Žmogaus interleukino-8 geno haplotipų funkcinio vaidmens tyrimas naudojant crispr / cas9 tarpininkaujant genomo redagavimui | mokslinės ataskaitos

Žmogaus interleukino-8 geno haplotipų funkcinio vaidmens tyrimas naudojant crispr / cas9 tarpininkaujant genomo redagavimui | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Lėtinis uždegimas
  • Haplotipai

Anotacija

Interleukino-8 ( IL-8 ) geno polimorfizmas buvo laikomas jautrumu periodonto ligoms. Tačiau IL-8 geno haplotipų funkciniai vaidmenys nebuvo ištirti. Čia pirmą kartą pademonstruota CRISPR / Cas9 sistemos panaudojimas kuriant IL-8 geną, ir išbandėme skirtingų haplotipų funkcionalumą. Siekiant sėkmingai sugeneruoti HEK293T ląsteles, turinčias AT genotipą pirmajame SNP - rs4073 (slapyvardis -251), TT genotipas antrame SNP - rs2227307, buvo naudojami du sgRNR vektoriai, nukreipti į IL-8 geną, ir nuogas homologinis taisomasis DNR, turintis skirtingus haplotipus. slapyvardis +396), TC arba CC genotipai trečiajame SNP - rs2227306 (slapyvardis +781) IL-8 lokuse. Stimuliuojamos poli I: C, ATC / TTC haplotipu, ląstelės žymiai padidina IL-8 transkripcijos ir transliacijos lygiu. Norėdami patikrinti, ar ATC / TTC haplotipas yra funkcionuojantis, mes panaudojome trans-šulinio tyrimą pirminių neutrofilų, inkubuotų su supernatantais iš „Poly I: C“ stimuliavimo eksperimento, transmigracijai. ATC / TTC haplotipo ląstelės žymiai padidino neutrofilų transmigraciją, patvirtindamos šio IL-8 haplotipo funkcinį vaidmenį. Bendrai kalbant, mūsų duomenys rodo, kad ATC / TTC haplotipo pernešimas savaime gali padidinti neutrofilų antplūdį uždegiminiuose pažeidimuose ir paveikti ligos jautrumą.

Įvadas

Interleukinas-8 ( IL-8 ) yra priešuždegiminis chemokinas, kurį sukelia uždegiminės aplinkos 1 ląstelės, pvz., Epitelio ląstelės, fibroblastai, endotelio ląstelės, makrofagai, limfocitai ir putliosios ląstelės. IL-8 sekrecija skatina neutrofilų aktyvaciją ir migraciją iš periferinio kraujo į infekcijos vietas, pasireiškiančias patogenų pašalinimu. Kontroliuojama IL-8 indukcija yra labai svarbi palaikant homeostatinę pusiausvyrą. Pavyzdžiui, padidėjęs IL-8 indukcija gali sukelti paūmėjusį uždegimą lėtinėmis uždegiminėmis ligomis 2, 3 . Priešingai, IL-8 sekrecijos slopinimas gali uždelsti neutrofilų antplūdį, sukurdamas patogeno išgyvenimo pranašumą, sukeliantį lėtinę infekciją.

Padidėjusi IL-8 ekspresija priskirta daugeliui ligų, tokių kaip lėtinė obstrukcinė plaučių liga 4, 5, hipertenzija 6, kancerogenezė 7, 8, idiopatinė plaučių fibrozė 9, 10, 11 ir lėtinis periodontitas 12 . Ankstesni tyrimai tyrė pavienių nukleotidų polimorfizmų (SNP) ryšį su IL-8 geno ekspresijos lygiu. IL-8 geno SNP rs4073 (slapyvardis -251) buvo laikomas funkciniu, nes -251A alelis buvo susijęs su didesniu IL-8 susidarymo lygiu in vitro , po stimuliacijos lipopolisaharidu ir citokinais 13 . Tai sutinka su išvada, kad IL-8 geno -251 SNP AA genotipas buvo susijęs su didesne IL-8 mRNR išraiška 14 . Tačiau kitas tyrimas parodė, kad šio geno tipas šiame -251 SNP buvo susijęs su padidėjusiu IL-8 mRNR lygiu 15 .

Genetiniai polimorfizmai paplitę bet kurioje konkrečioje populiacijoje ir dažnai pranešama, kad jų sveikata ir liga skiriasi 16, 17 . Ryšys tarp SNP ir periodontito yra gerai užfiksuotas 17, 18, 19 . Visų pirma IL – 8 geno polimorfizmai –251 (T / A), +396 (T / G) ir +781 (C / T), formuojantys haplotipą ATC / TTC, yra susiję su periodonto liga ir šio haplotipo nešiotojais turėjo 2 kartus didesnį jautrumą ligoms nei kiti haplotipai, pvz., ATT / TTC, o tai nebuvo susiję su jautrumu periodonto ligai 20 . Daugybė ataskaitų ištyrė, ar šio geno polimorfizmai turi įtakos periodontopatogenų lygiui ir IL-8 gamybai, palygindami rezultatus tarp pacientų, turinčių skirtingus haplotipus 21, 22, 23. Nepaisant IL-8 svarbos jautrumui ligoms, biologinis aiškinimas apie specifinį IL-8 haplotipo vaidmenį reguliuojant genų ekspresiją ir apie tai, ar neutrofilų gebėjimas ir aktyvumas, modifikuoti gabenant IL-8 haplotipą, turi nebuvo kreiptasi anksčiau. Taigi, norėdami nustatyti skirtingų IL-8 haplotipų vaidmenį transkripciniame ir transliaciniame IL-8 geno aktyvume ir patikrinti, ar tai turi įtakos neutrofilų migracijai, ar ne, mes panaudojome grupuotes, reguliariai tarpais išdėstytus, trumpus palindrominius pakartojimus (CRISPR), RNR vadovaujamas Cas9 nukleazes. lengvai ir greitai redaguokite IL-8 geną, kuris leido mums ištirti IL-8 haplotipų funkcinius aspektus. CRISPR / Cas9 sistema neseniai buvo naudojama kuriant genomus 24, 25, 26 . Šis tyrimas yra nauja priemonė genomo redagavimui naudojant neapsaugotą dvigubą DNR kaip homologinį taisomąjį šabloną, kad būtų galima sužinoti apie genų funkcinį vaidmenį, ir šioje ataskaitoje pagrindinis dėmesys skiriamas funkciniam poveikiui, susijusiam su IL-8 haplotipais.

Rezultatai

CRISPR / Cas9 klonavimas ir patvirtinimas IL-8 genomo redagavimui

Norint patikrinti, ar CRISPR / Cas9 sistema, valdoma pagal RNR, gali būti pritaikyta dvigubam genų niksavimui, sgRNR1 ir sgRNR2 viengrandės sekos buvo klonuotos į pX330 vektorių, kaip aprašyta metodų skyriuje (1 pav.). Konstrukcijos buvo patikrintos DNR seka, naudojant U6 promotoriaus DNR sekos sudarymo pradmenis (5′-CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA-3 ′). DNR sekos nustatymas ir daugelio sričių suderinimas su sense ir antisense vienos grandinės oligos parodė U6 promotoriaus seką ir įterptą sgRNR1, taip pat sgRNR2 taikymo seką pX330 vektoriuje (2A pav., B).

Image

Išplėstinis vaizdas iliustruoja IL-8 nukleotidų seką, apimančią tam tikros kreipiamosios sekos įterpimo vietą su Bbsl vietomis, nurodytomis protopacerio „vadovo sekos“ (sgRNR) įdėjimui.

Visas dydis

Image

SgRNR1 (A) ir sgRNR2 (B) intarpų taikymo sekos patvirtinimas sekant U6 promotoriaus seka prieš pX330 vektorių. Įdėklai buvo patvirtinti seka tiek pirmyn, tiek atgal.

Visas dydis

HEK293T ląstelių linijų, turinčių IL-8 haplotipus, generavimas

HEK293T ląstelės buvo transfekuotos pX330-sgRNR1 ir 2 plazmidėmis, papildomai naudojant homologinius taisymo šablonus su skirtingais IL-8 haplotipais. Teigiami klonai buvo parinkti kaip aprašyta metodų skyriuje. Rezultatai parodė trijų sąlygų redaguotų ir neredaguotų ląstelių linijų generavimą (3 pav.): 1) AT genotipas pirmajame SNP - rs4073 (slapyvardis -251), TT genotipas antrame SNP - rs2227307 (slapyvardis +396)., TC genotipas trečiajame SNP - rs2227306 (slapyvardis +781); 2) AT genotipas pirmame SNP, TT genotipas antrame SNP, CC genotipas trečiame SNP; 3) AA genotipas 1231 nukleotido padėtyje, GG genotipas 1877 nukleotido padėtyje, TT genotipas 2262 nukleotido padėtyje. CRISPR / cas9 metodas leido mums sukurti ląstelių linijas, turinčias IL-8 haplotipus. Naujausi tyrimai rodo, kad Cas9 nukleazės poveikis gali būti netikslinis ir sukuria nepageidaujamas mutacijas. 27, 28, 29, 30, 31 . Taigi mes toliau tyrėme hagotipo sgRNR poveikį mūsų genomo redaguotose HEK293T ląstelėse, taikydami RNR-seq analizę. Mes tvirtiname, kad ATC / TTC ir ATT / TTC transkriptomos yra panašios į kontrolines imunologinių kelių atžvilgiu. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes sugeneravome RNR sekos duomenis, du replikacijos kiekvienos iš ATC / TTC, ATT / TTC ir kontrolės. Turint du kiekvienos būklės pakartojimus, tikslumo skirtumų analizė yra ribota; taigi mes atlikome informatyvią praturtinimo analizę tokiu būdu. Palyginome pakitusius duomenis, kai mes sujungėme vieną ATC / TTC haplotipą ir vieną kontrolę į vieną grupę, o kitą ATC / TTC haplotipą, o kitą kontrolę į antrą grupę. Tada palyginome šių pakitusių duomenų T-statistikos spektrą su visų galimų permutacijų vidurkiu su nepermutuotų duomenų spektru, kad gautume spėjamą 986 genų, praturtintų diferencijuotai išreikštų genų rinkinį klaidingo atradimo greičio (FDR) lygiu, rinkinį. iš 0, 5. Todėl tikimės, kad 50% sąraše esančių genų bus diferencijuoti. Kadangi tai bus atsitiktinis visų diferencijuotai išreikštų genų pavyzdys, jei kokie nors keliai yra praturtinti tarp diferencijuotai išreikštų genų, tada jie taip pat bus praturtinti numanomu rinkiniu ir tokiu būdu gaus reikšmingas p vertes sodrinimo analizėje. Jei imunologiniai genai buvo paveikti skirtingai tarp haplotipų ir kontrolės, tada šis praturtintas sąrašas turėtų parodyti reikšmingą imunologiniu keliu susijusių genų kelio praturtėjimą. Mes sudarėme sąrašą naudodami išradingumo kelio analizę (IPA), pateikdami devynis žymiai praturtintus būdus, iš kurių reikšmingiausias sodrinimo p vertė yra 6, 89E-05. Ženkliai praturtinti būdai yra šie: epitelinių adhezinių jungčių rekonstravimas, neatitikimų taisymas, ILK signalizacija, paveldimas krūties vėžio signalizavimas, epitelinių adrenerų jungčių signalizavimas, EIFT signalizacija, glikolizė I, poliamino reguliavimas gaubtinės žarnos vėžiu ir androgenų signalizavimas, nė vienas iš jų nėra susijęs su imunologiniu keliai. Panašiai ištyrėme ATT / TTC haplotipą, sukuriantį 217 genų sąrašą, esant 0, 5 FDR lygiui. Šiuo atveju žymiai praturtinti būdai buvo EIF2 signalizacija, poliamino reguliavimas gaubtinės žarnos vėžiu ir piruvatų fermentacija. Nebuvo jokių imunologinių būdų, praturtintų ATT / TTC haplotipu. Heirarchichalo klasterizavimas su Euklidijos atstumu tarp diferencijuotai išreikštų genų parodė artimus haplotipų panašumus (4 pav. A). Mes sukūrėme Venno diagramą, vaizduojančią genų, kurie ryškiai skiriasi nuo haplotipų ir kontrolinės, skaičių (4 pav. B).

Image

( A ) HEK293T ląstelės su ATT / TTC IL-8 hipotipu; ( B ) HEK293T ląstelės su ATC / TTC IL-8 hipotipu; ( C ) HEK293T ląstelės be IL-8 hipotipo (laukinio tipo). Genominio PGR (gPCR) produktai buvo amplifikuoti iš HEK293T ląstelių, perkeltų pX330-sgRNR plazmidėmis, be homologinių taisymo šablonų, turinčių skirtingus IL-8 haplotipus (rodyklės ir tamsus fonas chromatogramoje bei sekos, parodančios atitinkamai nukleotidus).

Visas dydis

Image

RNR-seq buvo atliekama dviem egzemplioriais (du nepriklausomi eksperimentai), siekiant nustatyti genomo redaguotų HEK293T ląstelių diferencialinę transkripto išraišką. ( A) rodo hierarchinį grupavimą pagal Euklidijos atstumą (Neapdorotas: tuščias vektorius, H1: 1 hipotipo tipas ir H2: hipotipo tipas 2 ). B) „ Venn“ schema, rodanti nuorašų, žymiai skirtingų H1 ir H2, palyginti su laukinio tipo ląstelėmis, skaičių.

Visas dydis

ATC / TTC haplotipas aukščiau reguliuoja IL-8 geną transkripcijos ir transliacijos lygiu

Norėdami nustatyti citokinų reguliavimą genų redaguotose ir laukinio tipo ląstelėse, stimuliavome TLR3 agonistu poli I: C, kad nustatytume, ar haplotipo nešiotis turi įtakos transkripcijos lygiui. Po 24 h stimuliavimo IL-8 pasiuntinio RNR (mRNR) lygiai buvo išmatuoti kiekybine realaus laiko PGR. Analizė atskleidė, kad „Poly I: C“ dirgiklis padidino IL-8 mRNR raišką, kaip ir tikėtasi be stimuliuotos neigiamos kontrolės (5A pav.). Įdomu tai, kad ląstelių, turinčių ATC / TTC haplotipą, indukuotos IL-8 mRNR lygis buvo žymiai didesnis, palyginti su IL-8 mRNR lygiais, kuriuos sukėlė ATT / TTC haplotipas, esant poli I: C dirgikliui (5A pav.).

Image

( A) IL-8 mRNR lygiai CRISPR / Cas9 redaguotose HEK293T ląstelėse. Kiekybinis realaus laiko PGR, parodantis IL-8 mRNR raišką redaguotose ir laukinio tipo HEK293T ląstelėse, užkrėstose Poly I: C 24 val. Nestimuliuojamos ląstelės tarnavo kaip neigiama kontrolė. Gydant poli I: C, ATC / TTC haplotipas žymiai padidino IL-8 mRNR lygį. Reikšmės žymi mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± SD (* p-vertė <0, 05). ( B) IL-8 baltymo ekspresija CRISPR / Cas9 redaguotose HEK293T ląstelėse. ELISA buvo atlikta iš redaguotų ir laukinio tipo ląstelių, stimuliuotų poli I: C, 24 valandas. Ne stimuliuojamos ląstelės tarnavo kaip neigiama kontrolė. Gydant poli I: C, ATC / TTC haplotipas žymiai padidino IL-8 baltymų lygį. Reikšmės žymi mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± SD (* p-vertė <0, 05).

Visas dydis

Padidėjęs mRNR kiekis ląstelėse paskatino mus ištirti IL-8 baltymo lygį supernatantuose. Genų redaguotos ir laukinio tipo ląstelės buvo stimuliuojamos „Poly I: C“ 24 val., Kaip aprašyta aukščiau. Išsiskyręs IL-8 buvo išmatuotas supernatantyje ELISA metodu. Kaip ir tikėtasi, poli I: C stimuliuoti mėginiai turėjo aukštesnį IL-8 lygį, palyginti su nemodifikuotais mėginiais (5B pav.). Panašiai kaip mRNR lygiuose, ATC / TTC haplotipo sukelti IL-8 baltymo lygiai buvo žymiai didesni, palyginti su IL-8 baltymo lygiais, kuriuos sukėlė ATT / TTC haplotipas po poli I: C stimuliacijos (5 pav. B).

ATC / TTC IL-8 haplotipas padidina PMN transmigraciją

Norėdami patikrinti skirtingų IL-8 geno haplotipų funkcionalumą, mes patikrinome redaguotas ir laukinio tipo ląsteles, kad nustatytume, ar pakito kurio nors iš haplotipų gebėjimas skatinti PMN transmigraciją. Kaip ir tikėtasi, nesugebėjimas stimuliuoti ląstelių supernatantą sugebėjo sukelti PMN transmigraciją buvo mažesnis nei poli I: C stimuliuotų ląstelių. Atsakas į neigiamą kontrolę (DMEM terpę) buvo minimalus, priešingai nei rekombinantinis žmogaus IL-8 , kuris naudojamas kaip teigiama kontrolė, buvo didžiausias, palyginti su kitomis sąlygomis. Taip pat pastebėta, kad ląstelės, turinčios ATC / TTC haplotipą, smarkiai padidino savo gebėjimą sukelti PMN transmigraciją, palyginti su ATT / TTC haplotipu su poli I: C stimuliacija (6 pav.). Šis migracijos padidėjimas gali priklausyti nuo koncentracijos, nes ATC / TTC ląstelių tipas sukėlė didesnę IL-8 indukciją.

Image

Genomo pakoreguotos ir laukinio tipo ląstelės buvo stimuliuotos poli I: C, o supernatantas buvo naudojamas transwell sistemoje, kad būtų galima stebėti, ar nepakito ląstelių gebėjimas skatinti PMN transmigraciją. Atlikus migracijos testą, vidutinis migruotų PMN ląstelių skaičius analizuojamas FACS (A) ir nubraižoma brūkšninėje diagramoje, kur rezultatai išreiškiami kaip vidurkiai ± SD, gauti iš 6 laukų / grupės, neigiamos ir teigiamos kontrolės (B) . Supernatantas iš ATT / TTC haplotipo pasisavino žymiai daugiau neutrofilų, palyginti su laukinio tipo. Statistiniai palyginimai atlikti iš trijų nepriklausomų eksperimentų (* p-reikšmė <0, 05).

Visas dydis

Diskusija

Interleukinas-8 ( IL-8 ) laikomas svarbiu chemokinu sergant periodonto ligomis. Šį citokiną gamina įvairios ląstelės ir jis gali veikti kartu su kitais citokinų šeimos nariais, norėdamas reguliuoti šeimininko įgimtas reakcijas 2, 32, 33, 34 . Tiksliau, šis citokinas pritraukia leukocitus iš periferijos į infekcijos vietas ir aktyvina juos, kad jie taptų fagocitais. Intra-oda IL-8 vartojimas in vivo sukelia vietinį eksudaciją ir ilgalaikį neutrofilų kaupimąsi 35 . Nors yra ir kitų chemokinų, susijusių su neutrofilų pritraukimu į infekcijos vietą, IL-8 receptorių išmuštos pelės parodė uždelstą neutrofilų antplūdį per inkstus ir šlapimo pūslę ir nesugebėjo pašalinti bakterijų iš audinių 36, 37 . Tai rodo, kad IL-8 yra būtinas neutrofilų migracijai ir funkcijai. Neutrofilų funkcija yra svarbi ne tik sergant ūmiomis infekcijomis, bet ir atliekanti didelę reikšmę esant lėtiniams uždegiminiams sutrikimams, tokiems kaip periodontitas, aterosklerozė, psoriazė, reumatoidinis artritas, uždegiminė žarnyno liga, diabetas ir vėžys. 38, 39 .

Naujausios metaanalizės parodė teigiamą IL-8 geno polimorfizmo -251 (T / A) ryšį su lėtiniu periodontitu 40, T / + 3954C> T polimorfizmais ir agresyviu periodontito jautrumu. Meta-analizės duomenys. „Med Sci Monit 21“, 1617–1624 (2015). "Href = / artikeliai / srep31180 # ref41 aria-label =" 41 nuoroda "data-track = click data-track-label = link> 41. Keletas atvejų kontrolės tyrimų turi ištyrė skirtingus IL-8 geno haplotipus, kurie, kaip nustatyta, buvo susiję su periodontitu 20, 42, 43, pavyzdžiui, ATC / TTC haplotipą, kurio šio konkretaus haplotipo nešiotojai turėjo dvigubai didesnį jautrumą ligoms 20. Nepaisant to, IL-8 baltymų lygis GCF pacientams nebuvo koreliuojamas su ATC / TTC haplotipo 22 gabenimu. Šis koreliacijos nebuvimas gali būti siejamas su ribotu imties dydžiu tame tyrime, be to, į tą tyrimą įtraukti asmenys, sergantys lėtiniu periodontitu. nepaveiktas sunkių ir generalizuotų ligos formų.

Kadangi trūksta funkcinių tyrimų, mes iškėlėme hipotezę, kad labiau kontroliuojamomis sąlygomis atliktas in vitro tyrimas galėtų aptikti galimą skirtingų haplotipų įtaką IL-8 mRNR ir baltymų lygiui. Šis tyrimas parodė, kad ATC / TTC haplotipo buvimas gali labiau sureguliuoti IL-8 tiek mRNR, tiek baltymų lygiu. Šie aukštesni IL-8 mRNR ir baltymų lygiai kartu su neutrofilų migracija galėtų paaiškinti mažesnį periodontopatogenų kiekį pacientams, turintiems ATC / TTC haplotipą 21, 44 . Be to, didelis IL-8 kiekis gali padidinti uždegiminį ir imuninį atsaką bei vėlesnį periodonto pažeidimą. Mes manome, kad šie atradimai galėtų paaiškinti, kodėl pacientai, kurie buvo laikomi genetiškai jautriais lėtiniam periodontitui ir kuriems buvo mažesnis mikrobų iššūkis dėl IL-8 ATC / TTC haplotipo, gali būti periodonto sunaikinimas, nei pacientams, neturintiems 21, 44 .

Įrodyta, kad tas pats ATC / TTC haplotipas yra susijęs su bronchine astma, o rs4073T> SNP, kai buvo tiriamas atskirai, reikšmingos asociacijos neparodė 45 . Kiti tyrimai pranešė apie panašų ryšį su lėtiniu periodontitu, kai SNP buvo analizuojamas atskirai, tačiau, analizuojant analizuojant haplotipą, paaiškėjo, kad ryšys su liga yra 43, 46 . Todėl šie tyrimai patvirtina mintį, kad haplotipai yra galingesni nustatyti ligos ryšį nei atskiri polimorfizmai, ir jie gali suteikti daugiau informacijos, remdamiesi liga 43, 47 . Nepaisant anksčiau pranešto apie rs4073T> SNP 13 funkcinį vaidmenį, Hacking et al. Nepatvirtino šios asociacijos 48 . Hacking et al. , ir kiti teigė, kad kito SNP egzistavimas (arčiau rs4073T> A) gali vaidinti įtaką moduliuojant IL-8 geno ekspresiją 20, 48, 49, 50 . Taigi savo tyrime pastebėjome, kad IL-8 geno +781 (C / T) SNP rs2227306, atrodo, daro įtaką IL-8 tiek mRNR, tiek baltymų lygiu, manydami, kad čia analizuotų haplotipų skirtumas buvo susijęs su alelių toje padėtyje.

Ahn ir kt. Tyrimas . , pacientams, sergantiems idiopatine plaučių fibroze (IPF), padidėjęs IL-8 lygis pacientams, turintiems A alelį ties rs4073T> A SNP A bendro interleukino 8 geno alelyje, susijęs su idiopatinės plaučių fibrozės išsivystymu per IL -8 baltymų stiprinimo režimas. „Respir Res 12“, 73 (2011). "Href = / articles / srep31180 # ref51 aria-label =" Reference 51 "data-track = click data-track-label = link> 51. Autoriai naudojo luciferazės testą norėdami įvertinti Jie nustatė padidėjusį luciferazės aktyvumą, kai IL-8 geno promotoriuje yra rs4073T> SNP. Autoriai padarė išvadą, kad IL-8 promotorius SNP gali padidėjęs jautrumas IPF plėtrai dėl padidėjusio IL-8 A reguliavimo bendrojo interleukino 8 geno alelyje yra susijęs su idiopatinės plaučių fibrozės išsivystymu per IL-8 baltymą stiprinantį režimą. Respir Res 12, 73 ( 2011) “. href = / articles / srep31180 # ref51 aria-label = "Nuoroda 51" data-track = spustelėkite data-track-label = link> 51 . Naudodamiesi panašia reporterių vektorių sistema, Meade et al. , ištirti galvijų IL-8 promotoriaus haplotipai in vitro . Autoriai nustatė, kad luciferazės promotorius, turintis vieną iš haplotipo IL-8- h2 (C – GTAC), stipriai reguliuojamą luciferazės aktyvumą LPS ir TNF stimuliacijoje, patvirtinantis SNP funkcionalumą ir pasiūlęs diferencinį transkripcijos faktorių, jungiantį prie IL-8- h2 promotoriaus. (pvz., C / EBP, Oct-1, NFκB ir NFAT) 52 . Hacking et al. 48 pastebėjo, kad C / EBPb (CCAAT / sustiprinantis baltymas-beta) jungiasi prie transkripcijos komplekso, esant rs4073T> aleliui kvėpavimo takų epitelio ląstelėse, bet ne pirminėse limfocitų ląstelėse, ir tai rodo ląstelių tipo specifiškumą transkripcijos reguliavime 48 . Nors luciferazės reporterio tyrimai yra priimta technika, kurią galima naudoti SNP funkcionalumui patikrinti, manome, kad tai yra dirbtinė sistema, kurioje nėra sudėtingų norminių elementų, rastų chromatine. Norėdami pašalinti šią haplotipų funkcinės analizės spragą ir patikrinti savo hipotezę, mes priėmėme naują metodą, vadinamą grupuotu reguliariai tarpais išdėstomu trumpu palindrominiu pakartojimu (CRISPR). RNR valdoma Cas9 nukleazės sistema 53, kad būtų galima redaguoti IL-8 geną žmogaus embrioninių inkstų ląstelių linijoje. (HEK293T). Ši technologija šiuo metu yra aktuali tema genomo redagavimo srityje ir neįkainojama priemonė pasirinktiems genomams kurti 54 . IL-8 redaguojančioms ląstelių linijoms generuoti kaip modelio sistemą pasirenkame HEK293T ląsteles, nes ši ląstelių linija dažniausiai naudojama su CRISPR / Cas9 technologija, todėl jos yra gerai nusistovėjusi modelių sistema, skirta RNR valdomų endonukleazių efektyvumui genų redagavimo srityje išbandyti. 55, 56 . Taikydami šią techniką, mes sugebėjome sėkmingai redaguoti IL-8 geną HEK293T genome, kad turėtumėte skirtingus haplotipus beprecedenčio tikslumo ir lengvumo dėka. Be to, mes sugebėjome išbandyti skirtingų haplotipų poveikį IL-8 geno transkripcijai, baltymams ir taip pat įvertinti jų gebėjimą moduliuoti neutrofilų transmigraciją. Šiam tikslui naudojama metodika siūlo paprastą ir taikytiną struktūrą patvirtintoms redaguotoms ląstelių linijoms generuoti. Mūsų darbo eiga pritaikyta pagal anksčiau paskelbtus metodus ir (arba) namuose sukurtus protokolus, ypač naudojant neapsaugotą dvigubą DNR genomo redagavimui, kurį galima suskirstyti į keturias fazes: 1) sgRNR taikinio dizainas 30 ; 2) sgRNR ekspresijos vektoriaus konstrukcija 57 ; 3) Homologinio taisymo šablonai į homologinį nukreiptą taisymą (HDR); 4) Ląstelių kultūra ir transfekcijos. Ši metodika, naudojant CRISR / Cas9 sistemą, parodė, kad ATC / TTC haplotipo buvimas gali aukščiau reguliuoti IL-8 HEK293T ląstelėse stimuliavus Poli I: C. Roy ir kt. , naudodamiesi panašia technika per trumpą laiką 55 sukūrė dvi kloninių ląstelių linijas, nukreiptas į WNK1 geno 1 egzoną. Kadangi CRISPR / Cas9 sistema vis dar yra nauja ir patvirtinama, mes radome mažiau publikacijų, susijusių su SNP ir haplotipų redagavimu apskritai. Nors per pastaruosius dvejus metus ši technika buvo tobulinama ir naudojama nepaprastai, deja, programuojamos nukleazės, tokios kaip cinko piršto nukleazės, transkripcijos efektorinės nukleazės, RNA valdomos inžinerinės nukleazės (RGEN) ir CRISPR / Cas9 sistema, gali sukelti tikslinės mutacijos genome 27, 28, 29, 30, 31 . Vis dar kuriamos įvairios technologinės platformos, skirtos šalinti netikslinį šių nukleazių 58, 59 poveikį, kad būtų galima modifikuoti ar pakeisti sgRNR sekas, kad būtų sumažintas arba pašalintas nepageidaujamas skilimas vadovaujant nukleazėms. Šiuo atžvilgiu mes panaudojome viso genomo RNR-seq analizę, norėdami nustatyti diferencinę nuorašų raišką mūsų genomo redaguotose ląstelėse. Nors mes radome nuorašų, kurie buvo diferencijuotai išreikšti ATC / TTC haplotipu, palyginti su kontrole, tačiau tai sudarė ~ 2, 8% transkripto skirtumo (986 iš 34 917 nuorašų). Tačiau mes neradome jokio imunologinio kelio praturtėjimo genomo redaguotose ląstelėse. Nepaisant to, mes sutinkame, kad reikia būti ypač atsargiems kuriant sgRNR, kad pakeistumėte dominantį genomą.

Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad IL-8 geno ATC / TTC gali turėti teigiamą rezultatą dėl IL-8 geno transkripcijos ir transliacijos lygio, todėl gali pakeisti neutrofilų pritraukimą infekcijos vietoje. Dėl viso to, kad neutrofilai turi lemiamą reikšmę periodonto ligai, tikėtina, kad tam tikro IL-8 haplotipo ATC / TTC pernešimas gali prisidėti prie periodonto ligų jautrumo.

Medžiaga ir metodai

CRISPR-Cas9 vektorių konstrukcija

Bicistroninis pX330 vektorius buvo gautas iš Addgene (pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 buvo Feng Zhang dovana (Addgene plazmidė Nr. 42230)). Šis vektorius, sukonstruotas naudojant cDNR, koduojančius žmogaus kodonams optimizuotus Streptococcus pyogenes Cas9 (hSpCas9), kurie jungiasi ir skaido DNR, ir prisitaikančią CRISPR RNR (crRNR) / trans-aktyvinančią crRNR chimerą, turinčią gretimas BbsI klonavimo vietas, kad sudarytų „protospacer“ kreipiamosios sekos (sgRNR). ) įterpimas (1 pav.). Plazmidė buvo transformuota į DH5α kompetentingas ląsteles (Life Technologies, JAV) ir buvo atrinkta 100 μg / ml ampicilino (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) LB plokštelėse. Pavienė + ve bakterijų kolonija buvo pasėta 1 ml LB terpės ir leista augti purtiklyje 37 ° C temperatūroje. Po vienos nakties auginimo plazmidė buvo išskirta naudojant „PureLink Quick Plasmid Miniprep“ rinkinį (Invitrogen, Carlsbad, CA).

„sgRNA“ tikslinis dizainas

Norint pagerinti netaikomų taikinių specifiškumą, buvo sukurta Feng Zhang laboratorijos „Target Finder“ programa, skirta specifinei sgRNR 30 sukurti . DNR skaidymui reikalinga sinergetinė dviejų nepriklausomų specifiškumą koduojančių DNR rišančių modulių sąveika. Tai leido mums apibrėžti sgRNR porų atrankos parametrus, palengvinančius efektyvų dvigubą nikymą, kuriame gRNR1 turėjo būti pasroviui iki pirmojo SNP (-251), taip pat gRNR2 prieš srovę iki trečiojo SNP (+781) IL-8. genas. Todėl 28 bp ir 27 bp gairių sekos, nukreipiančios į DNR, buvo parinktos remiantis numatomu didelio specifiškumo prototipo greta motyvo (PAM) taikinių vietomis IL-8 gene. IdtDNA technologijomis kiekvienai sekai buvo susintetinti du vienas kitą papildantys oligos, turinčios kreipiamąją seką, įskaitant BbsI ligacijos adapterius.

sgRNR ekspresijos vektoriaus konstravimas

Kiekvienos oligos poros (100 mM) sensacinė ir antisense vienos grandinės DNR buvo atkaitinta naudojant 0, 5 μL T4 polinukleotidų kinazės (New England Biolabs, MA) ir 1 μL 10X T4 ligacijos buferio, kuriame bendras tūris yra 10 μl, inkubuojant oligo mišinį. 30 min. esant 37 ° C, po to 5 min. - 95 ° C, po to rampa iki 25 ° C, esant 5 ° C / min 60 . Atkaitintos oligos (gRNR1 ir gRNR2) buvo sujungtos į BbsI suvirškintą pX330 vektorių, naudojant 2 μL 10x greito suvirinimo buferio (Life Technologies, Paisley, UK) ir 0, 5 μL T7 DNR ligazės (New England Biolabs, Ipswich, MA) 57. . Ligacinis mišinys buvo apdorotas Plasmid Safe egzonukleazėmis ir transformuotas į „One -hot“ chemiškai kompetentingas DH5α ląsteles (Life Technologies, Paisley, JK). Transformuoti klonai buvo atrinkti ant 100 μg / ml ampicilino (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) LB plokštelių. Po plazmidinės DNR ekstrahavimo (Qiagen, CA), konstrukto seka buvo patikrinta automatine DNR sekos analize, atlikta Pensilvanijos universiteto DNR sekos sudarymo šerdyje.

Homologinis remonto šablonas

Sukūrus tikslinę dvigubos grandinės DNR pertrauką (DSB), galima pasirinkti kelis taisymo būdus 53 . DSB gali būti pataisytas naudojant homologinį taisymą (HDR), naudojant homologinę DNR kaip šabloną. Mūsų eksperimentiniam tikslui homologiniai taisymo šablonai buvo sukurti dviem etapais. Pirmiausia atlikome ankstesnio 20 tyrimo metu nenustatytų žmonių tiriamųjų DNR seką, kad patvirtintume ir atrinktume DNR mėginį, kuris reprezentuoja ATT / TTC haplotipą, ir vieną mėginį, kuris reprezentuoja ATC / TTC haplotipą. Antra, mes PCR amplifikavome fragmentą, atitinkantį tą pačią sritį, kuri buvo iškirpta kompleksiškai CRISPR / Cas9 su 1 kreipiamosios sekos intarpu ir 2 vadovo sekos intarpu (1 lentelė). Reakcijų produktai buvo patikrinti 1% agarozės gelyje. Susidomėjusios fragmentai buvo išgriebti iš gelio, skirto gryninti, naudojant „PureLink“ gryninimo rinkinį (Invitrogen, Carlsbad, CA), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, ir patikrinti DNR seka.

Pilno dydžio lentelė

Ląstelių kultūra ir transfekcija

HEK293T ląstelės buvo kultivuojamos šešių šulinėlių plokštelėse iki 50–60% santakos su pašildyta badaujančia terpe (DMEM, papildyta 10% dializuoto vaisiaus galvijų serumo ir 1% penicilino / streptomicino) ir inkubuotos 5% CO 2 inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje. C. Transfekcijos buvo atliktos keturiomis skirtingomis sąlygomis: 1. Transfekcija dviem specifiniais CRISPR / Cas9 plazmidės konstruktais, be homologinio taisymo šablono su ATT / TTC haplotipu; 2. Transfekcija dviem specifinėmis CRISPR / Cas9 konstrukcijomis, be homologinio taisymo šablono, turinčio ATC / TTC haplotipą; 3. Transfekcija dviem specifiniais CRISPR / Cas9 konstruktais; 4. Neigiama kontrolė (ląstelės, perkeltos TE (1X), ir transfekcijos reagentu. Iš viso 2, 5 × 105 ląstelės buvo perpiltos po 0, 5 μg kiekvienos sgRNR plazmidės ir 0, 2 μg DNR šablono, naudojant GenMute reagentą (SignaGen Laboratories, MD). Laikantis gamintojo nurodymų, terpė buvo pakeista šviežia terpe kitą dieną ir praėjus 48 valandoms po transfekcijos. Septyniasdešimt dvi valandas po transfekcijos ląstelės buvo surinktos, mažas ląstelių tankis suskaičiuotas, praskiestas iki 1 × 10 4 ląstelių / ml ir 2 μl / duobutėje buvo perkelti į 96 šulinėlių plokšteles kloninei atrankai. Genominė DNR buvo ekstrahuota naudojant „QIAmp DNA Mini Kit“ (Qiagen, CA). (1 lentelė). Homologiniai taisomojo šablono intarpai su SNP buvo patvirtinti DNR sekos analize, atlikta Pensilvanijos universiteto DNR sekos nustatymo šerdyje. Iš 10 klonų kiekviename po 4 klonus iš ATT / TTC haplotipo ir 1 kloną f rom ATC / TTC haplotipas buvo teigiamas.

RNR seq analizė

Neapdoroti sekų rodmenys, gauti iš „Illumina HiSeq 2500 V4 100bp“ vienkartinio skaitymo sekos, buvo filtruojami, kad būtų išsaugoti tik aukštos kokybės skaitymai. Duomenys buvo suderinti su genomu su STAR 61 . Apdorojimas žemu lygiu buvo atliktas naudojant PORT vamzdyną (github.com/itmat/Normalization). PORT pašalina ribosomų RNR, atlikdamas BLAST derinimą su etalonine rRNR. Tada PORT išlygina egzono signalą visuose mėginiuose, atsitiktinai imdamas skaitymą, kad būtų gautos SAM bylos su vienoda eksonų kartografų dalimi visuose mėginiuose. PORT normalizuojasi dėl kelių kitų veiksnių, įskaitant labai išreikštus labai kintančius elementus. Tada duomenys buvo įvertinti kiekiu genų lygiu, naudojant ENSEMBL geno anotaciją. Skirtingai išreikšti genai tarp kontrolinių ir CRISPR / cas9 išvestų haplotipų mėginių buvo nustatyti naudojant FDR kontrolę, naudojant PaGE 62 . Kelio analizė buvo atlikta naudojant išradingumo IPA (www.ingenuity.com/products/ipa). Visi keliai, kurių p vertė mažesnė nei 1, 0E-4, buvo laikomi reikšmingais, o tai praktikoje kelio analizėje yra liberalas kriterijus. Tvirtinti, kad jokie imunologiniai keliai nebuvo paveikti, reikėjo liberalių kriterijų.

HEK293T ląstelių stimuliacija

TLR3 kelias sukelia IL-8 ekspresiją, kai jį stimuliuoja poli I: C, TLR3 agonistas 63 . Funkcinei analizei atlikti HEK293T ląstelės, kurių genome buvo redaguojami haplotipai ir kartu su kontrolinėmis ląstelėmis, buvo kultivuojamos šešių šulinėlių induose iki 70–80% santakos su pašildyta badavimo terpe (DMEM papildyta 10% dializuoto vaisiaus galvijų serumo ir 1% penicilino / streptomicino) ir inkubuojami šviežio badavimo terpėje 5% CO 2 inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje. Iš viso 0, 5x106 ląstelės buvo stimuliuojamos 5 μg / ml poli I: C 24 val. Buvo šešios sąlygos: 1) HEK293T ląstelės, turinčios ATT / TTC haplotipą, stimuliuotos TLR3 agonistu poli I: C; 2) HEK293T ląstelės su ATC / TTC haplotipu, stimuliuotos TLR3 agonistu poli I: C; 3) HEK293T ląstelės, stimuliuotos TLR3 agonistu poli I: C; 4) HEK293T ląstelės su ATT / TTC haplotipu nestimuliuojamos; 5) HEK293T ląstelės su ATC / TTC haplotipu nestimuliuojamos; 6) HEK293T ląstelės nėra stimuliuotos. Vėliau buvo atlikti eksperimentai IL-8 geno ekspresijai įvertinti, IL-8 baltymo kiekiui įvertinti ir neutrofilų migracijai įvertinti.

Neutrofilų izoliacija

Penki mililitrai viso kraujo buvo gauti venų atlikimo būdu į mėgintuvėlius, kuriuose yra natrio heparino (BD Biosciences, CA). Neutrofilai buvo išskirti pagal „Nauseef 64“ . Neutrofilai buvo kelis kartus plaunami ir pakartotinai suspenduojami pašildytoje DMEM terpėje. Žmogaus neutrofilai buvo išskirti iš sveikų savanorių, gavus pasirašytą informuotą sutikimą, patvirtintą Pensilvanijos universiteto institucinėje apžvalgos taryboje (IRB). Visus eksperimentinius protokolus patvirtino Pensilvanijos universiteto IRB. Tyrimas buvo atliktas vadovaujantis Helsinkio deklaracijos principais.

PMN transmigracijos tyrimas

Mes pritaikėme neutrofilų transmigracijos tyrimo protokolą, kaip aprašyta anksčiau 65 . Tyrimas buvo atliktas modifikuotoje 24 duobučių (poros dydžio 3, 0 μM) kameroje (Corning Incorporated, NLD). Į kiekvieną šulinėlį buvo įdėta aštuoni šimtai mikrolitrų supernatanto, aprašyto aukščiau aprašytame žingsnyje. Rekombinantinis žmogaus IL-8 (R&D Systems, Minneapolis, MN) buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė, taip pat kaip neigiama kontrolė buvo naudojama tik DMEM terpė. Vėliau PMN (1x106) buvo dedama į viršutinę (bazolaterinę) kamerą ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje 2 valandas. PMN, kurie migravo per apatinę (viršūninę) kamerą, buvo išmatuoti fluorescenciniu ląstelių rūšiavimu (FACS), naudojant BD Accuri ™ C6 srauto citometrą.

Kiekybinis realaus laiko RT-PGR

Kiekvienos būklės RNR buvo išskirta naudojant „RNeasy“ rinkinį (Qiagen, CA) pagal gamintojo instrukcijas. RNR vientisumas ir kiekis buvo patikrintas spektrometrijos metodu NanoDrop ND1000 spektrofotometru. CDNR sintezei panaudoti penki mikrogramai bendros RNR, naudojant didelės talpos cDNR archyvų rinkinį (Applied Biosystems, CA). Realiojo laiko PGR buvo atlikta naudojant cDNR (50 ng) su IL-8 kaip pradmeniu ir zondu, o kaip GAPDH - kaip endogeninę kontrolę „ABI 7500 Fast“ sistemoje (Applied Biosystems, CA), esant TaqMan DNR polimerazei pagal Benakankakere et al. 66 . Duomenys buvo analizuojami DDCT 67 metodu, normalizuojant mRNR lygį iki mRNR AGT / TTC naudojant poli I: C stimulą.

ELISA

Buvo panaudoti du šimtai mikrolitrų kultūros supernatanto, aprašyto žingsnyje „HEK293T ląstelių stimuliavimas poli I: C“. IL-8 lygis buvo matuojamas fermentais sujungtu imunosorbentų tyrimu (ELISA), naudojant komerciškai prieinamą rinkinį (BD Biosciences, CA) pagal gamintojo instrukcijas. Absorbcija buvo rodoma esant 450 nm bangos ilgiui. Koncentracijos buvo išreikštos pg / ml.

Statistinė analizė

Kiekvieno paveikslo duomenys pateikiami iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų, kurių vidurkis (standartinis nuokrypis) yra ne mažiau kaip trys nepriklausomi duomenų taškai / sąlygos. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas kelis kartus, gaunant panašius rezultatus. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant „GraphPad Prism 5.0“ (San Diegas, Kalifornija). Duomenys buvo analizuojami naudojant vienpusį ANOVA, po kurio buvo atlikti keli Tukey palyginimo testai. Statistiniai skirtumai buvo laikomi reikšmingais esant p <0, 05 lygiui ir pažymėti žvaigždute (p <0, 05 (*)).

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Benakanakere, MR ir kt. Žmogaus interleukino-8 geno haplotipų funkcinio vaidmens tyrimas naudojant CRISPR / Cas9 tarpininkaujant genomo redagavimui. Mokslas. Rep. 6, 31180; „doi“: 10.1038 / srep31180 (2016).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.