Lantanido pagrindu pagaminti metalo-organinio karkaso nanodaleliai, pasižymintys unikaliomis fluorescencinėmis gesinimo savybėmis, skirti dviejų spalvų tarpląsteliniam adenozino vaizdavimui gyvose ląstelėse | NPP Azijos medžiagos

Lantanido pagrindu pagaminti metalo-organinio karkaso nanodaleliai, pasižymintys unikaliomis fluorescencinėmis gesinimo savybėmis, skirti dviejų spalvų tarpląsteliniam adenozino vaizdavimui gyvose ląstelėse | NPP Azijos medžiagos

Anonim

Dalykai

  • Biojutikliai
  • Metalo organiniai rėmai

Anotacija

Dvimatės (2D) medžiagos sukėlė didžiulį susidomėjimą, nes dažais pažymėtos biomolekulės yra naudojamos fluorescenciniams gesintojams, naudojamoms biojutėjime. Metalo-organinio karkaso (MOF) nanoskopai, kaip naujo tipo 2D medžiaga, retai buvo tiriami kaip bioanalitinės platformos. Čia mes susintetinome labai plonų lantanidų pagrindu sukurtų MOF (MOF-Ln) nanoskaičių seriją kaip dažais pažymėtą aptamerio platformą. Fluorescencinis gesinimas ar regeneravimas MOF-Ln nanoskaičiuose nustatomas pagal paženklintų fluoroforų krūvio savybes (teigiamas ar neigiamas). Neigiamai įkrauti fluoroforai patiria fluorescencinį „išjungimo ir po to einantį“ procesą, tuo tarpu teigiamai įkrauti fluoroforai patiria fluorescencinį „išjungimą, po kurio eina įjungimo“ procesas. Įdomios MOF-Ln nanoskaičių fluorescencinių gesinimo savybių dėka jie tampa puikia dviejų spalvų jutimo platforma intraląstelinei biomolekulių aptikimui.

Įvadas

Dvimatės (2D) nanomedžiagos sulaukė didelio susidomėjimo tyrimais dėl savo unikalių fizikinių ir cheminių savybių, taip pat dėl ​​galimo mokslinio ir technologinio pritaikymo dujų kaupimo, jutimo, elektronikos, energijos konvertavimo ir kaupimo bei elektrokatalizės srityse. 1 Biomedicinos srityje 2D nanodaleliai su ypač dideliu paviršiaus plotu, tokie kaip grafenas ir jo darinys - grafeno oksidas, buvo sėkmingai naudojami biomedicinos vaizdavimui, vaistų perdavimui ir vėžio terapijai. 2, 3 Kiti kylantys nanoskopai (pvz., MoS 2, WS 2 ir MnO 2 ), pasižymintys gerinančia fluorescencinę gesinimo funkciją, taip pat pasižymi selektyviu adsorbcijos afiniškumu vienos grandinės DNR ( ss DNR), palyginti su dvigrandine DNR ( DS DNR). 4, 5, 6, 7 Šie rezultatai paskatino atlikti tyrimus, siekiant išnaudoti galimus naujųjų 2D nanoskopų biologinius pritaikymus. Visai neseniai keletas grupių sėkmingai susintetino ir išplėtė 2D metalo-organinio karkaso (MOF) plonas plėveles arba nanosėklus. 8, 9, 10 Dar reikia ištirti jų galimą biologinį pritaikymą.

MOF yra patraukli funkcinių medžiagų klasė, kuri buvo išsamiai ištirta pritaikant dujas: 11 katalizę, 12 atskyrimą 13 ir jutimą. 14 MOF tikrai yra labai perspektyvūs gaminant daugiafunkcinius liuminescencinius jutiklius, nes tiek metalas, tiek ligando vienetai gali sudaryti platformas liuminescencijai generuoti, o kai kurios MOF pakrautos svečių molekulės taip pat gali skleisti arba sukelti liuminescenciją. 14 Jau yra suprojektuota ir susintetinta daugybė MOF cheminiam ir biocheminiam pojūčiui nustatyti. 15 Jų mikrometro dydžio pavieniai kristalai arba polikristaliniai milteliai riboja jų naudojimą biologinėse sistemose, ypač vaizdavimą in vivo ir vaistų išleidimą. Todėl ypatingas dėmesys buvo skiriamas MOF struktūrų miniatiūrizavimui nanometrų masto režimu. 16, 17

Palyginus su esamomis nanomedžiagomis (tokiomis kaip neorganiniai kvantiniai taškai, Au nanodalelės ir organinės liposomos bei polimerai), nanoskalės MOF (NMOF) gali turėti pranašumų kaip naujos nanomedicinos platformos. Viena vertus, tinkamai parinkus ir derinant metalo jonus ir jungiamuosius ligandus, NMOF turi didesnį struktūrinį pritaikomumą (įskaitant porų dydį, formą ir morfologiją). Kita vertus, atlikus numatytą užduotį, NMOF yra biologiškai skaidus. Neseniai keli NMOF buvo ištirti kaip biomedicininių vaizdų ir vaistų pristatymo nanokrokuliantai. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 Lin ir jo kolegos 19, 23 panaudojo NMOF, kad išleistų vaistus arba generuotų citotoksines reaktyviąsias deguonies (pvz., 1 O 2 ) rūšis vėžio terapijai. 22 Jie taip pat naudojo fluorescencinius NMOF realaus laiko tarpląsteliniam pH jutimui gyvose ląstelėse. 20 Nors jų tyrimas vis dar yra pradinėje stadijoje, NMOF turi didelį potencialą kaip naujo tipo terapinę ir (arba) biologinį vaizdą sukurianti platforma.

Atsižvelgdami į geras biologiškai skaidžias NMOF savybes ir struktūrinį pritaikomumą, mes paruošėme naujų lantanidų pagrindu sukurtų MOF (MOF-Ln) nanoskopų seriją ir ištyrėme jų naudojimą kaip fluorescenciniu ženklu pažymėto aptamerio pagrindu veikiančią jutimo platformą aptikti DNR ir mažas biomoleules. Tūriniai MOF-Ln kristalai buvo paruošti naudojant tiltelį jungiant 2, 2′-tio-acto rūgštį (S (CH2 COO) 2 2, TDA). Naudojant ličio interkalacijos metodą, 25 MOF-Ln kristalai buvo eksfoliuojami į ypač plonus MOF-Ln nanosėklus. Būdami DNR nanokadriais, MOF-Ln nanoseklentai per van der Waals jėgą adsorbavo dažais pažymėtą ss DNR zondą, kuris sumažino dažų (tetrametilmetamidino (TAMRA) ir fluoresceino (FAM)) fluorescencijos intensyvumą dėl krūvio perkėlimo iš dažo molekules lantano jonais. Jei buvo tikslinė DNR, ji hibridizuodavosi su dažais pažymėta DNR ant MOF-Ln nanoskaičių. Susidariusi dažais pažymėta ds DNR atsiskiria nuo MOF-Ln nanosuklių dėl sumažėjusio adsorbcijos afiniteto, kurį sukelia dvigubos grandinės struktūros standumas, todėl atsigauna TAMRAdd DNR fluorescencija, kaip jau pastebėta tradiciniame 2D nanoprobai. 26, 27 Tačiau FAM pažymėtos DNR DNR fluorescencija buvo netikėtai užgesinta. Šie reiškiniai parodė, kad po hibridizacijos su tiksline DNR TAMRA- s DNR jautė „įjungimo“ fluorescencinį atsaką, o „atmetimo“ atsakas pasireiškė naudojant FAM-DNR.

Įkvėpti šių išvadų, mes sukūrėme adenozino-5′-trifosfato (ATP) -aptamerio / MOF-Ln nanoslapų kompleksą, skirtą stebėti ATP aktyvumą gyvose ląstelėse. Daugybinių dažų-aptamerio / MOF-Ln nanoslapų surinkimui buvo naudojami ATP aptameriai, pažymėti FAM ir TAMRA. Koreguojant TAMRA-aptamerio ir FAM-aptamerio, įdėto į dažų-aptamerio / MOF-Ln nanoskopus, molekulinį santykį, jie buvo naudojami kaip dviejų spalvų nanoprobai ATP aktyvumui nustatyti. Iš pradžių dažų aptametro / MOF-Ln nanoskopai suteikė kelly žalia fluorescencinę spalvą. Sąveikaujant su ATP, aptameras pasikeitė į vidinių kilpų struktūras ir atsiribojo nuo MOF-Ln nanosuklių, dėl to fluorescencinė spalva pasikeitė į rausvai oranžinę (TAMRA-aptamerio „įjungimas“ ir „išjungimas“ - FAM-aptameris). Be to, dažų aptamerio / MOF-Ln nanoskopai buvo sėkmingai naudojami nukreipti į ląstelių ATP. Rezultatai rodo, kad dvispalvis nanoplazmas jautriai keičia ATP fluorescenciją ar spalvą ir žada būti idealus diagnostinis metodas gyvų ląstelių ATP matavimui.

Eksperimentinės procedūros

MOF-Lns sintezė

Taip pat buvo naudojamas TDA (0, 8 mmol) ir La (NO 3 ) 3 (0, 4 mmol) (Nd (NO 3 ) 3, Eu (NO 3 ) 3, Tb (NO 3 ) 3 ir Er (NO 3 ) 3 ) mišinys. ) buvo ištirpinta 20 ml NaOH tirpale (75 mM) ir uždaryta 30 ml buteliuke. Mišinys reaguojamas 140 ° C temperatūroje 24 valandas.

MOF-Lns eksfoliacija

MOF-Lns eksfoliacija buvo atlikta taip: 5 mg MOF-Ln pirmtako buvo suspenduota 2 ml EtOH. Mišinys ultragarsu tiriamas 30 min. Iš dalies išblukę MOF-Lns buvo surinkti centrifuguojant 8000 aps / min greičiu ir du kartus plaunami n- heksanu. Tolimesniam eksfoliavimui surinktos MOF-Lns buvo suspenduotos 10 ml 0, 16 M n -butilo ličio heksane ir 20 valandų maišytos 25 ° C temperatūroje N2 atmosferoje. MOF-Lns, sujungti su Li, po to 1 valandą buvo dedami į EtOH / H20 (9/1, tūris / tūris). Galutiniai paruošti MOF-Ln nanoskopai buvo gauti centrifuguojant (14 000 aps / min).

Fluorescencinės DNR jutimas

Įprastu matavimu fluorescencinis zondas P1 (20 nM FAM-P1 arba 15 n M TAMRA-P1) buvo sumaišytas su MOF-Ln nanosukrais (0, 2 mg ml −1 ) 10 mM fosfatu buferiniame druskos tirpale (PBS). buferio (pH 7, 4), kuriame yra 100 mM NaCl ir 4 mM MgCl2, 5 minutes. Po to į mišinį buvo pridėta tikslinė DNR T1 su skirtingomis koncentracijomis (nuo 2 iki 50 nM) ir hibridizuota su P1 5 minutes kambario temperatūroje. Išmatuota mišinio fluorescencija.

Fluorescencinio adenozino nustatymas

FAM pažymėtas AAA (FAM-P2, 20 nM) arba TAMRA pažymėtas AAA (TAMRA-P2, 15 nM) fluorescencinis zondas buvo inkubuotas su MOF-La nanosukrais (0, 2 mg ml −1 ) 10 mM PBS buferyje. (pH 7, 4), kuriame yra 100 mM NaCl ir 4 mM MgCl2, 5 minutes. Vėliau ATP (uridino trifosfato, guanozino trifosfato, citidino trifosfato, glutationo, žmogaus serumo albumino, askorbo rūgšties ar histamino) tirpalas su atitinkama koncentracija (30 nM FAM-P2 + MOF-La tirpalui ir 25 n M tirpalui TAMRA). P2 + MOF-La tirpalas) buvo pridėtas prie P2 + MOF-La tirpalo. Leidus mišiniui inkubuotis 10 min kambario temperatūroje, buvo užregistruoti mišinio fluorescencijos spektrai.

Ląstelių kultūros

MCF-7 žmogaus krūties vėžio ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje su 10% vaisiaus galvijų serumu, 5% penicilino streptomicino glutamino ir 5% natrio piruvatu (visi iš GIBCO, Grand Island, NY, JAV), esant 37 ° C, drėgnai. atmosfera, kurioje yra 5% CO 2 .

Dviejų spalvų adenozino vaizdavimas gyvose ląstelėse

Dažikliais pažymėtas AAA + MOF-La kompleksas (Dye-P2 + MOF-La) buvo paruoštas taip: į 1 ml buvo įpilta 2 μl FAM-P2 (25 μM) ir 2 μl TAMRA-P2 (25 μM). PBS buferis (0, 01 M, pH 7, 4), kuriame yra 100 mM NaCl ir 4 m M MgCl2. Po to į mišinį buvo įpilta MOF-La nanosuklių (0, 2 mg ml- 1 ). Mišinys maišomas 2 valandas kambario temperatūroje. Paruoštas „Dye-P2 + MOF-La“ buvo surinktas centrifuguojant (14 000 aps / min) ir ištirpintas 10 ml PBS (0, 01 M, pH 7, 4), kuriame yra 100 mM NaCl ir 4 m M MgCl2, kurio galutinė koncentracija yra 0, 1 mg ml. −1 tolimesniems tarpląsteliniams eksperimentams.

Vieną dieną prieš vaizdavimą ląstelės buvo pasėtos į šešių šulinėlių plokšteles, kad būtų gautas tinkamas tankis. Tada į šulinėlius buvo įpilta 20 μl Dye-P2 + MOF-La pradinio tirpalo ir inkubuota 4 valandas, norint paruošti Dye-P2 + MOF-La-paimtas MCF-7 ląsteles. Prieš vaizdavimą, į šulinėlius buvo įpilama FMD (galutinė koncentracija: 300 nM) ir inkubuojama 30 minučių mitochondrijų vaizdavimui. Po to sena Dulbecco modifikuota Eagle terpė buvo pašalinta ir tris kartus plaunama PBS buferiu (0, 01 M, pH 7, 4). Vaizdai buvo gauti naudojant konfokalinį fluorescencinį mikroskopą.

Rezultatai ir DISKUSIJA

MOF-Lns kristalizavimas

Ln koordinavimo polimerai buvo hidrotermiškai susintetinti iš Ln (NO 3 ) 3 (Ln = La, Nd, Eu, Tb ir Er) ir TDA ligando natrio hidroksido tirpale. Gauti kristaliniai produktai (MOF-La, MOF-Nd, MOF-Eu ir MOF-Tb) (papildomas paveikslas S1). Kristalinių MOF-Ln mėginių struktūros buvo stebimos atliekant miltelių rentgeno spindulių difrakciją. Kaip parodyta 1a paveiksle, kristalinis MOF-Tb gerai atitiko MOF-Eu {[Eu 2 (TDA) 3 ] · 2H 2 O}), kuris buvo paruoštas ankstesniame mūsų darbe 28 (1b paveikslas), tačiau skyrėsi nuo MOF La ir MOF-Nd. Šis MOF-Ln mėginių struktūrų skirtumas gali atsirasti dėl lantanido susitraukimo. 29 Vieno kristalų rentgeno spinduliuotės difrakcijos duomenys parodė, kad MOF-La kristaluojasi ortorombinėje erdvės grupėje Pbcn ir buvo suformuluotas kaip [La 2 (TDA) 3 ] · 2H 2 O, o koordinavimo struktūra nėra visiškai tokia pati kaip MOF. -Eu (papildoma S1 lentelė). MOF-La supaprastinta vienetinė ląstelių struktūra parodyta 1c paveiksle; La 3+ jonus derino devyni deguonies atomai ir vienas sieros atomas. TDA grandinių sujungimas La 3+ centrais sukūrė lakštus, sudarydamas sluoksnines struktūras, kaip parodyta 1d paveiksle ir papildomame S2 paveiksle. Pagal Furjė transformacijos infraraudonųjų spindulių spektrus, visų MOF-Lns koordinatinio TDA ligando COO grupės smailės buvo 1650 ir 1566 cm – 1 . Rezultatai parodė, kad Ln 3+ jonai (La 3+, Nd 3+, Eu 3+ ir Tb 3+ ) buvo suderinti su TDA tuo pačiu būdu (papildomas S3 paveikslas). Kaip parodyta skenavimo elektronų mikroskopijos vaizduose, visi MOF-Lns buvo užpilti 2D sluoksniais (2a1 pav. Ir papildomas S4 paveikslas).

Image

MOF-Lns struktūrinis apibūdinimas. a ) MOF-Lns miltelių rentgeno spinduliuotės difrakcijos modeliai. ( b ) trimatė MOF-Eu sluoksnių struktūra, žiūrint išilgai ašies. c ) MOF-La koordinavimo aplinka. d ) MOF-La 3D trimatės sluoksninės struktūros vaizdas išilgai ašies.

Visas dydis

Image

MOF-Ln nanoskaičių eksfoliacija ir apibūdinimas. (1) Skenuojamo elektroninio mikroskopijos (SEM) pavidalo MOF-La vaizdas. ( a 2 ir b 1) MOF-La nanoskopų SEM ir TEM vaizdai, paruošti ultragarsu 30 min. ( a 3, b 2 ir b 3) MO-La nanoskopų SEM ir TEM atvaizdai, paruošti Li-intercalation metodu. ( c 1 ir c 2) Tipinis atominės jėgos mikroskopijos vaizdas ir susijęs MOF-La nanoskopų aukščio profilis. ( c 3) Pasirinktas MOF-La nanoskopo elektronų difrakcijos modelis.

Visas dydis

Daugiasluoksnių MOF-Ln nanoslapų eksfoliacija.

MOF-Ln kristalai negalėjo būti tiesiogiai pasklidę tirpikliuose (įskaitant organinius tirpiklius ir vandenį), paprasčiausiai pasikliaujant tirpikliais, kad būtų kuo mažesnė eksfoliacijos energija. Taigi buvo ištirti skirtingi šveitimo būdai, norint paruošti labai disperguojamus 2D MOF nanoskopus. Kaip pavyzdį naudojant MOF-La, sluoksniuotas MOF-La 10 minučių ultragarsu etanolyje buvo dalinai eksfolijuojamas į nanodaleles (papildomas paveikslas S5). Ultragarso trukmei padidėjus iki 30 min., Buvo gauti daugiasluoksniai nanoskopai (2a2 ir b1 pav.). Tarpinės jungtys, sujungtos su Li, (tokios kaip MoS 2 ir WS 2 ), gali būti eksfolijuojamos į monosluoksnius priverstinės hidratacijos būdu. 25, 30, 31, 32 MOF-Lns struktūros yra labai panašios į MoS 2 arba WS 2, ypač MOF-Eu ir MOF-Tb (papildomos S6 ir S7 figūros). Šiame tyrime mes panaudojome Li-intercalation metodą, kad dar labiau eksfoliuotume daugiasluoksnius MOF-Ln nanoskaičius. Kaip parodyta 2b2 paveiksle, ypač ploni MOF-La nanodaleliai buvo gauti, kai birių MOF-La reakcija su n -butilitiu tęsėsi 10 valandų. Kai reakcijos laikas buvo prailgintas iki 20 val., MOF-La nanoskaičiai buvo visiškai nublukinti ir gauta daugiau nanoskopų (2a3 ir b3 pav.).

Rezultatai, gauti iš pasirinktos srities elektronų difrakcijos modelio ir atominės jėgos mikroskopijos, parodė, kad paruoštas MOF-La nanoslokštis buvo kristalinio lakšto struktūra, kurio plonasis storis buvo apie 60 mm . 2, 0 nm (papildomas S8 ir 2c1 – c3 paveikslas), ir kad daugumos eksfoliuotų MOF-La nanoskopų dydis buvo mažesnis nei 500 × 500 nm. Mūsų rezultatai parodė, kad Li-intercalation metodu eksfolijuoti MOF-La nanoskopai buvo apytiksliai nuo vieno iki trijų sluoksnių, o daugiau kaip 50% sudarė vieno sluoksnio nanoskopai (papildomas S9 paveikslas). Be to, mūsų rezultatai parodė, kad MOF-Nd, MOF-Eu ir MOF-Tb nanoskaičius taip pat galima nusausinti naudojant tą patį Li-intercalation metodą (papildomas paveikslas S10).

Nanofilmai MOF-Ln kaip dažais pažymėtos DNR fluorescenciniai gesikliai

Paruoštų MOF-Ln nanosuklių fluorescencinis gesinimo gebėjimas buvo įvertintas naudojant dažais pažymėtą ss DNR (P1 - kaip Homo sapiens naviko slopintuvo geno zondas). 3 paveiksle parodyti tipiški TAMRA-P1 ir FAM-P1 fluorescencijos emisijos spektrai 10 mM PBS, turinčiuose skirtingas tikslinės DNR T1 koncentracijas, pridedant MOF-La nanoskopus. TAMRA-P1 atveju fluorescencijos intensyvumas greitai sumažėjo, kai MOF-La nanosklodės buvo įtrauktos į 15 n M aptamerio tirpalą (3a pav.), Kuris buvo panašus į reiškinį, stebėtą kitiems 2D nanoskopams (grafenas, grafeno oksidas). arba MoS 2 ). Po hibridizacijos su tiksline DNR T1 buvo gauta stipri fluorescencijos emisija (3a pav.). Atkūrimo efektyvumas padidėjo su tikslinės DNR T1 koncentracija. Šis reiškinys parodė, kad MOF-La nanosuklių afinitetas ds DNR yra silpnesnis nei ss DNR. Tačiau FAM-P1 atveju buvo pastebėtas skirtingas fluorescencijos gesinimo reiškinys. Buvo tikimasi, kad FAM-P1 fluorescencijos intensyvumas sumažės sumaišius su MOF-La nanoskaičiais. Po hibridizacijos su T1, FAM grupių fluorescencija buvo toliau užgesinta (3b pav.), Užuot stebėjus TAMRA-P1 fluorescenciją. Grūdinimo efektyvumas padidėjo su FAM-P1 zondo koncentracija.

Image

MOF-Ln nanoskaičių fluorescencinės gesinimo savybės. TAMRA-P1 (15 nM) ( a ) ir FAM-P1 (20 n M) ( b ) fluorescencijos spektrai skirtingomis T1 koncentracijomis (0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40 ir 50 nM) 10 mM PBS, turinčiame 0, 2 mg · ml −1 MOF-La nanosuklių. Įdėklai rodo matomus TAMRA-P1 (1, 25 μM) ( a ) ir FAM-P1 (1, 25 μM) ( b ) fluorescencinius pokyčius, apšvitintus 365 nm šviesoje.

Visas dydis

Be to, dažais pažymėto P1 zondo specifiškumas buvo tiriamas naudojant trijų tipų DNR sekas, įskaitant puikiai komplementuojamą taikinį T1, vienos bazės nesuderintą seką MT1-1 ir šešių bazių nesuderintą seką MT1-2. Kaip parodyta papildomame S11 paveiksle, dažais pažymėtas P1 zondas veikė gerai, išskirdamas T1 ir neatitinkančius stovus (MT1-1 ir MT1-2).

MOF-Nd, MOF-Eu ir MOF-Tb nanoskopams mes nustatėme panašias fluorescencines gesinimo savybes kaip ir MOF-La nanoskopų atveju (papildomas paveikslas S12). Tačiau MOF-Ln nanoskopų fluorescencinis gesinimo pajėgumas sumažėjo, kai susitraukė lantanidas. Kaip parodyta 4a paveiksle, TAMRA-P1 fluorescencinio slopinimo efektyvumas MOF-Ln nanoselektuose sumažėjo nuo maždaug 55% iki 47%, 32% ir 23%, sumažėjus jonų spinduliui nuo La 3+ (1, 0 Å). į Nd 3+ (0, 98 Å), Eu 3+ (0, 95 Å) ir Tb 3+ (0, 92 Å) jonus. Palyginti su kitomis 2D medžiagomis (pavyzdžiui, grafeno oksidu ir MoS 2 ), 5, 33, 34, visų MOF-Ln nanosuklių fluorescencinis gesinimo gebėjimas buvo prastesnis. Manome, kad fluorescencinis numalšinimas, kuris vyksta MOF-Ln nanoselektuose, pagrįstas krūvio perkėlimu iš fluorescencinių molekulių į lantano jonus. Kai FAM-DNR arba TAMRA-DNR yra adsorbuojama ant MOF-La nanoskopo paviršiaus, nuo fluorescencinių grupių (FAM arba TAMRA) iki lantano jonų vis dar yra atstumas ( apie 8 Å) (4b paveikslas). . Šis atstumas gali blokuoti efektyvų krūvio perdavimą ir paveikti fluorescencijos gesinimo efektyvumą. Nuo La 3+ iki Tb 3+ lantano jonų spindulys palaipsniui mažėja dėl lantanoido susitraukimo. Didesnis La 3+ jonų spindulio dydis leidžia fluorescencinėms grupėms būti arčiau La 3+ jonų ir gali būti efektyvus fluorescencinis gesinimas, palyginti su mažesnio dydžio Nd 3+, Eu 3+ ir Tb 3+ jonais.

Image

Dažikliu pažymėtos DNR adsorbcijos apibūdinimas MOF-Ln nanosukratuose. ( a ) TAMRA-P1 fluorescencinis gesinimo efektyvumas ant MOF-Ln nanoskaičių. F 0 ir F yra TAMRA-P1 fluorescenciniai intensyvumai, jei nėra arba nėra MOF-Ln nanoskopų. b ) Dažais pažymėtos DNR adsorbcijos ant MOF-Ln nanoskopų schema. c ) MOF-Ln nanoskaičių Zeta potencialai H 2 O ir PBS. d ) FAM pažymėtos DNR ultravioletiniu spinduliuote absorbcijos spektrai MOF-La nanosukratuose. ( e, f ) MOF-La nanoskopų rentgeno fotoelektroninės spektroskopijos spektrai skirtingose ​​aplinkose.

Visas dydis

Kaip atskleidė zeta potencialo matavimai (4c paveikslas), MOF-Ln nanoskaičių paviršius buvo teigiamai įkrautas gryname vandenyje, nes paviršiaus Ln 3+ jonai nebuvo visiškai suderinti. Mažėjant jonų spinduliui, teigiamas MOF-Ln nanoskopų krūvis sumažėjo. Gali būti, kad mažesni Ln 3+ jonai buvo lengviau įterpiami į karbonilo grupes MOF-Ln nanoskaičių kraštuose. Taip pat pastebėta, kad MOF-Ln nanoskopai buvo neigiamai įkrauti PBS dėl HPO 4 2− adsorbcijos / koordinacijos paviršiniuose Ln 3+ jonuose. Absoliutus neigiamas MOF-Ln nanoskopų krūvis sumažėjo sumažinus jonų spindulį, galbūt dėl ​​mažesnių matmenų jonų slopinimo. Kai FAM-DNR hibridizavosi su papildoma taikinio DNR, susiformavusi FAM-DNR atsiskyrė nuo MOF-Ln nanoskaičių paviršiaus. Eksperimento sąlygomis neigiamai įkrautos karboksilo ir fenolio hidroksilo grupės ant FAM pakeitė adsorbuotus HPO 4 2− jonus ir adsorbuotas ant MOF-Ln nanoskaičiuoklių krašto, kas leido pakartotinai adsorbuoti atskirtą FAM-DNR DNR teigiamai. įkrautas MOF-Ln nanoskopų kraštas, kur Ln 3+ jonai dar nebuvo iki galo suderinti dėl elektrostatinių atrakcijų.

FAM-dDNR adhezija ant MOF-La nanosuklių buvo patvirtinta aptikant FAM- ds DNR (FAM-P1 + T1) likučius supernatante, gautą centrifuguojant. Kaip parodyta papildomame S13A paveiksle, po centrifugavimo pašalinus MOF-La nanosėklus, FAM-P1 + T1 supernatanto fluorescencijos intensyvumas buvo daug mažesnis nei gryno FAM-P1 + T1, kuris parodė, kad didžioji dalis FAM-P1 + T1 buvo adsorbuoti ant MOF-La nanoslapų ir pašalinti centrifuguojant. Kaip ir tikėtasi, TAMRA-P1 + T1 supernatanto fluorescencijos intensyvumas buvo panašus į gryno TAMRA-P1 + T1 (papildomas paveikslas S13B), rodantis, kad beveik visi TAMRA-P1 + T1 buvo ištirpinti tirpale, o ne adsorbuoti ant MOF-La nanoskaičius.

Tiesioginė FAM adsorbcija ant Ln 3+ jonų sutrumpina jų atstumą, todėl efektyvus įkrovos perkėlimas vyksta lengvai iš FAM į Ln 3+ jonus. Tiesą sakant, buvo pastebėtas intensyvus FAM-DNR fluorescencinis numalšinimas MOF-La nanosukratuose, kurio užgesinimo efektyvumas buvo maždaug 88% (3b paveikslas). Tačiau TAMRAdd DNR, turinčios teigiamai įkrautas grupes, negalėjo pakeisti adsorbuoto HPO 4 2− ; tokiu būdu jis atsiskyrė nuo MOF-Ln nanosuklių ir jo fluorescencija buvo atstatyta.

FAM-DNR fluorescencinis gesinimo mechanizmas MOF-La nanosukratuose buvo patvirtintas UV matomos absorbcijos ir rentgeno fotoelektroninės spektroskopijos (XPS) metodais. Kaip aprašyta 4d paveiksle, FAM-DNR (FAM-P1) buvo apibūdinta FAM absorbcijos juosta (495 nm). Pridėjus MOF-La nanoskaičius, mėlynas FAM juostos Soret judesys pasislinko. 35 Kai FAM-P1 hibridizavosi su T1, FAM-DNR absorbcijos juosta nebuvo atgauta, o tai rodo, kad FAM-DNR DNR vis dar buvo adsorbuota MOF-La nanosukratuose. Šį reiškinį patvirtino ir XPS apibūdinimas (4e ir f paveikslai). FAM-P1 ir TAMRA-P1 absorbcija MOF-La nanosukratuose sukėlė mėlyną La 3d rišamosios energijos poslinkį maždaug 1 eV. Tačiau po to, kai P1 hibridizavosi su T1, TAMRAds DNR atsiskyrė nuo MOF-La nanoskaičių paviršiaus ir La 3d surišančioji energija buvo atgauta, tuo tarpu FAM- ds DNR buvo pritvirtinta MOF-La nanoslapų krašte. ir vis dar buvo stebimas mėlynasis La 3d rišamosios energijos poslinkis. Šie rezultatai rodo, kad dažais pažymėta ss DNR gali adsorbuotis MOF-La nanoskaičių paviršiuje. Esant tikslinei DNR, suformuota TAMRA paženklinta ds DNR atsiskiria nuo MOF-Ln nanoplakštų paviršiaus, o suformuota FAM pažymėta ds DNR liks pritvirtinta prie MOF-Ln nanoskopų krašto dėl elektrostatinės sąveikos.

Tarpląstelinis adenozino zondavimas gyvose ląstelėse naudojant MOF-Ln nanoskaičius kaip dviejų spalvų jutimo platformas

Kaip ssDNR / RNR molekulių klasė, aptameriai buvo naudojami aptamerai, pasižymintys dideliu afinitetu ir specifiškumu. 36, 37, 38, 39 Šiame tyrime dažais paženklinti ATP aptamers ant MOF-La nanoslapų buvo naudojami intraląsteliniams dvispalviams fluorescenciniams ATP vaizdams. FAM pažymėtas ATP-aptameras (FAM-P2) ir TAMRA-paženklintas ATP-aptameras (TAMRA-P2) buvo inkubuoti kartu su MOF-La nanoslapiais, kad susidarytų Dye-P2 + MOF-La kompleksas, ant kurio FAM-P2 ir TAMRA-P2 buvo adsorbuoti su ta pačia moline koncentracija. Esant tiksliniam ATP, specifinis „Dye-P2“ surišimas su ATP paskatino standžios struktūros susidarymą. Panašiai kaip ds DNR, šios nelanksčios ATP aptamerio konformacijos afinitetas MOF-La nanoskaičių paviršiui buvo labai silpnas. Šis ATP jutimas buvo pagrįstas TAMRA fluorescencijos ir FAM fluorescencijos sumažėjimu, pridedant tikslinį ATP.

MOF-La pagrindu pagaminto adenozino jutiklio selektyvumas buvo patikrintas palyginus FAM ir TAMRA fluorescencijos intensyvumo pokyčius, kuriuos sukėlė ATP ir kitos biomolekulės, tokios kaip uridino trifosfatas, citidino trifosfatas, guanozino trifosfatas, žmogaus serumo albuminas, glutationas, askorbo rūgštis ir histamino. Kaip parodyta 5a – c paveiksle, ATP sukėlė TAMRA fluorescencijos atkūrimą ant TAMRA-P2 + MOF-La ir dar labiau užgesino FAM fluorescenciją ant FAM-P2 + MOF-La. Naudojant kitas biomolekules, priešingai, jokių akivaizdžių fluorescencijos signalų pokyčių nepastebėta. Šie rezultatai parodė, kad dažiklis P2 + MOF-La biosensorius pasižymi geru selektyvumu adenozinų atžvilgiu. Be to, dažiklis P2 + MOF-La biosensorius taip pat parodė gerą selektyvumą adenozinų atžvilgiu realiuose mėginiuose, pavyzdžiui, žmogaus plazmoje ir ląstelių ekstraktuose (papildomas paveikslas S14).

Image

MOF-La pagrįsto adenozino jutiklio selektyvumas. a ) FAM-P2 + MOF-La zondo (žalioji juosta, aptinkama ties 518 nm) ir TAMRA-P2 + MOF-La zondo (raudonoji juosta, aptikta 582 nm) didžiausias fluorescencijos intensyvumas skirtingoms biomolekulėms. ( b, c ) FAM-P2 (20 n M) ( b ) ir TAMRA-P2 (15 n M) fluorescenciniai spektrai, sumaišyti su MOF-La nanosėkliais (0, 2 mg ml −1 ), esant ATP ( uridino trifosfatas (UTP), guanozino trifosfatas (GTP) arba citidintrifosfatas (CTP)), kurių koncentracija atitinkamai yra 30 n M ( b ) ir 25 n M ( c ). d ) Adenozino aptikimo kalibravimo kreivės (0, 5–15 nM) pagal F ′ TAMRA (raudona) ir F ′ FAM (mėlyna). e ) Adenozino nustatymo kalibravimo kreivė (0, 5–15 nM), pagrįsta F ′ TAMRA / F ′ FAM santykiu.

Visas dydis

Didžiausias fluorescencijos intensyvumo santykis F / F 0 (kur F ir F 0 yra didžiausias fluorescencijos intensyvumas, esant atitinkamai tikslui ir jo neturint) buvo nubraižytas atsižvelgiant į ATP koncentraciją (5d paveikslas). Biosensorius „Dye-P2 + MOF-La“ rodė linijinį diapazoną nuo 0, 5 iki 15 nM ir žemą ATP aptikimo ribą - 500 pM, palyginamą su anksčiau praneštomis vertėmis. 5, 40 Be to, buvo pastebėta palanki tiesinė koreliacija tarp TAMRA-P2 + MOF-La zondo F / F 0 ( F ' TAMRA ) ir FAM-P2 + MOF-La zondo F / F 0 ( F ' FAM) ) (5e pav.). Todėl adenozino koncentraciją galima apskaičiuoti remiantis F ' TAMRA / F ' FAM santykiu.

Be to, MOF-La nanoskopų zeta potencialas buvo −29, 1 mV, esant pH 7, 5, PBS (papildomas paveikslas S15), kuris nanosferatams galėtų stabiliai pasiskirstyti biosistemoje. Remiantis aukščiau pateiktais apibūdinimais, dažiklis P2 + MOF-La biosensorius buvo naudojamas tarpląsteliniam adenozino tyrimui žmogaus MCF-7 krūties vėžio ląstelėse naudojant konfokalinę mikroskopiją. Po MCF-7 ląstelės buvo inkubuotos su dažais P2 + MOF-La, tarpląstelinės adenozino molekulės sąveikavo su dažais P2 (6a pav.). Švitinant 488 nm šviesa, buvo pastebėtas skiriamasis fluorescencijos pokytis, atitinkantis FAM esant 500–550 nm (žalia) ir TAMRA esant 550–650 nm (raudona). Kaip parodyta sujungtuose paveikslėliuose papildomame S16 paveiksle, ilgėjant inkubacijos laikui, fluorescencinė spalva pasikeitė iš kelly žalia į rausvai oranžinę. Šie radiniai parodė, kad dažiklis P2 nukreipė adenozinus į dupleksinę konfigūraciją, todėl dažų molekulės atsiskyrė nuo MOF-La nanoskopų paviršiaus ir vėliau atgavo fluorescenciją. Z nuskaitymo eksperimentas, naudojant konfokalinę mikroskopiją, patvirtino, kad dažai P2 + MOF-La endocitizavosi į MCF-7 ląsteles (papildomas paveikslas S17).

Image

Intraceluliarinis fluorescencinis adenozinų vaizdavimas. a ) Gyvų ląstelių tarpląstelinio adenozino zondavimo schema, naudojant dažus P2 + MOF-La. b ) Gyvų ląstelių adenozino stebėjimas. ( c - e ) Konfokalūs adenozinų vizualizacijos ląstelėje vaizdai, kurių inkubacijos laikas yra nuo 2 iki 6 h, ir adenozinų kiekybinis įvertinimas naudojant dviejų spalvų fluorescenciją. Mastelio juostos: b, 25 μm; c, 30 μm; d, e, 10 μm.

Visas dydis

Adenozino aktyvumas pavienėse ląstelėse taip pat buvo stebimas dažiklio P2 + MOF-La biosensoriumi. Kaip parodyta 6b paveiksle, inkubuojant 4 valandas, fluorescencinė spalva skirtingose ​​ląstelėse pasikeitė iš žalios į raudoną. Spalvų išsiskyrimo skirtumas taip pat buvo stebimas atskirose ląstelėse (6c – e paveikslas). Adenozino aktyvumas buvo aiškiai stebimas skirtingose ​​ląstelėse ir skirtinguose vienos ląstelės regionuose. Apskaičiavus F ' TAMRA / F ' FAM santykį, adenozino koncentracija gyvose ląstelėse buvo pusiau nustatyta (duomenys nurodyti 6 paveiksle), remiantis 5e paveiksle pateikta kalibravimo kreive. Gyvų ląstelių, inkubuotų su dažų P2 + MOF-La biosensoriumi 2 arba 4 valandas, adenozinų koncentracija galėjo būti stebima nuo 0, 5 iki 15 nM. Kai inkubacijos laikas buvo ilgesnis nei 6 valandos, F ' TAMRA / F ' FAM santykiai buvo už linijinio metodo diapazono, naudojant paruoštą dažiklio P2 + MOF-La biosensorių. Norint aptikti didelę adenozinų koncentraciją (> 15 n M), ruošiant dažų-P2 + MOF-La kompleksą, su MOF-La nanoskaičiais reikia inkubuoti daugiau FAM-P2 ir TAMRA-P2.

Atsižvelgiant į tai, kad ląstelinis ATP daugiausiai gaminamas mitochondrijose aerobinio kvėpavimo metu, 42 kartu buvo stebimas adenozinų ir mitochondrijų pasiskirstymas gyvose ląstelėse. Kolokalizacijai su mitochondrijomis buvo naudojamas „MitoTracker Deep Red FM“ (FMD, iš YEASEN, Šanchajus, Kinija) (papildomas paveikslas S18), komerciškai prieinamas mitochondrijų indikatorius, 43 . Kaip parodyta 7a – c paveikslėliuose, dažai-P2 + MOF-La ir FMD dažyti MCF-7 ląstelėse, kai kurie adenozinai buvo stebimi aplink mitochondrijas. „HeLa“ ląstelės taip pat buvo naudojamos stebėti adenozinų pasiskirstymą gyvose ląstelėse (papildomas paveikslas S19). Kadangi adenozinai paprastai egzistuoja mitochondrijose ir citozoliuose, adenozinų pasiskirstymas mažai sutapo su mitochondrijų pasiskirstymu (balta spalva 7 paveiksle ir papildomame S19C paveiksle; sužadinimo bangos ilgis buvo 644 nm).

Image

MCF-7 ląstelių, inkubuotų su dažais P2 + MOF-La ir FMD, konfokalios fluorescencijos vaizdai. ( a - c ) Pavienės ląstelės, inkubuojamos su dažais P2 + MOF-La ir FMD 4 valandas. Svarstyklės: 10 μm.

Visas dydis

Kontroliniame eksperimente FAM-P3 (su FAM pažymėta atsitiktine DNR P3) ir TAMRA-P3 (TAMRA pažymėta atsitiktine DNR P3) buvo sumaišyti su MOF-La nanoskaičiais, kad būtų gautas dažų P3 + MOF-La kompleksas, kuris buvo panašus į dažų-P2 + MOF-La kompleksą. Po dažų-P3 + MOF-La komplekso inkubacijos su MCF-7 ląstelėmis 6 valandas (fluorescencijos intensyvumas) akivaizdaus pokyčio nepastebėta (papildomas paveikslas S20). Šie rezultatai atskleidžia, kad dažų P2 + MOF-La kompleksas gali būti naudojamas kaip selektyvus jutiklis zondui aptikti gyvų ląstelių biomoleules.

Išvados

Mes susintetinome ir apibūdinome labai plonų MOF-Ln nanoskaičių seriją. Šie MOF-Ln nanoskopai parodė įdomų fluorescencinio gesinimo gebėjimą dažais pažymėtoms DNR. FAM pažymėtos ss DNR, turinčios neigiamus krūvius, fluorescencija buvo iš dalies numalšinta MOF-Ln nanoskaičiais. Hibridizuodamas su papildoma taikinio DNR, FAM-DNR DNR atsiskyrė nuo MOF-Ln nanoskaičių paviršiaus ir vėl prikabino prie nanoskaičių krašto, vykdydama elektrostatinę FAM ir Ln 3+ sąveiką. Tačiau su TAMRA pažymėtos ss DNR, turinčios teigiamus krūvius, fluorescencija parodė tas pačias gesinimo ir atsistatymo savybes MOF-Ln nanoselektuose kaip ir tradicinės 2D medžiagos. Mes nustatėme, kad dėl lantanido susitraukimo, MOF-La nanoskopai pasižymi geresniu fluorescencinio gesinimo gebėjimu nei MOF-Eu nanoskopai. Suderinus šiuos pranašumus, MOF-La nanoskopai buvo sėkmingai naudojami kaip dviejų spalvų jutimo platforma, skirta ląstelėje aptikti DNR ir mažas molekules. Šis darbas atskleidė naujas MOF-Ln nanoskaičių savybes. Mes tikime, kad šie nanoskiltai gali būti naudojami kaip naujo tipo platforma plačiam biologiniam pritaikymui.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „NPG Asia Materials“ svetainėje (//www.nature.com/am)