Mitf-a, alternatyvios mi transkripcijos faktoriaus izoformos, dalyvavimas triptazės geno ekspresijoje žmogaus stiebo ląstelėse | eksperimentinė ir molekulinė medicina

Mitf-a, alternatyvios mi transkripcijos faktoriaus izoformos, dalyvavimas triptazės geno ekspresijoje žmogaus stiebo ląstelėse | eksperimentinė ir molekulinė medicina

Anonim

Anotacija

Stiebo ląstelės vaidina pagrindinį vaidmenį inicijuojant ir plėtojant alergines ligas, išskiriant įvairius tarpininkus. Buvo žinoma, kad triptazė yra pagrindinis tarpininkas tarp putliųjų ląstelių sukeltų uždegiminių reakcijų. Šiame tyrime mes ištyrėme, ar triptazės geno transkripciją žmogaus stiebo ląstelėse sukėlė mikroftalmija ( mi ) asocijuotas transkripcijos faktorius (MITF). Pastebėjome, kad iš žmogaus CD34 + išaugintos išaugintos stiebo ląstelės ir žmogaus stiebo ląstelių linija HMC-1 stipriai ekspresuoja triptazės-beta1 ir MITF-A, kuris yra MITF alternatyvi splaisingo izoforma, nuorašus. HmC-1 ląstelėse triptazės geno transkripcinis aktyvumas buvo specifiškai didesnis, palyginti su triptazės neigiamomis ląstelėmis. Naudodami mutantines triptazės promotoriaus konstrukcijas, mes pastebėjome, kad du E-dėžutės (CANNTG) motyvai, apimantys nuo -817 iki -715 ir nuo -421 iki -202, sugeba įtraukti į triptazės geno transaktyvaciją MITF-A. Be to, šių motyvų turinčių oligonukleotidų prisijungimą prie MITF baltymų galima nustatyti EMGA būdu, naudojant HMC-1 ląstelių branduolinius ekstraktus ir anti-MITF mAb. Dėl per didelio MITF-A ekspresijos padidėjo HMC-1 ląstelių triptazės gamyba, o specifinės siRNR įvedimas prieš MITF sumažino triptazės raišką ir fermentinį aktyvumą. Šie duomenys rodo, kad MITF gali vaidinti vaidmenį reguliuojant triptazės geno transkripciją žmogaus stiebo ląstelėse.

Įvadas

Stiebo ląstelės vaidina svarbų vaidmenį kaip pagrindinės reaguojančios į neatidėliotino tipo padidėjusio jautrumo reakcijas, organizuodamos stiprią reakciją į alergenus (Galli, 2000; Galli ir kt., 1984). Stiebo ląstelės yra kuriamos iš CD34 + kraujodaros progenitorių, randamų periferiniame kraujyje ir kaulų čiulpuose (Kitamura et al., 1989). Žmonėse kaukolės ląstelės buvo išskirtos į du tipus, remiantis unikalia natūralių proteazių ekspresija; gleivinės stiebo ląstelės (MC T ), apibrėžtos kaip tos, kuriose yra tik triptazė, ir jungiamojo audinio stiebo ląstelės (MC TC ), kaip tos, kuriose yra ir triptazės, ir chimazės. Triptazė yra vienas iš patikimų stiebo ląstelių degranuliacijos žymenų ir susideda iš į tripsiną panašių serino proteazių (Irani ir kt., 1986; Sato ir kt., 1997). Žmogaus triptazė pasižymi antigeninėmis ir fermentinėmis savybėmis, sukeliančiomis proteolitinį aktyvavimą, skaidydama proteazės aktyvuoto 2 receptoriaus (PAR-2) N-galą (Irani ir kt., 1992).

Tryptazės ekspresijai putliosiose ląstelėse turi įtakos ne tik tarpląsteliniai veiksniai, įskaitant citokinus ir audinių aplinką, bet ir viduląsteliniai veiksniai, tokie kaip transkripcijos veiksniai. Gerai žinoma, kad ši išraiška žmogaus organizme padidėja inkubuojant in vitro su rekombinantiniu žmogaus kamieninių ląstelių faktoriumi (rhSCF) ir IL-6 (Kirshenbaum et al., 1991; Levi-Schaffer et al., 2003). Tačiau dar reikia nustatyti, koks yra triptazės geno transkripcijos mechanizmas žmogaus stiebo ląstelėse.

Su mikroftalmija susijęs transkripcijos faktorius (MITF) yra transkripcijos veiksnių bazinio / spiralės-kilpos-spiralės / leucino užtrauktuko (b-HLH-Zip) baltymo narys (Hemesath ir kt., 1994). B-HLH-Zip baltymai, įskaitant MITF, TFE3, TFEB ir TFEC, atpažįsta E-dėžutės (CANNTG) motyvus taikinių genų promotoriaus regione. Iki šiol žmogaus organizme buvo rasta gražių MITF izoformų, jos vadinamos MITF-A, -B, -C, -D, -E, -H, -M ir -J. Daugelio izoformų atveju pradinis egzonas yra pririšamas prie vėlesnės 1 egzono dalies, o po to prie bendrųjų 2–9 egzonų, užkoduojančius funkciškai svarbius motyvus, įskaitant b-HLH-Zip, transaktyvacijos domenus ir įvairias fosforilinimo sutarimo sekas ( Hershey ir Fisher, 2005). Neseniai atlikti tyrimai pranešė, kad pilvaplėvės ir kultivuojamos pelių stiebo ląstelės ekspresuoja keletą izoformų, tokių kaip MITF-A, -E, -H ir -Mc (Oboki ir kt., 2002; Takemoto ir kt., 2002). Anksčiau mes parodėme, kad MITF-A, -E ir -Mc buvo stipriai ekspresuojami kaulų čiulpų gautose stiebinėse ląstelėse, kultivuojamose esant IL-3, tačiau MITF-H ir -J buvo šiek tiek aptikti (Lee et al., 2008). Daugumos MITF izoformų transkripcijos aktyvumas yra panašus į pelių stiebo ląstelių specifinės proteazės 6 (MMCP-6), kuri yra pagrindinė į tripsiną panašaus serino proteazė pelėms, raišką. Visų pirma, SCF stimuliuojamos stiebo ląstelės ekspresuoja MITF-A, bet ne kitas izoformas. Vis dėlto reikia ištirti MITF izoformų ekspresijos modelį ir jų transkripcinį triptazės geno aktyvumą žmogaus stiebo ląstelėse.

Šiame tyrime mes ištyrėme MITF izoformas, kurios geriausiai ekspresuojamos žmogaus išaugintose stiebo ląstelėse ir HMC-1 ląstelėse. Mes taip pat ištyrėme MITF izoformų dalyvavimą triptazės geno transaktyvacijoje.

Rezultatai

MITF-A ir triptazės-beta1 ekspresija žmogaus stiebo ląstelėse

Mes ištyrėme MITF izoformų mRNR ekspresiją žmogaus CD34 + pirmtakų stiebo ląstelėse (hMCs) ir HMC-1 ląstelėse, naudodamiesi specifiniais pradmenimis, parodytais papildomų duomenų lentelėje S1. Bendros RNR, ekstrahuotos iš hMC ir HMC-1 ląstelių, buvo naudojamos sintetinti cDNR naudojant RT-PGR. Tiek hMC, tiek HMC-1 ląstelės stipriai išreiškė MITF-A nuorašą. MITF-E ir -H nuorašai buvo silpnai ekspresuojami HMC-1 ląstelėse, tačiau nebuvo aptikti hMC (1A pav.).

Image

MITF izoformų ir beta-triptazės genų ekspresija HMC-1 ląstelėse ir hMC. Visa RNR buvo ekstrahuota iš HMC-1, hMC ir 293 ląstelių kaip triptazės neigiama ląstelių linija. MITF izoformų (A) ir beta-1 ir beta-2 (B) nuorašai buvo analizuojami RT-PGR metodu. PGR produktai buvo elektroforeguoti 1% agarozės gelyje.

Visas dydis

Keletas triptazės genų yra susitelkę į 16p13.3 chromosomą. Triptazė-beta yra pagrindinės į tripsiną panašios serino proteazės, ekspresuojamos putliosiose ląstelėse, tuo tarpu triptazė-alfa vyrauja bazofiliuose (Galli, 2000). Taigi mes ištyrėme beta-triptazės raišką žmogaus stiebo ląstelėse, HMC-1 ląstelėse ir hMC ląstelėse RT-PGR metodu. Triptazės-beta1 nuorašas buvo nepaprastai ekspressuotas tiek hMC, tiek HMC-1 ląstelėse, tačiau alternatyvios splaisingo izoformos triptazės beta-2 nebuvo aptikta (1B paveikslas). Be to, beta3 triptazės kiekis buvo neigiamas 293 ląstelėse, ne stiebo ląstelių linijoje. Triptazės-beta1 mRNR ekspresijos lygis hMC buvo aukštesnis nei HMC-1 ląstelėse.

Trimetazės geno transaktyvacija žmogaus stiebo ląstelėse

Norėdami ištirti triptazės geno transkripciją žmogaus stiebo ląstelėse, mes klonavome beta1 triptazės geno 5'-aukščiau esančią sritį, kaip parodyta 2A paveiksle, ir sukonstravome reporterio plazmidę, kurioje yra triptazės geno promotorius, pradedant nuo -817. priešais luciferazės geną. Po reporterio plazmidės arba tuščio vektoriaus transfekcijos į triptazės teigiamas HMC-1 ląsteles ir triptazės neigiamas ląstelių linijas, Jurkat ir 293 ląsteles, triptazės geno transkripcija buvo patikrinta atliekant luciferazės aktyvumo testą. Reporterio plazmidės luciferazės aktyvumas HMC-1 ląstelėse padidėjo daugiau nei 30 kartų, palyginti su tuščio kontrolinio vektoriaus aktyvumu. Be to, luciferazės aktyvumas buvo stipriai padidintas HMC-1 ląstelėse, bet ne Jurkat ir 293 ląstelėse (2B paveikslas).

Image

Beta triptazės geno transkripcinis aktyvumas žmogaus stiebo ląstelių linijoje HMC-1. (A) Tryptazės geno 5 'kraštinę nukleotidų seką. CANNTG motyvas buvo įdėtas į dėžutę. Dalis pirmojo egzono parodyta didžiosiomis raidėmis, o 5 ’kraštas - mažosiomis raidėmis. Transkripcijos inicijavimo vieta buvo sunumeruota kaip +1. (B) Reporterio plazmidės (0, 5 µg) buvo perkeltos į HMC-1 elektroporacijos būdu, tačiau jos (1 µg) pateko į Jurkat ir 293 ląsteles, naudojant transfekcijos reagentą. Liuciferazės aktyvumo tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta Metodose. Duomenys atskleisti kaip santykinis luciferazės aktyvumas, padalytas iš tuščios plazmidės vertės.

Visas dydis

Norėdami ištirti pagrindinius elementus, susijusius su transaktyvacija triptazės-beta1 geno promotoriaus regione, mes susintetinome trylikacijos deleto mutantų konstrukcijas, pradedant nuo -817, -715, -621, -421 arba -202 triptazės promotoriaus amplifikuojant PGR (3A pav.) Ir tada jų reporterio plazmidės buvo perkeltos į HMC-1 ląsteles. Kai buvo transfekuotas -817 konstruktas, luciferazės aktyvumas buvo didžiausias (daugiau nei 30 kartų), palyginti su tuščios kontrolinės grupės aktyvumu. -421 konstrukcija atskleidė 15 kartų padidintą luciferazės aktyvumą. Tačiau luciferazės aktyvumas iš -202 konstrukto buvo palyginamas su tuščiosios kontrolės aktyvumu (3B pav.).

Image

Delecijos mutantų transkripcinis aktyvumas HMC-1 ir Jurkat ląstelėse esančiuose beta triptazės geno 5 'kraštuose. (A) Tryktazės promotoriaus sritis (-817 ~ + 24) buvo gauta iš HMC-1 genominės DNR, naudojant PGR. Pašalinti beta-triptazės promotoriaus konstrukcijos buvo susintetinti ir įterpti į priešais luciferazės geną esančią pGL3 bazinę plazmidę kaip reporteris transkripcinio aktyvumo tyrimui. (B) Žurnalistės plazmidės (0, 5 µg) buvo perkeltos į HMC-1 ląsteles. (C) Reporterio plazmidės (0, 5 µg) buvo kotransfekuotos į Jurkat ląsteles su MITF ekspresijos vektoriu arba be jo (0, 5 µg). Luciferazės aktyvumo tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta Metodose. Duomenys atskleisti kaip santykinis luciferazės aktyvumas, padalytas iš tuščio reporterio vertės (pGL3-basic).

Visas dydis

Mes taip pat ištyrėme, ar per didelis MITF-A ekspresija reguliuoja triptazės promotoriaus, kuris neišreiškia ir triptazės, ir MITF, transaktyvaciją Jurkat ląstelėse (3C pav.). Visos delecijos mutantų konstrukcijos, įvestos be MITF-A į Jurkat ląsteles, parodė tik žemą luciferazės aktyvumą. Kai -817 ir -421 konstrukcijos buvo kotransfekuotos MITF-A ekspresijos vektoriu, luciferazės aktyvumas pastebimai padidėjo atitinkamai atitinkamai daugiau nei 15 kartų ir 19 kartų, palyginti su tuščios kontrolės tirpalu. Priešingai, nt -715, -621 ir -221 konstrukcijos neturėjo jokio poveikio MITF-A padidėjusiam luciferazės aktyvumui. Šie duomenys rodo, kad nuo MITF priklausomi elementai gali būti išsaugoti nuo -817 iki -715 ir -421 iki -202 triptazės-beta1 geno promotoriaus regione.

Tryptazės geno transkripcija per MITF surišimo vietas

Kadangi MITF yra bHLH-Zip baltymų, atpažįstančių CANNTG motyvą, šeima, mes ištyrėme MITF rišamąsias vietas į triptazės geno transkripciją žmogaus stiebo ląstelėse. Nors triptazės promotoriaus regione iki -817 yra dešimt CANNTG motyvų, du CACCTG motyvai buvo rasti dviejuose regionuose nuo -817 iki -715 ir nuo -421 iki -202 ir buvo atrinkti kaip potencialios transaktivejančios vietos, atsižvelgiant į delecijos konstruktų luciferazės aktyvumą. triptazės geno. Norint ištirti dviejų CACCTG motyvų dalyvavimą stiebinių ląstelių triptazės geno transkripcijoje, CACCTG motyvai buvo pakeisti į CTCCAG, naudojant PGR, naudojant kiekvieną pradmenų porą. Taigi mes paruošėme tris mutacijos konstruktus, „Mut 1“, „Mut 2“ ir „Mut 1 & 2“, triptazės promotoriuje, pradedant nuo –817, ir pernešėme juos į HMC-1 ląsteles (4A pav.). Vienos mutacijos konstrukto „Mut 1“ arba „Mut 2“ transfektantuose, palyginti su ta „Wilde“ tipo reporterio plazmidė, reikšmingai sumažėjo luciferazės aktyvumas. Be to, dvigubos mutacijos konstrukto „Mut 1 & 2“ transfektantuose (4B pav.) Buvo dramatiškai panaikintas transkripcijos aktyvumas, kas rodo, kad abu CACCTG motyvai vaidina pagrindinį vaidmenį transkriptuojant triptazės geną putliosiose ląstelėse.

Image

Tryptazės transkripcijos aktyvumo reguliavimas naudojant CACCTG motyvus (E-dėžutės). (A) Diagramos rodo MITF rišančių vietų mutacijas triptazės promotoriaus konstruktuose, naudojamuose luciferazės aktyvumo tyrimui. (B) Norint ištirti beta-triptazės promotoriaus aktyvumą per du E-dėžutes, MITF surišančių vietų mutacijos buvo sukonstruotos PGR metodu ir įterptos į prieš luciferazės geną esančią pGL3 bazinę plazmidę. Žurnalistės plazmidės buvo įvestos į HMC-1 ląsteles, ir ląstelės buvo inkubuojamos 40 valandų prieš luciferazės aktyvumo tyrimą.

Visas dydis

MITF-A surišimo aktyvumas su CACCTG motyvais triptazės geno promotoriaus regione

Norėdami ištirti, ar MITF-A baltymas praktiškai jungiasi su dviem CACCTG motyvais, išsaugotais triptazės geno promotoriaus regione (nuo -817 iki -715 ir nuo -421 iki -202), mes ekstrahuojame branduolinius baltymus iš HMC-1 ląstelių, kurios ekspresuoja MITF- Baltymas. Branduolinių ekstraktų DNR jungimosi aktyvumą atliko EMSA, naudodama oligonukleotidus, turinčius CACCTG motyvus. Panaudoti oligonukleotidai buvo susintetinti, kaip parodyta 5 paveiksle, o WT-1 oligonukleotidas (zondas 1: heksametrinis motyvas parodytas langelyje) ir WT-2 oligonukleotidas (2 zondas) buvo pažymėti kaip zondas. Po reakcijos su branduolių ekstraktais abiejuose zonduose buvo suformuoti keli DNR-baltymų kompleksai. Visų pirma, didžioji dalis DNR-baltymų kompleksų buvo perversta, pridedant anti-MITF antikūnų abiejose reakcijose, naudojant 1 zondą ir 2 zondą. Abu DNR surišantys aktyvumai buvo pašalinti pridėjus nepaženklinto oligonukleotido, kaip konkurento, perteklių, tačiau o ne mutantinis oligonukleotidas.

Image

Iš žmogaus stiebo ląstelių išgauto MITF jungimosi aktyvumas CACCTG motyvuose 5-oje triptazės geno srityje. Branduoliniai ekstraktai, išgryninti iš HMC-1 ląstelių, buvo inkubuojami su biotiniluotu Oligo-1 (WT-1) arba -3 (WT-2), turinčiais potencialią MITF rišančią vietą, kaip EGMSA zondas. Atlikus elektroporezę, DNR-baltymų kompleksas buvo perkeltas į nailono membraną ir nufotografuotas avidin-HRP vizualizavimui. WT-1 ir -2 CACCTG motyvai buvo modifikuoti, kaip parodyta Mut-1 ir -2, atitinkamai, konkuruojančiam DNR jungties tyrimui, ir anti-MITF mAb buvo pridėta, kad būtų padarytas viršslinkis, kaip aprašyta Metodose.

Visas dydis

Padidėjusi triptazės ekspresija padidėjus MITF-A ekspresijai

Norėdami ištirti tiesioginį MITF-A baltymo poveikį mutazės ląstelių triptazės mRNR ir baltymo ekspresijai, MITF-A ekspresijos vektorių (0, 1 arba 1 μg) mes transfekavome į HMC-1 ląsteles ir MITF baltymo lygį išanalizavome Vakarų dėmė. MITF baltymo ekspresija buvo šiek tiek nustatyta tuščiuose vektorių įvestuose transfektantuose ir pastebimai padidėjo transfekuojant MITF-A vektorių (6A pav.). Be to, padidėjęs MITF baltymo lygis tuo pat metu padidino triptazės mRNR raišką priklausomai nuo dozės (6B pav.). Fermentacinis triptazės aktyvumas taip pat reikšmingai padidėjo dėl MITF per didelės ekspresijos stiebo ląstelėse (6C pav.).

Image

Padidėjusi triptazės ekspresija padidėjus MITF ekspresijai HMC-1 ląstelėse. (A) Po MITF-A (0, 1 arba 1 μg) arba tuščio ekspresijos vektoriaus (1 μg) transfekcijos į HMC-1 ląsteles, MITF baltymo ekspresija buvo analizuojama Western blot analize, naudojant anti-žmogaus MITF monokloninį antikūną. (B) Trytazės mRNR išraiška buvo analizuota naudojant RT-PGR, ir (C) triptazės fermentinis aktyvumas buvo išmatuotas, naudojant substratą tosil-gly-pro-lys-pNR (Sigma), naudojant tikslų mikrotinklelių skaitytuvą, kaip aprašyta Metodose.

Visas dydis

Sumažėjusi triptazės ekspresija dėl MITF išeikvojimo

Norėdami ištirti, ar MITF-A baltymo išeikvojimas daro įtaką triptazės mRNR ir baltymo raiškai stiebo ląstelėse, į HMC-1 ląsteles įvedėme MITF specifinę siRNR (0, 2 arba 1 µg) arba kontrolinę siRNR (1 µg). Mes pastebėjome, kad MITF baltymo ekspresiją žymiai sumažino MITF siRNR priklausomai nuo dozės, bet ne kontrolinė siRNR (7A pav.). Trimetazės-beta1 mRNR išraiška taip pat sumažėjo transfekuojant MITF siRNR, bet ne kontrolinę siRNR (7B pav.). Be to, fermentinis triptazės aktyvumas vėliau buvo sumažintas dėl MITF išeikvojimo putliosiose ląstelėse (7C paveikslas).

Image

Sumažėjusi triptazės ekspresija dėl MITF sumažėjimo HMC-1 ląstelėse. Po žmogaus MITF-A specifinės siRNR (1 arba 0, 2 µg) arba kontrolinės siRNR (1 µg) transfekcijos į HMC-1 ląsteles, (A) MITF išeikvojimas buvo analizuotas atliekant „Western blot“ analizę, o (B) - triptazės ekspresiją. mRNR ir (C) triptazės fermentinis aktyvumas buvo išmatuotas, kaip aprašyta Metodose.

Visas dydis

Diskusija

Žmogaus triptazės sudaro į tripsiną panašių serino proteinazių, kurias koduoja šių genų aleliai, esantys 16p13.3 chromosomoje, šeimą. CDNR identifikuotos triptazės rodo skirtingą sekos variaciją, suskirstytą į tris grupes, tokias kaip alfa, beta ir gama, turinčios aukštą sekos tapatumo laipsnį. Buvo žinoma, kad beta triptazė yra pagrindinis variantas, ekspresuojamas putliosiose ląstelėse, tuo tarpu triptazė alfa vyrauja bazofiliuose. Be to, į triptazę-bata taip pat įeina variantų izoformos, beta1 ir beta2 (Galli, 2000, Sommerhoff, 2001). Tačiau tikslios triptazės-bata izoformos žmogaus stiebo ląstelėse buvo neaiškios. Šiame tyrime mes parodėme, kad hMC ir HMC-1 ląstelės išreiškė triptazę-beta1 kaip pagrindinį izofermentą. Nors buvo žinoma, kad stiebo ląstelės išreiškia visas jas, mūsų rezultatas rodo, kad triptazė-beta1 gali būti pagrindinis tipas, kaupiamas stiebo ląstelių sekrecijos granulėse.

Pranešama, kad MITF reguliuoja pelių kaukolių ir melanocitų vystymąsi (Hemesath ir kt., 1994). Neseniai atlikto tyrimo metu mMCP-6 geno, kuris yra pagrindinis į tripsiną panašus serino proteinazė, aptinkamas pelėms, ekspresija buvo nepakankama MITF mutantų pelių išaugintose stiebo ląstelėse (Morri ir kt., 1996). Pernelyg didelis laukinio tipo MITF, bet ne mutantinio, MITF ekspresija sugebėjo transaktivizuoti mMCP-6 promotorių, prisijungdamas prie GACCTG ir CANNTG motyvų, suponuodamas, kad MITF vaidina esminį vaidmenį mMCP-6 transkripcijoje (Pejler et al., 2007). Ankstesniame tyrime mes pademonstravome, kad MITF-A yra pagrindinė izoforma, reguliuojanti mMCP-6 ekspresiją pelių gautose išaugintose stiebo ląstelėse (Lee ir kt., 2008). Kaip pranešta pelėms, mūsų rezultatas parodė, kad žmogaus stiebo ląstelės stipriai ekspresuoja MITF-A. Be to, triptazės geno transkripciją sukėlė būtent putliosios ląstelės, kurios ekspresuoja MITF-A, bet ne mastomos ląstelės. Triptazės ekspresija stiebo ląstelėse taip pat padidėjo dėl per didelės MITF-A ekspresijos, o MITF išeikvojimas sumažino triptazės ekspresiją. Tai reiškia, kad MITF-A tikriausiai yra svarbus transkripcijos faktorius, reguliuojantis triptazės ekspresiją žmogaus stiebo ląstelėse, taip pat pelėse.

Pelių mi lokusas koduoja bHLH-Zip baltymų šeimos transkripcijos faktorių, vadinamų mi transkripcijos koeficientu (MITF), narį. Pagrindinis domenas leidžia MITF baltymams prisijungti prie CANNTG motyvų (E-dėžutė) (Hodgkinson ir kt., 1993; Hughes ir kt., 1993; Eirikur ir kt., 1994). Kai ištrintos reporterio plazmidės buvo transfekuotos į HMC-1 ląsteles, atrodė, kad -817 reporterio plazmidės sukelia didžiausią luciferazės aktyvumą, palyginti su kitomis reporterėmis. Be to, padidėjus MITF ir triptazės neigiamoms Jurkat ląstelėms, luciferazės aktyvumas padidėjo, kai -817 ir -421 reporterio plazmidės buvo kotransfekuotos MITF. Tryktazės geno promotoriaus regione mes nustatėme du CACCTG motyvus nuo -817 iki -751 ir nuo -421 iki -221. Jų mutacija -817 reporterio plazmidėse reikšmingai sumažino luciferazės aktyvumą HMC-1 ląstelėse, net dviguba mutacija neparodė visiško jos panaikinimo. Šie rezultatai rodo, kad triptazės geno transkripcijos aktyvumui būtini du CACCTG motyvai. EMSA taip pat parodė, kad MITF baltymuose yra branduolinių ekstraktų, išskirtų iš putliųjų ląstelių, ir jie gali sudaryti DNR jungiančius kompleksus per CACCTG motyvus triptazės geno promotoriaus regione. Tačiau delecijos konstruktai, prasidedantys nuo -751 ir -621, parodė MITF sukeltos triptazės geno transaktyvacijos tylėjimą triptazės neigiamose Jurkat ląstelėse. Tai rodo, kad slopinamosios molekulės, ekspresuojančios triptazės neigiamas ląsteles, gali sąveikauti su kai kuriais motyvais, išsaugotais tarp -751 iki -421 promotoriaus srityje. Trimetazės tansaktyvacijos slopinamosios molekulės ir rišamieji motyvai dar turi būti ištirti.

Buvo žinoma, kad triptazė reguliuoja alerginius ir uždegiminius atsakus, įskaitant neutrofilų, Th2 ląstelių ir bazofilų įdarbinimą (Lee ir kt., 1998; Pejler ir kt., 2007). Kultūrinės stiebo ląstelės, gautos iš transgeniniu būdu įterptų vga9 / vga9 pelių kaulų čiulpų, kurie neišreiškia MITF, parodė nenormalius fenotipus, įskaitant įvairių genų ekspresijos trūkumus, įskaitant mMCP-4, -6, -7, granzimo B, prostaglandino. D2 ir triptofano hidroksilazė (Hodgkinson ir kt., 1993; Ito ir kt., 1998; Jippo ir kt., 1999; Ogihara ir kt., 2001; Mori ir kt., 2004). Tačiau mes negalime atmesti galimybės, kad MITF-A sukelia kitokį transkripcijos mechanizmą, kad sukeltų žmogaus triptazės geno ekspresiją, palyginti su MMCP-6 genu, ekspresuojančiu pelių jungiamojo audinio stiebo ląstelėse. Dauguma žmogaus stiebo ląstelių ekspresuoja gausią triptazę, o triptazės geno promotoriaus sritis neparodė akivaizdžios homologijos su MMCP-6. Pranešama, kad MITF sąveikauja su kitais transkripcijos veiksniais, TFE3, TFEB ir TFEC, kurie visi priklauso bHLH-Zip šeimai, per HLH-Zip domenus (Eirikur et al., 1994). MITF aa 123–127 regionas buvo svarbus PEBP2 sąveikai (Sato ir kt., 1997). Melanocituose transkripcinis koaktyvatorius CBP / p300 selektyviai asocijuojasi su MITF, kad suaktyvintų MITF transkripcijos funkciją (Hemesath et al., 1998; Price et al., 1998). Todėl įmanoma, kad kitas transkripcijos faktorius gali būti susijęs su MITF-A žmogaus triptazės geno transkripcijai.

Apibendrinant, mūsų duomenys parodė, kad MITF-A yra pagrindinė izoforma žmogaus stiebo ląstelėse ir vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant beta 1 triptazės geno transkripciją per prisijungimą prie dviejų CACCTG motyvų promotoriaus regione, kas rodo, kad MITF-A yra svarbus žmogaus stiebo ląstelių triptazės ekspresijos veiksnys. Tačiau norint parodyti su MITF siejamus koaktyvatorius, reguliuojančius ribotą beta-triptazės genų transkripciją žmogaus stiebo ląstelėse, reikia atlikti progresyvius tyrimus. Be to, dar reikia ištirti MITF-A transkripcijos reguliavimo mechanizmą stiebo ląstelėse. Toks identifikavimas paskatintų tolesnę putliųjų ląstelių vystymosi analizę ir būtų naudingas įvertinant putliųjų ląstelių išvestų proteazių fiziologinius vaidmenis.

Metodai

Ląstelės ir reagentai

Žmogaus CD34 + pirmtakų ląstelės buvo išskirtos naudojant EasySep žmogaus CD34 + atrankos kokteilį (StemCell Tech., Vankuveris, Kanada) iš žmogaus virkštelės kraujo, paimto mėgintuvėliuose, kuriuose yra 10 V / ml heparino. Žmogaus stiebo ląstelės buvo sukurtos iš CD34 + ląstelių, išaugintų Iscove modifikuotame Dulbecco terpėje (IMDM; GIBCO BRL), papildyta 100 ng / ml rhSCF (ATGen, Gyeonggi-do, KOREA), 50 ng / ml IL-6 (R&D sistemos, Mineapolis)., MN), 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 50 µM 2-merkaptoetanolio ir 100 U / ml penicilino / streptomicino iki 8 savaičių 5% CO 2, esant 37 ℃ drėgnoje atmosferoje. Pusė terpės buvo keičiamasi kas 2 dienas diferencijuojant kaulas. Stiebo ląstelės buvo identifikuotos dažant mėlyną toluidino tirpalu, o grynumas buvo didesnis nei 95%. HMC-1 ląstelės buvo palaikomos IMDM, turinčioje 10% FBS ir 100 V / ml penicilino / streptomicino. Jurkat ir 293 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM ir RPMI1640, turinčiuose atitinkamai 10% FBS. Kiti reagentai buvo įsigyti iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO).

Atvirkštinė transkriptazės polimerazės grandininė reakcija (RT-PGR)

Bendra RNR buvo ekstrahuota iš ląstelių, naudojant reagentą Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). CDNR sintezei RNR buvo atvirkščiai transkriptuojama su aukščiausio laipsnio vieno žingsnio RT-PGR rinkiniu (Invitrogen) 1 val., Esant 42 ℃, pagal gamintojo instrukcijas. Norėdami ištirti genų ekspresijos lygius žmogaus stiebo ląstelėse, PGR buvo atlikta su labai tikslios platinos Taq DNR polimerazės sistema, naudojant pradmenų porą, kaip parodyta papildomoje duomenų lentelėje S1. PGR amplifikacija buvo atliekama taip: denatūracija (94 ℃, 30 s), atkaitinimas (58 ℃, 30 s) ir ilginimas (72 ℃, 50 s). PGR produktai buvo elektroforeguoti ant 1, 2% agarozės gelio 1 × TAE buferiu ir nufotografuoti ant UV lempos.

Ekspresijos ir reporterio plazmidžių konstravimas

MITF-A viso ilgio cDNR buvo susintetinta iš visos RNR, ekstrahuotos iš HMC-1 ląstelių, naudojant RT-PCR, naudojant šią pradmenų porą, o po to įterpta į pcDNA3.1 (+) žinduolių ekspresijos vektoriaus (Invitrogen) EcoRI vietą. . Visos MITF-A cDNR sekos buvo identifikuotos sekos analizės būdu. Reporterio plazmidėse triptazės-beta1 promotoriaus sritis tarp nt -1557 ir nt +4 buvo susintetinta PGR, naudojant genominę DNR, ekstrahuotą iš HMC-1 ląstelių. DNR fragmentai, kuriuose yra triptazės-beta1 geno promotoriaus sritis, buvo klonuoti prieš luciferazės geno srovę pGL3 bazinėje plazmidėje (Promega, Madison, WI). Tryktazės promotoriaus srities delecijos mutantai buvo paruošti PGR naudojant kiekvieną pradmenų porą. Atrankinio konsensuso motyvų taškinė mutacija buvo sukurta naudojant „Quick Change II“ tiesioginio mutagenezės rinkinį (Stratagene, La Jolla, CA) su neatitinkančio prasmės ir antisense pradmenimis, kaip nurodyta toliau; Mut 1, 5'-GGCAGCCAGGCCTCCAGGGTGCAGCAAT-3 '(nuo -306 iki -279); Mut 2, 5'-TCCTGGGGTTGCTCCAGCACTCCTCTCT-3 '(nuo -747 iki -719). Deletuotos ir mutavusios konstrukcijos buvo patikrintos DNR seka.

Transfekcijos ir luciferazės aktyvumo tyrimas

MITF-A ekspresijos vektorius (0, 5 arba 1 µg) ir reporterio plazmidė (0, 5 arba 1 µg) buvo pernešti į HMC-1 (2x105 6 cm lėkštelėje) ir Jurkat ląsteles (5x105 6 cm lėkštelėje). atliekant elektroporaciją naudojant „MicrOperator“ (Soulin Bio, Seulas, Korėja) pagal gamintojo instrukcijas. Trans-LT1 transfekcijos reagentas (Mirusas, Pitsburgas, PA) buvo naudojamas norint juos iškrėsti į 293 ląsteles (5x105 6 cm inde). Po 24 valandų inkubacijos ląstelės buvo surinktos ir lizuotos luciferazės lizės reagentu (Promega). Tirpūs supernatantai buvo atskirti centrifuguojant 12 000 x g greičiu 20 min., Ir buvo naudojami luciferazės aktyvumui nustatyti naudojant luminometrą LB96P (Berthold GmbH, Wilbad, Vokietija). Β-galaktozidazė ir bendroji baltymų koncentracija sąlygojo normalizuotą luciferazės aktyvumą. Visi duomenys buvo parodyti kaip santykinės vertės, apskaičiuotos pagal kontrolinės išraiškos vektorių.

Western blot analizė

Norint selektyviai nutildyti žmogaus MITF geno ekspresiją HMC-1 ląstelėse, MITF siRNR (Santa Cruz Biotech, CA) arba neigiamos kontrolės siRNR buvo transfekuota į HMC-1 ląsteles, naudojant „MicrOperator“. Po 48 valandų inkubacijos, ląstelės 20 minučių buvo lizuojamos lediniame baltymų ekstrahavimo buferyje („iNtRON Biotech“, Gyeonggi-do, Korėja) ir centrifuguotos, kad atskirtų tirpius supernatantus. Jų baltymų koncentracijos buvo matuojamos naudojant bicinchinino rūgštį. Ląstelių lizatai (25 µg baltymų vienoje juostoje) buvo atskirti 10% SDS-PAGE ir perkelti į PVDF membranas. 1 valandą užblokavus 5% nugriebto pieno, membrana buvo nušveista anti-MITF mAb (Abcam, Kembridžas, Masačusetsas) per naktį 4 ℃, plaunama 1 × TBS, turinčiu 0, 1% Tween 20, ir inkubuojama su HRP konjuguotu antriniu. antikūnas 45 min. Galiausiai baltymai buvo vizualizuojami naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (Amersham Pharmacia Biotech, CA).

Tryptazės aktyvumo tyrimas

Išmatuotas triptazės aktyvumas, siekiant nustatyti triptazės gamybą putliosiose ląstelėse. Ląstelės buvo homogenizuotos 10 tūrių 20 mM Na-fosfato buferio (pH 7, 4). Po centrifugavimo supernatantai buvo naudojami kaip ekstraktas, kuriame buvo triptazė. Fermentacijos fermentacijos metu nustatytas triptazės aktyvumas buvo nustatytas naudojant substratą tosil-gly-pro-lys-pNA (Sigma), kuriame yra 50 µg / ml heparino. Mėginio ir reakcijos buferio mišinys buvo inkubuotas 2 valandas 37 ° C temperatūroje, o optinis tankis buvo matuojamas 405 nm bangomis mikroteklių plokštelių skaitytuve.

Elektroforetinio judėjimo gelio poslinkio tyrimas (EMSA)

Ląstelės du kartus plaunamos ledo šaltu PBS ir suspenduojamos 500 µl hipotoninio buferio (10 mM HEPES, pH 7, 9, 1, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT ir 0, 5 mM PMSF). Ląstelėms 15 minučių patinus ant ledo, buvo pridėta 30 µl 10% NP-40 tirpalo, kad purtytų 5 minutes. Po to mišinys 2 minutes buvo centrifuguojamas esant 3000 aps./min., O branduolių granulės vieną kartą plaunamos 500 µl PBS, prieš tai suspenduojant 65 µl buferio B (20 mM HEPES, pH 7, 9, 25% glicerolio, 400 mM NaCl, 1, 5 mM MgCl). 2, 0, 2 mM EDTA, 0, 2 mM EGTA, 1 mM DTT) 30 minučių ant ledo. Po centrifugavimo 15 min., Esant 15000 aps./min., Supernatantas, kuriame buvo branduoliniai baltymai, iki eksperimentų buvo laikomas -70 ℃. Unikalių oligonukleotidų poros, apimančios laukinio tipo arba mutantą CANNTG vietose, buvo atkaitintos DNR jungties tyrimui. Zondas buvo paženklintas Biotin-14-CTP naudojant BIOPRIME DNR ženklinimo sistemą (Invitrogen). Pažymėtas DNR zondas (25 ng) buvo sumaišytas su branduolio ekstraktu (10 µg baltymų) 20 µl reakcijos mišinyje, kuriame yra 10 mM Tris-HCl (pH 8, 0), 1 mM EDTA, 75 mM KCl, 1 mM DTT, 4 % „Ficoll“ tipo 400 ir 2 µg / ml poli (dI-dC). MITF specifiškumas ir tapatumas buvo patikrinti atitinkamai konkuruojant su mutantais oligonuklotidais ir padidinto poslinkio tyrimais su anti-MITF antikūnais. Po 15 minučių inkubavimo kambario temperatūroje, reakcijos mišinys buvo elektroforezuotas 5% poliakrilamido geliu 0, 25 × TBE buferiniame tirpale (pH 8, 3) ir perkeltas į nailono pernešimo membraną. Membrana buvo inkubuojama su blokuojančiu buferiu (1 × TBS buferis, 0, 5% želatinos, 5% SDS, 0, 05% Tween 20) 1 valandą, o po to 40 minučių kambaryje su HRP konjuguotu streptavidinu (ZyMED, San Franciskas, Kalifornija). temperatūra. Po plovimo TBS, turinčio 0, 1% Tween 20, DNR-baltymų kompleksai buvo vizualizuoti naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją.

Statistinė analizė

Tyrimų duomenys buvo apibūdinti kaip vidurkiai ± SEM. Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas naudojant Studento t- testą, norint išreikšti skirtumą tarp grupių. Manoma, kad visos p vertės <0, 05 atspindi statistiškai reikšmingą skirtumą.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

hMC

iš žmogaus CD34 + progenitorių gautų putliųjų ląstelių

MITF

su mikroftalmija susijęs asocijuotasis transkripcijos faktorius

SCF

kamieninių ląstelių faktorius

Papildoma informacija pridedama prie eksperimento ir molekulinės medicinos tinklalapyje esančio dokumento