Itraq pagrindu atlikta pasaulinio atsako į 17β-estradiolį kiekybinė proteominė analizė estrogeno skaidymo padermėje pseudomonas putida sjte-1 | mokslinės ataskaitos

Itraq pagrindu atlikta pasaulinio atsako į 17β-estradiolį kiekybinė proteominė analizė estrogeno skaidymo padermėje pseudomonas putida sjte-1 | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Aplinkos mikrobiologija
  • Proteomika

Anotacija

Mikroorganizmų skaidymas yra veiksmingas norint pašalinti tokius steroidinius hormonus kaip 17β-estradiolis (E2); tačiau jų skilimo mechanizmas ir metabolizmas į šias chemines medžiagas vis dar nėra labai aiškūs. Čia buvo išanalizuoti estrogeno skaidymo padermės Pseudomonas putida SJTE-1 į 17β-estradiolį ir gliukozę visuminiai atsakymai ir palyginta, naudojant iTRAQ (santykinės ir absoliučiosios kiekybės izobarinės žymės) strategiją kartu su LC-MS / MS (skysčių chromatografija-tandemas). masių spektrometrija). Buvo identifikuoti 78 baltymai su reikšmingais raiškos pokyčiais; 45 baltymai ir 33 baltymai buvo atitinkamai reguliuojami. Šie baltymai daugiausia dalyvavo reaguojant į stresą, energijos apykaitą, transportavimą, chemotaksį ir ląstelių judrumą bei anglies metabolizmą, kurie, kaip manoma, reaguoja į 17β-estradiolį ir vaidina jo metabolizmą. Buvo manoma, kad aukščiau sureguliuoti baltymai elektronų perdavimo, energijos generavimo ir transportavimo sistemose yra labai svarbūs efektyviam 17β-estradiolio įsisavinimui, translokacijai ir transformacijai. Didelė anglies apykaitos baltymų, išreikštų ląstelių ekspresija, ląstelės gali suaktyvinti 17β-estradiolį. Tuo tarpu baltymai, veikiantys fiksuojant gliukozę ir metabolizuojant, dažniausiai buvo nepakankamai sureguliuoti. Šie radiniai pateikia svarbių užuominų, kad būtų galima atskleisti 17β-estradiolio skilimo mechanizmą P. putida ir skatinti jo biologinį pakartotinį naudojimą.

Įvadas

Endokrininę sistemą ardantys junginiai (EDC) yra vienas iš labiausiai paplitusių aplinkos teršalų, kurie plačiai egzistuoja skirtingose ​​aplinkose ir daro didelį neigiamą poveikį gyvūnų ir žmonių reprodukcinei sistemai 1, 2 . Natūralūs estrogenai, sintetiniai estrogenai ir estrogeninės cheminės medžiagos yra pagrindiniai EDC komponentai; ir 17β-estradiolis yra laikomas didžiausiu natūralių estrogenų užteršimu dėl jo rimto neigiamo poveikio 3 . Nors jų koncentracija aplinkoje yra labai maža, aplinkos estrogenus sunku pašalinti. Žmonės juos gali įsisavinti vartodami maistą ir tada kelia grėsmę žmonių sveikatai 4 . Kartais keletas estrogeno metabolitų ir estrogenų neaktyviose būsenose, išleidžiamose į aplinką, gali būti paversti aktyviosiomis būsenomis, padidinant pašalinimo sunkumus 5, 6 .

Biodegradacija naudojant mikroorganizmus buvo laikoma viena veiksmingų EDC pašalinimo strategijų, o iš aktyvuoto dumblo, dirvožemio, vandenyno ir kitų ekosistemų aplinkos, tokios kaip Novosphingobium, Sphingomanas, Acinetobacter, Rhodococcus, Nocardioides ir Pseudomonas, buvo atskirtos štamai, turintys estrogeno skaidymo galimybes. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 . Dauguma štamų gali skaidyti natūralius estrogenus (E2, E1); kai kurie gali naudoti sintetinį estrogeną, pavyzdžiui, EE2, arba estrogenines chemines medžiagas, tokias kaip policikliniai aromatiniai angliavandeniliai (PAH) 15, 16, 17, 18 . Rhodococcus sp. ir Sphingomonas sp. , E2 pirmiausia buvo paverstas į E1, tada hidroksilintas, kad susidarytų 4-hidroksiestronas (4-OH-E1), po to suskaidydamas 4-OH-E1 žiedą į galutinius neestrogeninius produktus 11 . Pseudomonas spp. , ypač P. putida padermės yra plačiai tiriamos dėl jų didelių skilimo į estrogenines chemines medžiagas galimybių. P. putida OUS82, pavyzdinis naftos pakavimo organizmas, gali veiksmingai panaudoti fenantreną ir PAH 18 . Kitoms naftaleno skaidymo padermėms, P. putida ND6, P. putida G7, P. putida KT2440 ir P. putida AK5, taip pat būdingi 16, 19, 20, 21 . P. putida KA4 ir KA5 kitam EE nariui bisfenoliui A (BPA) 22 patvirtino pasižyminčius dideliu skilimo gebėjimu. Kai kurios Pseudomonas padermės gali biotransformuoti dietilostilbestrolį ir 4-nonilfenolį 23, 24 .

Nors buvo išskirta keletas estrogeno biologinio skaidymo padermių, jų visuotinis atsakas ir metaboliniai tinklai į chemines medžiagas išlieka neaiškūs dėl technologijos ir metodų apribojimų. Neseniai buvo įvertinta, kad lyginamoji proteomikos analizė yra priemonė atskleisti esminius pokyčius skirtingomis sąlygomis. Jis buvo naudojamas „ Pseudomonas“ tiriant visos ląstelės proteomų kompoziciją ir atskleidžiant biocheminius kelius ir pagrindinius efektorius, padedančius dėmėms pritaikyti specialią aplinką. 25, 26, 27, 28 . Pavyzdžiui, skirtingą fenolio ir sukcinato metabolizmą P. putida KT2440 atskleidė lyginamoji proteomika 29 . Nustatyta, kad P. putida KT2440 sukels visuotinį atsaką į aromatinių angliavandenilių šaltinius (fenolį arba benzoatą), padidindamas arba žemyn reguliuodamas fermentų grupes, skirtas substrato įsisavinimui, transportavimui, skaidymui ir produkto eksportui. 28, 29 . Taikant „iTRAQ“ technologiją, buvo ištirtas P. fluorescens Pf5 proteomas geležies ribojimo sąlygomis ir nustatyta, kad kai kurie baltymai, dalyvaujantys receptorių sistemose, vidinės membranos pernešėjai ir antrinių metabolitų biosintezė, yra žymiai pakitę 30 . Norint ištirti proteominius pokyčius, susijusius su naftaleno skaidymu P. fluorescens ATCC 17483, buvo naudojamas sieros-34S stabilus aminorūgščių žymėjimas (SULAQ34). Atskleidžiamas specifinis į oksidacinį stresą panašus atsakas 31 . Šios išvados praplečia mūsų žinias apie mikrobų adaptacijos mechanizmus ir palengvina biocheminį kelią. Tačiau proteominiai mikroorganizmų, pritaikytų estrogeninei aplinkai, tyrimai yra reti. Kiekybinė proteomika buvo naudojama norint nustatyti galimus metabolizmo kelius, susijusius su E2 ir E1 virsmu Stenotrophomonas maltophilia ZL1 32 . Rezultatai parodė, kad fermentai, dalyvaujantys tam tikruose kataboliniuose ir anaboliniuose keliuose, buvo labai ekspresuojami, ypač lipidų biosintezės baltymai 32 . Ir Sphingomonas sp. Atlikti TTNP3 į BPA ir nonilfenolio skilimo kelius 33 . Tačiau apie Pseudomonas štamų proteominę analizę iki estrogeno streso nebuvo pranešta.

Iš dumblo išskirtas P. putida SJTE-1 sugebėjo efektyviai suskaidyti daugybę estrogenų, įskaitant 17β-estradiolį, estroną ir kitas estrogenines chemines medžiagas, ir biologiškai paversti juos ne estrogeniniais produktais14. Nors jo genomo seka buvo gauta ir komentuota, visuotinis jo atsakas į estrogenus ir jo metabolinis mechanizmas vis dar menkai suprantami. Šiame darbe pritaikėme iTRAQ pagrįstą kiekybinės proteomikos technologiją, kad apibūdintume P. putida SJTE-1 proteominius profilius 17β-estradiolio aplinkoje, palyginti su gliukozės būkle. Buvo nustatyta, kad 78 baltymai yra labai sutrikę, dalyvauja reaguojant į stresą, įsisavinime ir transportavime, energijos apykaitoje, transliacijos ir nukleotidų apykaitoje bei angliavandenių apykaitoje.

Medžiagos ir metodai

Padermės, kultūrinės terpės ir chemikalai

Šiame tyrime naudojamas Pseudomonas putida SJTE-1 buvo išskirtas iš Šanchajaus, Kinijos, nuotekų valymo įrenginių dumblo 14 . „Luria-Bertani“ (LB) terpė (10, 0 g triptono, mielių ekstraktas 5, 0 g, NaCl 8, 0 g / l) ir minimali terpė (MM) (K 2 HPO 4 381, 5 mg, KH 2 PO 4 50, 0 mg, (NH 4 ) 2 HPO Šiame tyrime buvo naudojami 4 82, 5 mg, KNO 3 126, 25 mg, Na2S04 20, 0 mg, CaCl2 2, 0 mg, FeCl 3 0, 2 mg, MgCl2 2, 0 mg / L). 17β-estradiolis buvo ištirpintas bevandeniame etanolyje (> 99, 7%) iki 10 mg / ml koncentracijos, o jo darbinė koncentracija buvo 30, 0 mg / L. Kaip etaloninis anglies šaltinis buvo naudojama gliukozė, kurios koncentracija buvo 2, 0%. 17β-estradiolis (> 98%), DTT ir IAA buvo įsigyti iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, MO, JAV). Trypinas buvo pirktas iš „Promega Corporation“ (WI, JAV). Kiti reagentai buvo „China National Medicines Co., Ltd.“ (Pekinas, Kinija) produktai.

Bakterijų auginimas ir baltymų paruošimas

Pavienė P. putida SJTE-1 kolonija buvo pasėjama ir auginama LB terpėje per naktį 30 ° C temperatūroje, purtant 200 aps./min., Po to centrifuguojant 4 ° C, 5 000 aps./min. 5 minutes. Ląstelės tris kartus plaunamos 1x PBS (8, 0 g NaCl, 0, 2 g KCl, 1, 44 g Na2HP04, KH2P04 0, 24 g / l, pH 7, 4) ir pakartotinai suspenduotos granulės buvo pasėjamos į dvi kolbas, kuriose yra 100 ml minimalios terpės, papildytos 17β-estradioliu arba gliukoze, iki pradinio OD 600 = 0, 1. Augimo sąlygos buvo tiksliai suderintos abiem būdais, įskaitant indą ir aeracija. Ląstelės buvo auginamos ir surinktos vėlyvoje eksponentinėje fazėje (OD 600 = 0, 8 ~ 1, 0).

Ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos į 5 ml iš anksto atvėsinto lizės buferio (8 M karbamido, 4% CHAPS, 40 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 1 mM PMSF, 2 mM EDTA, 0, 5 mM EGTA, pH 7, 4) ir buvo sonikuotos. ledo, kol ląstelės buvo visiškai lizuotos. Ląstelių nuosėdos buvo pašalintos centrifuguojant 4 ° C temperatūroje, esant 12 000 aps / min 30 min. Supernatantai buvo nusodinami, įpilant 5 kartų atšaldyto tirpalo (etanolis: acetonas: acto rūgštis = 50: 50: 0, 1, tūris / tūris), po to centrifuguojant 4 ° C, esant 12 000 aps / min 60 minučių. Nuosėdos tris kartus plaunamos acetonu ir centrifuguojamos vakuume (Thermo Fisher Scientific Inc., DE, JAV). Tada sausi baltymai buvo ištirpinti 1 ml denatūravimo buferiu (50 mM NH4HCO3, 6 M guanidino hidrochlorido), kiekybiškai įvertinti naudojant Bradfordo metodą ir visi baltymai sureguliuoti į tą pačią 34 koncentraciją.

Baltymų virškinimas ir iTRAQ ženklinimas

Kiekvienas 200 μg bendro baltymo, esančio 200 μl denatūravimo buferyje, mėginys buvo sumažintas 2 μL 1 M DTT 60 ° C temperatūroje 1 valandą, o tada cisteino likučiai buvo užblokuoti pridedant 10 μL 1 M IAA 40 minučių kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. sąlygos. Redukuotiems ir alkilintiems baltymų mišiniams buvo atliktas FASP protokolas su centrifugavimo ultrafiltravimo įrenginiais, kurių nominali molekulinė masė buvo 10 000 Da (Sartorius, Gottingen, Vokietija), ir centrifuguota esant 20 000 greičiui 12 000 aps./min. Tada apatinis tirpalas buvo išmestas. Tris kartus išplovus 100 μl tirpinimo buferio, baltymai virškinami inkubuojant baltymus ir sekos laipsnio modifikuotą tripsiną (Promega Corporation, WI, JAV) santykiu 1:50 (tripsino ir baltymo masė), esant 37 ° C. C per naktį. Po suskaidymo, išsilaisvinti peptidai buvo surinkti centrifuguojant 20 000 aps./min. 20 min., O filtravimo elementai buvo plaunami 50 μL UA buferio. Gauti peptidų mišinių mėginiai buvo paženklinti naudojant 8-Plex iTRAQ reagentų rinkinį iš „Applied Biosystems“ („Thermo Fisher Scientific Inc.“, DE, JAV) taip: E2_1: 113; E2_2: 114; Gliukozė_1: 117; Gliukozė_2: 118. Tada pažymėti peptidų mišiniai (E2_1: 113 ir E2_2: 114, Gliukozė_1: 117 ir Gliukozė_2: 118) buvo sujungti ir išdžiovinti „SpeedVac“.

Aukštos pH atvirkštinės fazės skysčių chromatografija

Peptidų mišinys buvo ištirpintas buferiniu tirpalu A (20 mM amonio formato, pH 10, 0) ir frakcionuotas naudojant „Survey HPLC“ sistemą („Thermo Fisher Scientific Inc.“, DE, JAV) su atvirkštinės fazės kolonėle („Durashell-C18“ kolonėlė, 2, 1 mm × 250 mm, 5 μm, 100 Å, „Agela Technologies“, Wilmington, DE, JAV). Peptidai buvo išplaunami 5–30% B buferio gradientu (20 mM amonio formato 80% ACN, pH 10, 0) per 25 minutes, 15–38% B buferio per 15 minučių, 90% B buferio palaikymo 10 min. pastovus srautas - 0, 8 ml / min. Stebima absorbcija esant 214 nm, iš viso surinktos dvidešimt keturios frakcijos ir išdžiovintos vakuuminiame koncentratoriuje.

Nano LC-MS / MS

Baltymų frakcijos buvo analizuojamos naudojant LC sistemą (Eksigent 1D) kartu su ESI-Q-TOF masių spektrometru (Triple TOF 4600, SCIEX Pte. Ltd. Framingham, MA, JAV). Kiekvienas peptido mėginys buvo ištirpintas 2% acetonitrilo su 0, 1% skruzdžių rūgštimi ir po to įpiltas į Peptide gaudyklės koloną (0, 1 mm x 2 cm, 5 μm, Dionex, „Thermo Fisher Scientific Inc.“, DE, JAV) su auto LC sistemos pavyzdys. Kad mėsa būtų pašalinta ir koncentruota, gaudyklės kolonėlė 10 minučių buvo plaunama 2% acetonitrilo ir 0, 1% skruzdžių rūgšties srautu 5 μL / min. Įstrigę peptidai buvo išlaisvinti ir atskirti C18 kapiliarine kolonėle (75 μm x 150 mm, 3 μm, „Dionex“, „Thermo Fisher Scientific Inc.“, DE, JAV). Vėliau peptidai buvo išplaunami judančiąja B faze (98% ACN su 0, 1% skruzdžių rūgštimi), naudojant gradiento sistemą, naudojant tirpiklį A (99, 9% vandens su 0, 1% skruzdžių rūgšties) ir tirpiklį B (98% ACN su 0, 1% skruzdžių rūgšties). nuo 5% iki 45% B (5–100 min.), esant pastoviam srautui 300 nL / min. Masės spektrometras „Triple TOF 4600“ buvo naudojamas duomenų kaupimo režimu, kad būtų galima automatiškai persijungti iš MS į MS / MS. Elektrospurškimo įtampa buvo nustatyta 2, 5 KV; MS spektrai buvo gauti per 350–1250 m / z masės diapazoną, esant dideliam jautrumui, esant riedėjimo susidūrimo energijai. Vienam ciklui suskaidyti buvo atrinkti 25 intensyviausi pirmtakai, kurių dinaminis išskyrimo laikas buvo 25 s.

Paieška duomenų bazėse

Tandimo masių spektrai buvo išgaunami, o įkrovos būsenos dekonvoliuotos ir izotopuotos naudojant „MS Data Converter“ programinę įrangą iš „SCIEX Pte“. (Framingham, MA, JAV). Smailių sąrašas buvo tiesiogiai sugeneruotas iš sklindančių duomenų, naudojant centroido algoritmą, kurio smailės plotis buvo nustatytas kaip 0, 1 m / z, o intensyvumas virš 100. Nebuvo atliktas smailių lyginimas ar filtravimo procesas. Apskaičiavus krūvio būsenas, izotopų smailių sąrašas buvo eksportuotas kaip angmf failas tolimesnei duomenų bazės paieškai. Talismanas („Matrix Science“, Londonas, JK; versija 2.3.02) buvo įkurtas paieškai NCBI_SJTE-1 duomenų bazėje (4698 įrašai), kuri buvo nustatyta pagal genų homologiją tarp P. putida F1 ir P. putida SJTE-1, darant prielaidą, kad virškinimas fermentu tripsinu. Talismano buvo ieškoma su fragmento jonų masės tolerancija 0, 1 Da, o pirminio jonų tolerancija - 25 ppm. Kaip kintamos modifikacijos buvo nurodytos metionino, tirozino iTRAQ 8-Plex oksidacija ir lizinų karbamilinimas, nurodytos iTRAQ (N-terminalas, +304 Da), iTRAQ (Lys, +304 Da) ir MMTS (Cys, +46 Da). kaip fiksuotos modifikacijos.

Kiekybinė duomenų analizė

Pastolių Q + (versija „Scaffold_4.3.2“, „Proteome Software Inc.“, Portlandas, OR) buvo naudojami MS / MS pagrįsto izobarinio žymens peptido ir baltymų identifikavimui patvirtinti. Nustatymas buvo toks: Modelio tipas buvo pagal intensyvumą pagrįstas normalizavimas, skaičiavimo tipas buvo mediana, o Quant unikalumo modelis buvo unikalūs peptidai. Pamatinis tipas buvo vidutinis baltymo pamatas, o mėginių normalizavimas buvo įjungtas. Baltymų identifikavimas buvo priimtas, jei peptidų tikimybė buvo didesnė nei 92, 0%, FDR mažesnė nei 1, 0% pagal „Scaffold Local FDR“ algoritmą ir bent du identifikuoti peptidai. Baltymų kiekybinis įvertinimas buvo priimtas, jei buvo galima nustatyti didesnę nei 99, 0% tikimybę, kad FDR bus mažesnis nei 1, 0% ir kuriuose būtų bent vienas identifikuotas peptidas. Baltymai, kuriuose buvo panašių peptidų ir kurių nebuvo galima diferencijuoti remiantis vien MS / MS analize, buvo sugrupuoti taip, kad atitiktų kergimo principą. Baltymai, turintys reikšmingų peptidų įrodymų, buvo suskirstyti į grupes. Įgytas eksperimento intensyvumas visame pasaulyje buvo normalizuotas visuose įsigijimuose. Atskiri kiekybiniai mėginiai buvo normalizuoti kiekvieno įsigijimo metu. Paskirto baltymo peptidų identifikavimo intensyvumas buvo normalizuotas. Etaloniniai kanalai buvo normalizuoti, kad būtų 1: 1 pakeitimas. Skirtingai išreikšti baltymai buvo nustatyti naudojant Manno Whitney testo analizę ( p reikšmė). Galutinis baltymų santykio sąrašas buvo baltymų santykio vidurkis. Baltymų ir baltymų sąveikos tinklai buvo sukurti naudojant sąveikaujančių genų / baltymų paieškos įrankį (STRING, 10.0 versija) su vidutinio patikimumo lygiu (0, 4) ir visais prieinamais prognozavimo metodais (//string-db.org/). COG klasifikacijos gaunamos pagal P. putida ir P. putida SJTE-1 projektą IMG duomenų bazėje (//img.jgi.doe.gov/cgibin/er/main.cgi, Projekto ID: Gi23653). Buvo organizuotas platus heterogeniškų anotacijų turinys, pavyzdžiui, GO terminai, KEGG keliai, į terminų ar genų klases ir sutelktas per DAVID (//david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp) 35, 36 .

RNR ekstrakcija ir transkripcijos lygio analizė (RT-qPCR)

P. putida SJTE-1 buvo auginamas minimalioje terpėje su E2 arba gliukoze iki vėlyvosios eksponentinės fazės, kaip aprašyta aukščiau, ir RNR buvo ekstrahuota naudojant „RNeasy Mini“ rinkinį (QIAGEN, CA, JAV), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Visi RNR mėginiai buvo iš anksto apdoroti DNaze I, kad būtų išvengta genomo ir plazmidės DNR užteršimo. Ekstrahuotos RNR kokybė ir vientisumas buvo nustatyti naudojant 2% agarozės elektroforezę, o RNR koncentracija įvertinta NanoDrop UV spektrometru (Thermo Scientific, DE, JAV).

20 μL RT reakcijų buvo iš anksto suformuotos mišinyje, kuriame buvo 1 μL (1 μg / μL) visų RNR (visos skirtingų mėginių RNR buvo sureguliuotos iki 1 μg / μL), 1 μL genų specifinio pradmens (2 μM), 10 μL 2 × PrimeScript atvirkštinės transkriptazės pagrindinio mišinio („TaKaRa“, Dalianas, Kinija) ir 8 µL RNazės neturinčio ddH20. Mišinys inkubuotas 37 ° C temperatūroje 15 min., tada inkubacija tęsiama 50 ° C temperatūroje. 5 min. Reakcija buvo inaktyvuota kaitinant 85 ° C temperatūroje 5 minutes. CDNR kiekybiškai įvertintas UV spektrometras NanoDrop (Thermo Scientific, DE, JAV).

Kiekybinis realaus laiko PGR buvo atliktas naudojant skirtingų mėginių cDNR (sureguliuotus pagal tą pačią koncentraciją), genų specifinius pradmenis (S1 lentelė) ir IQSYBR Green Super-mix (TaKaRa, Dalianas, Kinija) IQTM 5 daugiaspalvėje realioje terpėje. laiko PGR aptikimo sistema (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, JAV). Reakcijos buvo inkubuojamos 95 ° C temperatūroje 5 min., Po to 40 ciklų - 95 ° C 10 s, o 68 ° C - 30 s. Kiekvienam RNR mėginiui buvo atlikti mažiausiai trys nepriklausomi eksperimentai. Kaip pamatinis genas buvo naudojamas 16S rRNR genas. Santykinis mRNR kiekio kartų pokytis buvo apskaičiuotas DDCt metodu. Statistinei analizei buvo naudojama SPSS 21.0 programinė įranga, o P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu pokyčiu.

Rezultatai

Baltymų, esančių P. putida SJTE-1, su 17β-estradioliu arba gliukoze kaip anglies šaltiniais aptikimas ir santykinis kiekybinis įvertinimas

Siekiant parodyti 17β-estradiolio sukeltų baltymų raišką P. putida SJTE-1, buvo atlikta kiekybinė proteominė analizė, paremta iTRAQ ženklinimo metodu. Biologiniam atkuriamumui užtikrinti buvo paruošti dviejų nepriklausomų eksperimentų baltymų mėginių dubliavimai minimalioje terpėje su 17β-estradioliu ir minimalioje terpėje su gliukoze. „iTRAQ“ etiketės (113 ir 114) buvo naudojamos atskirai 17β-estradiolio grupės mėginių etiketėms žymėti, o gliukozės grupės mėginiai buvo atskirai paženklinti 117 ir 118.

Kalbant apie 17β-estradiolio grupę, iš viso dviejuose biologiniuose replikatuose (lentelės S2, S3) buvo identifikuota 3 069 unikalūs peptidai ir 1 000 baltymų. Dviejuose eksperimentuose buvo aptikti 787 baltymai (1 pav.). Identifikuoti baltymai sudarė apie 21% iš 4698 numatytų baltymų, užkoduotų P. putida SJTE-1. Proteomikos duomenys buvo perkelti į „iProx“ duomenų bazę (www.iprox.org), subjekto ID IPX00080001. Manno Whitney testo analizė buvo atlikta siekiant nustatyti biologinį atkuriamumą. Norint nustatyti padidėjimo ar sumažėjimo reguliavimo ribą, buvo nustatytas visų baltymų variacijos koeficientas (CV) kiekviename kiekybiniame mėginyje. Vidutinis% CV buvo apie 22%. Remiantis tuo, reguliavimo slenkstis buvo nustatytas 1, 5 karto. Reikšmingu baltymų lygio pokyčiu buvo laikomi santykiai ≥1, 5 arba ≤0, 67, o P vertė mažesnė nei 0, 05. Iš viso 78 baltymai buvo laikomi baltymais, kuriems pasireiškia disfunkcija; 45 ir 33 baltymai buvo žymiai padidinti ir sumažinti (1 lentelė, 2 pav.).

Image

Juodi ir pilki apskritimai rodo baltymų, aptiktų per pirmąjį ir antrąjį MS eksperimentus, skaičių. Iš dalies sutaptų identifikuotų baltymų skaičius buvo 787.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Image

Skirtingai išreikšti baltymai, kurių pakitimai ≥1, 5 ar ≤0, 67 kartus, o p ≤ 0, 05, parodyti Volcano diagramoje. Y ašis žymi p reikšmę log-10 pavidalu; didesnė skaitinė reikšmė reiškia mažesnę p vertę ir didesnį patikimumą. X ašis rodo baltymo ekspresijos kartų pokytį log 2 santykio pavidalu; neigiama vertė reiškia teigiamą pokytį, o teigiama vertė - neigiamą pokytį. Todėl žali taškai reiškia aukščiau reguliuojamus baltymus, o raudoni taškai - žemyn reguliuojamų baltymų vardu.

Visas dydis

Skirtingai išreikštų baltymų funkcinės kategorijos

Nustatyti baltymai, kurių viršuje ir žemyn yra reguliuojama, buvo suskirstyti į šešias kategorijas pagal jų funkcijas ir vaidmenį biologiniuose procesuose, remiantis COG funkcine klasifikacija (3 pav.). Baltymai, dalyvaujantys reaguojant į stresą, chemotaksį ir judrumą, energijos apykaitą, karbonatų apykaitą, transporto sistemas ir ląstelių dalijimąsi, reagavo į 17β-estradiolio būklę. Dauguma diferencijuotai ekspresuotų baltymų buvo suskirstyti į angliavandenių apykaitos procesą, reiškiantį reikšmingą padermės atsaką į du skirtingus anglies šaltinius. Taip pat baltymai, esantys transliacijos ir nukleotidų apykaitos klasteriuose, ir baltymai, dalyvaujantys membranų transportavime ir ABC transportavimo sistemose, taip pat sudarė didelę dalį dis-išreikštų baltymų, tai rodo, kad 17β-estradiolis skatins aktyvų ląstelių pernešimą ir metabolinę paramą įsisavinant ir panaudojant šis sunkiai naudojamas anglies šaltinis. Be to, buvo išanalizuoti kiekvieno baltymo raiškos pokyčiai ir parodyti šilumos žemėlapiuose (4 pav.). Nors atskirose biologinėse arba technologinėse replikacijose gali būti tam tikrų klaidų, šie žemėlapiai vis tiek galėtų aiškiai atspindėti patikimą variacijų tendenciją. Pavyzdžiui, nuo TonB priklausomas receptorių, dalyvaujančių ląstelių transportavime, ir citochromo C (I klasė), susijęs su elektronų perdavimu, gydymas 17β-estradioliu buvo reikšmingai didesnis nei ekspresijoje, o nuo ATP priklausomos proteazės ATPazės HslU subvienetas buvo reikšmingai sumažintas. ši sąlyga reiškia padidėjusį ląstelių elektronų pernešimo ir energijos poreikį 17β-estradiolio biotransformacijos procese. Skirtingai išreikštų baltymų genų ontologijos analizė parodė, kad 52 baltymai buvo žymiai praturtinti transliacijos, oksidacijos redukcijos, pirmtakų metabolitų ir energijos generavimo bei acetil-CoA metabolizmo ir baltymų apykaitos procesų metu (2 lentelė). Tolesnis, DOVID ištirtų baltymų, išreikštų disfunkcija, sodrinimo laipsnis parodė, kad 46 padengti baltymai ribosomų, butanoatų apykaitos, pentozės fosfato metabolizmo keliu, aminorūgščių skilimo ir ABC pernešėjų reikšmingai pakeitė estrogeno aplinką (3 lentelė). Tai reiškė, kad baltymai keliuose angliavandenių apykaitos procesuose vaidina svarbų vaidmenį panaudojant 17β-estradiolį, kaip ir ankstesniame darbe 34 . Be to, buvo sukurti ir išanalizuoti skirtingai išreikštų baltymų baltymų-baltymų sąveikos tinklai, naudojant STRING. Baltymai buvo suskirstyti į tris didelius vienetus: vienetą, susijusį su transliacija (viršuje), oksidacijos redukciją ir anglies metabolizmą (kairysis dugnas), ir acetil-CoA bei riebalų rūgščių metabolizmą (dešinėje apačioje) (5 pav.). Tai parodė, kad estrogeninėje aplinkoje bakterijų ląstelės pradėjo aktyvius ląstelių metabolizmo procesus, kad galėtų dalyvauti ir palaikyti 17β-estradiolio transportavimą ir panaudojimą. Tai atskleidė ryšius, slypinčius baltymų lygio pokyčiuose, naudojant kompiuterinį analizės metodą, ir paaiškino bakterijų visuotinio poveikio estrogeno aplinkoje tyrimus.

Image

Baltymų anotacija ir diferencijuotai ekspresuotų baltymų klasifikacija buvo organizuota ir kondensuota per DAVID. Kiekvienos kategorijos procentas parodo baltymų santykį šioje kategorijoje visuose diferencijuotai išreikštuose baltymuose.

Visas dydis

Image

Naudojant „Genesis V1.7“ su iTRAQ gautais kiekybiniais duomenimis, sudarytas „Log 2“ santykinio baltymų gausos log 2, estradiolio aplinkoje, šilumos žemėlapis, palyginti su gliukozės kontrolės sąlygomis. Baltymai buvo sugrupuoti pagal žinomą ar spėjamą vaidmenį metabolizmo keliuose ar ląstelių procesuose.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Image

Baltymų ir baltymų sąveikos tinklai buvo sukurti naudojant STRING 10.0 su vidutiniu pasitikėjimo lygiu (0, 4) ir visais prieinamais prognozės metodais.

Visas dydis

Kiekybinis genų transkripcijos lygių RT-PGR patvirtinimas

Norėdami patvirtinti proteominės analizės rezultatus, atrinkome kai kuriuos genus, turinčius reikšmingą diferencialinės ekspresijos profilį, kad galėtume patvirtinti RT-qPCR. Tuo tarpu keli taikiniai taip pat buvo pasirinkti keli trumpų grandinių dehidrogenazės / reduktazės (SDR) genai, kurių iTRAQ analizė mažai skiriasi. Kaip parodyta 4 lentelėje, daugumos genų ekspresijos pokyčių tendencijos buvo nuoseklios abiejuose eksperimentuose, nepaisant nedidelių skirtumų raukšlės pokyčio lygiuose. Kai kurių genų transkripcijos pokytis ir raiškos kitimas buvo skirtingi, tikriausiai susiję su genų gausa. Tai rodo, kad proteomikos rezultatai dažniausiai atitinka RT-qPCR rezultatus, kurie galėtų atspindėti pokyčius, vykstančius 17β-estradiolio aplinkoje.

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

17β-estradiolis, žinomas kaip nedažnas anglies šaltinis, palyginti su gliukoze, gali sukelti bakterijų dauginimąsi ir metabolizmą; ląstelės gali paskatinti specifinius baltymus, kad jos biologiškai transformuotųsi ir pritaikytų šią aplinką. Šiame tyrime baltymų duomenys parodė, kad baltymai, dalyvaujantys medžiagų apykaitos procesuose, įskaitant reakciją į stresą, chemotaksį ir judrumą, įsisavinimą ir pernešimą, elektronų perkėlimą ir energijos apykaitą bei karbonatų apykaitą, turėjo reikšmingų pokyčių, kai P. Putida SJTE panaudojo 17β-estradiolį. –1.

Atsakas į stresą, chemotaksis ir judrumas

17-estradiolis, kaip nemalonus anglies šaltinis, daugeliu aspektų sukelia bakterijų dauginimąsi, nors ilgainiui jis gali būti mineralizuotas kaip anglies ir energijos šaltinis. Šie augimo įtempiai gali būti apibūdinami kaip kai kurių medžiagų apykaitos kelių perkrovos, vidinis toksiškų medžiagų perteklinis regioninis kaupimasis ir kai kurių ciklų, lemiančių elektronų perkėlimą ar papildomą faktorių, ciklo veiksnių regeneracijos trūkumas. Mūsų duomenimis, buvo nustatyta, kad septyni baltymai, dalyvaujantys reaguojant į stresą, yra reikšmingai diferencijuoti ir dauguma jų yra atsakingi už baltymų aktyvumo apsaugą (1 lentelė, 4 pav.). LPS surinkimo baltymas LptD yra išorinės membranos transportavimo baltymas, dalyvaujantis lipopolisaharidų transportavimo (Lpt) sistemoje ir vaidina esminį vaidmenį nepralaidžios išorinės membranos (OM) biogenezėje. Jis gali sudaryti kompleksą su LptE, kad gabentų lipopolisaharidą, pavyzdžiui, lipidą A, atsakingą už OM pralaidumą į išorinį ląstelės paviršių 37, 38 . OM gali apsaugoti ląsteles nuo aplinkai toksiškų molekulių ir yra svarbi ląstelių išgyvenimui streso sąlygomis. Tuo pačiu metu OM gali veikti kartu su keliais ištekėjimo siurbliais, kad sumažintų toksinių medžiagų įsisavinimą 39 . Kai kaip anglies šaltinis buvo naudojamas 17β-estradiolis, per daug ekspresuotas LptD baltymas galėjo skatinti OM sintezę, kad palaikytų ląstelių apsaugą esant šioms nedažnoms auginimo sąlygoms ir sumažintų toksinį poveikį, kurį sukelia 17β-estradiolio stresas. Kitas kenksmingas aplinkos streso poveikis ląstelėms yra hiperosmotinės ir oksidacinės ląstelinės mikroaplinkos susidarymas, kuris sąlygoja daugybės denatūruotų baltymų agregaciją ir daro įtaką ląstelių metabolizmui. Ribonukleazė PH priklauso šilumos smūgio „dnaK“ genų klasterio išplėstajam posistemiui, kuris aktyviai dalyvauja reaguojant į hiper osmosinį stresą ir šilumos šoko reakcijas, užkertant kelią streso denatūruotų baltymų agregacijai ir sukeliant denatūruotų baltymų skaidymą. Pastebėtina, kad prognozuojama, kad daugelis šios sistemos baltymų gali dalyvauti įvairiose tRNR ar rRNR modifikacijose. Kadangi manoma, kad daugelis tRNR modifikacijų pagerina skaitymo rėmo priežiūrą, kyla pagunda spėlioti, kad šių posistemio baltymų vaidmuo apsaugo ribosomų funkciją (pvz., Vertimo tikslumą) šiluminio šoko ir kitų stresų metu 40 . Ribonukleazė PH yra 3′-5 ′ egzoribonukleazė ir nukleotidiltransferazė, dalyvaujanti tRNR perdirbime. Viršutinis Ribonukleazės PH reguliavimas gali būti būtinas norint apsaugoti ribosomų funkciją esant 17β-estradiolio įtampai, ištaisant tRNR procedūros klaidas. Be to, nustatyta, kad flagellar motorinio jungiklio baltymas FliG, turintis reikšmės ląstelių judrumui, turi 1, 67 karto padidintą reguliuojamą ekspresiją 17β-estradiolio aplinkoje. Badavimo ar streso aplinkoje bakterijų ląstelės pasinaudos chemotaksio ir judėjimo sistemomis, kad pasiektų anglies patrauklumą aplinkoje ir palaikytų jų augimą. Padidėjęs FliG reguliavimas gali pagerinti ląstelių judrumą ir gali prisidėti prie ląstelių sugavimo 17β-estradiolio.

Priėmimas ir gabenimas

Mikroorganizmai gali pakeisti savo įsisavinimo ir transportavimo sistemas, kad prisitaikytų prie skirtingų maistinių medžiagų sąlygų. Esant geležies ribojimo sąlygoms, nuo Ton-B priklausanti receptorių sistema ir kai kurie P. fluorescens Pf-5 vidinių narių pernešėjai buvo žymiai labiau sureguliuoti 41 . Proteominės P. putida KT2440 charakteristikos, reaguojant į benzoatą, parodė, kad 21 baltymas, dalyvaujantis ABC pernešikliuose, yra sureguliuotas, įskaitant aminorūgšties ABC pernešėjų perilasminius surišimo baltymus ir tarpląstelinius ligandą surišančius receptorius 42 . Anglies šaltinių įsisavinimas iš aplinkos yra pagrindinis bakterijų augimo aktyvumas, o ATP rišančios kasetės (ABC) pernešėjai yra svarbiausi būdai, kuriais bakterijos įgyja šiuos anglies šaltinius. 17β-estradiolis tirpsta etanolyje, bet ne vandenyje, ir tai trukdo jį absorbuoti mikroorganizmams. Norint palengvinti jo įsisavinimą ir panaudojimą, gali prireikti kai kurių specifinių receptorių ir specialių pernešėjų. Remiantis proteomikos duomenimis, buvo rasta dvylika baltymų, susijusių su įsisavinimu ir transportavimo sistemomis, su reikšmingais jų ekspresijos lygio pokyčiais, ir šeši iš jų rasti KEGG kelio ABC pernešėjų terminale.

Vienas nuo TonB priklausantis receptorius buvo ekspresuotas 3, 3 karto 17β-estradiolio aplinkoje. TonB baltymas yra energijos keitiklis receptoriams išorinėje membranoje, naudojant citoplazminės membranos protono varomąją jėgą (PMF), siekiant palengvinti aktyvų substratų pernešimą per išorinę membraną 43, 44 . Tai reiškia, kad visa nuo TonB priklausanti transportavimo sistema turi turėti specialų išorinės membranos receptorių; ir yra bent septyni išorinės membranos receptoriai, atitinkantys TonB 45 . Nors išsami informacija apie šį nuo TonB priklausomą receptorių yra neaiški, mes spėjame, kad jis gali būti susijęs su 17β-estradiolio ar jo tarpinių medžiagų transportavimu per išorinę membraną.

Be to, trys aminorūgščių / amidų ABC transporterį substratą surišantys baltymai, įskaitant PAAT (poliarinės aminorūgšties pernešėjas) ir HAAT (hidrofobinės aminorūgšties pernešėjas) šeimas, turėjo reikšmingą aukštyn reguliuojamą išraišką, svyruojančią nuo 2, 5 iki 7, 6 raukšlių. Nuo substrato surišančių baltymų (SBP) pernešėjų yra daug bakterijų, kurios dalyvauja įvairiuose procesuose, tokiuose kaip maistinių medžiagų įsisavinimas, kvorumo nustatymas ir atsparumas vaistams, kurie buvo laikomi pirminiu maistinių medžiagų įsisavinimo didelio afiniteto pasirinkimu 46, 47 . Kalbant apie 17β-estradiolio savybes, jo įsisavinimui ir transportavimui gali prireikti nuo SBP priklausančių pernešėjų. Šie trys pernešėjai tikriausiai yra specifinių 17β-estradiolio ir kitų estrogeninių chemikalų pernešimo sistemų nariai. Be to, buvo rastas su poli (hidroksialkanoato) baltymu susijęs PhaF baltymas, kurio ekspresijos lygis padidėjo maždaug 1, 97 karto, kai anglies šaltinis buvo naudojamas 17β-estradiolis. Pranešama, kad šis baltymas nukreipia granules į ląstelės centrą be specifiškumo ląstelių dalijimosi proceso metu 48 . Jis gali būti 17β-estradiolio direktorius vienodam jo pasiskirstymui ląstelių dalijimosi ir augimo procesų metu; ir jo padidėjęs reguliavimas tikriausiai gali palengvinti efektyvų šios cheminės medžiagos panaudojimą ir biologinį virsmą ląstelėse.

Kita vertus, aplinkoje, kurioje yra 17β-estradiolis, įtakos turėjo ir baltymai, atsižvelgiant į gliukozės įsisavinimą ir pernešimą. Sumažėjęs gliukozės ABC transporterio ATP surišančio baltymo reguliavimas tik parodo, kad aplinkoje, kur nėra gliukozės, jo nereikia. Kadangi estradiolis netirpsta vandenyje, jo negalima pernešti pro vandens pripildytus kanalus. Porino baltymai gali sudaryti kanalus, kuriuose yra membranų, užpildytų vandeniu, kad būtų galima difuzuoti substratus gramteigiamų bakterijų išorinėje membranoje; o OprB yra gliukozės atžvilgiu selektyvus porinas, pasižymintis selektyvumu gliukozei ir ksilozei, kurį gamina P. aeruginosa ir P. putida 49 . Tiekiant 17β-estradiolį, porin OprB vaidmuo buvo patvirtintas 0, 47 karto sumažėjus, atsižvelgiant į žinomas jo funkcijas.

Elektronų perdavimas ir energijos apykaita

Pakankamas energijos ir deguonies tiekimas yra pagrindiniai taškai, palaikantys normalius ląstelių augimo ir dauginimosi procesus. Nepalankioje aplinkoje ląstelės inicijuoja apsaugos strategijas, pavyzdžiui, bioplėvelės formavimąsi, kad būtų užtikrintas pakankamas energijos tiekimas ir palaikoma bazinė ląstelių apykaita. Pseudomonas padermės gali generuoti didelį kiekį bioplėvelių, ypač vėlyvoje augimo fazėje, kad prisitaikytų prie maistinių medžiagų bado ar kitokio streso. Biofilmo dispersija yra energijos reikalaujantis procesas, todėl protono varomoji jėga yra būtina šiam procesui 50 . Todėl, kai 17β-estradiolis buvo naudojamas kaip vienintelis anglies šaltinis, jo metabolizmui ir P. putida SJTE-1 ląstelių augimui palaikyti reikėjo efektyvesnių energijos tiekimo ir elektronų perdavimo sistemų.

Proteomikos duomenys parodė, kad P. putida SJTE-1 buvo keletas baltymų, susijusių su elektronų perdavimu ir energijos metabolizmu, kurie buvo žymiai labiau sureguliuoti 17β-estradiolio aplinkoje (1 lentelė, 4 pav.). Palyginti su gliukozės kultūros sąlygomis, koenzimo pirolochinolino chinono (PQQ) sintezės baltymas E ir citochromas C (I klasė) buvo atitinkamai išreikšti atitinkamai 4, 8 ir 1, 9 karto. Citochromas C (cytC) yra gerai žinomas elektronus pernešantis baltymas ir kvėpavimo grandinės narys, veikiantis skirtinguose redokso procesuose 51 . PQQ, veikiantis kaip protezų grupė, nekovalentiškai prisijungia prie dehidrogenazės, sudarydamas chinoproteinus. Chinoproteinai paprastai katalizuoja pirmąjį oksidacijos reakcijos žingsnį bakterijų periplazmoje, prisidedant prie protono varomosios jėgos ir ATP 52 susidarymo. Gramneigiamose bakterijose yra speciali „periplasminė oksidacijos sistema“, kurią daugiausia inicijuoja chinoproteinų dehidrogenazės kartu su kvėpavimo takų grandinėmis; labai svarbu, kad būtų sukurtas membranos potencialas nepagaminant toksinių produktų, kad padidėtų ląstelių augimo pranašumas įvairiose aplinkose 53 . Tuo tarpu ATP sintazės alfa ir beta subvienetų ekspresija padidėjo 1, 57 karto ir 1, 48 karto, o tai galėtų skatinti oksidacinio fosforilinimo kelią ir sintetinti daugiau ATP, kad palaikytų didelį energijos poreikį 17β-estradiolio aplinkoje. Apskritai, dėl visų šių baltymų perraiškos gali būti sukurtos efektyvios elektronų perdavimo ir kvėpavimo grandinės, suteikiama daugiau energijos, kad būtų įveiktas augimo stresas ir galimas toksiškumas, bei užtikrinta normali ląstelių apykaita.

Karbonatų apykaita

Buvo nustatyta dvidešimt fermentų, susijusių su skirtingais metabolizmo keliais, kurie buvo diferencijuotai ekspresuojami 17β-estradiolio panaudojimo procese (1 lentelė, 4 pav.). Tarp jų keturi baltymai priklausė TCA keliui, o keturi pentozės fosfato kelio baltymai buvo visi sureguliuojami. Piruvato dehidrogenazė katalizuoja acetil-CoA susidarymą, kad pagreitintų TCA kelią; izocitratinė dehidrogenazė funkcionuoja kaip reguliuojantis fermentas TCA cikle, o gliukozės-6-fosfato dehidrogenazė ir 6-fosfogliukonato dehidratazė yra pagrindiniai fermentai pentozės fosfato kelyje. Badavimo gliukozės sąlygomis abu būdai gali susilpnėti.

Pastebėtina, kad acetil-CoA hidrolazės ir acetil-CoA acetiltransferazės fermentų piruvato metabolizmo kelyje yra padidinta atitinkamai 1, 94 ir 2, 24 karto. „ Comamonas“ testosterone buvo spėjama, kad steroidų B, C, D žiedai, atlikdami meta-skaidymą acetil-CoA 54, turėtų β oksidaciją. Pagrindinis β-oksidacijos produktas yra acetil-CoA. Panaši 17β-estradiolio molekulinė struktūra, palyginti su testosteronu, rodo, kad 17β-estradiolio metabolinis kelias taip pat gali būti panašus į testosterono, todėl acetil-CoA susidarymas gali būti lemiamas 17β-estradiolio panaudojimui. Acetil-CoA acetiltransferazė palaiko acetilo pernešimą, taigi –S-CoA gali būti pridedama prie B, C ir D žiedų. Jis gali būti sujungtas su acetil-CoA acetiltransferaze, kad būtų sukurta pusiausvyros būsena tarp vartojimo ir acetil-CoA sintezės.

Trumpa grandinės dehidrogenazės / reduktazės (SDR) buvo laikomos svarbiomis 17β-estradiolio metabolizmui. Buvo nustatyta, kad vienas SDR baltymas šiek tiek sumažėjo iki 0, 58 karto. Tiesą sakant, mes aptikome ir keturių kitų SDR išraišką šiomis dviem sąlygomis, ir reikšmingų pokyčių nepastebėta. Manome, kad be baltymų nestabilumo ir technologinių apribojimų yra dvi galimybės. Viena iš jų yra tai, kad specifinio SDR, skirto 17β-estradiolio metabolizmui, gali nebūti, nes ankstesniame pranešime buvo iškelta hipotezė, kad bakterijos gali pasirinkti bendro metabolizmo skilimo būdą, kad esamus fermentus panaudotų steroidinių hormonų skaidymui, nesukuriant naujų specifinių baltymų 7 . Tai yra prisitaikymo strategija, skirta sumažinti medžiagų apykaitos ir energijos suvartojimą ir pagerinti ląstelių išgyvenimą ribotoje aplinkoje. Tačiau tai vis dar yra hipotezė ir norint tai patvirtinti, reikia atlikti daugiau tyrimų. Kita galimybė yra tai, kad akivaizdūs SDR genų ekspresijos pokyčiai gali įvykti labai ankstyvoje ląstelių augimo fazėje kaip greitas atsakas į estradiolį. Kadangi proteominei analizei atlikti mes panaudojome ląsteles nuo logaritminės iki eksponentinės augimo fazės (0, 8–1, 0), ląstelių tankis ir ląstelių pritaikomumas palyginti pagerėjo; todėl ląstelėms nereikėjo keisti SDR genų ekspresijos.

Transkripcija, vertimas ir makromolekulių metabolizmas

Remiantis duomenimis, keturiolikoje ribosomų baltymų ir kitų baltymų, dalyvaujančių transliacijoje ir nukleotidų metabolizme, buvo reikšmingų pokyčių, tokių kaip 50S ribosomų baltymas L10, 30S ribosomų baltymas S20, nukleozididifosfato kinazė, priklausanti ribosomų keliui. To buvo tikimasi, nes ląstelės turi atlikti santykinius transkripcijos ir transliacijos pokyčius, kad generuotų diferencijuotą genų ekspresiją, kad atitiktų skirtingos aplinkos reikalavimus. Daugelio proteominių tyrimų metu ribosomų baltymų raiškos pokyčiai visada yra didele dalimi. Padermė SJTE-1 keičia skirtingų ribosomų baltymų ekspresijos lygius, gali padėti ląstelėms prisitaikyti prie ribotų estradiolio sąlygų, sumažinti toksinį poveikį ir garantuoti ląstelių metabolizmą. Be to, baltymai, dalyvaujantys riebalų rūgščių metabolizme, aminorūgščių metabolizme, ląstelių dalijimosi ir ląstelių apvalkalo biosintezėje, ir kai kurie, kurių funkcijos neaiškios, taip pat buvo sureguliuoti, kad tilptų 17β-estradiolio aplinką. Jie gali veikti transkripcijos ir vertimo procese ir padėti skaidyti estradiolį.

Apibendrinant, šiame darbe buvo lyginami P. putida SJTE-1 baltymų ekspresijos lygiai 17β-estradiolio ir gliukozės aplinkoje, naudojant „iTRAQ“ ženklinimą ir LC-MS / MS technologiją, ir bandyta nustatyti pagrindinius metabolizmo kelius arba baltymus, susijusius su mikrobų estrogenu. skilimo procesas. Nustatyta, kad 78 baltymai turi reikšmingų pokyčių ir daugiausia dalyvauja reaguojant į stresą, energijos apykaitą, transportavimo sistemas, chemotaksį ir ląstelių judrumą bei anglies metabolizmą. Baltymų, susijusių su elektronų perdavimu, energijos generavimu ir transportavimo sistemomis, reguliavimas reiškia, kad jie gali būti labai svarbūs veiksmingam 17β-estradiolio įsisavinimui, perkėlimui ir panaudojimui. Be to, per didelis baltymų, dalyvaujančių anglies metabolizme, ekspresija rodo, kad ląstelės pradeda su steroidais susijusių kelių pagrįstą 17β-estradiolio biotransformaciją narius. Kita vertus, baltymai, dalyvaujantys gliukozės kaupime ir metabolizme, dažniausiai buvo nepakankamai sureguliuoti. P. putida SJTE-1 pasižymi dideliu skilimo gebėjimu estrogeninėms cheminėms medžiagoms, jame yra keli numanomi estrogeno skilimo genai 14 . Nors buvo rasta keletas estrogeno skilimo padermių, iki šiol buvo gautos tik kelios estrogenus ardančių padermių genomo sekos, o bakterijų ir estrogeninių chemikalų lyginamoji proteomikos analizė nepranešama. P. putida turi didelį bioremeditacijos pranašumą ir buvo patvirtinta keletas padermių panaudojant estrogenines chemines medžiagas. Šis darbas gali parodyti 17-estradiolio biologinio skaidymo mechanizmą Pseudomonas ir skatinti tolesnį aplinkos taikymą.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Xu, J. et al . iTRAQ pagrindu atlikta pasaulinio atsako į 17β-estradiolį kiekybinė proteominė analizė estrogeno skaidymo padermėje Pseudomonas putida SJTE-1. Mokslas. Rep. 7, 41682; „doi“: 10.1038 / srep41682 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma lentelė s1

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildoma lentelė s2

  2. 2.

    Papildoma lentelė s3

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.