I komplekso stoka yra susijusi su onkocitiniais skydliaukės navikais | britų žurnalas apie vėžį

I komplekso stoka yra susijusi su onkocitiniais skydliaukės navikais | britų žurnalas apie vėžį

Anonim

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Onkocitiniams navikams būdingas hipertrofinis mitochondrijų proliferacija. Imunohistochemiškai išanalizavome visus oksidacinės fosforilinimo sistemos fermentus 19 onkocitinių skydliaukės navikų. Buvo nustatytas specifinis komplekso I trūkumas, kuris buvo išreikštas <5% lygio, nustatyto aplinkiniuose vėžiniuose audiniuose.

Pagrindinis

Oncocitiniai navikai ir oncocitomos yra gerybiniai arba piktybiniai navikai, susidedantys iš oksifilinių ląstelių, kuriems histologiškai būdinga smulki granuliuota eozinofilinė citoplazma ir padidėjęs mitochondrijų skaičius pagal struktūrą (Tallini, 1998). Nors onkocitiniai navikai dažniausiai nustatomi skydliaukės, inkstų ir seilių liaukose, tačiau apie juos buvo pranešta ir kituose kituose organuose, pavyzdžiui, smegenyse (Gallina ir kt., 2006) bei odoje (Jih ir kt., 2004).

Keliuose tyrimuose buvo pranešta apie ryšį tarp mitochondrijų DNR (mtDNR) mutacijų ir onkocitinių skydliaukės navikų (Tallini ir kt., 1994; Maximo ir kt., 2002; Bonora ir kt., 2006). Tyrime, kuriame dalyvavo 45 onkocitiniai skydliaukės navikai, 53% tirtų mėginių buvo nustatytos potencialiai patogeniškos mutacijos I komplekso (NADH-ubikinono oksidoreduktazės) subvienetuose (Gasparre ir kt., 2007). Tačiau stebėtų mutacijų poveikis komplekso I fermento aktyvumui ir baltymų kiekiui nebuvo parodytas ypač likusiais atvejais, kai nebuvo galima įrodyti aiškių įrodymų apie komplekso I trūkumą. Priešingai, mes nustatėme, kad 100% inkstų onkocitomų yra I komplekso fermento aktyvumas ir baltymai (Mayr ir kt., 2008). Mes hipoteze, kad skydliaukės onkocitomos turės panašų trūkumą.

Šiame tyrime mes tyrėme onkocitinius skydliaukės navikus imunohistocheminiu dažymu, kad išsiaiškintume mitochondrijų energijos apykaitos pokyčius šiame navike.

medžiagos ir metodai

Pacientų

Žmogaus onkocitinio skydliaukės naviko ( n = 19) ir folikulinės skydliaukės adenomos ( n = 4) pavyzdžiai buvo gauti iš Zalcburgo Paracelsus privataus medicinos universiteto Patologijos skyriaus. Tyrimas atliktas vadovaujantis vietinio tyrimų etikos komiteto gairėmis. Klinikiniai parametrai apibendrinti 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Imunohistocheminis dažymas ir analizė

Imunohistocheminiam dažymui buvo naudojami šie antikūnai: pelių monokloninis anti-komplekso I subvienetas NDUFS4 (1: 1000; Abcam, Kembridžas, JK), pelės monokloninis II anti-komplekso subvienetas 70 kDa (1: 3000; Mitosciences, Eugene, OR). JAV), pelės monokloninio anti-komplekso III subvieneto šerdis 2 (1: 1500; Mitosciences), pelės monokloninio anti-komplekso IV subvieneto I (1: 1000; Mitosciences), pelės monokloninio anti-komplekso V subvieneto α (1: 2000; Mitosciences) ir pelių monokloninis anti-porin 31HL (1: 3000; Mitosciences). Visi antikūnai buvo praskiesti Dako antikūnų skiediklyje su foną mažinančiais komponentais (Dako, Glostrup, Danija).

Audinių sekcijos (5 μm ) buvo deparafinuotos trimis ksileno pakeitimais, rehidratuojamos trimis absoliučiojo 2-propanolio pakeitimais, po to sekė šilumos sukeltas epitopas iš TE-T buferio (10 mM Tris, pH 9, 0, 1 m M EDTA, 0, 05). % Tween 20) 40 min. 95 ° C ir 20 min. Kambario temperatūroje. Skyriai buvo plaunami distiliuotu H20 ir buvo subalansuoti fosfatu buferiniu druskos tirpalu, turinčiu 0, 5% Tween 20 (PBS-T, pH 7, 4). Dažymas buvo atliktas naudojant Envision Detection System (Dako) pagal gamintojo instrukcijas, po to 10 min. Vizualizuojama diaminobenzidinu (DAB). Skaidrės buvo padengtos hematoksilinu.

Norint kiekybiškai įvertinti naviko audinio ir greta esančio normalaus audinio išraiškos lygių skirtumus, dažymo intensyvumo balų sistema (0: be dažymo; 1: silpnas dažymas; 2: vidutinio dažymo; 3: stiprus dažymas) padauginta iš vidutinio imunopozityvių procentų. buvo naudojamos ląstelės vienam didelės galios laukui. Kiekybinį vertinimą nepriklausomai atliko du skirtingi asmenys ir rodomos vidutinės vertės.

Statistinė analizė

Statistinei analizei pasiskirstymo lygybei buvo naudojamas „Wilcoxon“ suderintos poros pasirašyto rango testas. I ir II komplekso pasiskirstymas buvo lyginamas atitinkamai tarp normalaus ir atitinkamo naviko audinio. I komplekso pasiskirstymas taip pat buvo lyginamas su V kompleksu normaliame audinyje.

MtDNR analizė

Du 10 μm sekcijos buvo surinktos ir pašalintos parafinu dviem kartus keičiant ksileną ir absoliutų etanolį. Išgarinus etanolį, audiniai buvo apdoroti 200 μl PCRK (2 mg ml −1 proteinazės K, 75 mM Tris-HCl, pH 8, 8, 20 m M (NH 4 ) 2 SO 4, 0, 01% Tween 20) 60 ° C temperatūroje. ° C 24 valandas, po to 95 ° C 10 minučių. MtDNR sekos analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau (Mayr ir kt., 2008).

Rezultatai

Imunohistocheminis dažymas

Onkocitinės skydliaukės naviko ląstelės buvo neigiamos arba smarkiai sumažėjo komplekso I subvienetui NDUFS4, palyginti su aplinkiniais vėžiniais audiniais, esančiais visuose tirtuose mėginiuose (1 paveikslas). Imuninio jautrumas II komplekso 70 kDa subvienetui, III komplekso 2 subvieneto šerdiui, IV komplekso I subvieneto, komplekso V subvieneto α ir mitochondrijų membranos baltymo porinui padidėjo visuose naviko mėginiuose, palyginti su gretimais normaliais audiniais (1 paveikslas). Šie pokyčiai buvo nustatyti visose 17 onkocitinių adenomų ir dviem onkocitinės skydliaukės karcinomos atvejais. Skydliaukės folikulinės adenomos žymiai sumažino visų kvėpavimo takų grandinių fermentų ir porino būklę (papildomas 1 paveikslas).

Image

Reprezentatyvus visų kvėpavimo grandinės fermentų kompleksų ir onkocitinės skydliaukės adenomos porų imunohistocheminis dažymas. ( A ) Teigiamas I komplekso NDUFS4 subvienetų dažymas normaliame skydliaukės audinyje (viršutinėje dalyje) ir imunonegatyvus dažymas onkocitinio naviko audinyje (apatinėje dalyje). ( B - E ) Padidėjusi kvėpavimo grandinės komplekso II subvieneto išraiška 70 kDa ( B ), III komplekso III subvieneto šerdies ( C ), IV komplekso IV subvieneto ( D ) ir komplekso V subvieneto α ( E ) onkocitiniame navike, palyginti su gretimais normalus audinys. ( F ) Imunohistocheminis poryno dažymas atskleidžia būdingą mitochondrijų padidėjusį onkocitinių naviko ląstelių, palyginti su normaliu skydliaukės audiniu, reguliavimą.

Visas dydis

Statistinė analizė

Visi tirti onkocitiniai skydliaukės navikai parodė reikšmingą 95% I komplekso subvieneto NDUFS4 sumažėjusį reguliavimą, palyginti su šalia esančiu normaliu audiniu ( P <0, 0001; 2 pav.). Kompleksinis V subvienetas α parodė reikšmingą 40% ( P <0, 0003) padidėjusį naviko audinį (2 paveikslas). Tarp I ir V kompleksų normaliame audinyje reikšmingo skirtumo nebuvo ( P = 1, 000). I komplekso dažymo praradimas nepriklausė nuo klinikinių ypatybių, tokių kaip endokrininė padėtis, naviko dydis ir naviko audinių histologija.

Image

19 pacientų, sergančių onkocitiniais skydliaukės navikais, turintiems I ir II kompleksinius antikūnus, normalių ir navikinių audinių dažymo intensyvumo dažnio balų vertės.

Visas dydis

Skydliaukės folikulinės adenomos, palyginti su greta esančiu normaliu audiniu, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp I ir komplekso V dažų neparodė (2 papildomas paveikslas).

Mitochondrijų genomo mutacijų analizė

Visi septyni mitochondriškai užkoduoti komplekso I subvienetai buvo sekuojami 18 onkocitinių skydliaukės navikų. Komplikaciniuose I genuose ND1 , ND4 , ND4L , ND5 ir ND6 buvo rasta sutrikdančių mutacijų . Šeši atvejai patyrė rėmo poslinkio mutacijas (3571_3572insC, 10477delT / 10952_10953insC, 13235_13236insT, 14339_14340insA, 14603_14604insT), vienas atvejis nesąmonių mutaciją (12539G> A) ir tris atvejus, kai mutacijos sukelia aminorūgščių aminorūgščių pokyčius 39A, 39 > G ir 3946G> A). Aštuoniais atvejais jokios patogeniškos mutacijos nerasta.

Diskusija

Pateikiame tvirtų įrodymų apie ryšį tarp specifinio I kvėpavimo grandinės komplekso praradimo ir onkocitinių skydliaukės navikų. MtDNR mutacijos anksčiau buvo nustatytos onkocitiniuose skydliaukės navikuose; 26, 7% pavyzdžių nustatyta ardančių mutacijų. Papildomi 26, 7% turėjo potencialiai žalingų missense mutacijų viename iš septynių mitochondrijų genų, koduojančių I komplekso subvienetus (Gasparre ir kt., 2007). Panašūs rezultatai buvo gauti mūsų mėginiuose, kuriuose 33% pacientų turėjo rėmelio poslinkio mutacijas, 6% sustabdė mutacijas ir 17% galimai patogeniškų taškų mutacijas. Negalime atmesti mutacijų viename iš 39 branduoliu užkoduotų subvienetų. Ankstesniame tyrime jau buvo pranešta apie heterozigotines mutacijas GRIM-19 (Maximo ir kt., 2005), I mitochondrijų komplekso subvienetą, kuris taip pat reikalingas surinkimui. Dėl nevienalytės skydliaukės navikų sudėties sunku paruošti grynus naviko homogenatus fermentų matavimams ar Western blot analizei. Todėl Gasparre ir kt. (2007) negalėjo pranešti apie savo mėginių biocheminius rezultatus. Iš ląstelių kultūros tyrimų (Hofhaus ir Attardi, 1993) ir pacientų su I komplekso defektais (Ugalde ir kt., 2004a) yra žinoma, kad dėl sunkių mutacijų skirtinguose I komplekso subvienetuose sumažėja fermento komplekso stabilumas arba jis būna nepilnas. Be to, ne mutantiniai komplekso I subvienetai pasižymi kintamu stabilumu (Ugalde ir kt., 2004b). Pvz., NDUFS4 subvienetas yra ypač nestabilus, o jo stabilumas priklauso nuo to, ar yra iš anksto surinktas kompleksas I. Dėl tokio nesurinkto NDUFS4 nestabilumo, kaip kompleksinio I turinio matavimą, mes panaudojome imunohistocheminį dažymą NDUFS4 antikūnu.

I kompleksas yra neatsiejama skirtingų apoptozinių būdų sudedamoji dalis (Ricci ir kt., 2004; Martinvalet ir kt., 2008). Taigi I komplekso trūkumas gali turėti įtakos naviko formavimuisi nutraukiant apoptozinius kelius. Be to, kad jis, kaip kvėpavimo grandinės dalis, gali būti paverstas stipriu reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) formavimo fermentu. Parodyta, kad NDUFS1 I komplekso subvienetą proteolitiškai gali suskaidyti kaspazė-3, todėl gaunamas sutrumpintas fermentų kompleksas, skirtas gaminti ROS (Ricci ir kt., 2004). Antruoju metu nuo kaspazės nepriklausomas apoptozinis kelio granzimas A specifiškai skaido I komplekso NDUFS3 subvienetą. Tai vėl lemia padidėjusią ROS generaciją, mitochondrijų transmembraninio potencialo sutrikimą ir ląstelių žūtį (Martinvalet et al., 2008). Dėl to, kad nėra onkocitinių skydliaukės navikų, gali būti, kad I komplekso trūkumas gali užkirsti kelią naviko ląstelėms šiais būdais atlikti apoptozę.

1 lentelėje pateikti klinikiniai parametrai yra būdingi diagnozuojant onkocitomą, o I komplekso nepakankamumas nepriklausė nuo amžiaus, lyties, naviko dydžio, histologijos ir endokrininės padėties. Visoms tirtoms skydliaukės onkocitomoms nustatytas I komplekso trūkumas ir daugumai jų buvo gerybinė klinikinė eiga; tačiau 2 iš 19 šio tyrimo navikų buvo karcinomos. Neseniai buvo nustatyta, kad inkstų onkocitoma, dar viena gerybine eiga sergančio onkocitinio naviko rūšis, yra susijusi su I komplekso nepakankamumu (Gasparre ir kt., 2008; Mayr ir kt., 2008). Onkocitinė naviko ląstelių linija XTC.UC1, gauta iš Hürtle'o ląstelių karcinomos metastazių, rodo tiek įterpimo mutaciją gene, koduojančiame I komplekso ND1 subvienetą, tiek sumažėjusį I komplekso aktyvumą (Bonora ir kt., 2006). Ishikawa ir kt. (2008) pranešė apie I komplekso trūkumą, kurį sukėlė I komplekso ND6 geno mutacijos neoncocitinių pelių plaučių navikų srityje. Įdomu tai, kad šios mutacijos padidino metastazavusį navikų potencialą (Ishikawa ir kt., 2008), o kompleksinio I trūkumas oksifilinių navikų srityje, atrodo, nėra susijęs su metastazėmis. Dėl šios priežasties komplekso I trūkumas nėra laikomas specifiniu gerybinių onkocitinių navikų požymiu.

Norėdami nustatyti, kad izoliuotas I komplekso trūkumas yra būdingas onkocitiniams skydliaukės navikams, bet nėra bendras skydliaukės navikų požymis, mes ištyrėme keturis folikulų skydliaukės adenomos pavyzdžius. Priešingai nei onkocitomos, folikulų skydliaukės adenomos reikšmingai nesumažino kvėpavimo grandinės fermentų.

I komplekso netekimas buvo rastas visuose tirtuose onkocitiniuose skydliaukės navikų mėginiuose. Dėl griežtos tokių navikų priklausomybės nuo glikolitinio metabolizmo ši unikali savybė galėtų padėti sukurti naujus tikslinius šios ligos gydymo būdus.

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

„Powerpoint“ failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos figūros legendos

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „British Journal of Cancer“ svetainėje (//www.nature.com/bjc)