Stipresnio onkolitinio paramiksoviruso išskyrimas atliekant biologinę selekciją | genų terapija

Stipresnio onkolitinio paramiksoviruso išskyrimas atliekant biologinę selekciją | genų terapija

Anonim

Dalykai

  • Genų terapija
  • Genetinė inžinerija

Anotacija

Niukaslio ligos virusas (NDV) yra onkolitinis paramiksovirusas, turintis nesegmentinį vienos grandinės RNR genomą. Šioje ataskaitoje rekombinantinis onkolitinis NDV buvo įterptas į žmogaus naviko ksenografus ir pakartotinai izoliuotas bei apibūdintas po dviejų biologinės selekcijos etapų. Gali būti atkurta keletas izoliatų, kurie nuo viruso išsiskyrė naviko ląstelėse ir gebėjimo sudaryti sincitiją žmogaus naviko ląstelėse skiriasi nuo tėvų viruso. Išmatuotos padidėjusios onkolitinės galios sulėtėjusių naviko ląstelių monosluoksnių sluoksniuose, naviko ląstelių sferoiduose ir pelių ksenografinio naviko modelyje, buvo nustatyta trys izoliatai, kurie įrodė, kad yra aukštesnė onkolitinė galia, palyginti su tėvų virusu. Paviršiniai baltymai F ir HN buvo ištirti seka ir apibūdintas fusogeniškumas. Šis tyrimas parodo, kad in vivo NDV biologinis pasirinkimas gali sudaryti sąlygas išskirti naujus onkolitinius NDV, taigi yra galinga labai stiprių onkolitinių virusų kūrimo metodika.

Įvadas

Niukaslio ligos virusas (NDV) yra natūraliai pasitaikantis onkolitinis virusas, kuris iš prigimties dauginasi daugumoje žmogaus navikinių ląstelių. Naviko selektyvaus replikacijos mechanizmas suprantamas tik iš dalies. Manoma, kad ląstelinio interferono atsako trūkumas, kuris yra įprastas pastebėjimas žmogaus naviko ląstelėse, daugiausiai prisideda prie šio efekto. 1 Dėl nepakankamo naviko ląstelių atsakymo į interferoną selektyvusis replikacija ir susijęs citotoksiškumas pasireiškia tik naviko ląstelėse, tuo tarpu saugant normalias ląsteles. 2 Buvo pasiūlyta, kad apoptozė yra susijusi su virusų sukeliamomis ląstelių žudynėmis. 3 Skirtingai nuo kitų onkolitinių virusų, NDV nėra priklausomas nuo receptorių, specifiškai ekspresuojamų naviko ląstelėse. Priešingai, virusas jungiasi su visur esančia sialio rūgštimi, esančia ląstelės paviršiuje esančiuose glikoproteinuose. Taigi, NDV gali būti plataus veikimo onkolitinis agentas.

NDV nėra patogeniškas žmonėms, tačiau yra gerai ištirtas paukščių, ypač vištų, patogenas. Žmogaus navikams gydyti buvo išbandytos įvairios NDV padermės (anamnezė apžvelgta 5, o kai kurios padermės dabar išbandytos klinikinių tyrimų metu. 6, 7 ). NDV padermės paprastai klasifikuojamos į tris grupes (lentogenines, mezogenines ir velogenines) pagal jų patogeniškumą vištoms.

Lentogeniniai virusai paprastai laikomi vakcinomis, tuo tarpu mezogeniniai ir velogeniniai virusai paprastai laikomi patogenais. 4 Kadangi lentogeniniai NDV gali užkrėsti žmogaus navikines ląsteles, tačiau paprastai negali replikuotis navikinėse ląstelėse, jiems trūksta savaiminio amplifikavimo savybės, kuri yra pagrindinė mezogeninių NDV, kurie yra terapiniai kandidatai, savybė. Todėl iki šiol klinikiniai onkolitinių NDV padermių tyrimai buvo atlikti su mezogeninėmis padermėmis. Tačiau taip pat yra tiriamas lentogeninis štamas navikų gydymui. 8 Taigi, projektuojant NDV genomą arba parenkant genetinius variantus, kurie turi didesnę onkolitinę galią ir kurie gali būti pažengę link klinikinių bandymų, būtina kuo labiau sumažinti pavojų aplinkai, kad būtų išvengta netyčinio patogeninių virusų generavimo natūraliam šeimininkui, ypač paukštiena.

Keletas NDV padermių buvo genetiškai modifikuotos, kad pakeistų pasirinktas savybes, pradedant nuo 9, 10, 11 vakcinų padermių ir vėliau pereinant prie onkolitinių padermių. 12, 13 Pühler ir kt. 12 paveiksle aprašytas rekombinantinio viruso generavimas iš natūraliai onkolitinio mezogeninio NDV padermės MTH68, išreiškiančio pilną IgG antikūno dvi grandines kaip transgeną. Be to, transgeninis žalias fluorescencinis baltymas (GFP) buvo modifikuotas į viruso genomą, kad būtų sukurtas onkolitinis reporterio virusas, kurį galima stebėti dėl žmogaus naviko ląstelių infekcijos tiek in vitro, tiek in vivo . Šiuo metu tiek natūralūs, tiek genetiškai modifikuoti NDV virusai yra tiriami kaip onkolitiniai virusai navikų viroterapijai.

Vieno sluoksnio žmogaus navikinėse ląstelėse užtenka vienos NDV viruso dalelės, kad būtų galima sunaikinti daugiau nei 107 ląsteles. Tačiau 100% citotoksiškumas, kuris dažnai stebimas in vitro, visiškai nereiškia, kad žmogaus naviko ksenografijos eksperimentuose atsiras visiškas atsakas (Beier ir kt. , Nepaskelbti stebėjimai). Tolesni tyrimai parodė, kad intratumorinis viruso plitimas ksenografiniame audinyje yra ribotas dėl barjerų, kurie trukdo naviko, kaip organo, onkolizei, palyginti su vieno sluoksnio audinių kultūros ląstelėmis. Taigi reikalingi metodai, kurie sukuria virusus, galinčius įveikti šias ribojančias kliūtis in vivo . Elegantiškai kuriant labai stiprius virusus, Kuhn ir kt. 14 aprašyta ir patvirtinta in vitro metodika efektyvesniems onkolitiniams adenovirusams generuoti nukreiptos evoliucijos būdu. Jie privertė rekombinaciją tarp įvairių adenovirusų padermių, kad būtų sukurtas naujas, labai stiprus onkolitinis virusas ColoAd1. Tačiau šis metodas apsiriboja virusais, turinčiais dvigubus grandinius. Tikėtina, kad viengrandžių neigiamų genomo virusų, tokių kaip paramiksovirusai, rekombinacija neįvyks, o biologinę selekciją būtų galima atlikti tik remiantis stochastiškai vykstančiomis pavienėmis mutacijomis. Todėl norint ištirti šios klasės viruso biologinės selekcijos galią, reikia naujų metodų. Šiame rankraštyje aprašome ir patvirtiname, kad onkolitinio NDV in vivo selekcija in vivo žmogaus naviko ksenografuose yra galingas būdas išskirti virusus, pasižyminčius didesne onkolitine galia nei jų tėvų padermė tiek in vitro, tiek in vivo .

Rezultatai

NDV MTH87 biologinė atranka žmogaus naviko ksenografijoje

Navikas yra labai sudėtingas organas, kurį sunku tiksliai modeliuoti paprastose in vitro audinių kultūros sistemose. Neaišku, kokio faktoriaus ar veiksnių derinio trūksta dabartinėse in vitro audinių kultūros sistemose, ypač svarbiuose renkantis NDV, kurios efektyviai replikuoja, platina ir lizuoja naviko ląsteles. Žmogaus fibrosarkomos ląstelių linija HT1080 yra pavyzdinė ląstelių linija, labai jautri onkolitinių ląstelių žudymui NDV MTH68 in vitro . Tačiau in vivo pelių HT1080 navikų lizė, atlikta MTH68 būdu, nėra baigta, o virusinė infekcija plinta auglyje tik daugelyje mažų sričių (duomenys nepateikti). Todėl ši ląstelių linija yra gerai tinkama virusų, galinčių įveikti šias in vivo kliūtis, tyrimui.

Mes pasirinkome paprastą metodą, leidžiantį perduoti virusą in vivo, kad pasirinktume variantus, kurie turėjo savybių, kurios padidino šių virusų aktyvumą in vivo, palyginti su pradiniu viruso štamu. Šia metodika siekiama išnaudoti natūralų mutacijos greitį, būdingą bet kuriam replikuojančiam organizmui. Apskaičiuota, kad RNR virusų mutacija yra 0, 7 vienam viruso genomui per kartą. 15 Taigi 107 viruso dalelių populiacijoje, kuri galėtų būti skiriama pagal tradicinį naviko ksenografo modelį, turėtų būti apskaičiuota 0, 7 × 107 mutavusių virusų genomų populiacija ir, darant prielaidą, kad tai įvyksta nepažeidžiant būdų, turėtų būti sukurkite 7 × 10 6 įvairovę. Siekėme panaudoti šią natūralią įvairovę, kad galėtume identifikuoti labai stiprius virusus, naudodamiesi naviko sudėtingumu, kad pasirinktume labai stiprius variantus in vivo . Mūsų eksperimentinėje sistemoje naviko ksenografą turinčios pelės buvo gydomos rekombinantiniu NDV, turinčiu transgeninį GFP (MTH87). 12 Pažymėtina, kad gydymo metu vienas iš navikų reikšmingai nepadidėjo (pelė 3/5, 1a pav.). Priešingai, visos augliais gydomos naviką turinčios pelės turėjo būti sunaikintos per 2 savaites po gydymo dėl naviko naštos. Todėl buvo manoma, kad variantas ar variantai pelėse 3/5 efektyviai replikavosi ir plinta, todėl geriau augo navike nei tėvų gydytas virusas.

Image

Onkolitinio NDV naviko praeinimas. a ) HT1080 ksenografų auglio augimo kreivė nuogoms pelėms. Ištisinė linija: transporto priemonėmis gydomų gyvūnų vidurkis; punktyrinė linija: virusų (MTH87) gydytų gyvūnų vidurkis; punktyrinė linija: atskira pelės augimo kreivė 3/5. b ) Dviejų biologinės atrankos procedūrų etapų schema. c ) sincitijos formavimasis po infekcijos. Susilpnėjusios MiaPaCa naviko ląstelės buvo užkrėstos maketu (viršuje), MTH87 virusu (viduryje) arba vienkartiniu naviko praeinamu viruso telkiniu (apačia), kurių MOI buvo 0, 001. Praėjus 24 val. Po užkrėtimo, ląstelės buvo nudažytos Giemsa tirpalu, kad būtų galima parodyti sincitiją.

Visas dydis

Norėdami įrodyti, kad auglyje vis dar buvo replikuojantis virusas, auglys buvo pašalintas iš išnaikinto gyvūno, jis buvo išpjaustytas į dalis ir inkubuotas ant vieno sluoksnio HT29 žmogaus storosios žarnos karcinomos ląstelių (1b pav.). Šios ląstelės buvo pasirinktos kaip indikatorinės ląstelės, nes jos rodo stiprią viruso būdu išreikšto GFP ekspresiją po užkrėtimo MTH87, prieš jas užmušant. Jie taip pat yra geros ląstelių augintojos, galinčios sustiprinti virusą. Po inkubacijos su naviko gabalėliais buvo galima aptikti GFP teigiamas ląsteles (duomenys nepateikti). Tai buvo įrodymas, kad virusas vis dar buvo navike ir kad jis vis dar galėjo užkrėsti naviko ląsteles ir sukelti transgeno išraišką. Pakartotinai išskirti virusai buvo amplifikuoti HT29 gamintojo ląstelėse ir titruojami. Vėliau naviko viruso telkinys buvo apibūdinamas įvairių naviko ląstelių užkrėtimu. Kai MiaPaCa žmogaus kasos karcinomos ląstelės, kurios yra labai jautrios MTH68, panašios į HT1080 ląsteles, buvo inkubuotos su tuo virusu, pastebėtas pastebimai sustiprėjęs sincitijos susidarymas vienkartiniame ląstelių sluoksnyje (1c paveikslas). Šis fenotipas parodė, kad viruso biologinis pasirinkimas atrinko bent kelis fenotipiškai skirtingus virusus. Ji taip pat pasiūlė, kad sustiprėjęs sincitijos susidarymas yra susijęs su padidėjusia onkolitine ksenografijos galia.

Po pirmojo naviko pravažiavimo virusas buvo amplifikuotas vištų kiaušiniuose, kad būtų gautos aukštos titrų atsargos antram biologinės atrankos etapui. Viruso fondas vėl buvo įšvirkštas į navikinių pelių ksenografus. Po 32 dienų vienas auglys vėl buvo išaiškintas ir virusas galėjo būti pakartotinai išplatintas ląstelių kultūroje HT29 ląstelėse. Tada HT29 ląstelių supernatantas buvo naudojamas atskiriems viruso variantams išskirti iš biologiškai parinkto viruso MTH87.

Dėl biologinės selekcijos susidaro keli skirtingi fenotipiniai viruso klonai

Atskiri virusai buvo išskirti dvigubu apnašų valymu. Iš 48 atskirų virusų, kurie buvo išskirti ir iš pradžių analizuoti, buvo atrinkti 8 izoliatai, skirti išplėsti ir toliau apibūdinti, nes po HT29 ląstelių užkrėtimo jie turėjo individualius fenotipus. Šiems aštuoniems izoliatams buvo atliekamas antrinis apnašų valymas, o 2a paveiksle pavaizduoti pavieniai reprezentatyvūs „apnašos“ po užkrėstų sulipusių HT29 monosluoksnių, kurių labai mažas infekcijos kartotinis (MOI) - 0, 0001. Galima pastebėti, kad izoliatuose 15, 30 ir 37 aiškiai pastebimas sincitijos susidarymas, priešingai nei tėvų virusas MTH87, kuris nesukelia ląstelių-ląstelių suliejimo HT29 ląstelėse. Izoliatas (cl) 45 parodė pagreitintą plitimą monosluoksnyje, po kurio padidėjo GFP išreiškiančios plokštelės po 24 val.

Image

Biologinė selekcija duoda skirtingus viruso klonus, turinčius skirtingas savybes. ( a ) HT29 naviko ląstelės buvo užkrėstos tėvystės viruso MTH87 MOI 0.0001 ir aštuoniais atrinktais dvigubai apnašuose išvalytais biologiškai parinkto viruso izoliatais. Praėjus 24 val. Po užsikrėtimo, buvo paimti tipiškų atskirų plokštelių fluorescenciniai mikrofotografiniai vaizdai, parodantys infekcijos eigos skirtumus tarp atskirų klonų. Visi klonai išlaikė transgeno GFP ekspresiją. ( b ) Viruso plitimas: Konluenciniai HT29 ląstelių sluoksniai buvo užkrėsti 0, 001 nurodyto viruso MOI. Praėjus 0, 24 ir 48 valandoms po užkrėtimo, ląstelės buvo suspenduotos atliekant tripsinizavimą ir atliktos GFP-FACS analizė. Ląstelės, užkrėstos virusu ir išreiškiančios transgeninį GFP, bus įvertintos teigiamai. GFP teigiamų ląstelių procentinė dalis nubraižoma atsižvelgiant į laiką kaip infekcijos plitimo rodiklį. c ) Viruso augimo greitis: Konluentinės HT29 ląstelės buvo užkrėstos nurodytais virusais. Virusų titras buvo nustatytas infekcijos metu apnašų tyrimu. Histograma parodo maksimalų titro padidėjimą per 24 valandas, tai yra maksimalų viruso augimo greitį šiose ląstelėse. d ) Citotoksiškumas: žmogaus navikinės ląstelės NCI H460, HT1080 ir HT29 buvo užkrėstos nurodytais virusais, kurių MOI yra 0, 01. Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTS tyrimu praėjus 72 valandoms po užsikrėtimo. Histograma rodo visų trijų ląstelių linijų eksperimento vidutinę vertę.

Visas dydis

Biologinis pasirinktų klonų apibūdinimas

Norint kiekybiškai įvertinti virusinės infekcijos plitimą, GFP teigiamų ląstelių dalis po infekcijos buvo nustatyta atliekant fluorescencijos būdu aktyvuotų ląstelių rūšiavimo (FACS) analizę. Kaip matyti 2b paveiksle, aštuonių atrinktų izoliatų pasiskirstymo tempai buvo skirtingi. Kai kurie izoliatai greitai pasklido ląstelių sluoksnyje (15, 45, MTH87), kiti - tarpinis (48, 37, 30, 27, 29) ir pliso žymiai lėčiau. Tik cl 45 sąlygojo reikšmingą ląstelių mirtį tokiomis eksperimentinėmis sąlygomis, tai parodo sumažėjęs GFP teigiamų ląstelių skaičius. Po 48 h visi klonai lėmė, kad daugiau nei 70% ląstelių buvo užkrėstos ir išreiškusios viruso transgeno GFP.

Infekcijos plitimo greitis nebūtinai turi atitikti viruso replikacijos greitį, kuris matuoja viruso dalelių padidėjimą ląstelės supernatante. Todėl buvo išmatuotas ir aštuonių izoliatų viruso replikacija. Maksimalus infekcinių viruso dalelių (apnašas formuojančio vieneto (pfu)) padidėjimas supernatante per 24 valandas po HT29 ląstelių užkrėtimo yra parodytas 2c paveiksle. Tėvų virusas MTH87 aiškiai pasižymi didžiausiu augimo greičiu. Izolito cl45, kurio mikroskopiniu būdu stebimas greičiausias išplitimas, viruso dalelių amplifikacija yra tik tarpinė. Mažiausias replikacijos greitis buvo izoliato cl37, kuriame susidarė didžiausia sincitija, formavime.

Tradicinis onkolitinės potencijos rodiklis yra citotoksiškumas in vitro . Norint ištirti šią atskirų izoliatų savybę, trijų skirtingų žmogaus navikinių ląstelių linijų (NCI H460 nesmulkialąstelinis plaučių vėžys, HT29 storosios žarnos karcinoma, HT1080 fibrosarkoma) vientisieji sluoksniai buvo užkrėsti žemu MOI (0, 01). Po 72 valandų ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant MTS testą. 2d paveiksle parodytos trijų ląstelių linijų vidutinės gyvybingumo vertės po užkrėtimo. Keli izoliatai pasižymėjo stipresniu citotoksiškumu nei tėvų MTH87 virusas. Iš šio eksperimento buvo padaryta išvada, kad izoliatai cl 30, cl 37 ir cl 45 pasižymi didžiausia in vitro onkolitine galia. Todėl šie trys izoliatai buvo atrinkti tolesnei analizei ir apibūdinimui. Reikia pažymėti, kad trys labiausiai citotoksiniai klonai neturi panašių savybių fusogeniškumo, viruso plitimo ir augimo greičio atžvilgiu (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Padidėjusi onkolitinė potencija daugialąsteliniuose sferoiduose ir navikuose

Greitesnis plitimas, stebimas naudojant cl 45, gali prisidėti prie padidėjusios onkolitinės potencijos. Taip pat padidėjęs gebėjimas sulieti ląsteles, kaip pastebėta naudojant cl 30 ir cl 37, gali būti privalumas onkolitiniam virusui. Tėvų virusas NDV MTH87 yra labai citotoksinis virusas, kai jis taikomas vienkartinėms ląstelių ląstelėms. 12 Priešingai, naviko audinyje virusas yra daug mažiau naikinantis ir paprastai nesugeba išnaikinti visų apdoroto ksenografo ląstelių naviko ląstelių (Beier ir kt. , Neskelbti duomenys). Norėdami išbandyti biologiškai atrinktus viruso izoliatus labiau kliniškai reikšmingomis sąlygomis, mes panaudojome ląstelių sferoidus, kad gautume onkolitinio viruso trimatį substratą. Žmogaus storosios žarnos karcinomos HCT116 ląstelės gali būti auginamos kaip sferoidai, kurių skersmuo yra iki 400 μm. Vieno sluoksnio jie yra jautrūs MTH87 infekcijai ir, nors šios ląstelės demonstravo stiprią GFP ekspresiją, jos neparodė reikšmingos sincitijos (duomenys nepateikti). HCT116 sferoidai keletą dienų buvo užkrėsti tėvų virusu MTH87 arba biologiškai parinktais klonais, esant žemam MOI (3 pav.). Visi virusai sukelia ląstelių žudymą. Tačiau tėvų virusas buvo mažiau efektyvus nei klonai, šalinant 3D modelio ląsteles. Palyginus su monosluoksniais, onkolitinis poveikis sulėtėja keliomis dienomis, o tai rodo, kad 3D ląstelių pakavimas yra kliūtis viruso plitimui. Per 2 dienas po užsikrėtimo tik sferoidų kraštas užsikrečia ir sunaikinamas. Tik po 5–9 dienų virusas pasiekia sferoidų centrą ir galiausiai nužudomas. Infekcija tėvų virusu MTH87 nesudaro galimybės visiškai užmušti sferoidų ląstelių. Ląstelių gyvybingumo kiekybinio įvertinimo rezultatas (3b pav.) Atitinka mikroskopinius duomenis, patvirtinančius, kad visi trys tirti klonai yra stipresni onkolitiškai nei jų tėvų virusas.

Image

Dviejų ląstelių sferoidų pasirinktų klonų apibūdinimas. a ) HCT116 ląstelės buvo auginamos kaip sferoidai. Sferoidai, kurių vidutinis skersmuo 1000 μm, buvo užkrėsti MOI = 0, 01 nurodytų virusų. Infekcijos metu buvo stebimi atskiri sferoidai ir nurodytais laiko momentais buvo nufotografuota mikrofotografija su × 2, 5 objektyvu. b ) Citotoksinio poveikio kiekybinis įvertinimas, kaip nurodyta a punkte. Sferoidai buvo atskirti 7 dienas po užsikrėtimo ir gyvybingumas buvo nustatytas naudojant MTS testą. Histograma parodo užkrėstų ląstelių gyvybingumą, palyginti su modeliais apdorotomis ląstelėmis. ( C ) HCT116 ląstelės buvo auginamos kaip dideli daugialąsčiai agregatai, kurių skersmuo ∼ 3000 μm. Ląstelės buvo užkrėstos MOI = 0, 01 viruso ir atskiros duobutės buvo stebimos 8 dienas. Nurodytais laikais buvo darytos mikrofotografijos su × 2, 5 objektyvu tiek šviesiame lauke, tiek GFP fluorescencija. Vaizduose parodyta dviejų kanalų perdanga, siekiant parodyti viruso plitimą sferidose.

Visas dydis

Be sferoido tyrimų, taip pat buvo generuojami dideli daugialąsčių agregatai, kurie buvo naudojami infekcijų tyrimams. Šie disko formos ląstelių kompleksai gali pasiekti 2000 μm skersmenį. Po 1 dienos užkrėtimo GFP virusais, užkrėstas plonas ląstelių sluoksnis, esantis sferoido krašte, ir išreiškiantis transgeną (3c paveikslas). Negalima pastebėti jokių akivaizdžių virusų skirtumų. Praėjus 4 dienoms po užsikrėtimo, virusiniu būdu išreikštas GFP taip pat gali būti aiškiai aptinkamas ir agregatų centre po užkrėtimo 37 ir 45 izoliatais. Viruso plitimas nuo krašto iki centro yra uždelstas po užkrėtimo 30 ir dar daugiau izoliatų. uždelstas po užsikrėtimo tėvų laukinio tipo virusu. Pastebėtina, kad visi virusai nesugebėjo lizuoti agregatų, nors dauguma ląstelių nebebuvo gyvybingi (vertinant pagal trypano mėlyną dažymą, duomenys nepateikti).

Parodydami padidintą biologiškai atrinktų virusų klonų potencialą in vitro 3D naviko ląstelių modelyje, mes norėjome išbandyti biologiškai parinktų virusų onkolitinį stiprumą taip pat ir in vivo naviko modelyje. Nuogytoms pelėms buvo transplantuotos žmogaus HT1080 naviko ląstelės ir jos buvo apdorotos po to, kai naviko plotas pasiekė 20 mm 2 izoliatais cl 30, cl 37, cl 45, taip pat tėviniu štamu MTH87. Visi gyvūnai gavo 3 × 107 pfu dozę 7, 14 ir 21 dienomis. 4 paveiksle parodyti atskirų gyvūnų naviko augimo kreivės. Visi kontroliniais gyvūnais gydyti kontroliniai gyvūnai turėjo būti sunaikinti iki 14 dienos dėl naviko slogos (4 paveikslas, viršuje). MTH87 parodė reikšmingą naviko augimo slopinimą, kai kuriems gyvūnams reaguojant geriau nei kitiems. Gydymas visais trimis atskirais biologiškai atrinktais izoliatais davė žymiai geresnį priešnavikinį poveikį nei gydymas tėvų virusu. Visi gyvūnai turėjo augimo slopinimą arba visišką naviko atsaką. Kai kurie gyvūnai mirė eksperimento metu (vienas gyvūnas buvo gydomas grupėmis 30–50 ir 45, 2 gyvūnai - 37 grupių gydymo grupėje). Šie reiškiniai buvo pastebėti vėliau nei kontrolinių gyvūnų nužudymas dėl naviko naštos. Nebuvo jokio bendro kūno svorio sumažėjimo visose gydymo grupėse, palyginti su tirpikliais gydytose grupėse. Priešingai nei gydymas tėvų virusu, klonai ne tik sulėtino naviko augimą, bet ir sukėlė visišką atsaką, kurio nepastebėta naudojant laukinio tipo virusą. Daugiausia atsakiusiųjų buvo pastebėta grupėje, gydytoje 45 izoliatu (4 iš 8), po to 30 (2 iš 8) ir 37 (2 iš 8) ir MTH87 (0 iš 8).

Image

In vivo priešnavikinis poveikis. Nuogos pelės buvo persodintos naudojant HT1080 žmogaus ksenografus. Navikai buvo gydomi intratumoriškai, vartojant vienkartinę 3 × 107 pfu dozę, bet kurio buferio, tėvų viruso arba auglio praeinamų klonų cl 30, cl 37 ar cl 45. Diagramos rodo atskirų navikų augimą (naviko plotą). kiekvienoje grupėje ( n = 8) 70 dienų po gydymo. Gydymas dviem atskirai atrinktais izoliatais sukelia atsakymus: 0 su MTH87, 2 su cl 30, 2 su cl 37 ir 4 su cl 45.

Visas dydis

Galima daryti išvadą, kad atlikus MTH87 atrinkimą žmogaus naviko ksenografuose, virusai padidėjo onkolitiškai ne tik in vitro, bet ir in vivo .

Atrinktų klonų paviršiaus baltymų molekulinis apibūdinimas

Stebint, kad kai kurie iš biologiškai parinktų klonų skyrėsi sincitijos formavimuisi, prie skirtingų paviršinių baltymų genų mutacijų, sulietų baltymų F ir hemagglutinino neuraminidazės baltymo HN, mutacijos greičiausiai prisidėjo prie skirtingų onkolitinių savybių. Norint suprasti, ar pakitę fenotipai lemia tam tikras tų baltymų mutacijas ar variacijas, buvo išanalizuota F ir HN seka ir palyginta su tėvo viruso genais.

Buvo įmanoma nustatyti keletą bazės pakaitalų, kai kurie iš jų taip pat keičia atitinkamo baltymo aminorūgščių seką (apibendrinta 2 lentelėje). Tikėdamiesi iš fuzogeninių fenotipinių izoliatų cl 30 ir cl 37 išskirti sulietų baltymų skirtumus. Tačiau F baltymo pokyčiai buvo nustatyti tik cl 30 (2 lentelė). Priešingai, mes negalėjome aptikti jokio amino rūgšties pokyčio F37 baltymuose, esančiuose cl 37 ir cl 45, nors cl 37 turėjo stiprią fuzogeninį fenotipą. Todėl izoliato cl 37 gebėjimas sudaryti daugiau sincitijų nei tėvų virusas turi būti nepriklausomas nuo F baltymo geno sekos.

Pilno dydžio lentelė

Visų tirtų izoliatų HN baltymuose buvo pastebėti aminorūgščių pokyčiai. Vienas iš pakeitimų, T118A, būdingas visiems trims izoliatams, o N119K yra bendrai tarp cl 37 ir cl 45. Šie ryšiai rodo, kad klonai neatsirado visiškai nepriklausomai. Įprasta mutacija T118A yra beveik visuose sekamuotuose HN baltymuose „Genbank“ duomenų bazėje. D82N aprašytas kaip F-sąveikaujantis regionas HN kamiene. Aprašyta E495V mutacija, pakeičianti monokloninių antikūnų atpažinimą. Nebuvo pranešta apie kitų mutacijų funkciją.

HN baltymo mutacijos koreliuoja su padidėjusiu fusogeniškumu

Iš sekos rezultatų, gautų naudojant cl 37, buvo aišku, kad F baltymo skirtumai negali būti atsakingi už ląstelių ir ląstelių sintezės elgesio skirtumus tarp virusų. Ląstelių membranų suliejimui yra aprašyta, kad vien F nepakanka, o veikiau turi bendradarbiauti su HN baltymu. Labai tikėtina, kad būtina F ir HN sąveika. 18, 19 Todėl mes norėjome išbandyti, ar vietoj F HN baltymų pokyčiai buvo padidėjusio fusogeniškumo priežastis. Tuo tikslu cl 30, cl 37 ir cl 45 HN baltymų genai buvo klonuoti kaip papildoma DNR į eukariotų ekspresijos plazmides. Šių ekspresijos plazmidžių laikinas transfekcija atskirai davė labai panašų dažymo modelį kaip transfekcija su wt genu (5a pav.). Nebuvo pastebėta jokių akivaizdžių skirtumų ląstelių monosluoksnio, membranos dažymo ar intensyvumo lygiuose. Apibūdinama, kad paramyksovirusų suliejimo ekspresijos plazmidžių ir hemagglutinino baltymų kotransferacijų pakanka ląstelėms-ląstelėms sulieti (pvz., Sergel ir kt., 19 ). ir atitinkamų HN mutantų iš biologiškai parinkto viruso klono. Pastebėtas aiškus ląstelių ir ląstelių sintezės savybių skirtumas (5b pav.). Tuo tarpu laukinio tipo HN sukelia tik mažą sincitiją, o visi HN baltymai, gauti iš naviko paslanuotų izoliatų, sąlygojo žymiai didesnę sincitiją. HN iš cl 37 parodė didžiausią fusogeninės savybės padidėjimą, suderinant su savybėmis, kurios jau pastebėtos virusinei infekcijai HT29 ląstelėse (2a pav.). Taigi, norint įvertinti padidėjusį viruso fusogeniškumą, pakanka atskirų HN baltymo aminorūgščių pokyčių.

Image

HN baltymų molekulinis apibūdinimas. ( a ) U2OS ląstelės buvo transfekuotos ekspresijos plazmidėmis, koduojančiomis nurodytų virusų HN baltymą. Praėjus 48 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo nudažytos antikūnais prieš NDV ir antriniu anti-vištienos Cy3 antikūnu, taip pat Hoechst33258. Raudona fluorescencija parodo HN baltymo raišką ląstelėse, mėlyna fluorescencija rodo visų ląstelių branduolius ant dangtelio. Paveikslėliai buvo padaryti su × 20 objektyvu. ( b ) U2OS ląstelės buvo kotransfekuotos nurodytų baltymų ekspresijos plazmidėmis. Praėjus 48 val. Po transfekcijos, ląstelės buvo fiksuotos ir nudažytos Giemsa tirpalu, kad būtų galima pamatyti sincitijos susidarymą. Paveikslėliai buvo padaryti su 10 × objektyvu.

Visas dydis

Biologiškai parinkti virusai neturi padidėjusio toksiškumo natūraliai vištai-šeimininkei

NDV yra viščiukų patogenas. Aprašytas rekombinantinis virusas MTH87 yra gautas iš mezogeninio padermės, klasifikuojamos kaip gyvūnų patogenas. Svarbu, kad virusai, suprojektuoti ir parinkti dėl onkolitinės potencijos žmonių navikuose, nekeltų didesnio rūpesčio naminių paukščių saugai. Dėl to padidėjęs viruso stiprumas, padidėjęs toksiškumas naminiams paukščiams, nėra priimtinas gydant onkolitinį virusą. Dėl šios priežasties buvo parinktas dviejų pasirinktų klonų patogeniškumas natūralioje vištoje šeimininko vietoje. Dešimties dienų embrionuotų vištų kiaušiniai buvo užkrėsti tuo pačiu MOI visais virusiniais izoliatais, palyginti su pirminiu virusu, ir embrionų išgyvenimas buvo stebimas du kartus per dieną (6 paveikslas). Didžiausias mirštamumas buvo užkrėstas MTH87. Visų biologiškai atrinktų izoliatų embrionų išgyvenamumas buvo panašus arba geresnis. Apskaičiuotas vidutinis izoliatų mirties laikas yra 40–64 val., Palyginti su 36 valandomis laukinio tipo MTH87. Taigi izoliatorių cl 30, cl 37 ir cl 45 atveju biologinė selekcija žmogaus naviko audinyje nepadidino bendro viruso toksiškumo. Todėl biologiškai parinkto NDV toksiškumas ir onkolitinis stiprumas nėra tiesiogiai susiję.

Image

NDV toksiškumas vištų kiaušiniuose. Vienuolika 10 dienų embrionuotų vištų kiaušinių buvo užkrėsti 4000 pfu nurodytų virusų. Po užsikrėtimo embionų išgyvenamumas buvo stebimas du kartus per dieną 5 dienas. Diagrama rodo išlikusių embrionų skaičių atitinkamu laiko momentu.

Visas dydis

Diskusija

Šis darbas parodo, kad labai galingų onkolitinių NDV virusų išskyrimui gali būti naudojama in vivo biologinė selekcija, kuria siekiama išnaudoti mažą paramiksovirusų mutacijų greitį, dėl kurio kiekvieno kamieno mikrovariantai atsiranda tik po kelių genomo replikacijų. Savo tyrime mes pademonstravome metodikos galią išskirti ir išplėsti retą variantą, kuris turi norimų, pasirinktų savybių. Retas šių izoliatų pobūdis patvirtina ankstesnį darbą, kuris apibrėžė NDV genominį stabilumą ir palaiko viruso saugumą ir farmacinį naudingumą.

Nors visi izoliatai vis dar ekspresuoja transgeno GFP (bespalvės sincitijos nepastebėta, duomenys nepateikti), klonai parodė ryškius infekcijos plitimo ir gebėjimo formuoti sincitiją skirtumus, ypač lyginant su tėvų virusu. Apibūdinus aštuonių išrinktų iš dviejų atskirų izoliatų atranką, trims izoliatams nustatytas ryškus onkolitinio stiprumo padidėjimas, kai buvo tiriami sukibusios ląstelės. Tačiau nepavyko aptikti bendro fenotipo. Tuo tarpu izolatas cl 37 turėjo stiprų fuzogeninį fenotipą, cl 45 nebuvo labai fuzogeninis, bet labai greitai pasklido ląstelių kultūroje. Kai naviko ląstelės yra užkrėstos labai didele doze (MOI 1), siekiant įvertinti onkolitinį poveikį, beveik nepriklausomą nuo viruso replikacijos, įdomu, kad Cl 45 yra beveik mažiausiai stiprus iš aštuonių klonų (papildomas S4 paveikslas). Tai rodo, kad pagrindinis cl 45 pranašumas yra greitas replikacija ir viruso plitimas, o ne citotoksiškumas. Ši savybė ilgainiui gali būti modifikuota į vieną iš kitų klonų, kad dar labiau padidintų onkolitinę galią.

Remiantis šiais duomenimis, akivaizdu, kad įvairios skirtingos viruso savybės, atsirandančios dėl subtilaus baltymo sekos kitimo, panašiai veikia onkolitinį poveikį. Gerai įsivaizduojama, kad bus įmanoma suprojektuoti dar stipresnius virusus, kai šie savarankiškai atsirandantys variantai bus sujungti į genetiškai modifikuotą virusą.

Siekdami geriau apibrėžti galimą šių virusinių variantų klinikinį aktyvumą, išbandėme jų aktyvumą trijų dimensijų ląstelių sferoidais, kurie labiau modeliuoja in vivo situaciją. 20, 21, 22 Šis modelis buvo pritaikytas šiame tyrime. Eksperimentai iš tikrųjų parodė, kad pasirinktų virusų skverbtis skiriasi. Tačiau buvo pastebėta, kad nors cl 45, kuris yra daug mažiau fuzogeninis nei cl 37, turėjo panašų infekcijos modelį ir geresnį skverbimąsi nei laukinio tipo virusas. Todėl pastebėtas poveikis sferoido modelyje negali būti išimtinai siejamas su geresniu izoliato suliejimu tarp ląstelių. Mūsų eksperimentuose padidėjęs sferoidų citotoksiškumas koreliuoja su padidinta in vivo onkolitine galia, palaikančia 3D modelių naudingumą tyrimams su onkolitiniais virusais.

Remdami eksperimentus in vitro, ksenografijos eksperimente taip pat aprašome padidėjusį biologiškai parinktų virusų priešnavikinį poveikį in vivo (5 pav.). Ląstelės, kurios buvo naudojamos tam eksperimentui (HT1080), labai lengvai sudaro sincitiją in vitro . Todėl fusogeninis izoliatų fenotipas gali būti nepakankamai įvertintas ir gali būti ryškesnis mažiau fuzogeninių naviko ląstelių, pavyzdžiui, HCT116 ar HT29, ląstelėse. In vitro tyrimais negalima išmatuoti viruso klirenso iš organizmo. Todėl įmanoma, kad cl 30 ir cl 45, kurių atsakas yra didžiausias in vivo (papildomas S2 paveikslas), turi galimybę likti organizme ilgiau nei tėvų virusas ir cl 37. Cl 30 ir cl 45 virusą buvo galima išskirti iš likusių navikų, kurie neauga 55 dienas po gydymo (duomenys nepateikti). Viruso baltymo ekspresija auglyje 76 dieną buvo patvirtinta imunohistochemija (papildomas paveikslas S3). Reikia išaiškinti šio viruso atsparumo molekulinius pagrindus.

Daugiausia atsakiusiųjų ir geriausias priešnavikinis poveikis buvo pastebėtas naudojant cl 45. Šiam izoliatui būdingas ypač greitas plitimas ir didelis toksiškumas in vitro . Todėl atrodo, kad viruso plitimo iš ląstelių greitis yra kritinis veiksnio onkolitinio viruso veiksnys. Tai sutinka su siūlomais virusinės onkolitinės terapijos matematiniais modeliais, 23, 24, kurie padarė išvadą, kad efektyvus naviko ląstelių žudymas yra kritiškai priklausomas nuo to, kaip greitai virusas lizuoja užkrėstas ląsteles. Dabar mūsų išvados eksperimentiškai visiškai palaiko šiuos modelius.

NDV genomas koduoja šešis pagrindinius baltymus. Du iš jų yra transmembraniniai baltymai ir yra ekspresuojami viruso paviršiuje: sulietas baltymas F ir hemagliutinino neuraminidazės baltymas HN. HN yra prisijungimo baltymas, o F yra atsakingas už viruso apvalkalo susiliejimą su ląstelės-šeimininkės membrana. Kai F ir HN išreiškiami kaip transgenas ląstelėse arba transfekcijos, arba infekcijos būdu, daugelyje ląstelių susidaro sincitija, susiliejus ląstelėms. Kai kurie F baltymai gali skatinti vien ląstelių suliejimą. Vien HN neturi ląstelių sintezės aktyvumo. Jei F yra ekspresuojamas kartu su homotipiniu HN-baltymu, sincitijos formavimasis žymiai sustiprėja. 25 Tikslus HN sintezės skatinamosios veiklos mechanizmas vis dar nežinomas. NDV F baltymo mutacija 3 heptado srityje (L289A) lemia padidėjusį baltymo fusogeniškumą. 26

Norint suprasti biologiškai parinktų virusų sintezės elgsenos skirtumų molekulinius pagrindus, buvo padalijami paviršiaus baltymai. Kadangi paramiksoviruso fusogeniškumą daugiausia lemia F baltymas, buvo tikimasi, kad F baltymo mutacijos buvo pastebėtų skirtumų tarp biologiškai parinktų izoliatų priežastis. Stebėtina, kad labiausiai fuzogeninis izoliatas cl 37 nepakeitė F baltymo aminorūgščių sekos, palyginti su tėvų virusu. Priešingai, buvo nustatyti aminorūgščių pokyčiai HN baltyme. Iš trumpalaikio kotransfekcijos eksperimentų (5 paveikslas) daroma išvada, kad šios HN baltymo mutacijos iš tiesų lemia padidintą fusogeniškumą. Kadangi HN baltymų ekspresija neturi įtakos, aminorūgščių pokyčiai turi mechaniškai paveikti ląstelių suliejimą.

Vienintelė bendra mutacija tarp visų trijų analizuotų klonų yra T118A. Beveik visos paskelbtos HN sekos turi A vietą 118 vietoje (BLAST (pagrindinis vietinio suderinimo paieškos įrankis) - užklausa). Todėl gali būti, kad reta išimtis 118-T, esanti MTH68, veikia kliūdama ląstelių ir ląstelių susiliejimui. Aa 259 molekulinė funkcija nėra aprašyta. Žiūrint į 3D HN struktūrą, aminorūgštys E259, taip pat E495, yra ant paveikto baltymo paviršiaus. 27 Tačiau nėra įrodymų, ar jie sąveikauja su F-baltymu.

Ren et al. 28 paveiksle aprašytas heptado pakartotinių mutacijų F poveikis nuo HN priklausomai fuzijai, o L289A mutacija F aprašoma ypač siekiant sustiprinti sincitijos formavimąsi. 26 Priešingai nei F, visi HN baltymo aminorūgščių pokyčiai, kurie buvo nustatyti šiame tyrime, dar nebuvo susieti su sintezę skatinančia funkcija, todėl šie duomenys gali padėti išsiaiškinti HN vaidmenį NDV sintezėje.

Įrodyta, kad daugiau fusogeninių baltymų gali padidinti viruso onkolitinę galią, pvz., NDV F L289A, esantis VSV, 29 rodo, kad onkolitinio viruso gebėjimas sudaryti sincitiją koreliuoja su potencija. Jei svetimi hiperfuzogeniniai transgenai, tokie kaip GALV, yra ekspresuojami kitais rekombinantiniais onkolitiniais virusais, galima sustiprinti ir 30, 31, 32 virusų , palaikančių šią hipotezę, potenciją.

Šie rezultatai tvirtai rodo, kad ląstelių suliejimas yra privalumas onkolitinei potencijai. Our unpublished results from immunuhistochemistry of infected tumors with MTH68 wild-type virus show an incomplete penetration of the infection within the tumor and strongly argue that a major limit of the in vivo efficacy of NDV is the limited intratumoral spread. That issue may be overcome by enhanced fusogenicity of the virus as also supported for vaccinia virus. 33 Alternatively, relaxin as a transgene that enhances intratumoral spread is able to increase the oncolytic efficacy of an adenovirus. 33, 34

Although the enhanced fusogenicity of the clones can be pinpointed to the mutations in the HN protein, it is still not fully understood what accounts for the enhanced oncolytic effect. Additional mutations in the other genes or the regulatory sequences may contribute. Consequently, future studies will be required to completely sequence these viruses and then systematically separate driver from passenger mutations in the virus genome.

We were able to identify more potent oncolytic viruses by bioselection. To rule out the concern that increased oncolytic potency is also associated with increased toxicity towards normal cells, we infected normal primary fibroblasts with the clones in comparison with the parental virus. There was no significant difference in the cytotoxicity in that experiment (Supplementary Figure S1). The bioselected clones, therefore, maintain the tumor selectivity of the parental virus.

Because we were studying a mesogenic NDV that is classified as an animal pathogen, we were also concerned that the bioselection may have resulted in virus variants that not only replicated better in human tumor but also in their natural host chicken. Although we cannot conclude from the data (Figure 5) that the bioselected clones are more attenuated, we can state that the increased oncolytic potency in human tumor cells does not directly correlate with the toxicity in chicken. This is an important finding because it will not generally limit the bioselection method. In the long term of course, it would be desirable to develop a virus that has no environmental risk any more and is completely attenuated for chicken. Whether the method of bioselection analogously to vaccine research will be useful for that purpose remains to be determined. In general, such a strategy to decrease the chicken toxicity should not automatically decrease concomitantly the oncolytic potency.

We conclude that improved oncolytic viruses compared with the parental virus MTH68 were generated for further development and that the method of bioselection is a useful tool to enhance the properties of an oncolytic paramyxovirus.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

  3. 3.

    Papildomas S3 paveikslas

  4. 4.

    Papildomas S4 paveikslas

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento genų terapijos svetainėje (//www.nature.com/gt)