktos naudojant „Socialinių mokslų“ statistinės programinės įrangos „Windows“ 16.0 versijos statistinį paketą (SPSS Inc., Čikaga, IL, JAV).

Rezultatai

IL-33 receptorių baltymų ekspresija

Mes ištyrėme IL-33 receptoriaus ST2 baltymo ekspresiją žmogaus eozinofiluose, taip pat keliuose kituose kontrolinių ląstelių tipuose: žmogaus neutrofiluose, žmogaus stiebo ląstelių linijoje (HMC) -1, žmogaus keratinocitų ląstelių linijoje HaCaT ir žmogaus T limfocituose. . Kaip parodyta 1 paveiksle, ST2 buvo konstituciškai ekspresuojamas žmogaus eozinofilų ir T limfocitų baltymų lygyje.

Image

Reprezentatyvus IL-33 receptoriaus ST2 baltymo ekspresijos Western blot tyrimas žmogaus eozinofiluose, neutrofiluose, HaCaT ląstelėse, HMC-1 ląstelėse ir T limfocituose. Visi baltymai buvo išgauti iš eozinofilų, neutrofilų, HaCaT ląstelių, HMC-1 ląstelių ir T limfocitų (1 × 107 ląstelių). Vienodi baltymų kiekiai (15 μg) buvo analizuojami atliekant Western blot analizę. Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais iš esmės identiškais rezultatais ir parodytas tipinis blotas. HMC, žmogaus stiebo ląstelių linija; IL, interleukinas.

Visas dydis

IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis žmogaus eozinofilų išgyvenimui

Po 48 valandų inkubacijos su IL-1β, IL-18 arba IL-33 (10–100 ng / ml), gyvybingų eozinofilų procentas smarkiai padidėjo nuo 53 iki 89% (2a paveikslas), 46–86% (2b paveikslas). ) ir atitinkamai nuo 49 iki 82% (2c paveikslas) (visi P <0, 05). Tarp šių citokinų IL-18 pagerino eozinofilų išgyvenamumą priklausomai nuo dozės.

Image

IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis žmogaus eozinofilų gyvybingumui. Eozinofilai (5 x 105 vienoje duobutėje) 48 valandas buvo auginami su ( a ) IL-1β, b ) IL-18 arba ( c ) IL-33 (10–100 ng / ml) arba be jo. lėkštė. Eozinofilų gyvybingumo procentas buvo įvertintas atliekant TACS Annexin V-FITC analizę, naudojant srauto citometriją. * P <0, 05, ** P <0, 01, palyginti su terpės kontrole. FITC, fluoresceino izotiocianatas; IL, interleukinas.

Visas dydis

IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis adhezijos molekulių raiškai žmogaus eozinofilų paviršiuje

Kaip parodyta 3 paveiksle, IL-33 žymiai padidino ICAM-1 ekspresiją žmogaus eozinofiluose priklausomai nuo dozės, tačiau tai reikšmingai slopino ICAM-3 ir L-selektyino ekspresiją (visi P <0, 05). IL-1β stimuliavo reikšmingą ICAM-1 ekspresijos padidėjimą eozinofiluose, bet ne ICAM-3 ar L-selektino; IL-18 nepadarė reikšmingų ICAM-1, ICAM-3 ar L-selektino ekspresijos moduliacijų eozinofiluose.

Image

IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis ICAM-1, ICAM-3 ir L-selektino paviršiaus ekspresijai žmogaus eozinofiluose. Eozinofilai (5x105 ląstelių) buvo kultivuojami su IL-1β, IL-18 arba IL-33 (10–100 ng / ml) arba be jų 16 valandų. ( A ) ICAM-1, b ) ICAM-3 ir ( c ) L-selektino paviršiaus išraiška 10 000 ląstelių buvo ištirta srauto citometrija kaip PFI, kuri buvo normalizuota atimant tinkamą izotipinį kontrolę ir parodyta kaip aritmetinė. trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, palyginti su terpės kontrole. ICAM, tarpląstelinės adhezijos molekulė; IL, interleukinas; PFI, vidutinis fluorescencijos intensyvumas.

Visas dydis

IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis žmogaus eozinofilų chemokino ir citokinų atpalaidavimui

Citozinų ekspresijos profilis eozinofilų supernatantuose, kai jie buvo aktyvuoti IL-1β, IL-18 ir IL-33, pirmiausia buvo įvertinti pusiau kokybiškai, naudojant antikūnų pagrindu pagamintą RayBio žmogaus citokinų masyvą V (RayBiotech Inc., Norcross, GA, JAV). IL-1β, IL-18 ir IL-33 (50 ng / ml) suaktyvino eozinofilus (1, 5x106 ląstelių), kad akivaizdžiai sukeltų chemokinų CCL2 ir CXCL8 bei priešuždegiminio citokino IL-6 išsiskyrimą iš 79 skirtingų citokinų. kurie buvo sijojami po 48 h inkubacijos (duomenys nepateikti). Kaip parodyta 4 paveiksle, IL-1β, IL-18 ir IL-33 suaktyvino eozinofilus, kad išlaisvintų CCL2, CXCL8 ir IL-6 priklausomai nuo dozės, 48-ą valandą didesnį išsiskyrimą nei 24 val. Nors IL-1β, IL-18 ir IL-33 sąlygojo palyginamą CCL2 išsiskyrimo indukciją, IL-33 sukėlė stipriausią CXCL8 ir IL-6 atpalaidavimo stimuliaciją iš trijų IL-1 šeimos citokinų. Šiuos sukeltus citokinų ir chemokinų išsiskyrimus gali smarkiai slopinti transkripcinis inhibitorius aktinomicinas D ir transliacinis inhibitorius cikloheksimidas (duomenys nepateikti), kas rodo, kad IL-1β, IL-18 ir IL-33 skatina naujai susintetintų CCL2, CXCL8 ir IL-6, o ne iš anksto paruošti chemokinai ir eozinofilų citokinai.

Image

IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis CCL2, CXCL8 ir IL-6 išsiskyrimui iš žmogaus eozinofilų. Eozinofilai (1 x 106 ląstelių) buvo kultivuojami su IL-1β, IL-18 arba IL-33 (50 ng / ml) arba be jų 12 ir 24 valandas. Kultūros supernatantas be ląstelių buvo surinktas ir ( a ) CCL2, b ) CXCL8 ir c ) IL-6, išleistas į supernatantą, buvo kiekybiškai įvertinti naudojant ELISA. Rezultatai išreiškiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų aritmetinis vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, palyginti su terpės kontrole. ELISA, su fermentais susijęs imunosorbentų tyrimas; IL, interleukinas.

Visas dydis

Sinergetinis IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis IL-6 išsiskyrimui iš žmogaus eozinofilų

5 paveiksle pavaizduota, kad kombinuotas gydymas IL-1β (10 ng / ml) ir IL-33 (10 ng / ml) sąlygojo reikšmingą sinergetiškai padidėjusį priešuždegiminį citokinų IL-6 išsiskyrimą, tuo tarpu, kai kombinuotas gydymas IL-1β (10 ng / ml) ir IL-18 (10 ng / ml) arba IL-18 (10 ng / ml) ir IL-33 (10 ng / ml). Sinergetinis poveikis IL-6 išsiskyrimui galėtų būti dar labiau sustiprintas, kai IL-33 koncentracija padidėtų dvigubai (20 ng / ml) kartu su fiksuota IL-1β koncentracija (10 ng / ml). Be to, dėl sinergetinio IL-6 pagaminimo iš žmogaus eozinofilų padidėjo gydymas kartu su IL-1β (10 ng / ml) ir IL-18 (20 ng / ml), taip pat su IL-18 (10 ng / ml). ) ir IL-33 (20 ng / ml).

Image

Sinergetinis IL-1β, IL-18 ir IL-33 poveikis IL-6 išsiskyrimui iš žmogaus eozinofilų. Eozinofilai (1 × 106 ląstelių) 24 valandas buvo auginami skirtingose ​​IL-1β, IL-18 ir IL-33 koncentracijose. Kultūros supernatantas be ląstelių buvo surinktas ir IL-6, patekęs į supernatantą, buvo kiekybiškai įvertintas naudojant ELISA. Rezultatai išreiškiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų aritmetinis vidurkis ± SEM. ** P <0, 01, palyginti su terpės kontrole. # P <0, 05, # # P <0, 01, palyginti su IL-6 susidarymo suma gydant atskirais citokinais (IL-33, IL-1β ar IL-18). Ctrl, vidutinė kontrolė; IL, interleukinas; 1β (10), IL-1β (10 ng / ml); 1β (20), IL-1β (20 ng / ml); 18 (10), IL-18 (10 ng / ml); 18 (20), IL-18 (20 ng / ml); 33 (10), IL-33 (10 ng / ml); 33 (20), IL-33 (20 ng / ml).

Visas dydis

Intraceliulinis fosfo-ERK, fosfo-p38 MAPK ir fosfo-IκB-α dažymas žmogaus eozinofiluose

Kaip parodyta 6 paveiksle, stimuliavus IL-1β, IL-18 ar IL-33 15 minučių ERK, p38 MAPK ir IκB-α buvo greitai suaktyvinti eozinofiluose. ERK, p38 MAPK ir IκB-α fosforilinimas eozinofiluose buvo skirtingai indukuojamas stimuliuojant IL-1β, IL-18 ir IL-33.

Image

ERK, p38 MAPK, NF-κB aktyvavimas žmogaus eozinofiluose, stimuliuojant IL-1β, IL-18 ir IL-33. Eozinofilai (5x105 ląstelių) buvo kultivuojami su IL-1β, IL-18 arba IL-33 (50 ng / ml) arba be jų 15 min. Fiksavus ir permeabilizavus, ląstelėse fosforilinto ( a ) ERK, b ) p38 MAPK ir ( c ) IκB-α kiekis 10 000 permeabilizuotų eozinofilų buvo išmatuotas tarpląsteliniu dažymu ir srauto citometrija. Rezultatai buvo normalizuojami atimant atitinkamą izotipinę kontrolę ir parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų aritmetinis vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, palyginti su terpės kontrole. Ctrl, vidutinė kontrolė; ERK, tarpląstelinio signalo reguliuojama kinazė; IL, interleukinas; MAPK, mitogenu aktyvuota baltymo kinazė; NF, branduolinis faktorius.

Visas dydis

Įvairių inhibitorių poveikis žmogaus eozinofilų IL-1β, IL-18 ir IL-33 sukeltų išgyvenamumo padidėjimui

7 paveiksle parodyta, kad išankstinis gydymas IκB kinazės inhibitoriumi BAY11-7082, ERK inhibitoriumi U0126 arba p38 MAPK inhibitoriumi SB203580 30 minučių reikšmingai panaikino tiek IL-1β, tiek IL-18 sukeltą žmogaus eozinofilų išgyvenimo pagerėjimą, o prieš - 30 minučių trukęs gydymas BAY11-7082 ir U0126 taip pat pastebimai panaikino IL-33 sukeltą žmogaus eozinofilų išgyvenamumo padidėjimą (visų P <0, 05). Nebuvo rastas reikšmingas ląstelių gyvybingumo skirtumas tarp terpės kontrolinės (Ctrl) grupės ir grupių, gydomų skirtingais signalizacijos inhibitoriais, būtent, AG490 (3 μM), BAY11-7082 (1 μM), LY294002 (5 μM), U0126 (10). μM), SB203580 (7, 5 μM) ir SP600125 (3 μM).

Image

Įvairių inhibitorių poveikis žmogaus eozinofilų IL-1β, IL-18 ir IL-33 sukeltų išgyvenamumo didinimui. Eozinofilai (5 × 105 ląstelės) buvo iš anksto apdoroti inhibitoriais 30 min., Po to inkubuojami su ( a ) IL-1β, b ) IL-18 ir ( c ) IL-33 (50 ng / ml) inhibitorių buvimas dar 48 valandas. Eozinofilų procentinis gyvybingumas buvo įvertintas atliekant TACS Annexin V-FITC analizę, naudojant srauto citometriją. Jie išreiškiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų aritmetinis vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, palyginus tarp grupių, žymimų horizontaliomis linijomis. AG, AG490; BAY, BAY11-7082; Ctrl, vidutinė kontrolė; FITC, fluoresceino izotiocianatas; IL, interleukinas; LY, LY294002; U, U0126; SB, SB203580; SP, SP600125.

Visas dydis

Įvairių inhibitorių poveikis adhezijos molekulių IL-1β ir IL-33 sąlygotai paviršiaus išraiškai žmogaus eozinofilams

Kaip parodyta 8 paveiksle, išankstinis gydymas IκB kinazės inhibitoriumi BAY11-7082, ERK inhibitoriumi U0126 ir p38 MAPK inhibitoriumi SB203580 30 minučių reikšmingai panaikino IL-1β ir IL-33 sukeltą ICAM-1 raišką žmogaus eozinofilams. (visi P <0, 05). Išankstinis gydymas U0126 ir SB203580 30 min. Buvo nustatytas ryškus IL-33 sukeltos ICAM-3 ekspresijos slopinimas. Tai reikšmingai slopino L-selektoino ekspresiją žmogaus eozinofiluose po išankstinio gydymo BAY11-7082. U0126 ir SB203580 30 min. (Visi P <0, 05).

Image

Įvairių inhibitorių poveikis IL-1β ir IL-33 sukeltų adhezinių molekulių ekspresijai žmogaus eozinofiluose. Eozinofilai (5x105 ląstelių) buvo iš anksto apdoroti inhibitoriais 30 min., Po to inkubuojama dar su IL-1β arba IL-33 (50 ng / ml) arba be jo (50 ng / ml), esant inhibitoriams, dar 16 h. ( a, b ) ICAM-1, c ) ICAM-3, ( d ) L-selektino ekspresija 10 000 ląstelių buvo analizuojama srauto citometrija kaip PFI, kuri buvo normalizuota atimant tinkamą izotipinį kontrolę ir parodyta kaip aritmetinis vidurkis ± SEM iš trijų nepriklausomų eksperimentų. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 palyginus tarp grupių, pažymėtų horizontaliomis linijomis. AG, AG490; BAY, BAY11-7082; Ctrl, vidutinė kontrolė; LY, LY294002; U, U0126; SB, SB203580; SP, SP600125.

Visas dydis

Įvairių inhibitorių poveikis žmogaus eozinofilų IL-33, IL-1β ir IL-18 sukeltiems CCL2, CXCL8 ir IL-6 išsiskyrimams

9a paveiksle parodyta, kad išankstinis gydymas IκB kinazės inhibitoriumi BAY11-7082, ERK inhibitoriumi U0126 ir p38 MAPK inhibitoriumi SB203580 30 minučių reikšmingai panaikino IL-1β sukeltą CCL2 išsiskyrimą, o išankstinis apdorojimas BAY11-7082, PI3K. inhibitoriai LY294002 ir U0126 30 min. stipriai slopino IL-18 sukeltą CCL2 išsiskyrimą. Preliminarus gydymas BAY11-7082 ir U0126 30 minučių reikšmingai slopino IL-33 sukeltą CCL2 išsiskyrimą iš žmogaus eozinofilų (visi P <0, 05). Kaip parodyta 9b paveiksle, išankstinis gydymas BAY11-7082, U0126 ir SB203580 30 minučių reikšmingai panaikino IL-18 ir IL-33 sukeltą CXCL8 išsiskyrimą, tuo tarpu išankstinis apdorojimas U0126 30 minučių taip pat pastebimai slopino IL-1β. sukeltas CXCL8 išsiskyrimas iš žmogaus eozinofilų (visi P <0, 05). Be to, 9c paveiksle parodyta, kad išankstinis gydymas BAY11-7082, U0126 ir SB203580 30 minučių reikšmingai panaikino IL-1β-, IL-18 ir IL-33 sukeltą IL-6 išsiskyrimą iš žmogaus eozinofilų (visi P <0, 05). .

Image

Įvairių inhibitorių poveikis žmogaus eozinofilų IL-1β, IL-18 ir IL-33 sukeltiems CCL2, CXCL8 ir IL-6 išsiskyrimams. Eozinofilai (5 × 105 ląstelių) 45 minutes buvo apdoroti inhibitoriais, po to inkubuojami su ( a ) IL-1β, b ) IL-18 ir ( c ) IL-33 (50 ng / ml) arba be inhibitorių buvimas dar 24 valandas. Kultūros supernatantas be ląstelių buvo surinktas, o CCL2, CXCL8 ir IL-6, patekę į supernatantą, buvo įvertinti naudojant ELISA. Rezultatai išreiškiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų aritmetinis vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 palyginus tarp grupių, pažymėtų horizontaliomis linijomis. AG, AG490; BAY, BAY11-7082; Ctrl, vidutinė kontrolė; ELISA, su fermentais susijęs imunosorbentų tyrimas, LY, LY294002; U, U0126; SB, SB203580; SP, SP600125.

Visas dydis

Diskusija

IL-33 pasiūlytas kaip naujas imuninės sistemos reguliatorius, kuris inicijuoja įvairių tipų leukocitų, įskaitant žmogaus Th2 limfocitus, 12, 13 stiebo ląsteles, 6 bazofilus, 8, 13, 14 natūralių žudikų ląsteles, brendimą, migraciją ir aktyvaciją. 13 ir eozinofilai. 8, 15, 16. Be to, IL-1β buvo identifikuotas kaip stiprus tarpininkas, kuris inicijuoja Th17 limfocitų diferenciaciją, kad sukeltų autoimuninius atsakus, 17, o IL-18 buvo plačiai žinomas kaip induktorius, stimuliuojantis IFN-γ gamybą iš T limfocitų ir natūralių. žudiko ląstelės, skatinančios Th1 atsakus. 18 Įdomu, kad buvo pranešta, kad tiek IL-1β, tiek IL-18 taip pat gali suaktyvinti žmogaus eozinofilus. 19, 20 Iš tiesų, iki šiol nelabai suprantama, kaip IL-33 ir kiti du IL-1 šeimos citokinai IL-1β ir IL-18 suorganizuoja ir skatina alerginį uždegiminį atsaką. Atkreipdami dėmesį į tai, kad IL-1β, IL-18 ir IL-33 turi vienodą baltymų sekos homologiją, 1 yra receptorių vienetas ir Toll-like / IL-1 receptorių struktūra ląstelių receptorių srityje, 21 mes ištyrėme tarpląstelinius signalizacijos kelius. suaktyvinant žmogaus eozinofilų biologines funkcijas IL-1β, IL-18 ir IL-33, atkreipiant ypatingą dėmesį į adhezijos molekulės ekspresijos moduliavimą, išgyvenimo gerinimą ir citokinų bei chemokinų atpalaidavimo stimuliavimą.

Pirmiausia eozinofilų aktyvinimą galima būtų sureguliuoti ligandą / receptorius jungiančiame lygyje. Mes nustatėme, kad žmogaus eozinofilai konstituciškai ekspresuoja IL-33 receptorių ST2, kaip ir ankstesniuose tyrimuose. Kaip parodyta, kad tirpus ST2 susilpnina eozinofilų infiltraciją ir Th2 citokinų gamybą astmos pelių modelyje, 22, 23, reikšmingas tirpiojo ST2 išsiskyrimo padidėjimas virusinėje infekcijoje 24 ir astmatinis paūmėjimas 25 gali padėti sustiprinti neigiamą reguliuojamąjį poveikį. tirpus ST2 tokiomis ligomis. Panaudojant antagonistinį anti-ST2 ir rekombinantinių ST2 baltymų poveikį klinikiniams tikslams, gali būti lengviau kurti naujas alerginių ligų terapijos strategijas.

Uždelstas eozinofilų apoptozė yra pagrindinis eozinofilijos mechanizmas, sukeliantis alergines uždegimines reakcijas. 26, 27 rezultatai parodė, kad IL-33, taip pat IL-1β ir IL-18, galėjo žymiai pagerinti eozinofilų išgyvenamumą (2 pav.), Darydami išvadą, kad šios molekulės gali skatinti eozinofiliją alerginio uždegimo vietoje. Atkreipdami dėmesį į tai, kad padidėjusi ICAM-1 ekspresija buvo rasta bronchinės astmos priepuoliuose 28 ir aptikę ICAM-1, 29, 30 fibronektino ir hialuronaną rišančių savybių, mūsų išvadoje, kad IL-33 ir IL-1β sukeltas padidėjęs ląstelių paviršiaus ICAM-1 ekspresija ant žmogaus eozinofilų (3 pav.) gali suteikti papildomą biocheminį pagrindą padidėjusiam IL-33 ir IL-1β eozinofilų adhezijai tarpląstelinių matricos komponentų atžvilgiu uždegiminiuose audiniuose, pavyzdžiui, bronchų epitelyje. Be to, nustatyta, kad ICAM-1 / CD18 sąveika inicijuoja tvirtą eozinofilų adheziją prie bronchų epitelio ląstelių. Nepaisant didelės ICAM-3 ekspresijos ramybės stadijos žmogaus eozinofiluose, buvo pasiūlytas priešuždegiminis ICAM-3 vaidmuo skatinant eozinofilų apoptozę. 32 Perėjimas prie sustiprinto ICAM-1 ir sumažintos ICAM-3 ekspresijos aktyvuotuose eozinofiluose, stimuliuojant IL-33, gali paskatinti priešuždegiminių reakcijų pradžią. L-selektinas inicijuoja eozinofilų pririšimą ir sukimąsi ant endotelio ląstelių prieš tvirtą jų sukibimą ir transendotelio migraciją. 33 Mūsų rezultatai sutampa su ankstesniais įrodymais, atskleidžiančiais aktyvuotų eozinofilų L-selekto paviršiaus ekspresijos sumažėjusį poveikį alergenui astmos sąlygomis. Buvo iškelta hipotezė, kad stiprus IL-33 poveikis moduliuojant ICAM-1, ICAM-3 ir L-selektino ekspresiją eozinofiluose gali padėti skatinti jų sukibimą ir transmigraciją į uždegiminius audinius.

Klinikinių tyrimų metu buvo pranešta apie nestiprų proinflammatinio citokinų ir chemokino sekrecijos padidėjimą alergiškiems astma sergantiems pacientams. 35, 36 Mes nustatėme, kad pacientams, sergantiems alerginiu rinitu, vidutinė IL-33 koncentracija plazmoje buvo didesnė nei normalioms kontrolinėms grupėms (33, 6, palyginti su 9, 8 pg / ml). Buvo pranešta, kad alergiškiems astma sergantiems pacientams nustatyta padidėjusi CCL2 koncentracija bronchoalveoliniame plovimo skystyje. 37 Be to, CCL2 gali inicijuoti leukocitų infiltraciją ir uždegiminius atsakus, sukeldamas monocitų, T limfocitų, natūralių žudikių, eozinofilų ir bazofilų chemotaksizaciją, degranuliuodamas ir histamino išlaisvinimą iš bazofilų ir putliųjų ląstelių. 38, 39, 40 Kartu su įrodymais, įrodančiais, kad IL-33 yra Th2 limfocitų chemoterapinis tirpalas, 12 reikšmingas CCL2 išsiskyrimas iš eozinofilų, aktyvavus IL-1β, IL-18 ir IL-33, gali palengvinti tiek eozinofilų, tiek kitų leukocitai, siekiant skatinti alerginio uždegimo vystymąsi. Ankstesnis tyrimas atskleidė, kad padidėjęs IL-6 ir CXCL8 išsiskyrimas kūno skysčiuose atsirado dėl alergenų poveikio atopiniais pacientais. Buvo parodyta, kad neutrofilų chemoattraktantas CXCL8 ne tik padidina paviršiaus adhezijos molekulių ekspresiją ant neutrofilų, kad palengvintų jų migraciją ir kaupimąsi uždegimo audinyje, bet ir skatina neutrofilus išskirti granuliuotus baltymus ir gaminti superoksidą. 42 Nors IL-33 negalėjo suaktyvinti neutrofilų, 15 mūsų rezultatai rodo, kad jis gali bendradarbiauti su IL-1β ir IL-18, kad įdarbintų neutrofilus į uždegiminius audinius.

IL-6 vaidmuo šeimininko gynyboje ir ūmaus uždegimo srityje buvo gerai apibrėžtas. Lipopolisacharidas taip pat suaktyvina dendritines ląsteles ir makrofagus, kad išlaisvintų IL-33, 1, o sustiprėjęs IL-6, kurį sukelia IL-33, taip pat IL-1β ir IL-18, gali sustiprinti uždegiminius atsakus, susijusius su mikrobų infekcija. paūmėjantis alerginis uždegimas. Be to, buvo pranešta, kad tiek IL-1β, tiek IL-6 skatina Th17 limfocitų diferenciaciją 17, kurie pasižymi skirtinga IL-17A ir IL-17F gamyba, galbūt skatindami leukocitų pritraukimą ir uždegiminius procesus alergijoje. Dėl sinergetinio IL-6 gamybos poveikio, kurį sąlygoja bendras IL-1β ir IL-18, IL-1β ir IL-33, taip pat IL-18 ir IL-33 poveikis, gali sustiprėti Th17 poliarizacija su paracrine kilpa. mechanizmą ir tokiu būdu iššaukia gilesnį alerginio uždegimo poveikį.

Eozinofilų aktyvacija pirmiausia pradedama receptorių ir tirpių ligandų sąveika su ląstelių paviršiumi, po to suaktyvinami įvairūs signalizacijos keliai, reguliuojantys proinflampcinių genų transkripciją. Visi IL-1β, IL-18 ir IL-33 receptoriai priklauso IL-1 receptorių / Toll tipo receptorių superšeimai ir dalijasi Toll-IL-1 receptorių vienetu jų tarpląsteliniame domene signalizacijai. Išaiškintas reikšmingas Toll-IL-1 receptorių srities vaidmuo uždegime ir šeimininko gynyboje. 47 Kadangi visi IL-1β, IL-18 ir IL-33 aktyvina eozinofilus ir indukuoja tą patį citokinų ir chemokinų rinkinį, mes postuluojame, kad šie IL-1 šeimos citokinai gali dalytis ir perduoti persidengiančius signalo perdavimo būdus. Mūsų tyrimas atskleidė NF-κB, ERK ir p38 MAPK kelių dalyvavimą reguliuojant IL-1 šeimos citokinų (IL-1β, IL-18 ir IL-33) sąlygotą eozinofilų išgyvenimą, paviršiaus adhezijos molekulių ekspresiją ir alerginį uždegimą. - susijęs citokinų ir chemokinų išsiskyrimas iš eozinofilų. Kadangi NF-κB reguliuoja uždegimą sukeliančių genų, koduojančių citokinus ir adhezijos molekules, transkripciją lėtiniam uždegimui inicijuoti, ankstesniuose tyrimuose buvo pasiūlytas kritinis NF-κB vaidmuo astmos patogenezėje. 48, 49 Be to, gausūs įrodymai atskleidė, kad ERK ir p38 MAPK kaskados galėjo reguliuoti įvairių uždegiminių ląstelių, įskaitant Th2 limfocitus, stiebo ląsteles ir eozinofilus, proliferaciją, diferenciaciją, citokinų gamybą, chemotaksį ir apoptozę. 49, 50 Todėl NF-κB, ERK ir p38 MAPK takų suaktyvinimas IL-1β, IL-18 ir IL-33 sukeltose eozinofilų aktyvacijose dar labiau patvirtina šių signalo perdavimo būdų svarbą alerginių ligų patogenezėje. uždegimas.

Apibendrinant tai yra išsami ataskaita apie eozinofilų aktyvavimą IL-1β, IL-18 ir IL-33. Ši aktyvacija vyksta NF-κB, ERK ir p38 MAPK keliais ir lemia išgyvenimo pagerėjimą, paviršiaus adhezijos molekulės ekspresijos moduliavimą ir citokinų bei chemokinų išsiskyrimą. Mūsų tyrimas taip pat parodė sinergetinį IL-1β ir IL-18, IL-1β ir IL-33, taip pat IL-18 ir IL-33 derinio poveikį IL-6 atpalaidavimo indukcijai. Kartu su ankstesnėmis ataskaitomis šio tyrimo reikšmė neišvengiamai slypi tuo, kaip IL-33 ir su juo susiję IL-1 šeimos citokinai IL-1β ir IL-18 gali būti įtraukti į alerginio uždegimo patogenezę, pavyzdžiui, paracrininį Th17 limfocitų aktyvavimą. . Tolesnis pagrindinių eozinofilų aktyvacijos mechanizmų tyrimas gali suteikti daugiau įžvalgų kuriant naujas terapines strategijas eozinofilų sukeliamoms alerginėms ligoms gydyti.