Autofagijos dalyvavimas priešuždegiminiame folilų metilo-β-ciklodekstrino aktyvume | mokslinės ataskaitos

Autofagijos dalyvavimas priešuždegiminiame folilų metilo-β-ciklodekstrino aktyvume | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vėžio imunoterapija
  • Chemoterapija
  • Vaistų kūrimas
  • Tikslinė terapija

Anotacija

Autofagija, pagrindinis lizosominių ląstelių, įskaitant organelius, perdirbimo būdas, tampa pagrindiniu procesu, reguliuojančiu navikogenezę ir vėžio terapiją. Neseniai mes susintetinome metil-β-ciklodekstriną (FA-M-β-CyD), kuriame yra folio rūgšties, ir pademonstravome FA-M-β-CyD kaip naujo priešnavikinio vaisto galimybes. Šiame tyrime mes ištyrėme, ar FA-M-β-CyD priešvėžinis aktyvumas folio receptorių α (FR-α) pozityviose naviko ląstelėse yra susijęs su autofagija. Priešingai nei metil-β-ciklodekstrinas (M-β-CyD), per CLIC / GEEC endocitozę FA-M-β-CyD pateko į KB ląsteles (FR-α (+)). Po gydymo FA-M-β-CyD KB ląstelėse reikšmingo DNR kiekio sumažėjimo nepastebėta. Be to, drastiškai padidėjo mitochondrijų transmembraninis potencialas po gydymo FA-M-β-CyD. Tuo tarpu FA-M-β-CyD sukėlė KB ląstelėse autofaginių vakuolių, kurie buvo iš dalies colocalized su mitochondrijomis, susidarymą. Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad FR-α-ekspresuojantis ląstelėms selektyvus citotoksinis FA-M-β-CyD aktyvumas galėtų būti tarpininkaujamas autofagijos reguliavime, o ne apoptozės sukėlime.

Įvadas

Vėžio chemoterapijoje, siekiant kuo didesnio priešvėžinių vaistų gydymo efektyvumo, ypač svarbi yra vaistų teikimo technika. Norint suteikti aktyvų tikslinimą, žinomas cheminis naviko specifinių ligandų modifikavimas vaisto nešikliui. Iš įvairių navikui būdingų ligandų, folio rūgštis (FA) 1, 2, 3, 4, 5 atsirado kaip puikus taikinio ligandas, galintis stipriai sąveikauti su vėžio ląstelėmis, turinčiomis didelį afinitetą aflato receptorių (FR) atžvilgiu ( Kd : 10). –9 ~ 10 –10 M) 6, 7 . FR įtraukia ląstelės paviršių per glikozilfosfatidilinozitolio inkarą ir yra labai ekspresuojamas įvairiose naviko ląstelėse, įskaitant smegenų, kiaušidžių, krūties, inksto ir plaučių piktybinius navikus, ir normaliuose audiniuose yra nereikšmingas. Be to, progresuojant vėžiui, FR išraiškos lygis pastebimai padidėja 9 . Todėl FR yra vienas galingų kandidatų ne tik kaip perspektyvus žymeklis, bet ir kaip tikslinis baltymas vėžio terapijai.

Ciklodekstrinai (CyDs) yra cikliniai oligosacharidai, sudarantys inkliuzinius kompleksus su plačiu hidrofobinių molekulių diapazonu, ir yra plačiai naudojami farmaciniame regione 10, 11 . Buvo pranešta, kad CyD sąveikauja su cholesterolio ir fosfolipidų ląstelių membranų komponentais, todėl didelėse 12, 13, 14 CyD koncentracijose atsiranda raudonųjų kraujo kūnelių hemolizė . Be to, metil-β-ciklodekstrinas (M-β-CyD) dažnai naudojamas ardyti lipidų plaustus, nes jis gali sumažinti cholesterolio atsargas ląstelių membranose 15 . Keletas tyrimų taip pat parodė, kad M-β-CyD pažeidžia lipidų plaustus gali pakenkti vėžio ląstelėms ir sukelti ląstelių mirtį. Pažymėtina, kad Grosse ir kt . atskleidė, kad M-β-CyD reikšmingai sumažino navikų auglių auglį turinčiose pelėse po pilvaplėvės skyrimo 16 . Tačiau citotoksinei M-β-CyD reakcijai trūksta naviko ląstelių selektyvumo.

Neseniai, norėdami bandyti su naviku specifinę citotoksinę reakciją į M-β-CyD, anksčiau paruošėme FA konjuguotą M-β-CyD (FA-M-β-CyD) 17 ir įvertinome jo priešnavikinį aktyvumą 18. . FA-M-β-CyD, palyginti su M-β-CyD, KB ląstelėse pasižymėjo dideliu priešnavikiniu aktyvumu, labai ekspresuojančiu α folatų receptorių (FR-α). Vienkartinis į veną sušvirkštas FA-M-β-CyD reikšmingai slopino naviko augimą Colon-26 ląstelėse (FR-α (+)) turinčiose pelėse. Be to, priešvėžinis FA-M-β-CyD aktyvumas buvo didesnis nei doksorubicino, sušvirkštus į veną, naudojant tą pačią dozę. Šie rezultatai rodo, kad FA-M-β-CyD gali būti perspektyvus priešvėžinis agentas. Tačiau FA-M-β-CyD priešnavikinio aktyvumo mechanizmas vis dar neaiškus.

Autofagija, pagrindinis lizosominių ląstelių, įskaitant organelius, perdirbimo būdas, yra pagrindinis procesas, reguliuojantis navikogenezę ir vėžio terapiją 19, 20, 21, 22, 23 . Dinaminis autofagijos vaidmuo vėžyje yra slopinantis naviką ankstyvose vėžio vystymosi stadijose, tačiau yra nustatytų navikų augimo poveikis. Panašiai, autofagijos stimuliavimas reaguojant į terapinius vaistus, gali iš esmės skatinti arba susilpninti cheminį atsparumą ir priešnavikinį imunitetą. Todėl supratimas, ar ir kaip autofagija gali būti panaudota norint sunaikinti vėžio ląsteles, yra būtinas vėžio chemoterapijai. Šiame tyrime mes ištyrėme, ar FA-M-β-CyD priešnavikinis aktyvumas FR-α (+) ląstelėse yra susijęs su autofagija. Dėl to nustatyta, kad FA-M-β-CyD sukelia autofagosomų susidarymą FR-α (+) ląstelėse, parodydamas autofagijos dalyvavimą priešnavikiniame aktyvume. Atsižvelgiant į mūsų ankstesnius rezultatus, kad FA-M-β-CyD drastiškai slopino naviko augimą pelėms, pasėdėtoms FR-α (+) naviko ląstelėms 18, FA-M-β-CyD gali būti naudojamas kaip naujas priešvėžinis vaistas per reguliuojanti autofagiją vėžio chemoterapijai prieš FR-α per daug ekspresuojantį naviką.

Rezultatai

Priešnavikinis FA-M-β-CyD poveikis

Norėdami išaiškinti priešnavikinį FA-M-β-CyD poveikį FR-α (+) ląstelėse, ištyrėme priešnavikinį FA-M-β-CyD poveikį FR-α (+) ir FR-α (-) ląstelėse. FA-M-β-CyD turėjo didelį priešnavikinį poveikį FR-α (+) ląstelėse, tokiose kaip KB ir M213 ląstelėse, palyginti su kontrole, po gydymo 2 valandas (1A pav., B). Tačiau nebuvo reikšmingo priešnavikinio aktyvumo FR-α-neigiamose A549 ląstelėse (1 pav. C). Šie rezultatai rodo, kad FA-M-β-CyD turėjo FR-α (+) ląstelių selektyvų priešnavikinį poveikį.

Image

(A) KB ląstelės, (B) M213 ląstelės ir (C) A549 ląstelės. FA-M-β-CyD koncentracija buvo 10 mM. Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 3–4 kiekvienoje grupėje). * p <0, 05 palyginti su kontrole.

Visas dydis

FA-M-β-CyD ląstelių asociacija ir tarpląstelinis pasiskirstymas

Anksčiau mes pranešėme, kad FA-M-β-CyD turi FR-α (+) ląstelių specifinį priešnavikinį poveikį 18 . Norėdami gauti išsamią informaciją apie FR-α-tarpininkaujamo priešvėžinio FA-M-β-CyD poveikio mechanizmą, ištyrėme, ar TRITC-FA-M-β-CyD yra susijęs su KB ląstelėmis (2 pav.). Nepaprastai stebėtina, kad TRITC-FA-M-β-CyD yra labai susijęs su KB ląstelėmis (2A pav.), Nepaisant to, kad CyD yra žinomi kaip nepralaidūs biomembranai. Be to, pridedant FA kaip FR konkurentą, TRITC-FA-M-β-CyD asociacija buvo slopinama (2A pav.). Panašūs rezultatai buvo pastebėti M213 ląstelėse (2 pav. B). Be to, ląstelių asociacija FA-M-β-CyD buvo žymiai sumažinta FR-α žemyn reguliuojamose KB ląstelėse, palyginti su KB ląstelėmis (2 pav. C). Šie duomenys rodo, kad FA-M-β-CyD gali būti susijęs su ląstelėmis per FR-α.

Image

(A) KB ląstelės, (B) M213 ląstelės ir (C) FR-α smūgio ląstelės. Iš TRITC gautas fluorescencijos intensyvumas srauto citometru buvo nustatytas praėjus 1 valandai po inkubacijos 37 ° C temperatūroje.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme TRITC-FA-M-β-CyD pasiskirstymą ląstelėse KB ląstelėse po 1 val. (3 pav.). Reikia pažymėti, kad ląstelėse buvo pastebėtas TRITC-FA-M-β-CyD įsisavinimas KB ląstelėse. Be to, po 1 val. TRITC-FA-M-β-CyD daugiausia lokalizuota citoplazmoje, o ne branduolyje. Visi šie rezultatai rodo, kad FA-M-β-CyD pasiskirstė citoplazmoje po ląstelių įsisavinimo į KB ląsteles ir suteikė stiprų priešvėžinį poveikį.

Image

KB ląstelės buvo valomos TRITC-FA-M-β-CyD (10 μM) 1 valandą.

Visas dydis

FA-M-β-CyD sukėlė citotoksinį aktyvumą per apoptozę nepriklausomu keliu

Norėdami ištirti, ar FA-M-β-CyD sukelia apoptozę, ar ne, mes ištyrėme DNR kiekį branduolyje, transmembraninį potencialą mitochondrijose, TUNEL testą ir kaspazės 3 skilimo tyrimą KB ląstelėse. Čia mes panaudojome 2, 6-di- O -metil-β-CyD (DM-β-CyD) kaip teigiamą apoptozės induktoriaus kontrolę, nes anksčiau mes parodėme, kad DM-β-CyD sukėlė apoptozę slopindamas PI3K. - Aktyvusis aktyvumas, ekstrahuojant cholesterolį iš plazmos membranų NR8383 ląstelėse 24 . DNR kiekis KB ląstelėse po gydymo 10 mM DM-β-CyD 2 val. Buvo žymiai sumažėjęs, palyginti su kontroliniu (4A pav.). Tuo tarpu KB ląstelėse nebuvo pastebimas reikšmingas DNR kiekio sumažėjimas 10 mM FA-M-β-CyD (4A pav.).

Image

DNR kiekis (A) ir mitochondrijų transmembraninis potencialas (B) po gydymo FA-M-β-CyD. KB ląstelės buvo apdorotos FA-M-β-CyD (10 mM) 2 valandas. Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 3–4 kiekvienoje grupėje). * p <0, 05 palyginti su kontrole. † p <0, 05 palyginti su KB ląstelėmis, negydant FA. (C) TUNEL tyrimas po apdorojimo FA ląstelių FA-M-β-CyD. (D) Išvalytas kaspazės 3 tyrimas po apdorojimo FA-M-β-CyD KB ląstelėse. Buvo nurodytos apkarpytos dėmės. (E) Suskaidytos kaspazės 3 / pro-kaspazės 3 santykio juostos intensyvumas. Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 3 kiekvienoje grupėje). * p <0, 05 palyginti su kontrole.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme CyD poveikį transmembraniniam potencialui mitochondrijose, naudojant rodaminą 123 KB ląstelėse (4 pav. B). Transmembraninis potencialas KB ląstelių, gydytų DM-β-CyD, mitochondrijose, palyginti su kontrole, drastiškai sumažėjo. Ryškiai priešingai, KB ląstelių, gydomų FA-M-β-CyD, potencialas buvo drastiškai padidėjęs. Be to, šis potencialo padidėjimas, pridedant FA-M-β-CyD, buvo sumažintas iki kontrolės lygio esant FA, FR konkurentui (4 pav. B).

Toliau atlikome TUNEL tyrimą. Kaip parodyta fig. 4C, KB ląstelės, apdorotos DM-β-CyD, buvo nudažytos, palyginti su kontrole, ir tai rodo apoptozės indukciją. Tuo tarpu ląstelės, apdorotos FA-M-β-CyD, nebuvo dažytos.

Be to, atliekant suskaidytą kaspazės 3 analizę (4D, 4E pav.), DM-β-CyD galimai pagamino aktyvuotą kaspazę 3, skaidydamas pro kaspazę 3, ir tai rodo apoptozės indukciją. Tačiau FA-M-β-CyD parodė tik nedidelį pro-kaspazės 3 skaidymo aktyvumą. Bendrai šie duomenys rodo, kad FA-M-β-CyD sukelta ląstelių žūtis nepriklausė nuo apoptozės.

Autofagijos dalyvavimas ląstelių žūtyje, kurią sukelia FA-M-β-CyD

Autofagija yra normalus fiziologinis procesas organizme, kurio metu naikinamos organizmo ląstelės, ir tam tikromis sąlygomis ląstelės gali būti sunaikintos. Yra keletas pranešimų apie autofagijos ar autofaginės ląstelių mirties suaktyvėjimą vėžio ląstelėse po gydymo įvairiais priešvėžiniais vaistais 25 . Toliau mes ištyrėme, ar autofagosomų susidarymas KB ląstelėse yra susijęs su FA-M-β-CyD, naudojant „Cyto-ID® Autofhagy Detection Kit“, kuris aptinka autofagines vakuumas ląstelėse. Kaip parodyta 5A ir 5B pav., Autofaginiai vakuoliai KB ląstelėse buvo pastebėti po gydymo FA-M-β-CyD 2 val. Be to, autofaginių vakuolių, suaktyvėjusių gydymu FA-M-β-CyD, apimtys sumažėjo iš anksto apdorojant LY294002, autofagijos inhibitorių. Šie rezultatai rodo, kad FA-M-β-CyD sukėlė autofaginių vakuolių susidarymą KB ląstelėse.

Image

(A, B) FA-M-β-CyD poveikis autofagosomų formavimuisi KB ląstelėse. (C, D) FA-M-β-CyD poveikis baltymų agregacijos klirensui per autofagiją. (E) Chlorokino, bafilomicino A1, 3-MA ir LY294002 poveikis priešnavikiniam FA-M-β-CyD aktyvumui KB ląstelėms. Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM (n = 3–6 vienai grupei). * p <0, 05 palyginti su kontrole. p <0, 05, palyginti su FA-M-β-CyD be inhibitoriaus.

Visas dydis

Toliau mes atlikome autofagijos tyrimą naudodami „Premo ™ Autofhagy Jutikliai“ rinkinį, kuris gali stebėti baltymų agregatų klirensą per autofagiją, naudodamas GFP pažymėtą p62 pav. 5C ir 5D. Čia p62 baltymas gali jungtis ir su ubikvitinu 26, ir su LC327, tokiu būdu palengvinant ubiquitinuotų baltymų pašalinimą per autofagiją. GFP-p62 fluorescencija kontrolėje drastiškai sumažėjo pridedant FA-M-β-CyD. Tuo tarpu M-β-CyD neparodė reikšmingų GFP-p62 fluorescencijos pokyčių, palyginti su kontrole. Šie rezultatai leidžia manyti, kad sukauptos autofagosomos KB ląstelėse buvo skaidomos FA-M-β-CyD per autofagiją.

Toliau mes ištyrėme autofagijos inhibitorių, tokių kaip chlorokinas, bafilomicinas A1, 3-metiladeninas (3-MA) ​​ir LY294002, poveikį KB ląstelių gyvybingumui po gydymo FA-M-β-CyD. Čia chlorokinas ir bafilomicinas A1 apsaugo nuo endosomų rūgštėjimo, o tai slopina autofagosomos susiliejimą su lizosomomis ir lizosomų baltymų skilimą. 3-MA ir LY294002 buvo naudojami kaip PI3K inhibitoriai. Kaip parodyta 5E pav., KB ląstelių, gydomų FA-M-β-CyD, ląstelių gyvybingumas esant autofagijos inhibitoriams buvo didesnis nei vien naudojant FA-M-β-CyD. Visi šie duomenys rodo, kad FA-M-β-CyD gali sukelti autofaginę ląstelių mirtį.

Disfunkcines mitochondrijas ląstelėse atpažįsta ir skaido tiek neselektyvioji autofagija, tiek mitofagija - selektyvioji autofagijos rūšis 28, 29 . Kaip parodyta 4B pav., Mes nustatėme, kad FA-M-β-CyD žymiai padidino mitochondrijų membranos potencialą KB ląstelėse, nurodydamas mitochondrijų streso indukciją. Todėl mes ištyrėme mitofagijos dalyvavimą ląstelių žūtyje, kurią sukėlė mitochondrijų stresas po gydymo FA-M-β-CyD (6 pav.). Autofaginės vakuolės ir mitochondrijos, nudažytos atitinkamai „Cyto-ID® Autofhagy Detection Kit“ ir rodaminu 123, iš dalies buvo colocalized KB ląstelėse po apdorojimo FA-M-β-CyD (6 pav. A). Panašūs rezultatai buvo gauti M213 ląstelėse (6 pav. B). Todėl šie rezultatai leidžia manyti, kad FA-M-β-CyD sukelta autofaginė ląstelių mirtis gali būti siejama su mitofagija, kurią sukelia mitochondrijų stresas.

Image

(A) KB ląstelės ir (B) M213 ląstelės 2 valandas buvo apdorojamos FA-M-β-CyD, tada ląstelės buvo apdorotos Cyto-ID ™ ir rodaminu 123, kad būtų nudažytos atitinkamai autofagosomos ir mitochondrijos.

Visas dydis

Diskusija

Priešvėžinių agentų nukreipimas į spektrą vaidina svarbų vaidmenį ne tik užtikrinant stiprų priešnavikinį aktyvumą, bet ir sumažinant šalutinių reiškinių riziką chemoterapijoje su vėžiu. Anksčiau mes parodėme, kad FA-M-β-CyD turėjo FR-α (+) ląstelių selektyvų priešnavikinį poveikį 17 . Be to, mes atskleidėme, kad, esant FA, priešuždegiminis FA-M-β-CyD poveikis buvo žymiai slopinamas, tai rodo, kad FR tarpininkaujama endocitozė yra nepaprastai svarbi norint sustiprinti priešnavikinį poveikį FA-M-β-CyD 18 . Apskritai manoma, kad CyD įsisavinimas ląstelėse yra nereikšmingas turbūt dėl ​​jų hidrofiliškumo ir didelės molekulinės masės, FA-M-β-CyD iš tikrųjų buvo įtrauktas į KB ląsteles (3 pav.). Tuo tarpu buvo manoma, kad FR endocitizuojamas per nuo klarino nepriklausomus nešiklius / GPI įtvirtintus baltymus, praturtintus ankstyvuoju endosominiu skyriumi (CLIC / GEEC) 30 . Todėl, atpažinus FR-α, FA-M-β-CyD galėtų patekti į ląsteles per CLIC / GEEC. Tiesą sakant, FA-M-β-CyD yra labai susijęs su KB ląstelėmis, o ne su FR-α-numušimo KB ląstelėmis (2 pav. C), nurodant, kad FA-M-β-CyD gali būti kaip FR-α (+) ląstelių selektyvusis priešvėžinis vaistas.

Neseniai buvo atrastas alternatyvus ląstelių mirties kontrolės būdas ir nauji vaistai, sukeliantys vėžio ląstelių nykimą 31 . Tarp ląstelių mirties mechanizmų apoptozė vaidina lemiamą vaidmenį ląstelių išgyvenime ir auglių augime. M-β-CyD dažnai naudojamas siekiant sumažinti lipidų plaustus dėl cholesterolio ekstrahavimo iš plazmos membranų 15, 32 . Daugybė tyrimų atskleidė, kad M-β-CyD gali pakenkti vėžio ląstelėms dėl lipidų plausto pažeidimo. Pavyzdžiui, cholesterolio lygio sumažėjimas dėl M-β-CyD išprovokavo žmogaus epidermoidinės karcinomos ląstelių apoptozę 33 . Be to, mes anksčiau pranešėme, kad DM-β-CyD sukėlė apoptozę, nes sumažėjo PI3K-Akt aktyvumas, alveoliniuose makrofaguose pasišalindamas cholesterolį iš lipidų plaustų 24 . Mes taip pat patikrinome, ar DM-β-CyD aprūpina apoptozę KB ląstelėse dėl cholesterolio trūkumo (4 pav.). Be to, M-β-CyD taip pat sukėlė apoptozę KB ląstelėse dėl cholesterolio ekstrahavimo, dėl kurio sumažėja DNR kiekis branduolyje ir transmembraninis potencialas mitochondrijose 34 . Įdomu tai, kad FA-M-β-CyD reikšmingai išleido cholesterolį iš KB ląstelių (FR-α (+)) ir A549 ląstelių (FR-α (-)) į auginimo terpę, palyginti su M-β-CyD ir DM. -β-CyD ankstesniame mūsų tyrime 18 . Tačiau FA-M-β-CyD parodė stiprų citotoksinį aktyvumą nemažinant DNR kiekio branduolyje ir transmembraninio potencialo mitochondrijose (4 pav.), Kas rodo, kad ląstelių žūties mechanizmas FA-M-β-CyD sistemoje gali būti skirtingas. nuo apoptozės. Apskritai, FA modifikacija į M-β-CyD drastiškai pakeitė ląstelių žūties mechanizmą, greičiausiai dėl patekimo į FR-α per daug ekspresuojančias ląsteles, kurias sukėlė CLIC / GEEC endocitozė.

Svarbiausia, mes atskleidėme, kad autofagija gali sukelti ląstelių žūtį, kurią sukelia FA-M-β-CyD, FR-α ekspresuojančiose ląstelėse, tokiose kaip KB ląstelės. T. y., FA-M-β-CyD padidino autofagosomų žymens LC3-II raišką autofaginėse membranose KB ląstelėse (5A pav.). Pastaruoju metu manoma, kad autofagija yra pagrindinis procesas, reguliuojantis navikogenezę ir vėžio terapiją. Ankstyvame naviko vystymosi etape autofagija veikia kaip naviko slopiklis. Tuo tarpu pažengusioje naviko vystymosi stadijoje autofagija skatina naviko progresavimą. Naviko ląstelės, esančios centrinėje naviko masės srityje, patiria autofagiją, kad galėtų išgyventi esant mažai deguonies ir mažai maistinių medžiagų. Autofagija apsaugo kai kurias vėžio ląsteles nuo vėžio gydymo, blokuodama apoptozės kelią („apsauginė autofagija“). Šiame tyrime nustatyta, kad FA-M-β-CyD sukelia autofagosomų susidarymą FR-α-teigiamose ląstelėse, ir tai rodo autofagijos dalyvavimą priešnavikiniame veikime. Atsižvelgiant į mūsų ankstesnius rezultatus, kad FA-M-β-CyD drastiškai slopino naviko augimą pelėms, pasėdėtoms FR-α (+) naviko ląstelėms 18, FA-M-β-CyD gali būti naudojamas kaip naujas priešvėžinis vaistas per reguliuojanti autofagiją vėžio chemoterapijai prieš FR-α per daug ekspresuojantį naviką. Tačiau vis dar neaišku, ar FA-M-β-CyD skatina moformo fosforilinimą ir inaktyvaciją, sukeliantį autofagiją, ir aktyvuoja III klasės PI3K, kuris susijęs su autofagosomų formavimu. Todėl reikalingi tolesni ne tik FA-M-β-CyD sukelto autofagijos mechanizmo tyrimai, bet ir endocitozės kelio įnašas į ląstelės mirties mechanizmą.

Mitochondrijų pralaidumo porų (mPTP) suaktyvinimas yra susijęs su mitochondrijų depolizavimu, oksidacinio defosforilinimo atjungimu, mitochondrijų patinimu ir mirtį skatinančių veiksnių, tokių kaip citochromas c 35, išsiskyrimu. Neseniai Ziolkowski ir kt . parodė, kad M-β-CyD mažina žiurkių kepenų mitochondrijų funkciją ir slopina kalcio chlorido sukeltą patinimą 36 . Šiame tyrime į KB ląsteles internalizuotos FA-M-β-CyD gali sąveikauti su mitochondrijų į plaustą panašiais mikrodomainais, dėl kurių slopinamas mPTP aktyvumas, dėl to gali būti reguliuojamos autofagosomų formavimosi. Vykdomi išsamesni tyrimai dėl FA-M-β-CyD įtakos mitochondrijų funkcijai.

Apibendrinant, šiame tyrime mes atskleidėme autofagijos dalyvavimą FR-α ekspresuojančiame ląstelių selektyviame priešnavikiniame FA-M-β-CyD poveikyje. Šie duomenys suteiks puikios informacijos apie FA-M-β-CyD kaip naują autofagijos induktorių vėžio chemoterapijoje.

Metodai

Medžiagos

RPMI-1640 (be FA) buvo gautas iš GIBCO (Tokijas, Japonija). Tetrametilrodamino izotiocianatas (TRITC) ir FR-α siRNR (sc-39969) buvo atitinkamai nupirkti iš Funakoshi (Tokijas, Japonija) ir „Santa Cruz Biotechnology“ (Delaveras, Kalifornija). „Lipofectamine ™ 2000“ reagentas ir „Premo ™ Autofhagy“ jutikliai buvo gauti iš „Invitrogen“ (Tokijas, Japonija). „Cyto-ID® Autofhagy Detection Kit“ buvo įsigytas iš „Enzo Life Sciences“ (Farmingdale, NY).

Ląstelių kultūra ir in vitro priešnavikinis aktyvumas

KB ląstelės, žmogaus burnos poodinė karcinomos ląstelių linija, A549 ląstelės, žmogaus plaučių karcinoma ir M213 ląstelės, žmogaus cholangiokarcinomos ląstelių linija, buvo auginamos, kaip buvo pranešta anksčiau 17 . Kaip prieš tai pranešta 18, priešnavikinis aktyvumas in vitro buvo atliktas WST-1 metodu. Trumpai tariant, KB ląstelės, M213 ląstelės ir A549 ląstelės (5x104 / 96 šulinėlių mikrotinkleliai) 2 valandas 37 ° C temperatūroje buvo apdorotos 150 μL auginimo terpės, turinčios 10 mM FA-M-β-CyD. Autofagijos slopinimo tyrime KB ląstelės buvo iš anksto apdorotos RPMI-1640 auginimo terpe, kurioje yra 20 μM chlorochino, 1 nM bafilomicino A1, 5 mM 3-metiladenino (3-MA) ​​ir 50 μM LY294002 24 valandas. Po plovimo PBS (pH 7, 4) buvo papildyta 100 μL šviežio HBSS (pH 7, 4). Tada plokštės ir inkubuojamos su WST-1 reagentu 30 min. Sugerties bangos ilgis ir etaloninis bangos ilgis buvo atitinkamai 450 nm ir 630 nm.

FA-M-β-CyD ląstelių asociacija

KB ląstelės ir M213 ląstelės (1x106 / 35 mm lėkštelė) buvo inkubuotos su 1 ml kultūrinės terpės (be FA), turinčios 10 μM tetrametilrodamino izotiocianatą (TRITC) pažymėto FA-M-β-CyD (TRITC-FA- M-β-CyD) 37 ° C temperatūroje 1 val. Po plovimo PBS (pH 7, 4), ląstelės buvo iškasomos su 1 ml PBS (pH 7, 4). Duomenys buvo gauti 1 × 104 ląstelių FACS „Calibur“ srauto citometru, naudojant „CellQuest“ programinę įrangą (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Tarpląstelinis FA-M-β-CyD pasiskirstymas

KB ląstelės (1 × 10 6/35 mm stiklinis dugno indas) buvo apdorotos 10 μM TRITC-FA-M-β-CyD 37 ° C temperatūroje 1 valandą. Hoechst 33342 (10 μg / ml) buvo inkubuotas 37 ° C temperatūroje 10 min. Po plovimo PBS (pH 7, 4) buvo pridėta RPMI-1640 (be FA). TRITC ir Hoechest33342 aptikti buvo naudojamas fluorescencinis mikroskopas Biozero BZ-8000.

DNR kiekis ir mitochondrijų transmembraninis potencialas

DNR kiekis ir transmembraninis potencialas mitochondrijose KB ląstelėse buvo nustatyti taip, kaip anksčiau buvo pranešta 34 . Trumpai tariant, KB ląstelės (1 × 10/35 mm lėkštelė) 2 valandas buvo apdorotos RPMI-1640 (be FA), turinčios 10 mM DM-β-CyD arba FA-M-β-CyD. Propidium jodidas (PI, 20 μg / ml) ir rodaminas 123, atitinkamai DNR kiekio ir transmembraninio potencialo rodikliai mitochondrijose, buvo kiekybiškai įvertinti naudojant FACS „Calibur“ srauto citometrą su „CellQuest“ programine įranga.

TUNEL tyrimas

Apoptozės nustatymas buvo atliktas TUNEL tyrimu. Trumpai tariant, KB ląstelės (1 x 10/35 mm stiklinio dugno indas) buvo inkubuotos su 5 mM DM-β-CyD arba FA-M-β-CyD 37 ° C temperatūroje 1 valandą. Ląstelės plaunamos PBS ir fiksuojamos inkubuojant 4% paraformaldehide PBS 1 valandą kambario temperatūroje. Pagal terminalo dezoksinukleotidiltransferazės (TdT) tarpininkaujamą dUTP pravardę ir ženklinimo (TUNEL) testai buvo atlikti naudojant TACS® 2 TdT-DAB in situ apoptozės aptikimo rinkinį (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD) pagal gamintojo instrukcijas.

Išvalytas kaspazės 3 tyrimas

Kaspazės 3 skilimo tyrimas buvo atliktas atliekant Western blot analizę. Trumpai tariant, KB ląstelės (1 x 10/35 mm lėkštelė) 2 valandas buvo inkubuotos su RPMI-1640 auginimo terpe (be FA), turinčioje 10 mM DM-β-CyD arba FA-M-β-CyD. Išplovus PBS, ląstelės lizuojamos 4x mėginio buferiu (8% SDS, 40% glicerolio, 24% β-merkaptoetanolio Tris-HCl buferiniame tirpale (pH6, 8)) ir virinamos 5 minutes. Nustačius baltymų koncentracijas, naudojant bicinchinino rūgšties reagentą iš Pierce Chemical (Rockford, IL), mėginiai (20 μg kaip baltymai) buvo atskirti 12% SDS-PAGE ir perkelti į „Immobilon P“ membranas (Nihon Millipore, Tokijas, Japonija). Membranos buvo užblokuotos 5% liesu pienu PBS, turinčiame 0, 1% Tween 20 (PBS-T), ir inkubuotos su kaspazės 3 antikūnu (Santa Cruz, Delaveras, CA) 4 ° C temperatūroje per naktį. Po plovimo PBS-T membranos buvo inkubuotos su peroksidaze konjuguotų avių antriniais antikūnais (Amersham-pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Specifinės juostos buvo aptiktos naudojant ECL Western blot analizės rinkinį (Amersham Bioscience, Tokijas, Japonija). Juostos buvo aptiktos naudojant „Lumino“ vaizdo analizatorių LAS-1000 plus („Fujifilm“, Tokijas, Japonija). Suskaidytos kaspazės 3 / pro-kaspazės 3 juostos intensyvumo santykis buvo analizuotas naudojant Image-J programinę įrangą.

Autofagosomų formavimasis

Trumpai tariant, KB ląstelės (1 × 10/35 mm lėkštelė) 2 valandas buvo inkubuotos su FA-M-β-CyD (5 mM), prieš tai negydant 1 μM LY294002, autofaginio inhibitoriaus, 4 valandas. h, o tada ląstelės buvo apdorotos Cyto-ID® Autofhagy Detection Kit. Ląstelių stebėjimui buvo naudojamas Biozero BZ-8000 (KEYENCE) fluorescencinis mikroskopas.

Baltymų agregatų valymas per autofagiją

Baltymų agregatų klirensas per autofagiją buvo įvertintas Premo ™ autofagijos jutikliais. Trumpai tariant, ląstelės (5 × 105/35 mm stiklinio dugno indas) buvo inkubuojamos su RPMI-1640 auginimo terpe (be FA) 24 valandas. Po plovimo PBS, į auginimo terpę buvo įpilama 25 μL GFP-p62. Po 16 valandų inkubavimo, ląstelės buvo plaunamos PBS ir 10 valandų inkubuojamos su 50 μM chloroquine. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su 5 mM FA-M-β-CyD, esant 50 μM chlorokvinui 2 valandas. Po plovimo RPMI-1640 auginimo terpe (be FA), ląstelių stebėjimui buvo naudojamas Biozero BZ-8000 (KEYENCE) fluorescencinis mikroskopas.

Statistika

Visi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais kiekvienoje matavimų serijoje ir kiekviena serija buvo pakartota daugiau nei tris kartus. Eksperimento rezultatai parodomi kaip vidurkiai ± SEM. Reikšmingumo lygiai palyginimui tarp mėginių buvo nustatyti naudojant Scheffe testą. Nustatytas P <0, 05 statistinio reikšmingumo lygis.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    1 papildomas paveikslas

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.