Oktozės ketoreduktazės ir dviejų aciltransferazių dalyvavimas paulomicinų biosintezėje | mokslinės ataskaitos

Oktozės ketoreduktazės ir dviejų aciltransferazių dalyvavimas paulomicinų biosintezėje | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Antibiotikai
  • Biosintezė

Anotacija

C-4 hidroksietilo šakotosios oktozės buvo pastebėtos kelių gramų neigiamų bakterijų genų polisachariduose ir įvairiuose antibiotikuose, kuriuos gamina gramteigiamos bakterijos. Buvo pasiūlyta C-4 hidroksietilo atšaką paversti iš C-4 acetilo atšakos neatliekant ketoredukcijos etapo. Paulomicinai (PAU) yra glikozilinti antibiotikai, stipriai slopinantys gramteigiamas bakterijas, ir struktūriškai apibūdinami pagal unikalų C-4 ′ hidroksietilo šakotosios paulomikozės fragmentą. Nauja aldo-keto-reduktazė Pau7 buvo apibūdinta kaip fermentas, katalizuojantis PAU E (1) 7′-keto stereospecifinį ketoredukciją, kad būtų gaunamas PAU F (2) C-4 ′ hidroksietilo šakotosios paulomikozės fragmentas. Aktiltransferazė Pau6 papildomai papuošia C-4 ′ hidroksietilo atšaką, kurioje yra 2-osios paulomikozės dalis, prie 7'-OH prijungdama įvairias riebalų acilo grandines, kad susidarytų įvairūs PAU. Be to, buvo pasiūlyta dar viena aciltransferazė Pau24, atsakinga už PAU 13- O- acetilinimą.

Įvadas

Paulomicinai (PAU) yra glikozilintų antibiotikų grupė, kurie gali būti naudojami uretrito ir chlamidijos infekcijų gydymui. Jų struktūrą apibūdina unikalus izotiocinatas, turintis Paulo rūgštį ir C-4 ′ hidroksietilo šakotosios paulomikozės 1, 2, 3, 4 (papildomas S1A pav.). ). Keletas PAU analogų skiriasi vienas nuo kito specifinėmis riebiojo acilo grandinėmis, pritvirtintomis prie jų paulomikozės 7'-OH. C-4 šakotosios oktozės, panašios į paulomikozę, taip pat būna daugelyje kitų antibiotikų iš gramteigiamų bakterijų, įskaitant antibakterinius (avilamicinai) 5, 6, 7 ir priešnavikinius agentus (chinociklinai, 8, 9 izochinociklinai 10, 11 ir trioksacarcinai 12, 13 ). (Papildomas S1B pav.). C-4 acetilo atšakos įrengimą buvo pasiūlyta katalizuoti numatomu baltymų kompleksu (AviB1 / AviB2) avilamicino A biosintezėje, naudojant donoru piruvatą 6 . Tačiau palyginti nedaug žinoma apie kitą ketoredukcijos etapą, paverčiant C-4 acetilo šaką į hidroksietilo šaką.

Be gramteigiamų bakterijų antibiotikų, gramneigiamų bakterijų lipopolisahariduose buvo išskirtos ir C-4 šakotosios oktozės. Iš kelių gramų neigiamų bakterijų genų, įskaitant Yersinia pseudotuberculosis VI 14 serumą , Yersinia frederiksenii 15, Burkholderia brasiliensis 16, Budvicia aquatica 20186 17 ir Pseudomonas mandelii 18, buvo išskirti C-4 hidroksietilo šakotosios (7 R ) -jerininozės A O- antigenai . . Jo (7S) -izomeras yersiniozė B buvo pastebėtas Yersinia enterocolitica 19 O- antigenuose (papildomas S1C pav.). Skirtingai nuo gramteigiamų bakterijų, įdarbinamas vienas nuo TPP priklausomas flavoproteinas YerE, kad būtų galima įdiegti jersiniozės 20 C-4 acetilo šaką. Deja, stereospecifinis ketoredukcijos žingsnis, sukuriantis du stereoizomerus - jersiniozę A (7R) ir jersiniozę B (7S), dar nebuvo apibūdintas.

Ankstesniame 21 darbe iš Streptomyces paulus NRRL 8115 nustatėme PAU biosintetinio geno klasterį, kuris gali gaminti PAU E (1), PAU F (2), PAU A (3), PAU B (4), paulomenolio A (5). ) ir paulomenolio B (6) (1 pav.). Tarp PAU ir paulomenolių 1 junginyje yra oktozė su C-4 ′ acetilo šaka; o visi kiti junginiai, turintys unikalią C-4 ′ hidroksietilo šakotą paulomikozę. C-7 ′ S -konfigūracija anksčiau buvo paskirta iš 3 ir 4 hidrolizuoto paulomikozės darinio1H BMR ir 5 22 kristalų struktūros. Buvo pasiūlyta, kad AviB1 / AviB2 homologai Pau11 / Pau12 katalizuoja C-4 ′ acetilo atšakos prijungimą, kad susidarytų oktozė 1 junginyje. C-4 ′ acetilo atšaka stereospecifiškai redukuojama į hidroksietilo atotrūkį, kad būtų gautos 7′- OH 2, kuris bus dekoruotas įvairiomis riebios acilo grandinėmis, kad susidarytų įvairūs PAU. Šiame darbe mes aprašome Pau7 kaip stereospecifinę ketoreduktazę, paverčiančią C-4 ′ acetilo atšaką 1 į C-4 ′ hidroksietilo atšaką 2, Pau6 kaip aciltransferazę, įkraunančią skirtingas riebalų acilo grandines į 7′-OH ir Pau24. fermentas, katalizuojantis 13-OH acetilinimą.

Image

S. paulus NRRL 8115, laukinio tipo padermė; CIM3010, pau7 inaktyvuotas mutantas; CIM3017, papildytas CIM3010 kamienas; CIM3015, pau6 inaktyvuotas mutantas; CIM3018, papildytas CIM3015 štamas; CIM3016, pau24 inaktyvuotas mutantas; CIM3019, papildytas CIM3016 štamas. 1, PAU E; 2, PAU F; 3, PAU A; 4, PAU B; 5, paulomenolis A; 6, paulomenolis B.

Visas dydis

Rezultatai

Pau7 katalizuoja 7′-ketoredukciją 1

Genas pau7 koduoja tariamą oksidoreduktazę, priklausančią besiformuojančiai aldo-keto reduktazės (AKR) superšeimai 23, 24 . Išsami analizė parodė, kad Pau7 turi konservuotą AKR baltymų katalizinį tetradą (papildomas S4 pav.); ir tai yra naujas AKR5I poklasis, nes jo baltymų sekos tapatumas su kitais AKR5 šeimos fermentais yra didesnis nei 40%, bet mažesnis nei 60%. Ankstesniame darbe buvo sukonstruotas pau7 inaktyvuotas mutantas CIM3010 21 . CIM3010 atlikta HPLC analizė parodė, kad jis prarado gebėjimą gaminti visus PAU analogus, išskyrus 1 (1 pav.), Kuris buvo atpažintas pagal jo cheminę formulę C 29 H 36 N 2 O 16 S (nustatomas didelės skiriamosios gebos elektrolitinės purškimo jonizacijos masės spektrometrija., HR-ESI-MS, m / z [MH] - 699, 1716 (apskaičiuota 699, 1713) ir jo suskaidymo schema tandeminių masių aptikimo metu (papildomas S5 pav.). Produkcija 4, 5 ir 6 buvo iš dalies atstatyta perkomplementuojant pau7 CIM3010 (papildomas pav. S6), todėl atmetama galimybė gauti poliarinį efektą ir patvirtinamas Pau7 dalyvavimas PAU biosintezėje. Paulomenoliai yra paverčiami atitinkamais PAU hidrolizuojant Paulo rūgštį vėlyvosiose fermentacijos stadijose.

Norėdami patikrinti Pau7 kaip 7′-ketoreduktazę, mes šį fermentą E. colyje išreiškėme kaip N-His 6 žymėtą baltymą ir išgryninome jį naudodami Ni-NTA afiniteto chromatografiją (papildomas S7A pav.). Kaip ir tikėtasi, inkubuojant Pau7 su 1 ir NADPH, gautas naujas produktas, kurio HPLC sulaikymo laikas toks pat (2 pav.) Ir cheminė formulė kaip 2 (C 29 H 38 N 2 O 16 S, HR-ESI-MS, m / z). 701, 1859 [MH] -, apskaičiuota 701, 1869) (papildomas S6C pav.). Dramatiškas fermentinio aktyvumo praradimas, kai vietoj NADPH buvo naudojamas NADH (2 pav.), Rodo, kad Pau7 parodo aiškų NADPH, kaip kofaktoriaus, pasirinkimą, kaip ir dauguma kitų AKR fermentų 23 . Nustatyta, kad optimizuotos Pau7 reakcijos sąlygos yra pH 7, 5, 28 ° C. Pastovios būklės kinetinės analizės parodė Michaelis-Menten elgesį 1, kai K m 1, 1 ± 0, 2 mM, o k cat - 19, 5 ± 2, 4 min -1 ( Papildomas S7 pav.).

Image

Visos kontrolinės reakcijos buvo atliktos naudojant atitinkamus virtus fermentus.

Visas dydis

„Pau6“ papuošia paulomikozės 7′-OH skirtingomis riebalų acilo grandinėmis

Apibrėžę Pau7 kaip katalizatorių, redukuojantį 7′-keto iki 7′-OH, mes siekėme išaiškinti PAU struktūrinio diversifikavimo mechanizmą, į 7′-OH pridėdami skirtingas riebalų acilo grandines. Pau klasteryje yra dvi numanomos aciltransferazės, užkoduotos genų pau6 ir pau24 . „Pau6“ ir „Pau24“ turi didelę sekų tapatumą (39%) ir MppM (atitinkamai 36, 5% ir 36, 6%) - aciltransferazės, dalyvaujančios mannopeptimicino biosintezėje 25 . Norėdami funkciškai atskirti du fermentus, sukūrėme ∆pau6 mutantą CIM3015 ir ∆pau24 mutantą CIM3016, atitinkamai pakeisdami pau6 arba pau24 atitinkamai apramicino ir kanamicino atsparumo kasetėmis (papildomas S8 pav.). CIM3015 HPLC analizė parodė, kad jis negamino nė vieno PAU analogo, išskyrus 2 (1 pav.), Todėl Pau6 yra 7'-OH aciltransferazė. 2 tapatumas buvo patvirtintas HR-ESI-MS ( m / z 701, 1865 [MH] -, apskaičiuota 701, 1869) ir tandeminės masės analizės (papildomas S9 pav.). Visų pirma, 4, 5 ir 6 gamybą būtų galima atkurti išreiškiant pau6 ir pau24 atitinkamai CIM3015 ir CIM3016 trans (1 pav.), Išskyrus polinių efektų įtaką.

Norint patikrinti Pau6 kaip 7′-OH aciltransferazę, jis buvo per daug ekspresuotas kaip N-His 6- pažymėtas Pau6 S. lividans TK24, išgrynintas afininės chromatografijos būdu (papildomas S10A pav.) Ir inkubuotas su 2 ir izobutilo-CoA. Kaip ir tikėtasi, 2 buvo veiksmingai paverstas 4 (2 pav.), Tai patvirtino HR-ESI-MS ( m / z 771, 2281 [MH] -, apskaičiuota 771, 2288) (papildomas S10C pav.). Pau6 taip pat buvo inkubuotas su 2 ir acetil-CoA, ir nauju junginiu, turinčiu tą pačią cheminę formulę kaip PAU D (7) (C31H40N2O17S, HR-ESI-MS, m / z 743.1981 [MH] ] -, apskaičiuota 743.1975, papildomas S10E pav.) (2 pav.), Parodantis Pau6 patrauklumą skirtingų acil-CoA substratų atžvilgiu.

Pau7 yra stereospecifinė ketoreduktazė

Pau7 pavertimas 1 į 2 patvirtino, kad tai yra ketoreduktazė, redukuojanti C-4 ′ acetilo šaką į paulomikozės hidroksietilo šaką. Tačiau katalizinis Pau7 specifiškumas vis dar yra paslaptis, nes C-7 ′ konfigūracija 2 junginyje nebuvo nustatyta. Norėdami ištirti Pau7 katalizinį stereospecifiškumą, buvo patikrinta sujungta Pau6 ir Pau7 reakcija, naudojant substratus 1 ir izobutil-CoA, kuriuose pusvalandyje 1 buvo veiksmingai paverčiamas tiek 2, tiek 4. Kai reakcija buvo pailginta iki dviejų valandų, 2 (susidaręs sumažinus 1) buvo beveik visiškai paverstas 4 (2 pav.), Kas rodo, kad 2 turi tokią pačią 7 ′ S- konfigūraciją kaip 4 22, o tai rodo, kad Pau7 sumažina C-4 ′ acetilo atšaka stereospektyviai, kad būtų suformuota (7 ′ S ) -hidroksietilo šaka.

Pau24 yra atsakingas už 13-OH acetilinimą

Įdomu tai, kad Δpau24 mutantas CIM3016 panaikino visų PAU analogų gamybą, tačiau sukaupė tris naujus junginius (8, 9 ir 10) (1 pav.), Turinčius panašius UV spektrus (λmax = 232 nm, 274 nm ir 323 nm), kaip ir PAU ( Papildomos S11B – S13B pav. 8 junginio HR-ESI-MS analizė leido gauti [MH] - jonus, esant m / z 729, 2191, pagal chemišką formulę C 31 H 42 N 2 O 16 S (apskaičiuota 729, 2182) (papildomas S11 D pav.). Palyginus 4 ir 8 1H NMR duomenis, paaiškėjo, kad 8 prarado 13- O- acetilo signalus (S5 lentelė), o 8H NMR signalai buvo beveik identiški 4, išskyrus aliozės signalus. 14 dalis . H-9 – H-12 iš 8 signalai aiškiai pasislenka aukštyn, o ypač dramatiškas H-11 poslinkis nuo 4, 81 ppm 4 iki 3, 70 ppm 8 rodo pauloilo grupės atsiribojimą. Sutampantis H-13 signalo poslinkis žemyn (4, 01 ppm nuo 4 iki 4, 16 ppm, esant 8) reiškia, kad pauloilo grupė vėl pritvirtinama, išstumiant 13- O -acetilo grupę, o tai patvirtina HMBC koreliacija 8 nuo H-13 ( δH : 4, 16) iki C-1 ″ ( δ C : 161, 2) (papildomas S11K pav.). Remiantis jo MS ir NMR duomenimis, 8 junginys buvo galutinai identifikuotas kaip 11-de- O -pauloil-13-de- O -acetil-13- O -pauloil-PAU ​​B (3 pav.). HR-ESI-MS nustatė, kad 9 cheminė formulė yra C 32 H 44 N 2 O 16 S ( m / z 743, 2329 [MH] -, apskaičiuota 743, 2339) (papildomas S12D pav.), Kuri atitinka decetiletus. 3; panašiai cheminė formulė C 27 H 34 N 2 O 15 S iš 10 (HR-ESI-MS, m / z 657, 1599 [MH] -, apskaičiuota 657, 1607) (papildomas S13 D pav.) yra tokia pati kaip deacetilinti 1. 9 junginiai. ir 10 buvo priskirti 11-de- O -pauloil-13-de- O -acetil-13- O -pauloil-PAU ​​A ir 11-de- O -pauloil-13-de- O -acetil-13- O - Pauloyl-PAU ​​E, analogiškas 8, remiantis jų tandemo MS ir NMR duomenimis (3 pav.; papildomos S12 ir S13 pav.). Galiausiai trijų naujų junginių 8, 9 ir 10 antibiotikų aktyvumas buvo patikrintas prieš keletą gramteigiamų bakterijų ir slopinimo nepastebėta (S8 lentelė).

Image

Pagrindiniai COZY 8, 9 ir 10 yra pažymėti paryškintomis obligacijomis; o pagrindinės HMBC koreliacijos 8 yra pažymėtos rodyklėmis.

Visas dydis

Diskusija

C-4 hidroksietilo šakotosios oktozės pasiskirsto tiek gramteigiamose, tiek gramneigiamose bakterijose. Buvo pasiūlyta, kad C-4 hidroksietilo atšaka būtų paversta iš C-4 acetilo atšakos, neradus apibūdinimo ketoredukcijos 20 etape. Šiame tyrime mes apibūdinome Pau7 kaip stereospecifinę ketoreduktazę, dalyvaujančią paulomicino biosintezėje, kuri sumažina 7′-keto iš 1, kad susidarytų C-4 ′ hidroksietilo šakotosios paulomikozės dalis iš 2. Bioinformatikos analizė parodė, kad Pau7 priklauso AKR šeimai ir yra naujas pogrupis AKR5I. Keista, tačiau biosintetiniuose avilamicino, kosinostatino (chinociklino B), trioksacarcino ir yeriniozės A biosintetiniuose genų klasteriuose nebuvo rastas Pau7 homologas, rodantis, kad (i) Pau7 panašūs fermentai, atsakingi už panašius ketoredukcijas, buvo užkoduoti atskirtais genais arba (ii) Tais atvejais buvo verbuojamos ketoreduktazės, nepriklausančios AKR šeimai.

Įvairūs PAU susidarė apipavidalinant 7-OH paulomikozę įvairiomis riebalų acilo grandinėmis 1, 26, 27, tai rodo, kad buvo pasamdyta akiltransferazė, pasižyminti dideliu substrato patrauklumu. Pau6 buvo apibūdintas kaip 7′- O- acetiltransferazė tiek in vivo , tiek in vitro , o jo lankstumas skirtingų riebalų acil-CoA atžvilgiu buvo parodytas susidarius 4 ir 7 in vitro , kai buvo izobutilo-CoA arba acetil-CoA. naudojamas kaip substratas.

Kitai aciltransferazei, „Pau24“, buvo pasiūlyta katalizuoti acetilinimą esant 13-OH, remiantis 8, 9 ir 10 kaupimu CIM3016. Neabejotina, kad 13- O- acetilinimo etapas vyksta prieš susidarant 1 junginiui, tačiau tikslaus jo laiko šiame etape neįmanoma nustatyti. 8, 9 ir 10 junginiuose pastebėtas 13- O- pauloilo fragmentas gali būti paverčiamas jų 11- O- Paulilo homologais savaiminio transesterifikacijos metu fermentacijos metu (papildomas S15 pav.), Kuris panašiai pastebėtas ir daugeliu kitų atvejų 28, 29., 30 . Kaip alternatyva, 8, 9 ir 10 13- O- pauloilą gali sudaryti pauloilą pernešantis fermentas, kuris prideda pauloilo grupę prie 13- O -acetilinamų substratų 11-OH, bet teikia pirmenybę 13-OH, kai 13-de- O -acetiliuoti tarpiniai produktai kaupiami CIM3016. Kadangi 13- O- pauloilinti PAU niekada anksčiau nebuvo išskirti, buvo patikrintas 8, 9 ir 10 antibakterinis aktyvumas, todėl nebuvo slopinamas tirtų gramteigiamų bakterijų kiekis, rodantis, kad 13- O- acetilas arba pauloilo grupės padėtis yra svarbus PAU biologiniam aktyvumui.

Remiantis šiais rezultatais, mes siūlome, kad „Pau24“ katalizuotų 13- O- acetilinimo etapą prieš formuojant 1. Tada 1 junginys stereospecifiškai redukuojamas, norint gauti 2 nauju AKR Pau7. Galiausiai Pau6 prijungia skirtingas riebalų rūgštis prie 2'-paulomikozės 7'-OH 7'-OH, kad gautų įvairius PAU analogus (4 pav.).

Image

Pau24 yra atsakingas už 13-OH acetilinimą; Pau7 katalizuoja stereospecifinį paulomikozės 7′-keto redukciją į ( S ) -7′-OH; vėliau Pau6 papuošia 7′-OH įvairiomis riebalų acilo grandinėmis, kad gautų įvairius PAU.

Visas dydis

Metodai

Bakterijų padermės ir plazmidės

Šiame tyrime naudojamos bakterijų padermės ir plazmidės išvardytos S1 lentelėje.

Manipuliavimas DNR ir sekų analizė

Bendrosios DNR manipuliacijos buvo atliktos, kaip aprašyta 31 punkte . Pagal gamintojo nurodymus PGR buvo atlikti Taq DNR polimeraze (TransGene, Pekinas, Kinija) arba KOD-Plus DNR polimeraze (Toyobo, Osaka, Japonija). Visi šiame tyrime naudojami PGR pradmenys yra išvardyti S2 lentelėje. Streptomyces genominės DNR išskyrimas buvo atliktas pagal standartinę procedūrą 32 . Streptomyces ir E. coli transformacija - Streptomyces konjugacija buvo atlikta pagal standartinius protokolus 32 . DNR seka buvo atliekama Majorbio mieste (Šanchajus, Kinija). Baltymų funkcijoms numatyti buvo naudojama BLASTP paieška (//blast.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Buvo atlikti keli suderinimai su CLUSTALW.

∆ Pau6 mutanto CIM3015 konstravimas

Pau6 geno inaktyvuotas mutantas buvo sukonstruotas pakeičiant tikslinį geną apramicinui atspariu genų kasete ( aac (3) IV ), naudojant dvigubo kryžminio junginio rekombinaciją (papildomas S9 pav.). Norėdami sukonstruoti pau6 mutantą, du fragmentai, apimantys pau6, buvo amplifikuoti PGR, naudojant pradmenų porą pau4 -S ir pau6 -R 1, 7 kb aukščiau esančiam fragmentui ir pradmenų porą pau6 -S ir pau8 -S 1, 9 kb pasroviui. Tada du fragmentai buvo įterpti į pCIM2004 Bln I ir Mun I vietas atitinkamai per LIC strategiją 33, kad būtų sukurtas pCIM3019. Į plazmidės pCIM3019 įvedimą į S. paulus NRRL 8115 buvo atlikta konjugacija E. coli-Streptomyces . Kaip pageidaujami ∆ Pau6 mutantai buvo pasirinkti ekskonjugantai, pasižymintys atsparumu apramicinui ir neturintys mėlynojo pigmento. ∆ Pau6 mutantų genotipo patvirtinimas buvo atliktas PGR naudojant pradmenis pau6- ES ir pau6- ER, o vienas iš patvirtintų mutantų buvo vadinamas S. paulus CIM3015. (Papildomas S8 pav.).

∆ Pau24 mutanto CIM3016 konstravimas

Pau24 geno ardymo mutantas buvo sukonstruotas pakeičiant tikslinį geną kanamicinui atsparia geno kasete ( aph ) (papildomas S8 pav.). Pau24 1, 2 kb aukščiau esantis framgentas buvo amplifikuotas, naudojant pradmenų porą pau23 -ES ir pau23 -ER. Pab24 1, 3 kb ilgio fragmentas buvo amplifikuotas naudojant pradmenų porą pau24 D-S ir pau25 -ER. Du fragmentai buvo įterpti į atitinkamai pUC119 :: KanR Pst I / Bam HI ir Kpn I / Eco RI vietas, kad būtų gautas pCIM3020. 3, 5 kb mutanto alelis, turintis pau24 fragmentus aukštyn ir žemyn, ir atsparumo kanamicinui kasetė, buvo išpjaustytas Pst I / EcoRI ir įterptas į tas pačias pKC1132 vietas, kad gautų pCIM3021. Tada pCIM3021 plazmidė buvo įvesta į S. paulus NRRL 8115 per konjugaciją E. coli-Streptomyces . Kaip pageidaujami ∆ Pau24 mutantai buvo pasirinkti eksconjugantai, pasižymintys atsparumu kanamicinui ir jautrumui apramicinui . ∆ Pau24 mutantų genotipo patvirtinimas buvo atliktas PGR, naudojant pradmenis pau23 -ES ir pau25 -ER, ir po to atlikus Bam HI skaidymą, o vienas iš patvirtintų mutantų buvo pažymėtas kaip S. paulus CIM3016 (papildomas S8 pav.).

CIM3010, CIM3015 ir CIM3016 papildymas

Norėdami papildyti Δ pau7 mutantą CIM3010 21, 1, 0 kb DNR fragmentas, kuriame yra visas pau7 genas, buvo amplifikuotas iš S. paulus NRRL 8115 genomo, naudojant pradmenų porą pau7- ES / pau7 -ER ir įterptas į „pBluscript II“ Eco RV vietą. SK (+). Patikrinus DNR ištikimybę sekos nustatymu, 1, 0 kb pau7 fragmentas buvo išpjaustytas Nde I / Bam HI ir įterptas į tas pačias pUWL201PW-oriT vietas, kad gautų pCIM3022. PCIM3022 įvedimas į CIM3010 naudojant E. coli-Streptomyces konjugaciją sukūrė pau7 papildytą padermę CIM3017.

Panašiai, 1, 3 kb pau6 fragmentas, buvo PKR klonuotas, naudojant pradmenų porą pau6 -ES / pau6 -ER, sekos nustatymui įterptas į pBluscript II SK (+), atitinkamai išpjautas Nde I / Eco RI, ir įterptas į tas pačias vietas. „pUWL201PW-oriT“ generuoti „pCIM3023“. Δpau6 papildytas štamas CIM3018 buvo gautas įvedant pCIM3023 į CIM3015.

Norėdami papildyti Δpau24 mutantą CIM3016, 1, 3 kb DNR fragmentas, kuriame yra visas pau24 genas, buvo amplifikuotas, naudojant pradmenų porą pau24- ES / pau24 -ER, ir įterptas į „pBluscript II SK“ (+) „ Eco RV“ vietą. Patikrinus DNR ištikimybę, 1, 3 kb pau24 fragmentas buvo išpjaustytas Nde I / EcoRI ir įterptas į tas pačias pSET152- ermE * vietas, kad gautų pCIM3024. Transformavus pCIM3024 į CIM3016, atsirado Δ pau24 papildytas štamas CIM3019.

Pau7 ekspresija ir gryninimas

1, 0 kb pau7 genas, amplifikuotas pradmenų pora pau7 -ES / pau7 -ER, buvo klonuotas į pBluscript II SK (+) ir padalintas į seką. Tada sekos teisingas fragmentas buvo išpjaustytas Nde I / BamHI ir įterptas į tas pačias pET-28a vietas, kad gautų pCIM3025. Pavienis E. coli BL21 (DE3) / pCIM3025 transformatorius buvo pasėjamas į LB (su 100 μg / ml kanamicino) ir auginamas per naktį 37 ° C, 220 aps./min. Vienos nakties kultūra buvo naudojama inokuliuoti LB terpę (su 100 μg / ml kanamicino) praskiedžiant santykiu 1: 100 ir inkubuoti 28 ° C, 220 aps./min., Kol OD 600 pasiekė 0, 6. Po to Pau7 ekspresija buvo indukuota pridedant izopropil- β- tiogalaktozido (IPTG), kai galutinė koncentracija buvo 0, 1 mM, ir kultivuojama 18 ° C, 180 aps./min. Dar 18–20 valandų.

Pau7 buvo išgrynintas naudojant Ni-NTA afiniteto kolonėlę, vadovaujantis pagaminimo instrukcija (Novagen). Visi žingsniai buvo atlikti esant 4 ° C temperatūrai. Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant ir po to pakartotinai suspenduotos lizės buferyje (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolo ir 5% glicerolio, pH 7, 9). Po ultragarso ląstelių nuosėdos buvo pašalintos centrifuguojant (16 000 x g, 30 min.). Supernatantas, kuriame yra His-pažymėti baltymai, buvo perkeltas į Ni-NTA afiniteto kolonėlę, palaipsniui plaunamas skalbimo buferiu (lizės buferiu su 60 mM imidazolu) ir eliuvimo buferiu (lizės buferiu su 250 mM imidazoliu). Išgryninti baltymai buvo pašalinti ir koncentruojami ultracentrifugavimo būdu ir laikomi –80 ° C temperatūroje 100 mM HEPES buferyje (pH 7, 5) su 500 mM NaCl ir 20% glicerolio. Visos baltymų koncentracijos šiame tyrime buvo matuojamos Bradfordo metodu.

Pau6 ekspresija ir gryninimas

Genai pau6 buvo amplifikuoti iš S. paulus NRRL8115 genomo, naudojant pradmenų porą pau6 -ES / pau6 -ER, ir buvo klonuoti į pBluscript II SK (+) sekos nustatymui. Tada sekos teisingas fragmentas buvo išpjaustytas Nde I / EcoRI ir įterptas į tas pačias pPWW50-Gen Poly vietas, kad gautų pCIM3026. DNR fragmentas, turintis oriT, kuris buvo amplifikuotas pradiniu poru oriT -F / oriT -R ir įterptas į pCIM3026 Kpn I vietą per LIC strategiją, siekiant generuoti pCIM3027. Į S. lividans TK24 buvo įvesta plazmidė pCIM3027, kad būtų gautas norimas Pau6 heterologinis ekspresijos štamas CIM3020. CIM3020 buvo inkubuotas YEME terpėje (su 12, 5 μg / ml tiostreptono) 3 dienas, o ląstelės buvo surinktos centrifuguojant ir vėl suspenduotos lizės buferyje. Pau6 buvo išgrynintas Ni-NTA afiniteto kolonoje laikantis tos pačios tvarkos, kaip ir gryninant Pau7, ir iki naudojimo laikytas -80 o C temperatūroje 100 mM Tris-HCl buferiniame tirpale (pH 7, 5) su 20% glicerolio.

Fermentiniai Pau7 tyrimai

Pau7 tyrimai buvo atlikti 50 μl mišinyje, kuriame yra 100 mM HEPES buferio (pH 7, 5), 500 mM NaCl, 2 mM NADPH, 0, 2 mM 1 ir 6 μM Pau7 28 ° C temperatūroje 30 min. Reakcija buvo užgesinta trimis tūriais acetono. Temperatūros optimizavimas Pau7 tyrimui in vitro atliktas 25 μL reakcijos mišinyje, kuriame yra 500 mM NaCl, 2 mM NADPH, 80 μM 1 ir 2 μM Pau7 100 mM HEPES buferiniame tirpale (pH 7, 0) 30 min. Pau7 pH vertės optimizavimas buvo atliekamas 28 ° C temperatūroje, esant buferiams, kurių pH svyruoja nuo 6, 0 iki 8, 0 (50 mM fosfato buferis, kai pH 6, 0–7, 0, ir 100 mM HEPES buferis, kai pH 7, 0–8, 0) 30 minučių; kiekviename 25 μl reakcijos mišinyje buvo 500 mM NaCl, 2 mM NADPH, 40 μM 1 ir 2 μM Pau7. Kinetinių parametrų nustatymas 1 buvo atliktas prisotintu NADPH (4 mM). 1 junginys buvo nustatytas kaip kintamas substratas, kurio koncentracijos buvo 0, 02, 0, 04, 0, 09, 0, 18, 0, 36, 0, 72, 1, 4 ir 2, 8 mM. Fermento tyrimas buvo atliktas HEPES buferiu (100 mM, pH 7, 5), kuriame yra 500 mM NaCl ir 2 μM Pau7, esant 28 ° C temperatūrai 2, 5 min., Trimis egzemplioriais.

Fermentiniai Pau6 tyrimai

Pau6 tyrimai buvo atlikti 50 μl mišinyje, kuriame yra 100 mM Tris-HCl buferio (pH 7, 5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolio, 500 mM NaCl, 2 mM izobutil-CoA arba acetil-CoA, 80 μ M 2. ir 2 μM Pau6 28 ° C temperatūroje 30 min. „Pau7“ ir „Pau6“ jungtiniai tyrimai buvo atlikti taip: Bendroji „Pau7“ reakcija buvo užgesinta ir ekstrahuota 3 tūriu etilo acetato, išdžiovinta vakuume , po to vėl ištirpinta ir naudojama kaip substratas „Pau6 “ in vitro tyrimams.

Paulomicinų gamyba

Paulomicinų gamybai 50 μl S. paulus NRRL 8115 sporų ir mutantinių padermių buvo pasėjamos į GS-7 terpę 34 ir 2 dienas auginamos 28 ° C temperatūroje. Gauta sėklų kultūra buvo pasėjama į 50 ml terpės R5α 35 santykiu 2% (tūris / tūris) ir kultivuojama 4 dienas. Fermentacijos sultinys buvo surinktas centrifuguojant ir tris kartus ekstrahuotas 50 ml etilo acetato. Išdžiovinus vakuume , jis ištirpinamas 1 ml acetonitrilo ir tiriamas HPLC.

8, 9 ir 10 junginių išskyrimas

Iš 30 L R5α kultūros sultinio CIM3016 supernatantas buvo surinktas ir tris kartus ekstrahuotas 30 I etilo acetatu. Koncentruota vakuume , ji ištirpinama nedideliame kiekyje etilo acetato ir plėtojama chromatografija silikagelio kolonėlėje, palaipsniui išplaunant 500 ml petroleterio, 1000 ml etilo acetato, 1000 ml 50% etilo acetato / metanolio ir 500 ml metanolio. Etilacetato frakcija, turinti 8, 9 ir 10 junginius, buvo sukoncentruota vakuume. Ištirpinus nedideliame kiekyje acetonitrilo, 8, 9 ir 10 junginiai buvo toliau išgryninti pusiau paruošiamajame HPLC (Zorbax SB-C18, 5 μm , 9, 4 × 250 mm, Agilent, Santa Clara, CA, JAV), išplaunami acetonitrilu. : vanduo (40:60), srautas 2 ml / min. 8, 9 ir 10 junginiai išplaunami atitinkamai per 9, 2 min., 11, 1 min. Ir 6, 3 min. Galiausiai buvo gauta 3, 0 mg 8, 2, 0 mg 9 ir 1, 2 mg 10.

4 ir 6 junginių išskyrimas

4 ir 6 junginiai buvo išskirti iš 30 l auginimo sultinio S. paulus NRRL8115 tokiu pačiu būdu, kaip ir 8, 9 ir 10 junginiai. Supernatantas buvo ekstrahuotas 30 1 etilo acetatu tris kartus. Koncentruoti vakuume ir ištirpinti nedideliame kiekyje etilo acetato, jis buvo užpiltas chromatografijos metodu silikagelyje ir ištirpintas 500 ml petroleterio, 1000 ml etilo acetato, 1000 ml 50% etilo acetato / metanolio ir 500 ml metanolio. Tada etilo acetato frakcija, turinti 4 ir 6 junginius, buvo sukoncentruota ir toliau išgryninta pusiau paruošiamajame HPLC (Zorbax SB-C18, 5 μm, 9, 4 × 250 mm, Agilent, Santa Clara, CA, JAV), naudojant tą pačią programą kaip ir junginiams. 8, 9 ir 10. 4 ir 6 junginiai išplaunami atitinkamai per 7, 8 min ir 6, 7 min. Pagaliau buvo gauta 3, 0 mg 4 ir 4, 0 mg 6.

Antibakteriniai tyrimai

Antibakterinis aktyvumas buvo nustatytas agaro skiedimo metodu, aprašytu metodu, aprašytu 2, 36 . Kaip ištirtos bakterijos buvo naudojamos Staphylococcus pneumonija, Staphylococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus ir Bacillus subtilis . Po inkubacijos 24 valandas 37 ° C temperatūroje, buvo apskaičiuoti MIC (S3 lentelė).

Spektroskopinė analizė

HPLC analizė buvo atlikta naudojant „Apollo C18“ kolonėlę (5 μm , 4, 6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, JAV), naudojant Shimadzu HPLC sistemą (Shimadzu, Kiotas, Japonija). Trumpai tariant, kolonėlė buvo sukurta tirpalu A (vandeniu su 0, 1% trifluoracto rūgšties) ir acetonitrilu, srauto greitis 0, 8 ml / min. Acetonitrilo procentinė dalis buvo pakeista naudojant tokį gradientą: 0–5 min., 10%; 5–25 min., 10–90 proc .; 25–30 min., 90–100 proc .; 30–35 min., 100%. Aptikimo bangos ilgis buvo 320 nm. LC-MS analizė buvo atlikta Agilent 1260/6460 trigubo kvadrupolio LC / MS sistemoje (Santa Clara, CA, JAV) su elektropurškimo jonizacijos šaltiniu. HR-ESI-MS buvo atlikta Agilent 1260 HPLC / 6520 QTOF-MS instrumentu (Santa Clara, CA, JAV). BMR spektrai buvo užregistruoti kambario temperatūroje naudojant Bruker-500 BMR spektrometrą (Billerica, MA, JAV).

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Li, J. et al. Oktozės ketoreduktazės ir dviejų aciltransferazių dalyvavimas paulomicinų biosintezėje. Mokslas. Rep. 6, 21180; „doi“: 10.1038 / srep21180 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.