Kinetinis ląstelių, liečiančių substratą, elgesys: sąsajos standumas skatina ląstelių plitimą | mokslinės ataskaitos

Kinetinis ląstelių, liečiančių substratą, elgesys: sąsajos standumas skatina ląstelių plitimą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biologinė fizika
  • Biomedžiagos - ląstelės
  • Tarpląstelinė matrica
  • Kinetika
  • Šio straipsnio „Erratum“ buvo paskelbtas 2014 m. Liepos 7 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Norėdami apibūdinti išsamų ląstelių pasiskirstymo po substrato standumą poveikį, in situ buvo stebimos A549 ląstelės, kultivuojamos polidimetilsiloksano (PDMS) ir poliakrilamido (PAAm) paviršiais, kurių tūrinis standumas buvo nuo 0, 1 kPa iki 40 kPa. Ląstelių pasiskirstymas ant PAAm parodė teigiamą koreliaciją tarp pasiskirstymo greičio ir substrato standumo. Suskaičiavus PAAm gelių ir kolageno deformacijas, ląstelių elgseną nustatė ne matricos rišimas, o bendras PAAm standumas. Kita vertus, keičiant PDMS tūrinį standumą, ląstelių pasiskirstymui įtakos neturėjo. Remiantis imitacinėmis analizėmis, silicio dioksido tipo sluoksnio elastingumas, kurį sukelia PDMS paviršius, dominavo ląstelės ir substrato sąveikoje, o ne bendras medžiagos standumas, rodantis, kad ląstelių pasiskirstymą daugiausia lėmė sąsajų standumas. Tada ląstelių plitimo kinetika pirmą kartą buvo modeliuojama remiantis absoliutaus greičio teorija.

Įvadas

Ląstelių ir juos supančio substrato (tarpląstelinės matricos, ECM) sąveika sukelia daugybę reakcijų, kurios vaidina esminį vaidmenį reguliuojant jų elgesį ir likimus 1 . Kadangi ECM teikia fizinę paramą ląstelių tvirtinimui ir yra atsakingas už aplinkos signalų perdavimą į ląstelę, ląstelės ir ECM biointerface yra nepakeičiama ląstelės gyvenimo dalis. Taigi ląstelė gali pajusti įvairius išorinius signalus ir į juos reaguoti, įskaitant sąsajos chemiją, topografiją ir mechaniką, o tai keičia jos morfologiją, dinamiką, elgesį ir funkcijas 2 . Tyrinėdami cheminį ir topografinį šio paviršiaus modelį, mes jau žinojome, kad ląstelės skirtingai reaguoja į paviršiaus chemijos pokyčius ir gali konkrečiai atskirti kelių amino rūgščių baltymus ar net peptidus 3 . Ląstelių judėjimą iš anksto nustatytais keliais galima valdyti asimetrinių ląstelių lipnių salų 4 mikrorajonuose. Pastaraisiais metais vis labiau akivaizdu, kad ląstelės atsakas į aplinkos signalus peržengia ląstelės gebėjimą atlikti paviršiaus chemiją ir topografiją, todėl dėmesys buvo sutelktas į bioįtampų mechaniką, ypač į matricos standumą 5, 6, 7 Be to, remiantis biomechenofamarkologijos principu 8, 9, naujai parengtas daugiadalykis tyrimas parodė, kad substrato standumas taip pat gali paveikti ląstelių, tokių kaip vėžinės ląstelės, reakciją į vaistus 10 .

Standumo jutimo procesas, ty ląstelės suvokia juos supančios aplinkos mechanines savybes traukdamos ir stumdamos, o reaguodamos į jėgą perduoda biocheminius signalus, vadinamas mechanotransdukcija. Svarbu suprasti mechanotransdukcijos procesą, nes šis ryšys prisideda prie įtemptos homeostazės palaikymo ir normalios audinių struktūros bei funkcijos palaikymo, kaip minėta aukščiau. Kadangi šių procesų sudėtingumas yra bauginantis, mūsų supratimas vis dar yra pradinėje stadijoje.

Ląstelės pasklidimas yra pradinis kinetinis procesas, vykstantis po adhezijos įvykių, kai ląstelė liečiasi su substratu, o tai pateikia gerą ląstelės ir substrato sąveikos supaprastinimo prototipą 14 . Norėdami ištirti substrato standumo įtaką ląstelių elgsenai ir ištirti pagrindinį fizinį mechanizmą, pasirinkome dviejų tipų dirbtinį substratą, ty PAAm ir PDMS, modifikuotus I kolagenu. Čia PAAm, turintis skirtingą tūrinį standumą, visada parodo skirtingas porėtas tinklo struktūras. Priešingai, tą patį silicio dioksidą primenančio sluoksnio standumą ant PDMS paviršiaus iš tikrųjų sukelia UV spinduliai, nesvarbu, kokia švelni yra PDMS birioji dalis. Atliktas ląstelių plitimo elgesio in situ stebėjimas ir atitinkamai ištirti paaiškinimai, daugiausia teoriniais būdais.

Rezultatai

Ląstelių plitimo membranos išplėtimo ir mastelio dėsnio apibūdinimas

Ląstelių pasklidimas, apimantis nuo aktino priklausomus membranos plėtinius ir integrino sukeltą adheziją, yra pradinis glaudaus kontakto tarp ląstelės ir substrato procesas. Akivaizdus šio dinaminio proceso bruožas yra 2-D paviršiaus kontaktinių sričių kitimai. Kontaktinei sričiai atskleisti panaudojome DIC mikroskopiją ir apskaičiavome kontaktinio ploto pokyčius submikrono ir antruoju tikslumu. 1b pav. Parodyta šviesaus lauko vaizdų serija rodo, kad kontaktų plotai plintant laikui bėgant didėja. Kai ląstelė pirmą kartą liečiasi su substratu, ji iš grubios sferos pasikeičia į storą diską ant paviršiaus ir šio proceso metu gauna signalą iš susiliejusių integrinų. Ploto variacijose vyrauja konkurencija tarp dviejų membranos judesių, pailgėjimo, kurį sukelia aktino polimerizacija žievėje, ir atgalinio srauto dėl miozino susitraukimo ir membranos įtempimo 15 . Panašiai kaip ir anizotropiniame plitime 14, filopodijos palaikomi pratęsimai yra netaisyklingi su daugeliu stochastinių trumpalaikių pratęsimo periodų (STEP). Ląstelių plitimo sritis, plačiai naudojama statistika nustatant tam tikros molekulės ar ligos būseną, vaidinančią citoskeleto reguliacijoje 16, kaip laiko funkciją, yra gerai aprašyta sigmoidine kreive 17 . Šią sigmoidinę kreivę galima pritaikyti atliekant galios eksponentinę funkciją (1c pav.); taigi ląstelės plitimui būdingas mastelio dėsnis R ~ t α . Galios dėsnio mastelio koeficientas α yra universalus ir be matmenų parametras, jis geriau apibūdina ląstelių sklidimo kinetiką nei kiti matmenų parametrai, tokie kaip ląstelės kraštų greitis. Ląstelių plitimo elgsena yra analogiška lašelių plinta 18, nors pagrindinis mechanizmas yra visiškai kitoks.

Image

a) Ląstelių sričių apskaičiavimo žingsniai. Iš kairės į dešinę: originalus DIC vaizdas, aptinkamas kraštas, optimizuojamas slenkstis, užpildoma skylė pašalinant triukšmą. b) Ląstelių pasklidimo laiko registravimas per pirmąsias 20 minučių. c) santykinis sąlyčio spindulys kaip laiko funkcija. Šį santykį gali gerai suderinti galios įstatymai. Masto juosta: 10 μm.

Visas dydis

PAAm ir PDMS substratų standumo įtaka ląstelių plitimui

ECM mechaninės savybės, ypač standumas („tūrinis standumas“), apibrėžtas jo tamprumo moduliu, vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant daugybės tipų ląstelių elgseną tiek in vitro, tiek in vivo . Remiantis jų reakcija į substrato tvirtumą, ląstelių linijas galima suskirstyti į dvi kategorijas: „priklausomos nuo standumo“ (tos, kurioms būdingas ryškiai skirtingas ląstelių elgesys, kai substrato standumas yra įvairus), ir „nepriklausomos nuo standumo“ (tos, kurios vienodai atrodo abiejuose) minkšti ir standūs substratai) 7 . Kadangi standumas yra būdingas medžiagos kiekis, įdomu pastebėti, kad A549 elementų pasiskirstymo elgesys parodė „tvirtumą, priklausomą nuo PAAm“, ir „standumą, nepriklausomą“ nuo PDMS, tame pačiame standumo intervale.

Kaip parodyta 2 pav. Ir „Movie S1“, A549 ląstelės ant PAAm substratų rodė skirtingą atsaką. PAAm A549 ląstelių morfologija esant 1200 s po sėjos svyravo, pasikeitus substrato standumui. Suapvalintos, beveik rutulinės ląstelės, turinčios keletą netaisyklingų membranų išsikišimų, matomų ant 0, 3 kPa minkštųjų gelių, yra ryškus kontrastas su plokščiomis, didelėmis sklaidosiomis ląstelėmis, turinčiomis akivaizdžių išsikišimų ant standžiausių 32, 6 kPa gelių. Ląstelės, pasėtos ant gelių, kurių vidutinio standumo 2, 3 kPa, parodė elgesį tarp jų. Prognozuojami ląstelių plotai po 20 minučių sėjos padidėjo didėjant substrato standumui, pvz., Padidėjo nuo 326 ± 67 μm 2 (n = 17) ant minkšto substrato iki 479 ± 196 μm 2 (n = 21) ant kieto substrato. Projektuojami 2, 3 kPa gelių ląstelių plotai buvo 442 ± 106 μm 2 (n = 23), tai yra viduryje. Be to, ant tvirtesnių substratų esančios ląstelės pasklido daugiau membranų išsikišimų, tuo tarpu minkštų substratų išplėtimai greitai atsitraukė ir neprisidėjo prie gryno ląstelių ploto padidėjimo. Kaip aprašyta aukščiau esančiame skyriuje, apibūdinti membranos pailgėjimo greičius ir kiekybiškai įvertinti šios sklaidos dinamiką buvo naudojamas bendrasis parametras „mastelio dėsnio koeficientas α “. Remiantis eksperimentiniais duomenimis, kieto substrato mastelio dėsnio koeficientas turi didesnę vertę - 0, 079 ± 0, 035, tai reiškia, kad ląstelės pasiskirsto greičiau. Minkšto ir tarpinio substrato mastelio dėsnio koeficientai yra atitinkamai 0, 017 ± 0, 011 ir 0, 048 ± 0, 018. Aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad ląstelių pasiskirstymo greitis didėja didėjant standumui.

Image

a) Ląstelių pasklidimo ant skirtingų substratų registracija per tam tikrą laiką. Lamellipodia ar filopodia pratęsimai priklauso nuo substrato elastingumo. b) Prognozuojami ląstelių plotai po 20 min. sėjimo. Jie didėja, didėjant elastingumui. c) ląstelių pasiskirstymo ant skirtingų paviršių greitis. Ant standesnio pagrindo esančios ląstelės pasiskirsto daug greičiau nei ant minkšto pagrindo. ** p <0, 01, gautas atlikus vienpusę ANOVA analizę. Masto juosta: 10 μm.

Visas dydis

PDMS atveju substratų, turinčių skirtingą standumą, ląstelių morfologijos skirtumas nebuvo akivaizdus (3a pav. Ir „Movie S2“). Minkštas substratas neslopino ląstelių plitimo. Net ant 0, 1 kPa substrato ląstelės buvo plokščios, visiškai pasklidusios su akivaizdžia lamellipodia ar filapodia, kurios nesiskyrė nuo tų, kurios augo ant kieto substrato. Kaip parodyta 3b pav., Po 20 minučių auginimo kultūroje numatytos vietos buvo beveik vienodos visiems trims substratams, maždaug 440 μm 2 (447 ± 132, 413 ± 80, 444 ± 106, nuo kieto substrato iki minkšto). Analizuodami pasklidimo greitį, mes nustatėme, kad visų substratų mastelio dėsnio koeficientai buvo daugmaž vienodi, o tai reiškia, kad PDMS substratų standumo kitimai neturėjo akivaizdžios įtakos ląstelių pasklidimo greičiui (žr. 3c pav.). Minkšto substrato mastelio koeficientas buvo 0, 087 ± 0, 026 (n = 15), tuo tarpu tarpinio ir kieto substrato masto koeficientas buvo atitinkamai 0, 066 ± 0, 020 (n = 15) ir 0, 076 ± 0, 028 (n = 19). PDMS mastelio dėsnio koeficiento vertės yra lygios standžiausio PAAm substrato vertėms, o tai reiškia, kad ląstelės PDMS pasiskirsto labai greitai.

Image

a) Ląstelių pasklidimo ant skirtingų substratų registracija per tam tikrą laiką kaip ir PAAm. b) Beveik tie patys numatomi plotai, jokių reikšmingų statistinių skirtumų nėra. c) Ląstelės greitai plinta tiek ant kieto pagrindo, tiek ant minkšto pagrindo. Masto juosta: 10 μm.

Visas dydis

Į silicio dioksido panašų sluoksnį ant PDMS paviršiaus

Tirdami, kaip PAAm ir PDMS standumai įtakoja ląstelių elgseną, mes standartizuojame kolageno susiejimo su substrato paviršiumi metodą, naudodami tą patį heterobifunkcinį baltymų kryžminimą, sulfo-SANPAH. Šis standartizavimas sumažina paviršiaus cheminių savybių įtaką lyginant dviejų tipų substratus. Modifikacijos metu reikalingas UV šviesos šaltinis, kad suaktyvintų N- hidroksisukcinimido esterį sulfo-SANPAH, kad jis reaguotų su pirminiais kolageno aminais. Tačiau ankstesni tyrimai parodė, kad PDMS paviršiuje po UV spinduliuotės susidarys plonas ir trapus silicio dioksido tipo sluoksnis 19, 20, 21, 22 . Mūsų eksperimentai taip pat parodė, kad ant PDMS yra paviršiaus sluoksnis (parodyta S1, S2 ir S3 pav.). Pirmiausia mes panaudojome optimizavimo metodą, pagrįstą baigtinių elementų metodu (FEM) ir AFM įpjovomis, kad gautume mechanines paviršiaus sluoksnio savybes (tamprumo modulį ir storį), o paskui siekdami įvertinti silicio dioksido tipo sluoksnio įtaką PDMS tūriniam standumui. į FEM.

Atlikus optimizavimo procedūrą, nustatyta, kad PDMS (60: 1) paviršiaus sluoksnio elastinis modulis ir storis yra 7, 0 MPa ir 200 nm. Šių rezultatų tinkamumas buvo kokybiškai (kreivės forma) ir kiekybiškai (vidutinė paklaida <5%) patvirtintas palyginus FE generuojamos jėgos ir poslinkio kreivę su eksperimentiniais duomenimis (4b pav.). PDMS paviršiaus sluoksnio parametras (80: 1) yra labai artimas PDMS (60: 1) parametrui (S4 pav.). Kadangi ankstesnė literatūra 22 parodė, kad plazmos stangrinamasis poveikis buvo panašus skirtingose ​​PDMS mišinių santykio formose, paviršiaus slėgio parametrus (čia 60: 1) pritaikėme kitiems PDMS mišinių santykiams (80: 1 ir 100: 1).

Image

a) Įbrėžimų modeliavimo baigtinių elementų modelis, kurį sudaro įdubimas ir PDMS pagrindas su paviršiaus sluoksniu. b) AFM kreivės vidurkis ir optimizuota FE kreivė.

Visas dydis

Pagrindą deformavo jėgos, perduodamos iš ląstelės per židinio adheziją; todėl, norėdami ištirti ląstelės ir substrato sąveiką, mes sutelkėme dėmesį į jėgas kontaktinėje srityje tarp ląstelės (židinio adhezijos) ir PDMS substrato. Kadangi šlyties įtempis kontaktinėje srityje turėjo didelę reikšmę ląstelių plitimui, paviršiaus sluoksnio įtaką galėjo kiekybiškai atspindėti šlyties įtempis. Priėmus optimizuotą parametrą, į šio modelio birias medžiagas 40 kPa nusodinamas silicio dioksido tipo sluoksnis (200 nm), kurio modulis yra 7, 0 MPa. 23 poslinkio suvaržymo sąlyga naudojama remiantis idėja, kad ląstelės turi jutimą 24 . Kai tūrio standumas buvo keičiamas plačiu diapazonu, jėga, kurią veikė ląstelės, padidėjo, o ląstelių deformacija buvo beveik tokia pati. Palyginti su plikomis medžiagomis be stangrių sluoksnių, kompozicinės medžiagos maksimalūs šlyties įtempiai paviršiuje yra maždaug dešimt kartų didesni - 10 kPa (5b ir 5e pav.). Tai reiškia, kad visų medžiagų elastingume dominuoja tarpslankstelinis standumas. Kaip matyti iš 5 pav. (C – e), kintant tūrio standumui nuo 0, 1 kPa iki 40 kPa, šlyties įtempiams daromas nedidelis poveikis. Šis rezultatas dar kartą patvirtina, kad į silicio dioksido panašų paviršių dominuoja birios medžiagos, o tai reiškia, kad „tikrasis“ elastingumas, kurį jaučia ląstelės, nėra tūrio standumas ir yra daug didesnis už jį. Šis „tikrasis“ elastingumas paprastai nepatenka į standumo diapazoną, kurį ląstelė gali pajusti (S5 pav.). Tai gali būti priežastis, kodėl ląstelės PDMS elgiasi „griežtai“.

Image

a) PDMS modeliuojamas kaip pusės cilindro (150 μm spindulio ir 60 μm storio). Kontaktinė sritis buvo traktuojama kaip puslankis, kurio spindulys 6 μm, artimas židinio adhezijos dydžiui. Modelis, kurį sudaro kieto paviršiaus sluoksnis ir reikalavimus atitinkančios birios medžiagos, traukiamas tam tikru atstumu. b) Šlyties įtempis ant plikos PDMS paviršiaus kontaktiniame regione su tinklinio buferio sritimi. Kontaktinė sritis (židinio sukibimo dydis) buvo brūkšniuotojo pusės apskritimo viduje. Didžiausia vertė buvo 1 kPa. (c – e) Šlyties įtempis PDMS su kietu sluoksniu paviršiaus. Dėl kietojo sluoksnio šlyties įtempis kontaktinėje srityje buvo dešimt kartų didesnis - 10 kPa. Pakeitę PDMS tūrį nuo 0, 1 kPa (c) iki 40 kPa (e), tai mažai prisideda prie paviršiaus šlyties įtempio. Vienetas (b – e): MPa.

Visas dydis

Kas lemia ląstelės atsaką į PAAm, tarpląstelinės matricos rišimąsi ar substrato standumą?

Mechaninio transdukcijos metu endogeninio citoskeleto ląstelių susitraukimas yra subalansuotas atspariomis jėgomis, atsirandančiomis dėl ECM deformacijos, kurios dydį lemia ECM 25 elastinis modulis. Kadangi substratas, toks kaip Petri lėkštelė / stiklas / hidrogeliai, dažnai naudojamas palaikyti ECM, jėgos perduos substratui ir sukels deformaciją tol, kol jungtys tarp ECM ir substrato yra pakankamai stiprios. Tokiu būdu ECM ir substratas veikia kaip serijos sistema, kurią ląstelės supranta ir reaguoja. Lygiavertis šios sistemos E * elastingumas gali būti nustatytas taip

Image

kur E C , U C ir E S , U S yra atitinkamai matricos ir substrato elastinis modulis ir Puasono santykis.

Kaip parodyta 1 lygtyje, serijinės sistemos komponentas, kurio elastingumo modulio vertė yra mažesnė, daugiau prisidės prie visos sistemos. Tai reiškia, kad minkšta dalis dominuoja sistemoje. Ar ji minkšta, ar ne, galima spręsti apie deformacijos mastą toje pačioje apkrovoje. Kadangi ECM tinklas yra sudėtingas ir nestabilus 26, mes dažnai nekreipiame dėmesio į ECM dalies įtaką, o visos sistemos elastingumas nurodomas kaip pagrindo elastingumas. Jei norite naudoti PAAm, tai paprastas metodas, kurį pasiūlė Trappmann ir kt. buvo sukurtas norint įvertinti ECM elastingumą, remiantis porėtų medžiagų ypatybėmis 27 . Ant paviršiaus esančios poros nustato ECM tvirtinimo vietas (S6 pav.), O tai reiškia, kad atstumas tarp kovalentinių tvirtinimo taškų yra ilgesnis, esant didesnėms poroms, ir trumpesnis, mažesnėms poroms. Kai ląstelės veikia kolageno tempimo jėgą (mūsų tyrime naudojamas ECM), mechaninis grįžtamasis ryšys apims tam tikrą to kolageno segmento, kuris buvo sujungtas su minkštu substrato tinklu, judėjimą. Kadangi kolagenas yra pusiau lankstus polimeras, kurio ištvermės ilgis ≥ 15 nm 28, kolageno deformacija gali būti gaunama modeliuojant kolageną, įtvirtinantį paviršių kaip paprastą atraminį pluoštą su dviem fiksuotais galais (6 pav.). Tada kolageno pluošto segmento įlinkis D C nustatomas pagal apkrovą W (tempimo jėgą, kurią veikia ląstelė) ir būdingą kolageno segmento ilgį L 29 :

Image

kur E ′ yra kolageno (ne E C ) modulis, apie 1 MPa 30, o I - inercijos momentas; apvaliajam kolageno pluoštui I = πd 4/64 , d yra kolageno pluošto skersmuo, apie 100 nm 31 .

Image

Sukurta įvertinti tarpląstelinės matricos pririšimo ir tūrio standumo pagrindinius veiksnius.

Visas dydis

Kadangi PAAm geliai iš pradžių buvo naudojami gelio elektroforezėje baltymams atskirti, skirtingas kryžminių jungčių tankis lemia ne tik skirtingą porų dydį, bet ir skirtingą gelių standumą. Šiame modelyje kolageno deformacija greitai mažėja didėjant segmentų ilgiui, o tai reiškia, kad kolageno tinklas tampa minkštesnis, kai įtvirtinto substrato poros yra didesnės. Kadangi porų dydis buvo atvirkščiai koreliuojamas su 27 standumu, didesnis porų dydis taip pat reiškia mažesnį gelių standumą. Taigi svarbu įvertinti kolageno tinklo vaidmenį ir substrato tvirtumą.

Kolageno generuojamos jėgos tvirtinimo vietoje perduodamos į gelius ir sukelia deformaciją. Kadangi kolageno pluoštas yra tvirtesnis nei geliai, substrato deformaciją galima gauti naudojant modelį, kuriame standus, plokščias strypas traukiasi į elastingą tarpinę dalį. Deformacija išreiškiama 32

Image

100 kPa PAAm L yra maždaug 2, 5 nm. Tada galima apskaičiuoti kolageno ir PAAm palyginamąją deformaciją

Image

Palyginti su substrato deformacijos dydžiu, kolageno pluoštas deformuojasi labai mažai ir elgiasi daug griežčiau, o tai reiškia, kad substrato elastingumas yra pagrindinis indėlis į visos sistemos elastingumą. Kadangi kolageno pluošto deformaciją lemia porėtas substrato tinklas, tai taip pat rodo, kad pagrindinis veiksnys yra bendras gelių standumas. Šiuo atveju yra pakankamai tikslus substrato elastingumas, kad būtų galima apibūdinti aplinkos nelankstumą.

Ląstelių plitimo teorinis modelis

Biologiniu požiūriu ląstelių plitimas yra aktyvus procesas, o kartu ir greičio procesas 33 . Tai susiję su sudėtingais biocheminiais ir biofizikiniais įvykiais, tokiais kaip membranos plėtiniai, kurių pagrindą sudaro aktinas, ir adhezai su integrinu (7 pav.). Nuolatinį pailginimą palaiko nuolatiniai junginiai, jungiantys 14 . Tada cheminiai ir fiziniai ECM signalai gali būti perduoti į ląstelės vidinius baltymus, kurie valdo nuolatinį ląstelės formos rekonstravimą. Nors ląstelės yra sudėtingos biocheminės automatai, mes manome, kad fizinius ląstelių plitimo principus galima užfiksuoti naudojant mikroskopinių parametrų rinkinį. Čia pateikėme teorinį modelį, apibūdinantį šią ląstelių plitimo savybę.

Image

Cheminiam aktino surinkimo procesui turi įtakos integrino ir ECM surišimo jėga bei membranų atsparumas.

Visas dydis

Ląstelių plotų padidėjimą, kurį sukelia membranos pailgėjimas, daugiausia galima priskirti aktino polimerizacijai membranos periferijoje. Šio proceso metu cheminei aktino polimerizacijos reakcijai įtakos turi integrino ir ECM surišimas bei atsparumas membranoms. Neatsižvelgiant į filapodijos ar lamellipodijos tinklą, čia tiriamas izotropinis plitimas kaip paprasčiausia šio modelio forma 34 . Mes taip pat nekreipėme dėmesio į ribinius baltymus, branduolio baltymus ir kitus baltymus, kurie veikia gijų reakcijas 35 . Taigi ląstelių plitimo greitis gali būti apibūdinamas konkurencija tarp polimerizacijos ir depolimerizacijos greičio. Aktino polimerizacija apima G-aktino monomerų inicijavimą ir dimerizavimą, po kurių vyksta aktino gijų dauginimas. Jei dėl paprastumo neatsižvelgiama į inicijavimą ir dimerizavimą, aktino polimerizaciją galima traktuoti kaip paprastą bimolekulinę rišamąją reakciją, kai laisvasis subvienetas jungiasi su siūlelio, kuriame yra n subvienetų, galu, kad būtų sukurtas n + 1 36 ilgio siūlas. Esant cheminei pusiausvyrai, naujų subvienetų pridėjimo prie kaitinimo siūlelių galų greitis yra subvienetų disociacijos greitis. Kol laisva energija bus neigiama, ši reakcija vyks savaime. Šios rišamosios reakcijos lygtis gali būti parašyta taip:

Image

Kadangi ši cheminė reakcija yra greičio procesas, absoliučiojo greičio teoriją (arba pereinamosios būsenos teoriją) galima pritaikyti, norint gauti ląstelių pasklidimo mastelio dėsnį 33 ir ištirti substrato standumo įtaką. Esant pusiausvyrai, aktino polimerizacijos tolimesnis dažnis turėtų būti toks pat kaip ir mažėjančio dažnis, tai yra

Image

kur k B yra Boltzmanno konstanta, T yra absoliuti temperatūra, h yra Plancko konstanta, E a = 14 k B T yra rišamosios reakcijos 37 aktyvacijos energija, p yra steracinis koeficientas 33, apie 10 −7, k B T / h yra pagrindinis dažnis, jis yra apie 10 13 / s kambario temperatūroje, kurį galima žymėti ω 0 .

Kai kaitinimo siūlelio gale veikia išorinės jėgos, reakcijos pusiausvyra pasislinks taip, kad pasikeis monomero pridėjimo tikimybė. Atliekant vairavimo darbus su gijų siūlais, tolimesnis ir mažesnis dažniai gali būti užrašomi tokia forma:

Image

Image

Varomosios jėgos keičia šulinio paviršiaus potencialo gylį ir keičia monomerų surinkimo bei išardymo tikimybę. Taigi gijų augimo greitis gali būti išreikštas

Image

kur δ yra būdingas vieno monomero ilgis, apie 2, 7 nm 38 .

Norėdami išspręsti 9 lygtį, turime gauti vairavimo darbą w . Remiantis ankstesniu ląstelių plitimo supratimu, varomąją jėgą sudaro cheminė energija, kurią išskiria jungdamiesi su integrinu, ir pasipriešinimo jėgą, kurią sukelia membranos įtempimas ir membranos deformacija. Panašiai kaip juostelė, esanti ant elastingo sluoksnio, šlyties įtempį sukibimo srityje, kurį kontroliuoja varomoji jėga, galima gauti iš:

Image

kur

Image

yra būdingas abipusis ilgis, kai μ a yra ECM šlyties modulis. E yra Youngo A549 ląstelių modulis, h E yra būdingas atstumas tarp paviršiaus ir aktino darbo, h E ≈ 20 nm, o h a yra aktino citoskeleto storis, h a ≈ 0, 5 μm 39 . Remiantis ankstesniu tyrimu 40, gaunama jėga f d yra adhezijos ir membranos pasipriešinimo derinys, ty

Image

kur N i yra integrinų tankis 41, apie 800 / μm 2, 10 k B T yra vieno integriino surišimo energija, γ 0 yra pradinė membranos įtempis, 0, 01 pN / nm 42, K yra elastinio standumo koeficientas. sujungtos membranos ir citoskeleto deformacija, 30 pN / nm 43, R yra ląstelės spindulys, kintantis su laiku. Jei darome prielaidą, kad membranos gale esančios jėgos vaidina pagrindinį vaidmenį, su vairavimo darbu susijęs šlyties įtempis užrašomas kaip τ (0) = f d λ a . Atsižvelgiant į vidutinį kiekvieno monomero S užimtą plotą (apie 0, 01 μm 2 ) 40, vairavimo darbą galima išreikšti taip:

Image

Pakeitus vairavimo darbo išraišką į 9 lygtį, santykis tarp sklidimo spindulio ir laiko perrašomas taip:

Image

Mūsų atveju, palyginti su šiluminiu svyravimu k B T , važiavimo darbas w yra gana mažas ( w / k B T <0, 1). Pagal hiperbolinės sinuso funkcijos savybes mes apytiksliai

Image

paprastumui. Tada lygtį (13) galima išspręsti taip:

Image

Tiriant eksperimentinius duomenis, normalizuotasis spindulys ( R ′ = R ( t ) / R 0 ) naudojamas norint rasti visuotinius ryšius su normalizuotu laiku ( τ = t / T 0 ). Tokiu būdu laiko vienetas yra savavališkas, nes T 0 39 nėra suvaržytas. Naudodami pirmosios eilės Taylor išplėtimą, kai τ = 1, galime gauti paprastą apytikslį:

Image

Tokiu būdu iš mūsų biofizinio modelio išvedamas spindulio ir laiko santykio mastelio dėsnis, ir galima gauti mastelio koeficientus, kurie naudojami apibūdinti sklidimo greitį eksperimente. PAAm tyrime substrato tvirtumas kinta nuo 0, 3 kPa iki 33 kPa, o mastelio koeficientą galima gauti kaip 0, 013, 0, 06 ir 0, 095, pakeičiant kitų šiame skyriuje pateiktų dydžių reikšmes į 15 lygtį. Įprasti eksperimentiniai skirtingų PAAm substratų duomenys yra gerai suderinti su mūsų modeliu (8 pav.). Taigi tai taip pat leidžia mums ištirti substrato standumo įtaką minėtam modeliui. PDMS atveju visų paviršių šlyties įtempiai buvo didesni nei kieto PAAm pagrindo. Tai reiškia, kad „tikrasis“ PDMS elastingumas yra per didelis ir peržengia standumo diapazoną, kurį gali suvokti ląstelė. Taigi mūsų modelio numatytos trijų substratų kreivės yra tapačios ir sutampa su griežta PAAm kreive (parodyta S7 pav.).

Image

Šis rezultatas atitinka tipinius duomenis apie PAAm mūsų eksperimente.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime nagrinėjamas fizinis mechanizmas, lemiantis A549 ląstelių pasiskirstymą ant dviejų skirtingų substratų, PAAm ir PDMS: mastelio dėsnis, kurį seka ląstelės, plinta, ir priežastys, kodėl ląstelės išskiria du substratus su skirtingu masės standumu tuo pačiu diapazonu. Remdamiesi eksperimentiniais stebėjimais ir teorine analize, mes išsiaiškinome, kad:

  1. Ląstelių plitimo elgsena su PAAm rodo teigiamą koreliaciją su substrato standumu, tuo tarpu ląstelių sklidimo elgsenai įtakos neturi kintamas PDMS tūrinis standumas.

  2. PDMS atveju silicio dioksido tipo sluoksnio standumas ant paviršiaus dominuoja ląstelės skleidime, o ne jos tūrinis standumas.

  3. Palyginus su tarpląstelinės matricos rišimu, PAAm standumas vaidina svarbesnį vaidmenį nustatant ląstelių elgseną.

  4. Ląstelių plitimo kinetika aprašyta remiantis absoliutaus greičio teorija, taip pat atkreipiamas dėmesys į sąsajų standumo įtaką.

Ląstelės pasklidimas yra pradinis procesas, kai ląstelė liečiasi su substratu, o sąsajoje tarp ląstelės ir substrato vyksta sąveika. Kadangi ECM ir substratas teikia fizinę paramą ląstelių tvirtinimui, „tikrąjį“ standumą, kurį ląstelės gali pajusti ir į kurį reaguoti, lemia didžiulis substrato standumas, atskirtinio sluoksnio paviršiaus paviršiaus sąsajos standumas substrato paviršiuje ir ECM standumas ( kurį lemia tarpląstelinės matricos rišimas).

Masinis standumas paprastai, nors ir ne visada, laikomas pagrindiniu veiksniu nustatant ląstelių elgseną. Ankstesni tyrimai parodė, kad tūrinis standumas vaidino svarbų vaidmenį reguliuojant ląstelių funkcijas, pavyzdžiui, proliferacija 44, migracija 5, diferenciacija 6 ir apoptozė 7 . Apie ląstelių pasklidimo ir tūrinio standumo ryšį taip pat buvo pranešta eksperimentuose ir teorijose 39, 40, 45 . Atskirame ląstelių plitimo tyrime, kurį atliko Wang et al. 45, padaryta išvada, kad NIH3T3 fibroblastai plinta greičiau ir ant stipresnių PAAm gelių išsikiša didesnius plotus nei ant minkštesnių. Šis reiškinys taip pat gali būti modeliuotas 39, 40, kad būtų galima apibūdinti sklidimo kinetiką ir ištirti substrato standumo įtaką. Ląstelių pasiskirstymas ant PAAm gelių mūsų tyrimuose atitinka jų rezultatus.

Tarpfazinis standumas daugiausia lėmė ląstelių plitimą PDMS. Kadangi sunku palyginti lyginamuosius PDMS ir PAAm tyrimus, pranešta apie mažai darbo, o pagrindinis mechanizmas vis dar neaiškus. Ankstesnėse ataskaitose klampumą žymintis nuostolių modulis turėjo įtakos MSC diferenciacijai 46, o PDMS viskoelastingumo pokyčiai gali įtakoti epitelio lapo judėjimą 47 . Tai leido manyti, kad PDMS klampumas, darantis įtaką ląstelių elgsenai mažinant ląstelių jautrumą standumui, buvo galimas suderinimas su šiuo akivaizdžiai prieštaringu atradimu. Tai skiriasi nuo mūsų paaiškinimo. Ląstelių elgsena, kuriai įtakos turėjo standus PDMS paviršiaus sluoksnis, anksčiau buvo tiriama atliekant FEM analizę 22, tačiau mes pirmieji ją pastebėjome eksperimentuose. Kadangi UV / UVO / plazmos procedūros yra plačiai naudojamos hidrofobinio PDMS paviršiaus funkcionalizavimui, reikėtų pastebėti šį paviršiaus modifikavimą, kuris gali dominuoti ląstelės ir substrato sąsajoje. Be to, padengdami ploną aukso sluoksnį ( E ~ 70 GPa), pagrindas tampa standus 27, o tai labai padidins paviršiaus sąsajos standumo svarbą ir nusveria tūrio standumą.

ECM standumas taip pat prisideda prie „tikrojo“ elastingumo. Trappmannas ir jo kolegos 27 pastūmė į priekį dabartinį supratimą kamieninių ląstelių biologijos ir biomedžiagų susikirtimo vietoje, parodydami, kad kamieninių ląstelių plitimui ir diferenciacijai įtakos turi tai, kaip ECM molekulės yra pririšamos prie PAAm substrato, o ne tūrinis substrato standumas. Tačiau mūsų tyrimo išvada priešinga. Mūsų modelyje yra kriterijus, pagal kurį galima įvertinti konkurenciją tarp tūrinio standumo ir tarpląstelinės matricos rišimo. Tokiu būdu reikia atsižvelgti ne tik į minkščiausio, bet ir į standesnio pagrindo deformacijas. Tai gali būti įrodyta traukos jėgos mikroskopija 23, kurioje fluorescencinių dalelių padėtis keičiasi, kai ląstelės veikia susitraukimo jėgas. Kadangi vietinis kolageno tvirtumo standumas yra daug didesnis nei skaičiuojant tūrinį standumą, ignoruojant vietinį standumą ir traktuojant tūrinį standumą, nes „tikrasis“ standumas atrodo pagrįstas. Mūsų modelis taip pat rodo, kad parametro vertės pakeitimas prisideda tik prie vienos dalies kitimo (vietinis kolageno juostų standumas arba tūrinis standumas), ir tai nepatvirtina palyginamosios šios dalies svarbos. Pavyzdžiui, plonu aukso sluoksniu ( E ~ 70 GPa) padengus paviršių, padidėja pagrindo paviršiaus standumas, o pagrindo deformacija bus gana maža. Tuomet visos sistemos elastingume vyrauja skirtingi porų dydžiai. Tačiau tūrio standumo svarbos sumažinimas dar nereiškia, kad jo galima atmesti. Auksinių nanodalelių, kurių atstumas nuo 60 nm iki 190 nm, panaudojimas standžiame substrate (3 MPa) taip pat rodo, kad vietinis kolageno juostų standumas turi įtakos ląstelių elgsenai, tai nereiškia, kad negalima atmesti ir tūrio standumo. What we should note in our model is that the relative distance L relates to, but may not equal to the pore sizes of the hydrogels. The collagen may also be decoupled from the hydrogels, then it shows more compliant and the role of local stiffness of collagen tethers may be reconsidered. Although the stiffness of ECM contributes little in 2D cell culture compared with bulk stiffness, it will play a more important role in 3D cell culture environment, because the cells are encapsulated in pure ECM.

The relationship between cell radius and spreading time can be obtained from the experiments, and it was found to satisfy the scaling law 39 . Studying cell spreading within the scaling law allows us to quantify the cellular dynamics through two observable quantities, projected areas A max and scaling factor α . Different but constant scaling factor α i in different phases of spreading are evident in a double logarithmic plot, which divides the whole process into three phases 48 . Due to the limitation of our experimental techniques, the membrane dynamics at the earliest spreading phase cannot be obtained since the cell body usually occludes in bright field imaging. The universal power-law behaviour of cell spreading 49 in the initial phase is omitted in our study.

The application of absolute rate theory to cell spreading, which is performed for the first time in our study, is based on the fact that all biochemical reactions are rate processes 33 . Our model predicts the scaling law of radius-time relationship, which is similar to Brownian Ratchet model 38 . It is not surprising that both models have the same form and Boltzmann factors, as long as we realize that actin polymerization can be treated as Markov process. The addition of monomer onto the end of actin filament is an independent process, and has nothing to do with previous polymerization. Brownian motion is another typical Markov process. In this way, our model based on absolute rate theory is established and linked to other models. To incorporate the influence of interfacial stiffness in our model, we introduce the shear stress of the interface between cell and substrate to disturb the biochemical reactions, as the shear stress at the margin of the contact area guides cell spreading 39 . For PAAm, which has no separable surface layer, the shear stress is determined by the bulk stiffness of the substrate. For PDMS, the shear stress obtained by FEM simulation is much larger, which indicates that the stiffness of stiffen layer at the surface outweighs the bulk stiffness of PDMS. In this way, cell spreading behaviours on PAAm and PDMS can be described and characterized as one model in the context of interfacial environments.

In summary, not only experimental results from distinguishing between PAAm and PDMS with varied bulk stiffness but also theoretical analysis on the two systems indicate that the interfacial stiffness of substrate mainly guides cell spreading behaviours. Our finding suggests that the interfacial stiffness should be taken into account in regulating cell behaviours, including cell adhesion, spreading and subsequent migration, and may have a major impact on the design of materials for tissue engineering applications.

Metodai

Preparation of PAAm and PDMS substrates for cell spreading

The preparations of PAAm hydrogels were adapted from a previously described protocol 50 . PAAm gels were mixed with acrylamide at final concentrations of 3, 5, 10 wt/vol% and bis-acrylamide at the corresponding concentration of 0.06, 0.15, 0.3 wt/vol%. 3/1000 total volume of ammonium persulfate (APS) and 1/1000 total volume of Tetramethylethylenediamine (TEMED) were added to gel solutions to accelerate the polymerizing process. A thin film of PAAm hydrogels (about 100 μm) was formed like a “sandwich” by carefully placing an amino-silanated glass coverslip (15 mm in diameter) on top of 20 μl of gel precursor solution which sit in the middle of the chloro-silanated confocal dish (Shengyou). Three hours later, we added PBS buffer into the confocal dish, and peeled off the top coverslip. The remaining monomer and crosslinker were removed by washing with PBS three times. For cell seeding, collagen I protein was conjugated to the surface of hydrogel using the heterobifunctional linker Sulfo-SANPAH (ProteoChem). 500 μl of a 0.2 mg ml −1 solution in 50 mM HEPES were pipetted onto the gel surface in a confocal dish (with a 20 mm diameter glass bottom), which was then placed under a homemade 365 nm ultraviolet light and irradiated for 10 minutes. Afterwards, the gels were washed with 50 mM HEPES in PBS and this procedure was repeated once. The substrates were coated with 500 μl of a 0.1 mg ml −1 solution of rat type I collagen (Invitrogen) in acetic acid for three hours at 37°C. Samples were washed three times with PBS before the seeding of cells.

The two parts of the PDMS kit (Sylgard 184, Dow Corning) were mixed in different ratios at the 100:1, 80:1, 60:1 base: crosslinker. The mixture was stirred sufficiently and degassed for one hour. Then the PDMS gels were spun on the plasma-treated confocal dish, and cured at 80°C for 24 hours. For cell seeding, the PDMS substrates were treated in a similar way with PAAm gels as described above.

Mechanical characterization of substrate stiffness

The mechanical properties of PAAm and PDMS were tested at the micro-scale by atomic force microscopy (AFM, Agilent 5500). To apply the Hertz model appropriately, a glass sphere (around 8.0 μm and 5 μm in diameter) was glued on the cantilever of AFM tip. The spring constant of tip was calibrated using the method of “Thermal K” before experiment. The resonant frequency is around 35 kHz and the measured spring constant is 0.368 N/m and 0.043 N/m, respectively. The stiffer cantilever was used in the measurement of stiffer substrates, and the soft cantilever was used for soft ones. The indentation speed was set as 5.0 μm/s. The z-position ranged from 2 μm to −1.5 μm during the indentation, and can be adjusted in Pico View. The elastic modulus of the substrate was calculated from the force-curve using our homemade software and obtained as an average of multiple measurements. The elastic modulus of all substrates used in our research is shown in Table 1. The value of softest PDMS was obtained from other paper 27, because this substrate is too viscous to hold the load for a longer time. The experiment on UV treated PDMS was performed in the same way. 3 samples were tested and force curve was obtained for at least 30 locations per sample. All AFM curves were averaged, resulting in a single curve.

Pilno dydžio lentelė

Optimized method based on finite element simulation and AFM indentation

An optimization method based on finite element analysis was performed to evaluate the effects of plasma treatment (the thickness and elastic modulus of surface layer). The final goal was to match simulated indentation process with the corresponding AFM experiments. The indentation process can be treated as an axisymmetric problem in which a glass microsphere was glued on the AFM tip (Fig. 4a). The model was composed of the AFM spherical indenters and the bi-layer PDMS substrate consisting of a surface layer ( E surf , t ) and the bulk. The indenter was modeled as a rigid body. The material description of PDMS followed a hyperelastic and nearly incompressible neo-Hookean law. To fit with the experimental data, neo-Hookean material properties were used as the initial “ E modulus” defined by the following relationship E = 3 μ , where μ is the shear modulus. The contact between the indenter and the substrate was modeled as frictionless. The force-indention curve was derived from the displacement and reaction force of rigid sphere. Initial elastic modulus (range from 1000 to 20000 kPa) and thickness (100 to 300 nm) of the surface layer was defined and then adjusted to fit the experimental data, until an “optimized” model of the material was found.

Finite element analysis of cell-substrate interactions on the PDMS surface

Based on the determined PDMS structure and mechanical properties, an x-axisymmetric model of substrate was built, as shown in Fig. 5a. To mimic the substrate deformed by the cellular force transmitted through focal adhesion, we established such a model that the substrate was pulled by a rod at a given displacement (200 nm in z-axis, 300 nm in y-axis) as a Neo-Hookean solid (Fig. 5a). The contact region was a half circle with 12 μm in diameter which is near to the size of focal adhesions. Then the contact region was fine-meshed to facilitate contact detection and processing. As the shear stress in contact region mattered a great deal to cell spreading, the influence of surface layer could be reflected in the shear stress quantitatively.

Cell culture and seeding onto substrates

A549 cells (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin at 37°C in 5% CO 2 . When the assay was conducted, A549 cells were harvested with trypsin and EDTA and seeded onto PAAm and PDMS substrates (functionalized with collagen I) at a density of 10, 000 per cm 2 . All reagents in this section were purchased from HyClone.

Measurement of cell spreading and motility

To address the dynamics of cell spreading, we used differential interference contrast microscopy (DIC), with a 20× air objective (Ti-E, Nikon) to quantitatively record the spreading process of individual A549 cell. The temperature of assays was controlled by a heated stage (Model 321 Autotuning Temperature Controller, LakeShore). Time-lapse imaging of a field containing 10 to 20 cells was performed with a charge-coupled device (CCD) camera (Cool SNAP HQ 2, Photometrics) at a 10 s interval for 40–60 minutes after plating on different substrates. To settle the problem of focus drift in the whole assay, a solution termed the Perfect Focus System (PFS) was used. Each assay under this specific condition was repeated at least three times. The parameters were controlled by the MetaMorph software. Cell areas were measured using MetaMorph as well. At least 15 cells in three assays per substrate type were analyzed. The measurements of the cell area were conducted at ten second interval and normalized to the initial area of the digested cells.

Data process

To obtain the radical parameters of cells on the plane of the substrate, we used MetaMorph to transform the 16-bit digital gray scale images into binary images which can separate the cell area from the background. This separation involves the following major steps: detect edges, confirm threshold, fill holes and remove noise, as illustrated in Fig. 1a. In the process of edge detecting, we used Kirsch convolution to isolate and enhance the edges in the image by comparing brightness changes in the neighboring pixels. After that, we applied segmentation to the image to differentiate between objects of interest (cell) and other parts of the image (background) based on the image's grayscale levels. Too low or too high threshold will lead to incorrect fragment of cell and background. To solve this problem, a tool called “Auto Threshold for Light Objects” was used to optimize the threshold. Once finished, the image was transformed into a binary image (orange cell and black background). The last step is filling the holes inside the edges and removing the background to obtain the data of cell areas. Because we are primarily interested in the dynamics of cells during spreading, we did not include any activity such as polarization, migration, quiescence that followed the cells reaching their fully spreading states.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Filmas S1

  2. 2.

    Papildoma informacija

    Filmas S2

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary infomation

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.