Dna polimerazės β variantas k167i, kuris randamas stemplės karcinoma sergantiems pacientams, pablogina polimerazės aktyvumą ir ber | mokslinės ataskaitos

Dna polimerazės β variantas k167i, kuris randamas stemplės karcinoma sergantiems pacientams, pablogina polimerazės aktyvumą ir ber | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Pagrindo ekscizijos remontas
  • DNR pažeidimo atsakas

Anotacija

DNR polimerazė β (pol β) yra pagrindinis fermentas atkuriant DNR bazės eksciziją ir svarbus veiksnys palaikant genomo vientisumą ir stabilumą. Įrodyta, kad stemplės vėžiu (EC) sergantiems pacientams, kuriems buvo nustatytas K167I pol β variantas, sumažėjo gyvenimo trukmė. Tačiau nežinoma, ar variantas veikia pol β funkcijas ir (arba) kaip jis prisideda prie vėžio atsiradimo ir progresavimo. Šiame tyrime mes išreiškėme ir išgryninome K167I variantą. Be to, mes nustatėme, kad K167I žymiai sumažino polimerazės aktyvumą. Dėl to K167I pakeitimas sumažino bazės ekscizijos atstatymo (BER) efektyvumą, kai tiriamas atstatant arba naudojant ląstelių ekstraktus. Galiausiai mes pastebėjome, kad K167I variantą ekspresuojančios EC ląstelės yra jautrios DNR pažeidžiančioms medžiagoms. Šie rezultatai rodo, kad K167I variantas paveikė pol β biocheminį aktyvumą, dėl kurio sutrinka BER funkcija, o tai vėliau gali prisidėti prie genomo nestabilumo ir vėžio vystymosi.

Įvadas

Tumorigegenezė yra evoliucijos procesas, pasirenkantis genetinius ir epigenetinius pokyčius, leidžiantis išvengti antiproliferacinių ir ląstelių žūties mechanizmų, kurie paprastai riboja somatinių ląstelių kloninę plėtrą 1 . Genominis nestabilumas, dažnas vėžinių ląstelių bruožas, skatina onkogeninių mutacijų kaupimąsi, o radiacija ir įvairūs genotoksiniai agentai išlieka svarbūs ir, kaip nustatyta, daugumoje navikų 2, 3 . Atsakas į DNR pažeidimą, kuris saugo genomo vientisumą, atkuria DNR žalą ir yra kaip onkogeno sukelta biologinė kliūtis nuo vėžio progresavimo už jo ankstyvosios stadijos 4 .

DNR pol β yra pirminė polimerazė, dalyvaujanti bazės ekscizijos atstatyme (BER), dėl savo bifunkcinio dezoksiribozės fosfato lipazės ir polimerazės aktyvumo, ir ji veikia visuose 5, 6, 7, 8 BER poodiniuose keliuose. BER yra pagrindinis DNR atstatymo būdas eukariotų ląstelėse, jis yra atsakingas už iki 20 000 pažeidimų pašalinimą vienoje ląstelėje per dieną, įskaitant oksidacinį ir alkilinimo pažeidimą 9, 10 . Iš visų nustatytų BER baltymų buvo įrodyta, kad pol β yra pagrindinis tiek trumpalaikio BER (SP-BER), tiek ilgo pleistro BER (LP-BER) keliuose 11, 12, 13, 14, 15 . Pol β yra 39 kDa baltymas, turintis du domenus; dRP lipazės domenas (8 kDa) ir polimerazės domenas (31 kDa). Šie du domenai atitinka dRP lipazės ir polimerazės veiklą, kuri yra atsakinga už atitinkamai cukraus fosfato grupės pašalinimą ir naujų dezoksiribonukleotidų įtraukimą 16 .

Buvo pranešta, kad mutacijos, turinčios įtakos dRP lipazės ar polimerazės aktyvumui, ląstelėse sumažina BER efektyvumą ir sukelia padidėjusį jautrumą alkilinantiems ar oksidaciniams agentams, įskaitant metilmetansulfonatą (MMS) 21, 22, apie 17, 18, 19, 20 pol β. Polimorfizmai gali sukelti biocheminius pokyčius, BER trūkumą ir polinkį į vėžį 18, 23, 24, 25, 26, 27, todėl įdomu nustatyti, ar ir kaip konkretus polimorfizmas padidina vėžio atsiradimo tikimybę. Ankstesniuose mūsų tyrimuose dėl EC buvo rastas pavienis nukleotidų pakaitalas, kurio rezultatas yra K167I variantas. EB pacientams, kuriems buvo nustatytas K167I variantas, gyvenimo trukmė taip pat sutrumpėjo 28 . Tačiau nežinoma, ar variantas veikia pol β funkcijas ir (arba) kaip jis prisideda prie vėžio vystymosi ir progresavimo.

Šiame dabartiniame tyrime mes išreiškėme ir išgryninome K167I variantą ir nustatėme, kad jis žymiai sumažina polimerazės aktyvumą. Čia pakeitimas K167I sumažino BER efektyvumą, kai buvo tiriamas tirpinimo tyrime ir ląstelių ekstraktuose. Be to, K167I variantą ekspresuojančios EC ląstelės buvo jautrios DNR pažeidžiančioms medžiagoms. Šie rezultatai rodo, kad K167I variantas turėjo įtakos pol β biocheminiam aktyvumui, dėl kurio atsirado BER trūkumas, kuris galiausiai gali prisidėti prie vėžio vystymosi.

Rezultatai

K167I variantas turi polimerazės aktyvumo trūkumų

Norėdami nustatyti K167I varianto poveikį pol β biocheminiam aktyvumui ir biologinėms funkcijoms, pirmiausia išreiškėme ir išgryninome WT ir K167I žmogaus pol β, tada atlikome pradmenų prailginimo eksperimentus ir galiausiai atlikome dRP lizės ir DNR surišimo aktyvumo tyrimus 29 . Grunto prailginimo tyrime mes nustatėme, kad K167I variantas turėjo maždaug 70% mažesnį grunto prailginimo aktyvumą, palyginti su WT fermentu (1A pav.). Tačiau tarp K167I varianto ir WT fermento DNR surišančiojo aktyvumo ar dRP lipazės aktyvumo skirtumų nebuvo (1B pav., C). Šie rezultatai nebuvo netikėti, atsižvelgiant į tai, kad K167I mutacija vyksta 31 kDa delno srityje, kuri yra polimerazės katalizinis domenas.

Image

( A ) Polimerazės aktyvumo testai buvo atlikti naudojant biotinu pažymėtą 1-nt spragą turinčią DNR substratą (pol-GAP). Atskirti DNR polimerizacijos produktai buvo nuvilkti naudojant Sepharose-avidin granules. Po plovimo, į produktus įterptų radioaktyviai paženklintų nukleotidų kiekis buvo nustatytas skaičiuojant skysčių scintiliaciją. Mes nustatėme, kad K167I variantas (0, 25 ng: 5, 2 ± 0, 57, 0, 5 ng: 11, 3 ± 1, 25, 1 ng: 18, 5 ± 2, 31, 2 ng: 26, 2 ± 2, 94, 4 ng: 32, 1 ± 3, 51, 6 ng: 35, 7 ± 3, 97, 8 ng: 37, 8 ± 4, 84), turėjo maždaug 30% pradmens prailginimo aktyvumo, palyginti su WT fermentu (0, 25 ng: 11, 2 ± 1, 52, 0, 5 ng: 25, 4 ± 3, 45, 1 ng: 52, 6 ± 5, 79, 2 ng: 71, 8 ± 7, 04, 4 ng: 84, 5 ± 7, 95, 6 ng: 91, 3 ± 8, 89, 8 ng: 99, 1 ± 8, 97). ( B ) ELISA metodu pagrįsti K167I afiniteto DNR surišimo adsorbcijos tyrimai (0, 0125 μg: 0, 08 ± 0, 005, 0, 025 μg: 0, 15 ± 0, 011, 0, 05 μg: 0, 21 ± 0, 015, 0, 1 μg: 0, 27 ± 0, 011, 0, 2 μg: 0, 33 0, 024, 0, 4 μg: 0, 36 ± 0, 023, 0, 8 μg: 0, 38 ± 0, 028) ir WT pol β (0, 0125 μg: 0, 09 ± 0, 005, 0, 025 μg: 0, 17 ± 0, 010, 0, 05 μg: 0, 24 ± 0, 015, 0, 1 μg: 0, 31 ± 0, 021, 0, 2). μg: 0, 36 ± 0, 020, 0, 4 μg: 0, 38 ± 0, 023, 0, 8 μg: 0, 41 ± 0, 028). DNR substratas buvo pažymėtas pol-GAP biotinu. ( C ) 5'dRP lipazės aktyvumo kiekybinis įvertinimas K167I (1 ng: 22, 4 ± 2, 79, 2 ng: 31, 7 ± 3, 04, 4 ng: 70, 6 ± 7, 15, 6 ng: 82, 1 ± 7, 92, 8 ng: 89, 7 ± 8, 25, 10). ng: 95, 4 ± 8, 74) ir WT pol β (1 ng: 21, 9 ± 2, 31, 2 ng: 35, 2 ± 2, 94, 4 ng: 76, 2 ± 6, 89, 6 ng: 84, 3 ± 7, 64, 8 ng: 93, 1 ± 8, 73, 10 ng: 98, 7 ± 8, 81).

Visas dydis

K167I variantas turi mažesnį BER efektyvumą

Sumažėjęs K167I varianto polimerazės aktyvumas leido manyti, kad K167I greičiausiai turėjo įtakos BER funkcijai. Šiai hipotezei patikrinti buvo atliktas BER tyrimas, naudojant uracilą, turintį substratą (pol β-U) 29 . Uracilo pažeidimo pašalinimas dėl UDG ir APE1 suderinto veikimo sukėlė nikelio DNR dupleksą, po kurio buvo inkorporuotas 32 P-dCTP ir kiti deoksinukleotidai, iš kurių susidarė 20–30 nt nesujungtų tarpinių junginių, kurie buvo matomi „PhosphorImager“. . Šio tyrimo rezultatai parodė, kad uracilo pažeidimai buvo efektyviai ištaisyti esant WT pol β, ir buvo gauta 40 nt juosta, bet ne su K167I variantu (2A pav.). Norėdami patvirtinti, kad K167I variantas daro įtaką BER efektyvumui, mes išreiškėme žmogaus WT ir K167I pol β pol β išmušimo EC9706 ląstelėse. Tada BER efektyvumo tyrimuose buvo naudojami branduoliniai ekstraktai (NE) iš šių ląstelių linijų. Šių eksperimentų rezultatai parodė, kad ląstelių, ekspresuojančių WT pol β, NE efektyviai atitaisė uracilo pažeidimą ir sukūrė visiškai suremontuotą 40 nt produktą, tuo tarpu NE, kurio ląstelės išreiškė K167I pol β, NE remonto efektyvumas maždaug 80% sumažino efektyvumą. palyginti su WT pol β efektyvumu (2B pav.).

Image

( A ) BER rekonstrukcijos tyrimai su išgrynintu WT ir K167I pol β. Iš WT gauto produkto (0, 625 ng: 34 ± 0, 9, 1, 25 ng: 59 ± 2, 5, 2, 5 ng: 84 ± 5, 4, 5 ng: 100 ± 6, 3) ir K167I (0, 625 ng: 8 ± 0, 5, 1, 25 ng) santykinis procentas. : 12 ± 0, 9, 2, 5 ng: 22 ± 1, 3, 5 ng: 31 ± 1, 5) parodyti pol β pavyzdžiai. ( B ) BER atstatymo tyrimai, naudojant sveikų ląstelių ekstraktą WT ir K167I. Santykinis pataisyto produkto, gauto esant skirtingoms fermentų koncentracijoms iš WT, procentas (1 μg: 18 ± 0, 9, 2 μg: 38 ± 1, 7, 3 μg: 63 ± 3, 2, 4 μg: 91 ± 3, 9, 5 μg: 100 ± 5, 4) ir Parodyti K167I (1 μg: 3 ± 0, 5, 2 μg: 8 ± 1, 1, 3 μg: 12 ± 1, 5, 4 μg: 16 ± 3, 5, 5 μg: 21 ± 2, 8) pol β mėginiai.

Visas dydis

Pol β išmušimo ląstelės, ekspresuojančios K167I variantą, demonstruoja mažesnį DNR atstatymo pajėgumą

Pirmiausia atlikome kolonijų formavimosi testus, kad nustatytume K167I poveikį nuo tvirtinimo vietos nepriklausančiam EC9706 ląstelių augimo pajėgumui. EC9706 ląstelės, WT (WT), pol β išmušimo ląstelės ( pol β - / - ) ir pol β - / - ląstelės, ekspresuojančios žmogaus WT arba K167I pol β ( pol β - / - / WT ir pol β - / - / K167I, atitinkamai) buvo tiriami. Rezultatai parodė, kad pol β - / - / K167I kolonijų skaičius buvo didesnis nei pol β - / - / / WT, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo tarp dviejų grupių nebuvo (3 pav. A). Atsižvelgdami į mūsų pastebėjimą, kad K167I pol β sukėlė sutrikusią BER, mes pasiūlėme, kad K167I variantą ekspresuojančios ląstelės būtų jautrios DNR bazę žalojantiems agentams. Norint patikrinti šią hipotezę, keturi EC9706 ląstelių tipai buvo gydomi jautriu metilo metansulfonatu (MMS). Šie rezultatai parodė, kad pašalinus pol β ląsteles, kaupiasi DNR pažeidimai, kai MMS koncentracija yra> 1 mM (3B pav.). FACS duomenys atskleidė, kad apoptozinių ląstelių skaičius iš pol β - / - arba pol β - / - / K167I mėginių didesnis nei WT grupėje. Be to, K167I ląstelėse MMS sukelta apoptozė padidėjo 6 kartus, palyginti su WT ląstelėmis (4, 6%, palyginti su 0, 8%) (3C pav.). Augimo slopinimo tyrimų duomenys parodė, kad MMS nuosekliai turėjo stipresnį slopinamąjį poveikį pol β - / - / K167I ląstelių augimui, palyginti su WT arba pol β - / - / WT ląstelėmis. Po MMS apdorojimo, MMS apdorotų / neapdorotų β - / - / K167I ląstelių santykis buvo <10%, tuo tarpu WT arba pol β - / - / WT ląstelių santykis buvo> 80% (3D pav.).

Image

( A ) Nuo tvirtinimo vietos nepriklausomas augimas buvo matuojamas kolonijų susidarymu minkštame agare. Buvo įvertintos kolonijos, turinčios> 50 ląstelių. ( B ) DNR pažeidimo tyrimas. Ląstelės buvo apdorotos MMS. Pažeistų DNR pažeidimų kiekis buvo nustatytas naudojant ARP. ( C ) MMS sukelta apoptozė buvo analizuojama srauto citometrija. ( D ) Ląstelių jautrumas buvo nustatytas augimo slopinimo eksperimentais po to, kai ląstelės buvo apdorotos MMS.

Visas dydis

Diskusija

Pol β yra pirminė polimerazė, dalyvaujanti BER per savo bifunkcinę dezoksiribozės fosfato lipazės ir polimerazės veiklą, ir yra svarbus veiksnys palaikant genomo vientisumą ir stabilumą. Pol β užpildo vieną nukleotidų tarpą ir katalizuoja dRP grupės pašalinimą 13, 31, 32 . Maždaug 30% žmonių navikų, ištirtų dėl mutacijų pol β, išreiškia pol β variantus 30 . Daugelis šių variantų atsiranda dėl vienos aminorūgšties pakaitų. Šiame tyrime mes išreiškėme ir išgryninome K167I pol β variantą. Tyrimais, atliktais naudojant šį variantą, nustatyta, kad K167I variantas nesugebėjo katalizuoti DNR sintezės, tačiau vis tiek sugebėjo surišti DNR ir turėjo dRP lipazės aktyvumą, panašų į WT pol β. Mes taip pat atradome K167I mutaciją, kuri žymiai sumažino polimerazės aktyvumą, sumažino BER efektyvumą ir bendrą DNR bazės pažeidimo atstatymo pajėgumą tiek in vitro , tiek in vivo . Remiantis mūsų ankstesniais atradimais, kad EB pacientai, kuriems yra K167I, sumažino gyvenimo trukmę, nuo tvirtinimo vietų nepriklausomų augimo tyrimų rezultatai parodė, kad pol β - / - / K167I kolonijų skaičius buvo didesnis nei pol β - / - / WT. Tačiau tarp šių dviejų grupių statistinio reikšmingumo nepastebėta. Šie rezultatai rodo, kad asmuo, turintis K167I variantą, gali būti jautrus endogenines ir egzogenines DNR žalojančioms medžiagoms dėl sutrikusios polimerazės aktyvumo ir ląstelių bazės ekscizijos atstatymo pajėgumų.

Amino rūgšties liekana Lys167 yra labai svarbi 33, 34 pol β funkcijoms. Pagal kristalų struktūrą K167I priskiriamas polimerazės kataliziniam domenui pol β 16 . K167I pakeitimas gali sutrikdyti vandenilio jungčių susidarymą ir taip pabloginti polimerazės aktyvumą. Remiantis šia hipoteze, šiuose eksperimentuose K167I turėjo maždaug 30% WT pol β DNR polimerazės aktyvumo (1A pav., B). Čia mes parodėme, kad K167I nesugeba katalizuoti DNR sintezės, tarpininkaujamos polβ. Kai WT pol β jungiasi su DNR, jis katalizuoja DNR sintezę ir dRP fragmento pašalinimą, taip paruošdamas DNR ligavimui III α DNR ligaze. Jei K167I jungiasi prie DNR, jis negali užpildyti vieno nukleotido tarpo. Kai kurie neužpildyti tarpai gali lemti ląstelių mirtį. Tai atitinka mūsų parodymą, kad K167I raiška, nesant WT pol β ląstelėse, jautrina juos MMS. Dėl MMS poveikio ląstelėms, ekspresuojančioms K167I, žūva. Tikėtina, kad neužpildytos spragos sukelia citotoksiškumą, dėl kurio atsiranda MMS jautrumas.

Dabartiniame tyrime mes iliustravome, kad vienas nukleotidų pakaitalas gali turėti didelę įtaką baltymų funkcijai. Individualus polimorfizmas daro silpną poveikį, tačiau atitinkamų polimorfizmų deriniai gali dar labiau padidinti padidėjusią žmonių ligų riziką 35 . Kadangi DNR nuolat keičiasi, spontaniškai arba pasireiškiant išoriniams veiksniams, labai efektyvios DNR taisymo sistemos yra nepaprastai svarbios, norint pašalinti pažeistus DNR pažeidimus ir išlaikyti genomo vientisumą. Genominis nestabilumas, bendras vėžinių ląstelių bruožas, galėtų paskatinti onkogeninių mutacijų kaupimąsi. Tokiu atveju K167I pol β variantas gali smarkiai prisidėti prie žmogaus vėžio vystymosi dėl susilpnėjusios polimerazės aktyvumo.

Metodai

Rekombinantinio laukinio tipo ir varianto pol β paruošimas

Laukinis tipas (WT) ir K167I variantas žmogaus pol β buvo gauti ankstesniame mūsų tyrime 28, 36 . Į pET28a ir pcDNA3.1 vektorius buvo įterpti WT pol β ir K167I genai.

Baltymų išraiška ir gryninimas

WT arba K167I pol β sulieti baltymai buvo ekspresuojami BL21 DE3 ląstelėse. Kultūros buvo auginamos 37 ° C temperatūroje iki vidutinės log fazės ir po to indukuojamos 1 mM IPTG 4 valandas. Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant. Fermentai (WT ir K167I pol β) buvo išgryninti naudojant neapdorotą HisTrap FF rinkinį (GE Healthcare, Piscataway, NJ) pagal gamintojo instrukcijas. Gryninimo efektyvumas buvo nustatytas mėginių, atskirtų SDS-PAGE gelyje, dažymu Coomassie Blue. Baltymų kiekis buvo nustatytas Bradfordo baltymų tyrimu (Beyotime).

In vitro pradmens prailginimo tyrimas

Grunto prailginimo reakcijos buvo atliktos tirpale, kuriame yra (α-32P) dCTP, biotinu pažymėtas DNR substratas pol-GAP ir pol β (WT arba K167I), kaip aprašyta anksčiau 29 . Dalis reakcijos produkto buvo inkubuoti su avidin-Sepharose 4B granulėmis, išplauti ir kiekybiškai įvertinti naudojant skysčio scintiliacijos analizatorių. Reakcijos produktas buvo sustabdytas. Mėginiai buvo atskirti atliekant 20% poliakrilamido gelio elektroforezę (PAGE), turinčią 8M karbamido, ir vizualizuota naudojant „PhosphorImager“ (Molecular Dynamics, Inc).

DNR surišimo tyrimas

Biotinu pažymėtas pol-GAP DNR substratas buvo imobilizuotas ant streptavidinu padengtos 96 šulinėlių fermento, susieto su imunosorbento testo (ELISA) plokštele, ir tris kartus plaunamas rišamuoju buferiu. Po to buvo pridėta 0–0, 8 mg WT arba K167I pol β, ir mėginiai buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje. Tada mėginiai buvo inkubuoti su pelės anti-pol β antikūnu (Santa Cruz Biotech) ir ožkos anti-pelės IgG / HRP antikūnu (Santa Cruz Biotech). Tada mėginiai buvo apdoroti tetrametilbenzidinu (TMB) ir reakcijos buvo sustabdytos naudojant HCl. Optinis tankis (OD) buvo matuojamas esant 450 nm bangos ilgiui (OD 450 ), naudojant mikroplokštelių skaitytuvą.

5′dRP lipazės tyrimas

5′dRP-pradmens substratas pol β-U 29 buvo pažymėtas (γ- 32 P) -ATP 5'-gale U turinčiame oligonukleotide, o po to apdorotas pol-β-U substratu uracilo DNR glikozilaze ( UDG) ir APE1. Tada įpjauta APsite turinti DNR buvo inkubuota (20 min., 37 ° C) su WT arba K167I pol β (0–10 ng) buferiu. Tada buvo pridėtas formamido, turinčio gelio užpildymo buferį, reakcijos produktai išskaidomi ant 20% poliakrilamido gelių, kuriuose yra 8M karbamido, ir vizualizuojami naudojant „PhosphorImager“.

Atkurtas bazės ekscizijos taisymo tyrimas

Kaip BER substratas buvo naudojamas 5 ′ galo pažymėtas polisβ U substratas. Visiškos taisymo reakcijos buvo atliktos 20 μl reakcijos mišiniuose. UDG apdorotas substratas (20 nM) buvo inkubuotas 5 minutes su APE1, išgrynintu polβ (WT arba K167I) ir T4 DNR ligaze buferiniame tirpale, esant 37 ° C, 30 min. Reakcijos produktai buvo atskirti 20% denatūravimo poliakrilamido geliu ir vizualizuota naudojant „PhosphorImager“.

Ląstelių linijos ir kultūra

Mūsų laboratorijoje anksčiau buvo nustatytos WT ir pol β nulinių ( pol β - / - ) EC9706 ląstelių linijos. Ląstelės buvo palaikomos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, JAV), ir inkubuojamos 37 ° C ir 5% CO 2 . Tiek pol β - / - / WT, tiek pol β - / - / K167I stabilios ląstelių linijos buvo gautos naudojant pcDNA3.1-WT / K167I vektorius ir Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas.

Kolonijų susidarymo tyrimas

Keturios EC9706 ląstelių linijos (WT, pol β - / -, pol β - / - / WT ir pol β - / - / K167I) buvo nuplaunamos, tripsinizuotos, suskaičiuotos ir suspenduotos (1 000 ląstelių viename inde) 2 ml. terpė plius 0, 4% agaro (Sigma, St Louis, MI). Agaro-ląstelių mišinys buvo padengtas ant apatinio sluoksnio, sudaryto iš 1% agaro visos terpės, viršuje. Buvo pastebėta kolonijų formacija, kuri įvyko maždaug per dvi savaites. Naujai suformuotos kolonijos buvo pritvirtintos etanoliu, nudažytos krištolo violetiniu, ir buvo įvertintos kolonijos, turinčios> 50 ląstelių.

Ląstelių ekstrakto paruošimas

Ląstelės buvo kultivuojamos ir inkubuojamos per naktį, kad būtų pasiekta vidutinė eksponentinio augimo fazė, tris kartus plaunamos PBS ir pakartotinai suspenduojamos 10 6 ląstelių / 20 μl tirpalo buferiniame tirpale I. Įpylus tokio paties tūrio buferio II, ląstelių suspensija sumaišoma. 1 val. 4 ° C temperatūroje ir centrifuguojama; supernatantas buvo išgautas ir laikomas -80 ° C temperatūroje. Baltymų koncentracijos buvo nustatytos Bradfordo baltymų tyrimu 37 .

DNR pažeidimo tyrimas

Trumpai tariant, vienkartinis ląstelių sluoksnis buvo apdorotas MMS 1 valandą logaritminio augimo fazės metu. Tada ląstelės buvo nuplaunamos, tripsinu pašalintos ir surinktos. Genominė DNR buvo ekstrahuota naudojant DNRzol reagentą (Invitrogen), padengta ELISA plokštelėmis ir aptikta naudojant AP vietoje specifinį reagentą - Aldehido reaktyvųjį zondą (ARP) (Invitrogen), mėginiai buvo inkubuojami su HRP konjuguotu streptavidinu ir TMB. Reakcijos buvo sustabdytos naudojant 1N HCl. Optinis tankis (OD) buvo matuojamas esant 450 nm bangos ilgiui (OD 450 ), naudojant mikroplokštelių skaitytuvą.

MMS jautrumo tyrimas

WT ir pol β nulinės ( pol β - / - ) EC9706 ląstelės buvo pasėtos po 2000 šulinių ir inkubuotos per naktį 37 ° C temperatūroje. Mėginiai buvo apdoroti serijiniais MMS skiedimais 1 valandą, po to plaunami ir inkubuojami šviežioje terpėje, DMEM, turinčioje 10% FBS, normaliomis augimo sąlygomis 72 valandas. „CellTiter 96 AQueous“ vieno tirpalo ląstelių proliferacijos tyrimo rinkiniu (Promega) buvo išmatuotas optinis tankis (OD), esant 490 nm bangos ilgiui (OD 490 ). Ląstelių skaičius buvo suskaičiuotas naudojant apverstą mikroskopą (Promega). 200 × padidinimas). Duomenys išreiškiami augimo procentais, palyginti su neapdorotais kontroliniais vienetais.

Ląstelių apoptozės analizė

Nuimtos ląstelės, apdorotos MMS, buvo pakartotinai suspenduotos, esant 1 x 106 ląstelių / ml tankiui, 1 × rišančiame buferyje. Po dvigubo dažymo FITC-Annexin V ir propidium jodidu (PI), naudojant FITC Annexin V Apoptozės aptikimo rinkinį I (BestBio, Šanchajus, Kinija), ląstelės buvo analizuojamos naudojant FACScan ® srauto citometrą (BD Biosciences), aprūpintą „Cell Quest“ programine įranga ( BD Biosciences).

Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS 17.0 programinę įrangą. Visi duomenys yra išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Duomenims analizuoti buvo naudojamas dvipusis nesuporuotas Studento testas ir vienpusė dispersijos analizė (ANOVA). Daugybinis grupių palyginimas atliktas SNK metodu. Rezultatai buvo laikomi reikšmingais, kai P vertės buvo <0, 05.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Wang, Y. et al. K167I DNR polimerazės β variantas, aptinkamas stemplės vėžiu sergantiems pacientams, blogina polimerazės aktyvumą ir BER. Mokslas. Rep. 5, 15986; „doi“: 10.1038 / srep15986 (2015).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.