Jak-stat ir g-baltymų sujungtų receptorių signalizacijos keliai dažnai keičiasi epitheliotropinėje žarnos t-ląstelių limfomoje | leukemija

Jak-stat ir g-baltymų sujungtų receptorių signalizacijos keliai dažnai keičiasi epitheliotropinėje žarnos t-ląstelių limfomoje | leukemija

Anonim

Dalykai

  • Vėžio genetika
  • Vėžio genomika
  • Vėžio terapija
  • Ląstelių signalizavimas
  • Sekavimas
  • T-ląstelių limfoma

Anotacija

Epitheliotropinė žarnyno T ląstelių limfoma (EITL, dar vadinama II tipo enteropatija, susijusi su T ląstelių limfoma) yra agresyvi žarnyno liga, kurios prognozė prasta, o jos molekuliniai pakitimai nebuvo išsamiai apibūdinti. Siekėme nustatyti lengvai pritaikomus ekrano pakeitimus, kurie leistų geriau diagnozuoti ir (arba) gydyti šią mirtiną ligą. Atlikus viso egzomo egzistavimą iš keturių EITL normalių navikų porų, po to sekant giluminį 42 naviko mėginių sekos nustatymą, didelėje dalyje ląstelių buvo aptikti dažni JAK-STAT ir G-baltymų sujungto receptoriaus (GPCR) signalizacijos kelių pokyčiai. pavyzdžiai. Tiksliau, 63% atvejų buvo mutavusi STAT5B , 35% - JAK3 , 24% - GNAI2 , daugiausia - žinomose aktyvinimo vietose, pagrindinėse funkcinėse srityse. Be to, STAT5B lokusas turėjo neutralų kopijos heterozigotumo praradimą, dėl kurio mutantinė kopija buvo dubliuojama, o tai rodo mutanto STAT5B dozės svarbą EITL vystymuisi. JAK-STAT ir GPCR kelių reguliavimas taip pat buvo paremtas genų ekspresijos profiliavimu ir toliau patikrintas paciento naviko mėginiuose. In vitro per didelis GNAI2 mutantų ekspresija paskatino pERK1 / 2, kuris yra MEK-ERK kelio narys, padidėjimą. Pažymėtina, kad tiek JAK-STAT, tiek MEK-ERK kelių inhibitoriai efektyviai sumažina iš paciento gaunamų pirminių EITL ląstelių gyvybingumą, nurodydami galimas šios neoplazmos terapines strategijas, kol šiuo metu nėra veiksmingo gydymo.

Įvadas

Su enteropatija susijusi T-ląstelių limfoma (EATL) yra reta agresyvi pirminė žarnyno ne Hodžkino limfoma, sukelianti 5, 4% periferinių T ląstelių limfomų ir 10–25% visų pirminių žarnyno limfomų. 1, 2, 3 EATL pirmą kartą 2008 m. Buvo įtrauktas į Pasaulio sveikatos organizacijos hematolimfoidinių navikų klasifikaciją. Jį sudaro I ir II tipai. 1 klasikinis arba I tipo EATL yra susijęs su celiakija, HLA-DQ2 ir DQ8 haplotipais, ir yra labiau paplitusi Vakaruose. 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, atvirkščiai, II tipo EATL labiau paplitęs Azijoje, o keli tyrimai neįrodė ryšio su celiakija. 9, 10, 11, 12 Atsižvelgiant į toliau aprašytus II tipo EATL klinikinės patologijos požymius ir sąsajų su celiakija nebuvimą, jo nomenklatūroje terminas „susijęs su enteropatija“ nėra tinkamas ir įvairūs pavadinimai, įskaitant monomorfines žarnyno T-ląsteles. buvo pasiūlyta limfoma 11 ir epitelioropinė žarnyno T ląstelių limfoma (EITL) 13 . Šiame tyrime šią neoplazmą vadinsime EITL.

EITL prognozė yra labai prasta, o vidutinis išgyvenamumas yra tik 7 mėnesiai. Šiuo metu nėra veiksmingo šios ligos gydymo ar tikslinio gydymo. Daugybė publikacijų buvo nukreiptos į klinikinį ir patologinį EITL apibūdinimą. Kartu su kitais mes išsamiai aprašėme šios sudėtingos ligos histologiją. 11, 13 Trumpai tariant, EITL rodo zoninį variantą, kuriame yra centriniai invaziniai monomorfinių neoplastinių limfocitų lakštai, periferinė gleivinės zona, į kurią įsiskverbia morfologiškai netipiniai intraepiteliniai limfocitai (IEL), ir tolima zona, kuriai būdinga gleivinė, turinti normalią šiltą architektūrą, tačiau padidėjęs morfologinis skaičius. . Tariama kilmės ląstelė yra žarnyno IEL, o klonavimo analizė parodė, kad tolimojoje gleivinėje esančioje IEL yra kloninis ryšys su invazine limfoma. 13, 14 CD8 + CD56 + fenotipas ir plati branduolinė su megakariocitais susijusios tirozinkinazės ekspresija yra bruožai, besiskiriantys nuo klasikinio EATL, 13, 15, kai dauguma neoplastinių ląstelių išreiškia CD8αα homodimerus. Vis dar nesutariama, ar šios ląstelės turi daugiausia T ląstelių receptorių (TCR) β ar γδ fenotipus. 11, 13

Citogenetiniai tyrimai parodė MYC (8q24) 10, 13, 16 padidėjimą ir perkėlimą EITL, nors jie taip pat gali būti pastebimi klasikiniame EATL. 17 Priešingai, 1q32.2-q41 ir 5q34-q35.2 prieaugis yra labiau būdingas EATL, palyginti su EITL, tuo tarpu 9q31.3 prieaugis ir 16q21.1 praradimas gali būti stebimas tiek klasikiniame EATL, tiek EITL. 1, 3 Neseniai buvo pranešta, kad aktyvinanti STAT5B p.N642H mutacija yra įprasta T ląstelių limfomoje, gautoje iš γδ T ląstelių, įskaitant kai kuriuos EITL atvejus. Daugiacentriame tyrime mes panaudojome naujos kartos sekos sudarymo būdus, kad apibūdintume dažnius genetinius EITL pokyčius. Pateikiame pirmąjį šios ligos viso egzomo sekos nustatymo (WES) tyrimą ir didžiausioje iki šiol paskelbtoje serijoje parodome , kad STAT5B aktyvinančios mutacijos randamos tiek TCRαβ, tiek TCRγδ kilmės EITL navikuose. Pateikiame daugybę įrodymų, kad JAK-STAT ir G-baltymų sujungtų receptorių (GPCR) signalizacijos keliai yra labai aktyvūs EITL, ir, kas svarbiausia, šių kelių slopinimas tiksline terapija efektyviai sumažina pirminių EITL ląstelių gyvybingumą.

medžiagos ir metodai

Pacientai ir mėginiai

EITL buvo apibrėžta kaip pirminė žarnyno T ląstelių limfoma, turinti būdingą morfologiją, paprastai turinčią citotoksinį, CD3 + CD8 + CD56 + EBER – fenotipą. Iš „SingHealth“ audinių saugyklos buvo gauti penki greitai užšaldyti pirminiai navikai ir suderinti viso kraujo mėginiai. Pacientai buvo įdarbinti 2010–2014 m. Ir visi pateikė pasirašytą informuotą sutikimą pagal Helsinkio deklaraciją. Papildomi 41 archyve įtaisyti formalinu fiksuoti parafinu įterpti pavyzdžiai, surinkti nuo 2003 iki 2014 m., Buvo gauti iš šių centrų: Nacionaliniame vėžio centre Singapūre, Singapūro bendrojoje ligoninėje, Nacionalinėje universiteto ligoninėje ir Tan Tock Seng ligoninėje Singapūre, Guangdongo bendrojoje ligoninėje ir Sun Yat- senų universiteto vėžio centras Kinijoje, Malajos universitetas ir ligoninė Raja Permaisuri Bainun Malaizijoje, „Samsung“ medicinos centras Korėjoje, „Chi Mei“ medicinos centras Taivane ir Mahidolio universitetas Tailande. Keturiolika iš jų taip pat buvo naudojami ankstesniame tyrime su tais pačiais identifikatoriais. 13 Klinikopatologiniai požymiai išvardyti 1 papildomoje lentelėje. Naviko ląstelių kiekis buvo įvertintas hematoksilinu ir eozinu. Tyrimą patvirtino „SingHealth“ centralizuota institucijų peržiūros taryba (2004/407 / F).

Sekos ir mutacijų analizė

Išsamūs metodai aprašyti papildomoje informacijoje. Trumpai tariant, visos keturios augliui normalios EITL poros buvo viso sekos sekos, naudojant „SureSelectXT Human All Exon V4 + UTRs“ fiksavimą (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV) ir „HiSeq 2000 Sequencing System“ (Illumina, San Diegas, CA, JAV). Visi kandidatų variantai buvo vizualiai patikrinti „Integrative Genomics Viewer“. 19, 20 Tik integruotosios genomikos žiūrinčiojo tikrosios mutacijos buvo laikomos somatinėmis, o variantai, kurių dažnis 15%, buvo toliau patvirtinti atliekant Sangerio seką (2 papildoma lentelė).

GNAI2 , JAK3 ir STAT5B genų paplitimo tyrimas buvo atliktas 42 navikų mėginiuose, naudojant giluminę amplikono seką. Kiekvienam genui buvo seka tik įprasti taškai, pateikiami COSMIC v.72, ir regionai, identifikuoti per WES (3 papildoma lentelė). CREBBP mutacijų dažnis buvo nustatytas dalinio paplitimo grupėje (16 atvejų), naudojant vienkartinio praturtinimo technologiją (NuGEN Technologies, San Carlos, CA, JAV).

SNP genotipų rinkinys ir navikų specifinių alelių kopijų skaičiaus analizė

Genominė DNR iš keturių auglio normalių porų buvo hibridizuota su genomo plataus žmogaus vieno nukleotido polimorfizmo (SNP) masyvo 6.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, JAV) mikroschemomis. Navikų alelinės kopijos skaičiaus analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau. 21

Stabili ląstelių linijos konstrukcija ir Western blot

Viso ilgio GNAI2 cDNR buvo amplifikuota naudojant „AccuPrime Pfx“ DNR polimerazę (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) ir klonuota į retrovirusinį vektorių MIGR1 (Addgene; plazmidės Nr. 27490) 22 Xho I ir Eco RI vietose. GNAI2 mutacijos (c.535C> T p.R179C ir c.535C> A p.R179S) buvo sugeneruotos naudojant QuikChange II XL į vietą nukreipto mutagenezės rinkinį (Agilent Technologies) ir patvirtintos Sanger seka.

„HuT78“ ir „Jurkat“ ląstelių linijos buvo iš ATCC (Manassas, VA, JAV) ir palaikomos Iscove modifikuotoje Dulbecco terpėje (Invitrogen), papildytoje 20% vaisiaus galvijų serumo (HyClone; GE Healthcare, Little Chalfont, JK) ir RPMI-1640 (Invitrogen). papildytas atitinkamai 10% vaisiaus galvijų serumu (HyClone; GE Healthcare). Kultūros buvo reguliariai tikrinamos dėl užkrėtimo mikoplazma. Stabilios ląstelių linijos buvo sugeneruotos retrovirusine infekcija ir rūšiuojant žaliomis fluorescencinėmis baltymais teigiamas ląsteles, naudojant BD FACSAria III ląstelių rūšiatorių (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, JAV).

Baltymų ekstraktai buvo paruošti RIPA ląstelių lizės buferyje (150 mm NaCl, 50 mm Tris-HCl, 0, 5% deoksichlorato natrio druskos, 200 mm NaF, 200 mm PMSF, 1% NP-40 ir 1 mm EDTA), esant šviežiai pridėtai proteazei. inhibitorius (Roche, Bazelis, Šveicarija). Prieš surenkant baltymų lizatus, HuT78 linijos serume badavo 24 valandas. Visi baltymų ekstraktai buvo atskirti ant natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio ir perkelti į „Trans-Blot Turbo Mini PVDF“ membranas (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV). Panaudoti antikūnai išvardyti 4 papildomoje lentelėje. Signalai buvo vizualizuoti naudojant „ChemiDoc MP System“ (Bio-Rad).

Pirminių EITL ląstelių gyvybingumo tyrimas ex vivo

Pirminės EITL ląstelės iš paciento 065T buvo švirkščiamos į NOD scid gama (NSG) pelę (P1; Džeksono laboratorija, Bar Harbor, ME, JAV), po to toliau poodiškai suformuotos naviko ląstelės buvo praeinamos po oda ir į pilvaplėvės injekciją (P2). ). Kiekvienoje perėjoje buvo naudojami aštuonių savaičių patelės. P2 pelėms buvo labai patinę pilvaplėvės, žarnyno ir pilvaplėvės navikai. Visus mėginius, įskaitant P2 pilvaplėvės skysčio ląsteles, histologiškai apibūdino vyresnysis hematopatologas (SYT) ir jiems diagnozavo EITL. Dėl nuolatinio paciento pirminio naviko ir P2 pilvaplėvės skysčio ląstelių fenotipo, nuo šiol mes vadinsime jas pirminėmis EITL ląstelėmis. Sangerio seka patvirtino visų somatinių mutacijų, nustatytų pradiniame navike (5 papildoma lentelė), buvimą ir pirminėse ląstelėse. Eksperimentai su gyvūnais atitiko „SingHealth“ institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto etinius reikalavimus.

Pirminės EITL ląstelės buvo palaikomos RPMI-1640 (Invitrogen), papildytame 10% žmogaus serumu (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) ir 500 TV / ml interleukino-2 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Vokietija). Norint ištirti tikslinės EITL terapijos galimybes, 5 × 10 3 ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles iš trijų techninių kopijų ir apdorotos Stattic (CAS 19983-44-9; Selleck Chemicals, Houston, TX, JAV) ir MEK inhibitoriais. PD0325901 (CAS 391210-10-9; Axon Medchem, Groningenas, Nyderlandai) 72 valandas, ir tofacitinibas (CP 690550; Selleck Chemicals), Trametinib (GSK 1120212; Axon Medchem) ir Gefitinib (ZD 1839; Axon Medchem) 96 96 val. h nurodytose koncentracijose. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant „CellTiter-Glo“ liuminescencinių ląstelių gyvybingumo testą (Promega, Madisonas, WI, JAV). Inhibitorių veiksmingumas buvo papildomai įvertintas pagal jų poveikį tikslams pasroviui, naudojant Western blot. Ląstelių lizatai PD0325901, Trametinibui ir Tofacitinibui buvo surinkti 2 val. Ir po Stattic 24 val. Po gydymo. Dozės ir atsako kreivės buvo nubraižytos naudojant Prism programinę įrangą (GraphPad, La Jolla, CA, JAV). Visi gydymo vaistais eksperimentai buvo pakartoti bent du kartus su kiekvienu inhibitoriumi.

Prisijungimo numeriai

WES sekos, pavienių pradmenų sodrinimo technologijos ir giliųjų sekų sekos sekos nustatymo duomenys buvo deponuoti Europos branduolinių medžiagų archyve, kurio registracijos numeris yra PRJEB9720. „Affymetrix“ genomo plataus žmogaus SNP masyvo 6.0 ir „GeneChip“ žmogaus genomo U133 Plus 2.0 masyvo duomenys pateikiami „Gene Expression Omnibus 23“ su registracijos numeriu GSE70654.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Somatinių variantų identifikavimas pagal WES

Norėdami nustatyti somatines mutacijas EITL, mes atlikome keturių navikų WES su suderintais viso kraujo mėginiais (1a pav.). Norint maksimaliai padidinti varianto aptikimą iš riboto mėginio dydžio, buvo taikomi trys skirtingi skambintojų variantai - „Genomo analizės įrankių rinkinys“, „ 24 MuTect 25“ ir „Strelka“. Vidutinis aprėpties gylis buvo 126 ×, o vidutiniškai 88% tikslinių bazių buvo padengta bent 20 skaitymų (6 papildoma lentelė). 296 kandidatų variantų Sanger patvirtinimas parodė klaidingai teigiamą 3, 72% procentą. EITL mėginiuose buvo didelis mutacijų krūvis - vidutiniškai 85 mutacijos viename mėginyje (diapazonas 59–137). Iš viso buvo nustatyta 340 nesinoniminių somatinių mutacijų 313 genuose. Septyni iš šių genų taip pat patyrė tylias somatines mutacijas (5 papildoma lentelė). Nesinonimiškus variantus sudarė 284 missense ir 16 nonsense mutacijų, 13 kadrų poslinkio indelių, 25 sujungimo vietos mutacijos ir 2 mutacijos, dėl kurių buvo prarastas sustabdymo kodonas (papildomas 1a paveikslas). Kaip pastebėta daugelyje kitų vėžio atvejų, 27, 28 EITL mutacijų spektras pasižymėjo C> T perėjimų vyravimu (papildomas 1b paveikslas).

Image

Grafinė EITL navikų mutacijos ir subklonalumo profilio apžvalga. a ) Atliktų analizių tipai ir kiekvienam eksperimentui naudotų mėginių skaičius. Laikinai užšaldyti atvejai yra išvardyti pagal atitinkamus asmens tapatybės dokumentus. b ) Venno diagrama, iliustruojanti pasikartojančias atradimų grupės mutacijas. c ) EITL 013T mėginio subkloninė architektūra, gauta atlikus „SciClone“ analizę. Viršutinė schema parodo branduolio tankio nustatymą, o apatinio varianto alelių dažnis parodytas atsižvelgiant į skaitymo gylį (20 × aprėptis), atsižvelgiant į kopijavimo neutralų heterozigotiškumo neturinčių regionų praradimą. CNA, kopijų skaičiaus analizė; FFPE, įterptas formaline fiksuotas parafinas; GEP, genų ekspresijos profiliavimas.

Visas dydis

Iš viso buvo rasta 14 genų, pakartotinai mutavusių (1b paveikslas ir 5 papildoma lentelė). Tarp jų buvo kalcio jonus surišantis genas, daugialypis į EGF panašius domenus 6 ( MEGF6 ), ląstelių dydžio reguliatorius, kuriame gausu 16 ritininių ląstelių ( PRR16 ), ir milžiniškas raumenų baltymas Titinas ( TTN ), genai, turintys funkciją neuronų migracijoje, aksonai. Nurodymai ir cheminis tyrimas: R eelin ( RELN ), 1 žiedinė sankryža ( ROBO1 ) ir Semaphorin 3 A ( SEMA3A ) ir funkcijos, susijusios su blauzdų judėjimu ir transportavimu - Dynein 9 ( DNAH9 ) ir Intraflagellar Transport 140 ( IFT140 ). Be to, mutacijos buvo aptiktos histono acetiltransferazėse esančiame CREB jungiančiame baltyme ( CREBBP ) ir dviejose (numanomose) histono metiltransferazėse - papildomose sekso šukose panašiam transkripcijos reguliatoriui 3 ( ASXL3 ) ir SET srities domenams, kurių sudėtyje yra 2 ( SETD2 ). gali turėti vaidmenį EITL.

Įdomu tai, kad trys iš pasikartojančių mutavusių genų buvo su žinomais aktyvinančiais žirklės variantais. Jie apėmė du pagrindinius JAK-STAT kelio narius, centrinę signalų kaskadą imuninėse ląstelėse - janus kinazę 3 ( JAK3 ) ir signalo keitiklį bei 5B transkripcijos aktyvatorių ( STAT5B ) ir G baltymo alfa slopinančio aktyvumo polipeptidą 2 ( GNAI2 )., Gα baltymų šeimos narys. Pažymėtina, kad visais keturiais atvejais STAT5B buvo mutavęs, ir tai rodo svarbų vaidmenį EITL formavime. Trijuose mėginiuose buvo įprasta p.N642H mutacija, o ketvirtajame buvo padarytas sudėtingas pakaitalo įvykis 17 egzono pradžioje, dėl kurio atsirado du amino rūgščių pokyčiai - p.V712E ir p.S715L (žr. Papildomą pastabą ir 2 paveikslą). Tiek JAK3, tiek GNAI2 buvo mutavę nepaprastu 2/4 atvejų. JAK3 pakitimai įvyko dviejose skirtingose ​​aktyvinimo padėtyse (p.V674A ir p.M511I), tuo tarpu GNAI2 buvo mutavus tame pačiame kodone abiejuose mėginiuose (p.R179C ir p.R179S).

Norėdami suprasti EITL navikų kloninę architektūrą, mes naudojome „SciClone 29“ ląstelių, turinčių specifines mutacijas, populiacijoms identifikuoti. Visi keturi atradimų kohortos mėginiai parodė pastebimą vidinį naviko heterogeniškumą su penkiais subklonais, esančiais kiekviename naviko mėginyje (1c paveikslas, 3 papildomas paveikslas ir 7 papildoma lentelė). Kadangi buvo analizuojami tik nuo kopijų neutralūs segmentai, kuriuose nėra heterozigotiškumo segmentų, mes negalėjome nustatyti, ar JAK3 ir STAT5B mutacijos buvo skirtinguose subklonuose. Tačiau atitinkami pataisyti alelių dažnio variantai rodo, kad šios mutacijos yra dviejuose atskiruose klonuose (5 papildoma lentelė).

GNAI2 , JAK3 , STAT5B ir CREBBP paplitimo patikra

Aukštas STAT5B , JAK3 ir GNAI2 mutacijų dažnis nedidelėje tik keturių mėginių atradimų grupėje buvo intriguojantis, paskatinęs mus toliau analizuoti šių mutacijų paplitimą didesnėje EITL mėginių serijoje. Keturiasdešimt du papildomi EITL navikai (1 greitai užšaldytas ir 41 archyvinis mėginys) buvo tikrinami dėl GNAI2 , JAK3 ir STAT5B mutacijų, naudojant giluminę amplikono seką. Iš viso 57 mutacijos buvo padengtos vidutiniškai 20 004 skaitymais (diapazonas 104–175 515; 8 papildoma lentelė). Kadangi amplikonai apėmė tik įprastus mutacijos taškus, nurodytus COSMIC v.72, ir pozicijas, nurodytas atradimų kohortoje, tikėtina, kad mūsų rezultatai yra tikrosios šių trijų genų mutacijos dažnio įverčiai.

2 paveiksle apibendrinti atradimų ir paplitimo grupių rezultatai. STAT5B mutacijos buvo aptiktos 25/42 (60%) atvejų; 24/42 (57%) turėjo žinomas aktyvinančias mutacijas (p.N642H) Src homologijos 2 dimerizacijos srityje (2b paveikslas). JAK3 buvo mutavęs 14/42 (33%) mėginiuose su 13/42 (31%) turinčiomis aktyvinančiomis mutacijomis (p.M511I, p.A573V ir p.V674A / F), kurių dauguma buvo pseudokinazės domene (2c paveikslas). . Mes nustatėme du mėginius, turinčius dvi atskiras JAK3 aktyvinančias mutacijas, o trečiuoju atveju buvo nustatyti nepaprastai dideli trys aktyvinantys mutacijos atvejai, rodantys, kad šiems pacientams labai pasikeitė JAK3 funkcija. Pažymėtina, kad nė viename iš šių mėginių nebuvo aktyvinančios STAT5B mutacijos (2a paveikslas). Bendrai JAK-STAT kelias buvo pakeistas 32/42 (76%) atvejais. Stebėtina, kad didelis navikų pogrupis kartu suaktyvina dviejų to paties kelio narių mutacijas. Panašus reiškinys neseniai buvo aprašytas JAK1 ir STAT3 sisteminėse ALK neigiamose anaplastinėse didelių T ląstelių limfomose. 30 Be to, buvo įrodyta, kad šie mutantai sąveikaudami konstituciškai suaktyvina pasroviui perduodamus STAT3 signalus. Taigi tolesni mutavusių JAK3 ir STAT5B tyrimai yra pateisinami ir gali parodyti EITL navikogenezę.

Image

Dažnai mutavę EITL genai, identifikuojami WES ir giliųjų sekų sekos amplikonais. a ) STAT5B , JAK3 ir GNAI2 mutacijų dažnis, susijęs su CD8 dimeriu ir TCR tipu. Mutacijų pasiskirstymas b ) STAT5B , c ) JAK3 ir ( d ) GNAI2 genuose. Kiekvieno pakeitimo dažnis žymimas skliaustuose po etiketės. Užpildyti apskritimai rodo žinomus mutacijos taškus ir tuščių apskritimų mutacijas, kurių funkcinė pasekmė nežinoma. * Iš viso nustatytos keturios nesinonimiškos missense mutacijos, pakeičiančios dvi aminorūgštis. G, GTP surišantis; ND, nepadaryta; SH2, Src homologija 2; TA, transkripcijos aktyvacijos domenas; TCR, T-ląstelių receptoriai.

Visas dydis

GNAI2 mutacijos buvo stebimos 9/42 (21%) mėginiuose. Buvo nustatyti du pagrindiniai taškai - p.R179 ir p.T182 - abu yra GTP rišančiame domene (2d pav.) Ir yra žinomi aktyvinantys variantai. 31, 32, 33 Buvo nustatyta, kad vienu atveju buvo abi mutacijos. Nors yra mažesnis mutacijų dažnis, palyginti su STAT5B ir JAK3 , buvo pasiūlyta, kad mažesnį G baltymo α-subvienetų dažnį galima paaiškinti mutacijomis receptoriuose, sujungtuose su šiais G baltymais. 34 Atsižvelgiant į tai, abiejuose GNAI2 laukinio tipo atradimų kohortos pavyzdžiuose buvo patirtos somatinės mutacijos GPCR (5 papildomoji lentelė). Todėl būtų įdomu ištirti GPCR ir kitų Gα i signalizacijos narių mutacijų paplitimą didesnėje grupėje, kad būtų galima nustatyti dažnį, kuriuo ši kaskada keičiama EITL.

Nustatyta, kad visų trijų genų pokyčiai vienas kito atžvilgiu neatmeta ( JAK3 ir STAT5B : P vertė = 0, 2527; GNAI2 prieš STAT5B : P vertė = 0, 5118; GNAI2 prieš JAK3 : P vertė = 0, 9998; vienpusis Fišerio testas 35 „ CoMEt“). Dėl riboto įvykių skaičiaus negalėjome išanalizuoti giliųjų sekų sekos nustatymo duomenų subklonalumo; tačiau pataisyti alelių dažnio variantai rodo, kad visų trijų genų daugybinės mutacijos gali būti randamos tiek tame pačiame, tiek skirtinguose subklonuose (8 papildoma lentelė).

Taip pat išanalizavome CREBBP mutacijų dažnį dalinio paplitimo grupėje iš 16 mėginių. Mutacijos buvo nustatytos 2/16 (13%) atvejų, o iš viso CREBBP mutavo 6/20 (30%) mėginių (papildomas 4 paveikslas ir 9 papildoma lentelė). Buvo pranešta apie daugelio piktybinių navikų, įskaitant B-ląstelių limfomas, 36, 37, inaktyvinančias CREBBP mutacijas , o mutacijos buvo aprašytos kaip ankstyvieji įvykiai, susiję su prastesne baigtimi. 38, 39 Nors mūsų serijoje buvo numatoma, kad kiekvienas identifikuotas variantas bus ardantis, visose mutacijose įvyko mutacijos su sutampančiomis STAT5B ir (arba) JAK3 mutacijomis, kas rodo, kad CREBBP mutacijos gali būti ne pagrindinis inicijuojantis įvykis ir dar labiau patvirtinti aktyvuotos JAK- STAT kelias EITL.

Mutacijų koreliacija su patologiniais požymiais

Nustatytas STAT5B mutacijų dažnis yra beveik dvigubai didesnis nei anksčiau paskelbtame EITL tyrime su TCRγδ ekspresija. 18 Kadangi pastarasis rėmėsi Sanger sekos nustatymu, šį skirtumą bent jau iš dalies galima paaiškinti mažesniu Sanger sekos jautrumu. Tačiau mūsų pastebėjimai nepatvirtina hipotezės, kad STAT5B aktyvinančios mutacijos įvyksta tik EITL TCRγδ linijoje, nes aktyvinantys variantai buvo vienodai identifikuoti TCRαβ, TCRγδ, dvigubai neigiamais ir abejotinais dvigubai teigiamais atvejais (20%, 36%, 32). % ir 12% kiekviename pogrupyje; 2a paveikslas ir 10 papildoma lentelė). Panašus stebėjimas buvo atliktas ir dėl JAK3 ir GNAI2 aktyvinančių mutacijų.

Mes toliau atskyrėme mėginius pagal CD8 dimerų išraišką. Kiekvieno geno aktyvinančios mutacijos buvo navikuose su CD8α, CD8αβ ir dvigubai neigiamomis T ląstelėmis; daugiau nei pusė mėginių, kurių STAT5B aktyvinantys variantai buvo CD8αα tipo (61% CD8α, 26% CD8αβ ir 13% dvigubai neigiami) ; 10 papildoma lentelė). Tai atitinka nuostatą, kad EITL daugiausia yra CD8αα IEL navikas. 13 Svarbu tai, kad tarp mutantų atvejų su skirtinga TCR ir (arba) CD8 ekspresija nėra fenotipinio skirtumo (papildomi 5 ir 6 paveikslai).

Nukopijuokite numerio pakeitimus EITL

Norėdami apibūdinti EITL chromosomų anomalijas, visus mėginius iš atradimų kohortos profiliavome į viso genomo SNP matricą. Visi navikai buvo maždaug diploidiniai. Mes nustatėme kiekvieną iš anksčiau nurodytų dažnų chromosomų pokyčių (16q12.1 praradimas ir 9q31.3 ir 8q24 padidėjimas) 1, 3, 10, 13, pakartotinai pakitusių 2/4 pavyzdžių (papildoma 11 lentelė). Tai apima MYC geno amplifikaciją (keturios kopijos iš dviejų mėginių). Svarbu tai, kad 1q32.2-q41 ir 5q34-q35.5 pokyčiai, klasikiniame EATL labiau paplitę, palyginti su EITL, nebuvo nustatyti. Kiti pasikartojantys nuostoliai apėmė 8p, 11q ir 12p bei 7q prieaugį (išsamūs regionai 11 papildomoje lentelėje).

Pažymėtina, kad visi keturi mėginiai parodė neutralų heterozigotumo praradimą 17q chromosomoje, kurioje yra STAT5B (3a ir b pav.). Šis reiškinys anksčiau buvo pastebėtas JAK2 ir JAK3 kitose hematologinėse neoplazmose, 40, 41, ir manoma, kad jis atsirado dėl somatinių rekombinacijų. Kiek mums yra žinoma, tai yra pirmas kartas, kai įgyta vienkartinė disomija buvo aprašyta STAT5B ir dar kartą parodo, koks yra pagrindinis šio geno vaidmuo kuriant EITL. Atsižvelgiant į tai, imunohistocheminė mėginių analizė naudojant mutavusį STAT5B atskleidė pastebimą fosforilinto STAT5 padidėjimą (12 papildoma lentelė), kurio pavyzdys parodytas 3c paveiksle. Įdomu būtų sužinoti, ar histologiškai iš tolimos gleivinės į centrinę naviko zoną pereinama nuo heterozigotumo iki homozigotiškumo, ar kliniškai nuo pirminės diagnozės iki atkryčio, atspindinčio kloninę evoliuciją, kaip pastebėta kituose navikuose. 41, 42

Image

Įgyta vienkartinė disomija STAT5B lokuse. a ) Dviejų STAT5B mutantų mėginių, išskiriančių 17q chromosomą, auglio (ASCAT) alelio specifinės kopijos skaičiaus analizė. Viršutinės plokštės rodo SNP neapdorotų (raudonų) ir segmentinių (žalių) B-alelių dažnį (BAF). Apatinėse plokštėse pateikiami aleliui būdingi kopijų skaičiaus profiliai - raudonos linijos žymi aukštesnįjį, o žalioji - žemesnįjį kopijos chromosomų haplotipus. Žalia linija yra lygi nuliui, o tai rodo heterozigotumo praradimą. b ) Sanger sekos elektroferogramos, parodančios, ar tuose pačiuose mėginiuose yra STAT5B somatinė mutacija. c ) Reprezentatyvūs pSTAT5 imunohistocheminio dažymo vaizdai STAT5B laukinio tipo ir mutantų atvejais. Padidinimas × 400. VAF, varianto alelio dažnis iš WES.

Visas dydis

Mes taip pat nustatėme du mėginius su PIK3CG geno amplifikacija (atitinkamai penkios ir keturios kopijos), kurie taip pat buvo akivaizdūs baltymų lygyje tiek pačiame PIK3CG, tiek pasroviui esančiame pAKT viename mėginyje (papildomas 7 paveikslas). Tokios amplifikacijos paplitimas turėtų būti tiriamas didesnėje grupėje, nes tai galėtų atverti naujas tikslinės terapijos galimybes. Pirmasis PI3K inhibitorius jau naudojamas tam tikrų B ląstelių piktybinių navikų gydymui, kurių dar daug kuriama. 43

EITL paveikti keliai ir biologinės funkcijos

Pagrindinėms biologinėms funkcijoms ir signalizacijos keliams, paveiktiems EITL, nustatyti buvo naudojami du skirtingi metodai - mutavusių WES genų išradingumo kelio analizė (IPA) ir genų rinkinio praturtinimo analizė (GSEA), atlikta pagal EITL navikų genų ekspresijos profiliavimą.

Tarp visų mutavusių genų pagrindinės ląstelių funkcijos, tokios kaip ląstelių žūtis, išgyvenimas, vystymasis, diferenciacija, homeostazė ir proliferacija, buvo pastebimai praturtintos (13 papildoma lentelė), daugelis jų paveikė limfocitus ar T-ląsteles. Be to, mutavę genai taip pat buvo reikšmingai susiję su komponentais, dalyvaujančiais T ląstelių ir žarnyno morfologijoje, ir genais, žinoma, susijusiais su vėžiu ir limfoidinėmis piktybinėmis ligomis. Svarbu ir tai, kad pastebimas ląstelių signalizacijos praturtėjimas ir DNR surišimas. Visi šie duomenys rodo, kad pagrindinės ląstelių funkcijos yra svarbios EITL vystymuisi ir yra gerai susijusios su šios ligos pobūdžiu.

Remdami mūsų genominius radinius, kanoniniai JAK-STAT ir GPCR signalai buvo vieni iš praturtintų IPA būdų (klaidingų atradimų dažnis q-vertė = atitinkamai 0, 24 ir 0, 03; papildoma 14 lentelė). Be to, buvo pakeisti ir keli kiti šių kaskadų aspektai, nurodantys aukščiau aprašytų GNAI2 , JAK3 ir STAT5B mutacijų svarbą. Tai apima JAK1 ir JAK3 vaidmenį signalizuojant γc citokinų signalus, signalus apie onkostatino M, interleukino-2 ir interleukino-9 signalus, cAMP tarpininkaujant signalizacijai ir Galai signalizaciją. Taip pat buvo rasta praturtintų vėžio molekulinių mechanizmų, kurie rodo klasikinių vėžio genų įsitraukimą į šią ligą. Pastarąjį patvirtina kiekvienu atveju aptikti bent vienas mutavęs naviko slopintuvas arba onkogenas (5 papildoma lentelė). Kadangi IPA nesvarsto genų pakitimų pasikartojimo, mes pakartojome analizę tik su pasikartojančių mutavusių genų sąrašu. Svarbu tai, kad visi minėti keliai, išskyrus Gaαi signalizaciją, buvo žymiai praturtinti EITL (15 papildoma lentelė).

Norėdami patikrinti, kas išdėstyta pirmiau, nesusijusiais būdais, atlikome keturių EITL navikų, iš kurių CD8αα ir dviejų CD8αβ, genų ekspresijos profiliavimą. Kadangi siūloma, kad EITL atsirastų dėl CD8 + IEL, 13 savo duomenis integravome į sveikų donorų viešai prieinamą CD8αα ir CD8αβ T ląstelių profilį. Iš viso EITL navikuose buvo reikšmingai padidinta 1760 genų reikšmė ( P <0, 05 ir raukšlės pokytis  1, 5; 16 papildoma lentelė). GSEA prieš molekulinius parašus duomenų bazės genų rinkiniai 45 buvo naudojami norint panaikinti nereguliuojamus kelius. Panaudoti genų rinkiniai ir visa GSEA statistika yra parodyta 17 papildomoje lentelėje. Pažymėtina, kad GSEA nepriklausomai patvirtino IPA analizės išvadas, naudodama mutavusius WES genus. Keletas GPCR signalizacijos aspektų buvo rasta žymiai praturtinti EITL mėginiuose, įskaitant GPCR ligando surišimą, signalizavimą GPCR ir, svarbiausia, Gaα signalizavimą (8 papildomas paveikslas). Tai aiškiai rodo žymų Gα i signalizacijos reguliavimo panaikinimą EITL ir papildomai rodo atrastų GNAI2 mutacijų funkcinę svarbą.

Be to, mes taip pat nustatėme, kad KEGG JAK-STAT signalizacijos kelias yra žymiai praturtintas EITL. Aukštesnioji q reikšmė (17 papildoma lentelė) šiuo atžvilgiu nestebina, nes žinoma, kad JAK-STAT kelio aktyvacija vyksta baltymų fosforilinimo, o ne padidintos mRNR ekspresijos dėka. Dar svarbiau, kad buvo nustatyta išskirtinė asociacija su genais, kurių promotoriuose yra STAT5B surišimo vietos, tiek dėl trumpesnio, tiek ilgesnio sutarimo motyvo. Mes tai dar kartą patvirtinome GSEA, palyginti su viešai prieinamų STAT5 taikinių genų rinkiniais. 46 Buvo reikšmingas praturtėjimas tarp STAT5 taikinių ir genų, reguliuojamų EITL (normalizuotas praturtėjimo balas = 1, 78, klaidingo atradimo dažnis q-vertė <0, 001; papildomas 8d paveikslas).

Genų ekspresijos profiliavimo duomenys buvo patvirtinti atsitiktinai parinktų genų realiojo laiko PGR (18 papildoma lentelė). Dviejų eksperimentų vertės buvo nuoseklios, nors koreliacija nebuvo statistiškai reikšminga dėl mažo imties dydžio (papildomas 9 paveikslas). Apibendrinant, buvo įrodyta, kad JAK-STAT ir GPCR signalizacijos keliai žymiai praturtėjo EITL navikais, naudojant du skirtingus duomenų rinkinius ir metodikas.

Tikslinė terapija slopina pirminių EITL ląstelių gyvybingumą

Suaktyvinant genų, koduojančių G baltymų α-subvienetus, mutacijas, įvyksta daugelio žmonių vėžys, onkogeniniai G baltymų slopinamųjų subvienetų pokyčiai vyksta daug rečiau. Onkogeninė GNAI2 forma ( GNAI2 p.R179C / H), vadinama gip2 , 32, pirmiausia buvo nustatyta antinksčių žievės ir kiaušidžių endokrininiuose navikuose, 31 ir p.T182A vėliau apibūdinta kaip konstituciškai aktyvuotas mutantas. 33 Pažymėtina, kad gip2 konstituciškai suaktyvina mitogenų suaktyvintą baltymo kinazę 47, greičiausiai dėl slopinamojo poveikio ląstelių cAMP lygiui. 48

Norėdami geriau suprasti tai, kas išdėstyta aukščiau, sukūrėme stabilias ląstelių linijas, kurios per daug išreiškia GNAI2 laukinio tipo ir mutantų formas (p.R179C ir p.R179S). Abiejose mutantinėse ląstelėse buvo nustatytas stiprus fosforilinto ERK1 / 2 lygio reguliavimas, tuo tarpu bendras ERK1 / 2 baltymo lygis nepakito (4a pav.). Tas pats stebėjimas buvo atliktas dviejose nepriklausomose ląstelių linijose. Remiantis tuo, imunohistocheminė GNAI2 mutantų analizė taip pat atskleidė fosforilinto ERK1 / 2 padidėjimą (12 papildoma lentelė), kurio pavyzdžiai parodyti 4b paveiksle, leidžiant manyti, kad MEK-ERK signalizacijos kelias abejotinai suaktyvinamas šiuose EITL navikuose.

Image

Veiksminga tikslinė JAK, STAT ir MEK inhibitorių terapija pirminėse EITL ląstelėse. ( a ) Stabilios ląstelių linijos buvo sukurtos per daug ekspresuojant GNAI2 laukinio tipo ir mutantus HuT78 ir Jurkat ląstelėse. Atitinkamų baltymų ekspresija buvo įvertinta Western blot metodu. b ) Reprezentatyvūs pERK1 / 2 imunohistocheminio dažymo vaizdai GNAI2 laukinio tipo ir mutantiniuose navikuose. Padidinimas × 400. c ) Reprezentatyvus e x vivo ląstelių gyvybingumo tyrimas pirminėse EITL ląstelėse, apdorotose PD0325901 ir „Stattic“ 72 valandas, ir Tofacitinib, Trametinib ir Gefitinib 96 valandas. Visi rezultatai yra normalizuojami iki kontrolinės (dimetilsulfoksidas (DMSO)) ir pateikiami kaip vidurkis ± sd. Eksperimentas buvo pakartotas mažiausiai du kartus su kiekvienu inhibitoriumi. d ) Nurodytų baltymų imunoblotai pirminėse EITL ląstelėse, apdorotose PD0325901, Tofacitinibu ir Trametinibu dviem ir Static 24 valandas, esant nurodytoms koncentracijoms.

Visas dydis

Visų pirma, nustatant suaktyvintus kelius EITL siūlo naujas gydymo galimybes. JAK3 ir STAT5B yra tiesiogiai nukreipti į mažų molekulių inhibitorius, ir kadangi mutantinis GNAI2 aktyvina MEK-ERK kelią, MEK inhibitoriai gali būti veiksmingi EITL gydymui. Norėdami dar labiau patvirtinti JAK-STAT ir GPCR signalizacijos kelių dalyvavimą EITL išgyvenime, įvertinome dviejų abiejų kelių inhibitorių poveikį pirminėse EITL ląstelėse - tofacitinibą (pan-JAK inhibitorius), Stattic (STAT3 inhibitorių) ir MEK inhibitorius. Trametinibas ir PD0325901. Visi keturi inhibitoriai sumažino ląstelių gyvybingumą priklausomai nuo dozės, palyginti su kontrole, gauta su nešikliu (4c paveikslas). Svarbu tai, kad pirminės ląstelės buvo atsparios nereikšmingo kelio inhibitoriui - EGFR inhibitoriui Gefitiniibui - tai rodo, kad pastebėtas poveikis atsirado ne dėl bendro citotoksiškumo. Be to, visi keturi vaistai aiškiai slopino signalizacijos kaskadas pasroviui, tai įrodė STAT3, STAT5 ir ERK1 / 2 fosforilinimo slopinimas (4d paveikslas).

Šios pirminės EITL ląstelės turi mutacijas tiek JAK3, tiek pasroviui esančiame STAT5B , ir tai gali paaiškinti prastesnį Tofacitinibo jautrumą, palyginti su Stattic. Tolesnis mūsų duomenų palaikymas, JAK-STAT kaskados inaktyvacija, pašalinant kelio narius ar tikslinę terapiją, taip pat veiksmingai sumažina odos T-ląstelių limfomos ląstelių, turinčių aktyvinančią p.A573V JAK3 mutaciją, ląstelių gyvybingumą. 49, 50, 51, 52 Nepaisant GNAI2 mutacijų pirminėse EITL ląstelėse, keli kiti GPCR kelio nariai - GPCR HTR1F , GRM5 , MRGPRX3 ir GPR179 ir baltymų tirozino fosfatazė DUSP4 (5 papildoma lentelė) - yra visi. pakitęs šiose ląstelėse gali sukelti GPCR kelio aktyvavimą pasroviui. Svarbu tai, kad DUSP4 inaktyvuoja ERK1 / 2. Pirminėse EITL ląstelėse nustatyta p.R300W mutacija yra tiesiai DUSP4 katalitinio dvejopo specifiškumo fosfatazės domeno viduryje. Kaip dažniausiai stebima mutacijų veikimas fermentų funkciniuose domenuose, tikėtina, kad nustatyta p.R300W mutacija sukelia DUSP4 baltymo inaktyvaciją, dėl kurios suaktyvėja ERK baltymai, ir tai gali paaiškinti MEK slopinimo šiose ląstelėse efektyvumą. Be to, GPCR, Gaa ir MEK-ERK keliai yra žymiai praturtinti pradiniame naviko mėginyje (papildomi 8a ir c paveikslai), dar labiau palaikydami šių signalizacijos kelių abejotiną aktyvavimą. Visi šie rezultatai rodo, kad tikslinė terapija gali būti naudinga gydant EITL pacientus.

Išvados

Tai yra pirmasis tyrimas, išsamiai apibūdinantis EITL molekulinius pokyčius ir pateikiantis naujas įžvalgas apie šios ligos patogenezę. Mes aiškiai pademonstravome JAK-STAT ir GPCR signalizacijos kelių pokyčius keliais lygmenimis, įskaitant mutacijas, chromosomų pokyčius ir transkripcijos padidėjusį reguliavimą. Didelis mutacijų dažnis ir mutacijų vieta pagrindinėse funkcinėse srityse rodo šių variantų svarbą ir ypač gali suteikti naujų galimybių tiksliniam gydymui ar geresnei diagnostikai. Tai patvirtina mūsų in vitro duomenys, rodantys pirminių EITL ląstelių reakciją į abiejų kelių inhibitorius. Šiems atradimams pagrįsti ir funkciškai įvertinti pagal konkrečiai ligai reikalingą modelį reikia atlikti papildomus tyrimus.

Prisijungimai

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE70654
  • PRJEB9720

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildomos lentelės

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento Leukemijos svetainėje (//www.nature.com/leu)