Didelis laidumas, kalcio aktyvuotas k + (bk) kanalas yra reguliuojamas cisteino stygos baltymu | mokslinės ataskaitos

Didelis laidumas, kalcio aktyvuotas k + (bk) kanalas yra reguliuojamas cisteino stygos baltymu | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Eksperimentiniai ligos modeliai
  • Jonų kanalai nervų sistemoje
  • Ligos mechanizmai
  • Kalio kanalai

Anotacija

Didelio laidumo, kalcio suaktyvinti K + (BK) kanalai yra plačiai paplitę visoje nervų sistemoje, kur jie reguliuoja veikimo potencialo trukmę ir šaudymo dažnį kartu su presinapsiniu neurotransmiterio išsiskyrimu. Mūsų paskutinės pastangos nustatyti chaperonus, kurie nukreipti į neuronų jonų kanalus, atskleidė cisteino stygos baltymą (CSPα) kaip pagrindinį BK kanalo išraiškos ir srovės tankio reguliatorių. CSPα yra su pūslelėmis susijęs baltymas, o CSPα mutacijos sukelia paveldimą neurodegeneracinį sutrikimą, suaugusiųjų prasidėjusį autosominį vyraujantį neuronų keroidų lipofuscinozę (ANCL). CSPα nulinės pelės rodo 2, 5 karto didesnę BK kanalo išraišką, palyginti su laukinio tipo pelėmis, o tai nematoma su kitais neuronų kanalais (ty Ca v 2.2, K v 1.1 ir K v 1.2). Be to, mutacijos CSPα J domene arba cisteino stygų srityje žymiai padidina BK raišką ir srovės amplitudę. Mes darome išvadą, kad CSPα veikia norėdamas reguliuoti BK kanalo išraišką, todėl su CSPα susiję BK pokyčiai gali prisidėti prie neurodegeneracinių sutrikimų, tokių kaip ANCL, patogenezės.

Įvadas

Didelis laidumas, kalcio suaktyvinti K + kanalai (BK kanalai) yra plačiai pasiskirstę visame CNS ir vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant neuronų veikimo potencialo trukmę, greitos po-hiperpolarizacijos apimtį ir sprogimo žaibo dažnį 1, 2, 3 . BK kanalai taip pat yra matomi ikisinapsinėje membranoje, kur jie reguliuoja depolarizacijos sukelto kalcio antplūdžio dydį ir laiką, taip paveikdami neurotransmiterio išsiskyrimą sinapsėje 4, 5, 6, 7, 8 . Genetinis BK kanalo subvienetų ištrynimas pelėms 9, 10 ir funkcijų padidėjimo kanalo mutacija žmonėms 11, 12 yra susiję su neurologiniais sutrikimais, tokiais kaip ataksija ir epilepsija. Taigi akivaizdu, kad neuronų BK kanalo aktyvumo pokyčiai sukelia CNS disfunkciją ir dėl šios priežasties labai svarbu suprasti BK kanalų reguliavimo mechanizmus. Šiame tyrime mes pateikiame įrodymų, kad ko-chaperonas, cisteino stygos baltymas (CSPα), kontroliuoja neuronų BK kanalų ląstelių paviršiaus tankį.

CSPα yra su sinapsinėmis pūslelėmis susijęs baltymas, plačiai ekspresuojamas nervų sistemoje ir pasižymintis unikaliomis neurodegeneracinėmis savybėmis 13, 14 . Tai didelės J baltymų šeimos narys 15 . CSPα turi N galinį J domeną ir vidurinį regioną, kuriame yra 13–15 cisteino liekanų 16 eilutė, kuri yra palmitoilinta ir yra kritiška CSPα tvirtinimui prie sinapsinių pūslelių 17, 18 . CSPα yra aktyvus kaip trimerinis kompleksas, susidedantis iš 70 kDa (Hsc70) šiluminio šoko giminingo baltymo ir mažo tetratricopeptido baltymo (SGT) 19, 20, 21 .

Nors CSPα nėra būtinas neuromediatorių išsiskyrimui, po 3 savaičių amžiaus jis turi išlaikyti sinapsinę funkciją pelėms. Genetiškai modifikuotos pelės, neturinčios CSPα, atrodo normalios gimus, tačiau maždaug po 20-osios dienos jiems išsivysto progresuojantis motorinis deficitas ir CNS degeneracija, o po to ankstyvas mirtingumas tarp 40–80 dienų 14 . CSPα niekinių pelių sinapsių netekimas priklauso nuo aktyvumo, o sinapsės, kurios dažnai suaktyvėja, pavyzdžiui, susijusios su fotoreceptoriais ir GABAerginiais neuronais, prarandamos pirmiausia 22, 23 . Buvo pranešta, kad CSPα išnaikintų pelių CNS sinapsėse sumažėja 22 baltymų kiekis, o keli kiti sinapsiniai baltymai yra tariami CSPα chaperono sistemos klientai, remiantis asociacijų tyrimais 25, 26, 27, 28. Kuris kliento baltymas (-ai) yra kritinis (-iai), norint suaktyvinti įvykius, sukeliančius degeneraciją, ir kurie pokyčiai yra paskesniuose pirminiuose įvykiuose, yra dabartinis biologinis klausimas. Konkrečiai, tyrimai su CSPα nulinėmis pelėmis rodo, kad t-SNARE SNAP25 (sinaptosominiu būdu susijęs 25 kDa baltymas), kuris yra esminis eksocitozės metu, ir GTPazės dinaminas1, būtinas endocitozės metu, yra CSPα chaperono komplekso klientai, ir tai lemia prognozę. kad CSPα funkcijos praradimas pakenks vezikulų prekybai neuronais 24, 29, 30, 31, 32 . Įdomu tai, kad CSPα niekinių pelių degeneraciją gali išgelbėti pernelyg išreikštas laukinio tipo, bet ne neaktyvus SNAP-25 30 mutantas. Be to, per didelis α-sinukleino, kuris neturi homologijos nei su CSPα, nei su SNAP-25, ekspresija užkerta kelią CSPα-null pelių degeneracijai 29 . Kaip tiksliai šie baltymai kompensuoja CSPα praradimą, šiuo metu nežinoma. CSPα svarba apsaugai nuo sinapsių yra gerai nustatyta, tačiau mūsų žinios apie mechanistinius įvykius, kuriais grindžiama ši apsauga, yra silpnos ir liko daug klausimų.

BK kanalų veiklai reikalingas sudėtingas reguliavimo mechanizmų rinkinys, įskaitant: moduliaciniai priedų subvienetai 33, fosforilinimas 34, palmitoilinimas 35 ir alternatyvusis sujungimas 36 . Šiame tyrime mes pademonstravome, kad CSPα reguliuoja ląstelių paviršiaus BK kanalų ekspresiją, ir tai turėtų pakeisti sinapsinę funkciją. Mes pranešame, kad CSPα niekinių pelių smegenų audinyje padidėja neuronų BK kanalo išraiška. Taip pat parodome, kad labai konservuoto motyvo mutacija J domene (ty HPD pakeitimas AAA pakaitalais) ir 116 liekanos ištrynimas arba Leu115 pakeitimas Arg CSP cisteino stygų srityje padidina BK srovę, selektyviai padidindamas ląstelės paviršiaus BK kanalo ekspresiją. . Šie duomenys atskleidžia naują chaperone pagrįstą ląstelių mechanizmą, kuris reguliuoja BK kanalo išraišką CNS. Šie stebėjimai iškelia intriguojančią galimybę, kad su CSPα susijęs BK srovės tankio disreguliavimas gali pakeisti neuronų jaudrumą ir prisidėti prie patogeniškų įvykių sekos, susijusios su vienu ar daugiau neurodegeneracinių sutrikimų.

Rezultatai

Remiantis mūsų pradiniu stebėjimu apie tvirtus BK kanalo tankio pokyčius neuroblastomos ląstelėse, kurios kartu išreiškia CSPα mutantinius baltymus, BK kanalas buvo identifikuotas kaip galimas CSPα chaperono komplekso baltymas. Pranešama, kad J baltymų šeimos nariai reguliuoja kelių tipų jonų kanalų prekybą / ekspresiją, įskaitant: hERG (su žmogaus eteriu susijęs genas) K + kanalas 37, 38, CFTR (cistinės fibrozės transmembranas). laidumo reguliatorius) 39 ir K ATP kanalas (ATP jautrus K + kanalas) 40, todėl atsiranda tikimybė, kad J-baltymai yra ląstelių mašinos komponentai, kurie priima „trejetą“ sprendimus dėl to, ar jonų kanalais prekiaujama ir (ar) jie laikomi ląstelės paviršiaus arba suskaidytas. Norėdami ištirti ryšį tarp CSPα ir BK kanalo išraiškos, pirmiausia išmatuojome BK kanalo išraišką laukinio tipo ir CSPα išmušimo pelėse. CSPα niekinės pelės gimsta normaliai, tačiau praėjus 2–3 savaitėms, jos nustoja priaugti svorio ir pasireiškia aklumu, nuo veiklos priklausoma neuronų degeneracija ir progresuojančiais motorikos sutrikimais. CSPα niekinės pelės paprastai miršta per anksti 40–80 dienų 14 . Heterozigotinėse pelių mutantuose yra mažiau CSPα baltymų nei laukinio tipo kontrolėse, tuo tarpu homozigotinėse pelių mutantuose nėra aptinkamo CSPα 14 . 1 paveiksle parodyta BK kanalo, Ca v 2.2, Kv1.1 ir K v 1.2 kanalų išraiška ištisų smegenų sinaptosomų membranų frakcijose iš CSPα - / -, CSPα - / + ir CSPα + / + pelių, įvertinta Western blot būdu. . BK kanalo ekspresija yra žymiai padidėjusi CSPα niekinių pelių, tuo tarpu heterozigotai rodo ekspresijos lygį, panašų į laukinių tipų. Be to, stebimas BK kanalo padidėjimas yra selektyvus, nes CSPα - / - arba CSPα - / + pelių smegenyse Ca v 2.2, K v 1.1 ir K v 1.2 kanalų audinių lygis reikšmingai nesikeičia. laukinio tipo kontrolė. Įdomu tai, kad BK kanalo α subvienetų mRNR nebuvo padidėjusi CSPα - / - pelių smegenyse, kaip nustatyta kiekybine RT-PGR (1 lentelė), kas rodo, kad padidėjęs BK kanalo baltymo lygis CSPα - / - smegenų audinyje nėra dėl transkripcijos įvykio. Taip pat gerai žinoma, kad CSPα pirmiausia yra ekspresuojamas audiniuose, kuriuose sekretuojama sekrecija, pavyzdžiui, smegenyse ir kasoje 16, 41 . Pelių lygiame aortos raumenyje, kuriame yra ryškūs BK kanalo lygiai, nepastebėtas skirtumas tarp vidutinio BKα subvienetų išraiškos lygio tarp trijų genetinių pagrindų (1C pav.). Atsižvelgiant į tai, kad CSPα nėra išreikštas aortoje, šis radinys nėra netikėtas.

Image

(A) BK kanalo, Ca v 2.2 kanalo, K v 1.1 ir K v 1.2 kanalų porus formuojančių α subvienetų, aptiktų sinaptosomomis praturtintose membranos frakcijose, paruoštose iš visų smegenų, porų formavimo α subvienetų reprezentatyvūs Vakarų blot duomenys. Bendras vienoje juostoje pakrautas baltymas buvo 40 μg; β-aktino aptikimas tuose pačiuose blotuose buvo naudojamas vienodam įvairių juostų krovimui patikrinti. Duomenys, pateikti A skydelyje, buvo atrinkti iš viso ilgio Western blot vaizdų, kurie pateikiami 1 papildomame paveiksle. (B) Histograma rodo vidutinius BK, Ca v 2.2, K v 1.1 ir K v 1.2 kanalų baltymų laukinėje gamtoje duomenis. - tipo, heterozigotiniai ir niekiniai smegenų mėginiai, nustatyti kiekybiškai nustatant kameros skleidžiamą chemiliuminescenciją. Kiekybiniam nustatymui buvo apskaičiuotas nustatyto mėginio kanalo baltymo ir β-aktino santykis visoms trims genetiniams fonams. Tada heterozigotinių ir nullinių audinių kanalo tankio duomenys buvo normalizuoti pagal laukinio tipo audinius, padalijant visus apskaičiuotus koeficientus iš laukinio tipo santykio tam tikroje kanalo rūšyje. (C) Histograma, rodanti BK kanalo išraišką, aptiktą aortoje iš CSPα heterozigotinių ir niekinių pelių, palyginti su laukinio tipo pelėmis. BKα subvienetų aptikimo kiekybinis įvertinimas buvo atliktas kaip aprašyta B skydelyje. Vidutiniai Western blot duomenys buvo gauti iš 5–6 gyvūnų (B grupė) ir 3–4 gyvūnų (C grupė) iš kiekvieno genetinio fono (2–3 vados). * rodo statistiškai reikšmingą skirtumą nuo heterozigotos ir laukinio tipo verčių, nustatytų atliekant vienpusį ANOVA ir Tukey post-hoc testą; p <0, 05.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Norėdami gauti mechanistinį supratimą apie CSPα įtaką BK kanalo proteostazei, sukūrėme iš pelių CNS gautą katecholaminerginę (CAD) ląstelių liniją 42, stabiliai išreiškiančią pelių neuronų BK kanalą ( 43 ; žr. Metodų skyrių), kuris įgalintų griežtą elektrofiziologinę ir BK kanalo lygio imunocitocheminė analizė. BK kanalų išraiška šiose ląstelėse buvo matuojama esant myc pažymėtiems CSPα arba myc pažymėtiems funkcijų praradimo mutantams CSPα HPD-AAA . Funkciškai HPD motyvo (likučiai 43-45) mutacija CSPα sutrikdo labai konservuoto J domeno vientisumą ir taip užkerta kelią CSPα suaktyvinti Hsp70 / Hsc70, kad būtų galima atlikti konformacinį baltymo lankstymą 44 . Taigi tikimasi, kad funkcinio praradimo CSPα HPD-AAA praradimas pakeis endogeninio CSPα aktyvumą CAD ląstelėse ir veiks dominuojančiu-neigiamu būdu 45 . 2A ir B paveiksluose pavaizduota Western blot analizė ir atitinkami vidutiniai BK kanalo išraiškos duomenys stabilioje CAD ląstelių linijoje 48 valandas po pereinamojo laikotarpio transfekcijos myc-pažymėtomis CSPα, CSPα HPD-AAA arba pCMV plazmidėmis (neigiama kontrolė). Kaip ir tikėtasi, 3 skirtingos CSPα rūšys buvo identifikuotos atlikus Western blot analizę transfekuotose ląstelėse; nesubrendusi 26 kDa forma, 34 kDa subrendęs palmitoilintas baltymas ir 70 kDa CSPα dimeris 42, 46 . Esant CSPα HPD-AAA, BK kanalo išraiška buvo padidinta ~ 6 kartus (657, 5 ± 175, 4%), palyginti su plazmidės kontrole (100%). Priešingai, padidėjęs laukinio tipo CSPα lygis reikšmingai nepakeitė BK kanalo išraiškos. Kadangi genetinis CSPα išmušimas yra susijęs su padidėjusiu BK kanalo baltymu smegenų audinyje (1 pav.), Spėliojome, kad CSPα natūraliomis sąlygomis gali tiesiogiai arba netiesiogiai sąveikauti su neuronų BK kanalais. Tačiau nepavyko užfiksuoti stabilių CSPα-BK kanalų kompleksų iš laukinio tipo pelių smegenų, naudojant klasikinę imunoprecipitacijos strategiją (n = 4, duomenys nepateikti). Toks pastebėjimas gali parodyti arba komplekso susidarymo tarp natūraliųjų CSPα ir BK kanalų trūkumą, arba kad tokios tariamos sąveikos yra trumpalaikio, mažo afinitetiškumo ir jų negalima aptikti taikant šį analitinį metodą.

Image

Laukinio tipo CSPα, CSPα HPD-AAA, laukinio tipo Hsp40 ir Hsp40 HPD-AAA schema parodyta paveikslo viršuje, kuriame nurodytos J srities ir cisteino stygų sritys. (A) „BK bl“ subvieneto išraiškos Western blot analizė stabiliose BK stabiliose CAD ląstelėse, pereinamai perkeltose su „myc“ pažymėtomis CSPα arba CSPα HPD-AAA (kiekviena 0, 75 μg cDNR) arba 1 μg cDNR, koduojančių „myc“ pažymėtą Hsp40 arba Hsp40 HPD- AAA . pCMV plazmidė (1 μg cDNR) buvo naudojama kaip transfekcijos kontrolė. Po 48 val. Po transfekcijos ląstelės buvo surinktos ir 30 μg ląstelių lizato buvo atskirtos SDS-PAGE ir patikrintos anti-BKα subvieneto antikūnu (viršutiniu) arba anti-myc antikūnu (viduryje). Panašiam mėginio įkrovimui patikrinti buvo naudojamas endogeninio β-aktino (apatinio) aptikimas. BKα subvieneto duomenys, pateikti viršutiniame šios plokštės paveikslėlyje, buvo pasirinkti iš viso ilgio vesterno blot, kuris pateiktas papildomame 2A paveiksle. Histograma (B grupė) kiekybiškai apibūdina santykinius ląstelių BKα subvienetų išraiškos pokyčius, esant WT ir HPD-AAA mutantų formoms CSPα ir Hsp40. (C skydelyje) parodyta reprezentacinių baltymų, kuriems pranešta apie palmitoilinimą, vakarų blotai. Tirpūs lizatai buvo paruošti iš stabilių BK ląstelių, laikinai transfekuotų laukinio tipo CSPα arba HPD-AAA mutantu, kaip nurodyta skydelio viršuje. eGFP buvo naudojamas kaip transfekcijos kontrolė. Mėginiai kairiajame stulpelyje (žymimi minuso ženklu) yra lizatai iš neperkeltų ląstelių. Β-aktino aptikimas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. Rezultatai atspindi 4 nepriklausomus eksperimentus, kurie visi pateikė kokybiškai panašius duomenis. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp reikšmių buvo nustatyti -ANOVA, * p <0, 05.

Visas dydis

Kadangi CSPα yra labai konservuotos J baltymų šeimos narys, mes pagrįstai teigėme, kad kiti J baltymai taip pat gali įtakoti BK kanalo raišką. Hsp40 (40 kDa šilumos šoko baltymas) yra citozolinis J baltymų šeimos narys, kuris ekspresuojamas konstituciškai, taip pat reaguodamas į ląstelių stresą. Kaip ir CSPα, Hsp40 yra apsaugomas nuo neuronų ir veikia kartu su Hsc70, tačiau tikslus jo ląstelių apsauginių veiksmų mechanizmas vis dar menkai apibūdinamas 47 . CAD ląstelėse, stabiliai išreiškiančiose BK kanalus, laikinas laukinio tipo Hsp40 (99, 3 ± 21, 7%) arba funkcijos praradimo mutanto Hsp40 HPD-AAA (94, 7 ± 9, 5%) ekspresija nepakeitė BKα subvieneto išraiškos (2B paveikslas). . Visi šie rezultatai rodo, kad praradęs funkcionuojantis CSPα HPD-AAA mutantas sukelia selektyvų BK kanalo lygio padidėjimą, tuo tarpu lygiavertė Hsp40, susijusio J baltymo, mutacija neturi jokio poveikio.

Buvo pranešta, kad BKα subvienetai gali atlikti palmitoilinimą 35, paskatindami mus ištirti, ar esant CSPα mutantui CSPα HPD-AAA, taip pat gali padidėti kiti palmitoilinti baltymai. Kaip parodyta 2C paveiksle, CSPα HPD-AAA nepadidino palmitoilintų baltymų 48, 49 SNAP25, sintaksino1, GAP43 (augimo susijęs baltymas 43 kDa) ir flotilino ekspresijos BK stabiliose CAD ląstelėse. CSPα niekinių pelių sinaptosomose mes taip pat nepastebėjome K v 1.1 ekspresijos pokyčių (1A pav.) - dar vienas baltymas, kuris buvo palmitoilintas 50 .

Norėdami įvertinti CSPα mutantinių formų įtaką ląstelių paviršiaus ekspresijai funkcinių BK kanalų srityje, atlikome visos ląstelės pleistro spaustuko elektrofiziologiją, norėdami nustatyti aktyvius BK kanalus vienoje CAD ląstelėje. Norėdami atskirti BK kanalo srovę nuo endogeninių įtampos K + kanalų (ty K v 1 tipo kanalų), šiems kanalams blokuoti panaudojome 4-aminopiridiną (4-AP, 5 mM) ir išmatuojome likusias visos ląstelės sroves, jei jos nėra. ir labai selektyvaus BK kanalo inhibitoriaus, penitrem A (100 nM) 51 buvimas. 3A paveiksle parodytas penitemo A jautrių visos ląstelės srovės tankio srovės įtampos diagrama, užfiksuota iš CAD ląstelių, stabiliai išreiškiančių BK kanalus, kurie buvo laikinai transfekuoti laukinio tipo arba mutantinėmis CSPα formomis. Esant CSPα HPD-AAA mutantui, BK srovės tankis buvo žymiai didesnis, palyginti su eGFP ekspresuojančiomis kontrolinėmis ląstelėmis, parodydamas didesnį funkcinių BK kanalų paviršiaus išraišką. Priešingai, laukinio tipo CSPα trumpalaikė ekspresija neturėjo jokios įtakos vienaląsčių BK srovės tankiui, o tai atitinka Western blot duomenis, parodantį labai nedidelį išorinių laukinio tipo CSPα poveikį BKα subvienetinio baltymo lygiui BK stabiliose CAD ląstelėse ( 2B pav.). 3B paveiksle pavaizduotos reprezentatyvios membranos srovių šeimos, užfiksuotos iš stabilių BK ląstelių, kai nėra ir nėra penitremo A aprašytomis transfekcijos sąlygomis. Dešiniajame stulpelyje rodoma penitrem A jautri srovė, gaunama skaitmeniniu atimties būdu (ty kairiajame stulpelyje atėmus vidurinę koloną). Šie duomenys aiškiai parodo, kad CSPα funkcijos praradimo mutantas HPD-AAA padidina funkcinių BK kanalų ekspresiją ląstelių paviršiuje.

Image

CSPα domeno architektūra parodyta paveikslo viršuje. A. BK stabilių CAD ląstelių, laikinai perkeltų CSPα laukinio tipo arba mutantinėmis formomis, elektrofiziologinė analizė. Atskiri CAD elementai buvo užfiksuoti pagal įtampą, kaip pavaizduota bandymo impulsų protokole, parodytame kairėje, ir BK kanalo srovei izoliuoti buvo naudojamas selektyvus BK kanalo inhibitorius, penitrem A (100 nM). Srovės ir įtampos diagrama apibendrina penktremo jautrų visos ląstelės srovės tankį, užfiksuotą iš perkrautų ląstelių, kaip aprašyta dešinėje diagramos pusėje. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SE, o statistiškai reikšmingi skirtumai buvo nustatyti naudojant vienpusį ANOVA ir Dunnett post-hoc testą (palyginti su vien tik GFP); * (p <0, 05), ** (p <0, 01). B. Reprezentatyvios ištisų ląstelių srovių šeimos, užfiksuotos iš stabilių BK ląstelių, laikinai perkeltų CSPα laukinio tipo arba mutantinėmis formomis, reaguojant į įtampos pakopas nuo –20 iki +200 mV. Kairėje skiltyje rodoma visa visos ląstelės srovė, užfiksuota iš ląstelių nurodytomis transfekcijos sąlygomis. Viduriniame stulpelyje rodoma srovė, likusi esant BK kanalo blokatoriaus penitremui A, o dešiniajame stulpelyje - apskaičiuotos skirtumų srovės, gautos skaitmeniškai atimant A penitreme nurodytas sroves iš visų visos ląstelės srovių. Nurodytos mastelio juostos.

Visas dydis

CSPα palmitoilinimo mutantai CSP 116 ir CSP L115R padidina BK kanalo išraišką

2011 m. Buvo pranešta, kad naujos žmogaus CSPα mutacijos (ty 116 likučio ištrynimas arba Leu115 pakeitimas Arg) yra tiesiogiai susijusios su suaugusiųjų prasidėjusia autosominiu būdu dominuojančia neuronų keroido lipofuscinoze (ANCL) 52, 53, 54 . ANCL yra greitai progresuojantis, neurodegeneracinis jaunų suaugusiųjų sutrikimas, kuriam būdingi psichiniai pasireiškimai, traukuliai, progresuojanti demencija ir motorinis deficitas. Išsamūs patogeniniai šių CSPα mutacijų mechanizmai dar nėra išsiaiškinti, tačiau asmenys, sergantys ANCL, turi fenotipus, primenančius progresuojančius motorinius trūkumus, pastebėtus CSPα KO pelėse. Abi šios mutacijos trukdo CSPα cisteino stygos srities palmitoilinimui, kuris yra svarbus tvirtinant CSPα prie sinapsinių pūslelių. Norėdami įvertinti šių tariamų dominuojančių neigiamų mutacijų poveikį ląstelėms, ištyrėme CSPα Δ116 ir CSPα L115R mutacijų įtaką funkcinio BK kanalo lygiui mūsų CAD ląstelėse, stabiliai išreiškiančiose neuronų BK kanalus. BK kanalo aktyvumo analizė esant CSPα Δ116 arba CSPα L115R yra parodyta 3 paveiksle. BK kanalo srovės tankis yra žymiai didesnis esant CSPα Δ116 ir CSPα L115R mutantams, palyginti su laukinio tipo CSPα arba eGFP išreiškiančia kontrole. ląstelių, tačiau padidėjimas yra mažesnis nei pastebėtas naudojant CSPα HPD-AAA mutantą. Visi šie duomenys rodo, kad CSPα disfunkcija daro didžiulį poveikį BK kanalo išraiškai KO pelės modelyje, taip pat modelio neuronų ląstelių linijoje.

Norėdami nustatyti, ar nefunkcionalus mutantas CSPα HPD-AAA taip pat galėtų paveikti BK kanalo aktyvumą neneuroninėse ląstelėse, užfiksavome BK sroves iš žiurkės aortos lygiųjų raumenų ląstelių linijos (ty A7r5 55 ), stabiliai perkeltas tuo pačiu BKα subvieneto cDNR, naudojamu sukurti stabilias CAD ląsteles. 4 paveiksle pateikti duomenys rodo, kad laukinio tipo CSPα arba CSPα HPD-AAA laikina ekspresija, kaip patvirtinta imunocitochemija (4B paveikslas), neturėjo jokios įtakos BK srovės tankiui A7r5 ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose BKα subvienetus. Taigi šie radiniai atitinka pastebėtą CSPα išmušimo poveikio natūralaus BK kanalo lygiams pelių aortoje trūkumą (1C pav.). Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad BK kanalų reguliuojamas CSPα veikiamas papildomų faktorių, išreikštų sekrecinėse ląstelėse, tokiose kaip neuronai.

Image

(A) Penitrem A jautrus srovės tankio grafikas neparodė reikšmingo skirtumo tarp apdorojimų esant 100 mV. Iškviesta srovė buvo> 5 kartus didesnė už natūralaus A7r5 ląstelių srovę tuo pačiu potencialu (duomenys nepateikti). (B) Imunocitocheminis A7r5 ląstelių dažymas anti-BKα subvieneto antikūnais parodė BK kanalo ekspresiją. Pateikti duomenys atspindi bent penkis skirtingus eksperimentus.

Visas dydis

Biocheminis patvirtinimas, kad CSPα HPD-AAA sąlygotas BK srovės tankio padidėjimas buvo susijęs su BK kanalo ląstelių paviršiaus ekspresijos padidėjimu kartu su kanalo baltymo visu ląsteliniu fondu, parodytas 5 paveiksle. Šiuo tikslu stabiliai CAD ląstelės yra stabilios. ekspresyvūs BK kanalai pirmiausia buvo transfekuoti CSPα variantais, po to nepažeistas ląsteles žymėti biotinu. Tada biotinilinti ląstelių paviršiaus baltymai buvo išgauti iš bendro ląstelių lizato, paimant streptavidiną, po to atlikta Western blot analizė. BK kanalo biotinilizacijos laipsnis buvo įvertintas, esant neigiamai kontrolei, kai buvo transfekuota CSPα, CSPα HPD-AAA arba pCMV plazmidė. Remiantis 2 ir 3 paveiksluose pateiktais duomenimis, 5A paveiksle pateikti rezultatai savarankiškai patvirtina, kad CSPα HPD-AAA (2 juosta) žymiai padidino BK kanalo paviršiaus išraišką ląstelėje, palyginti su laukinio tipo CSPα (1 juosta) arba plazmidė. valdymas (3 juosta). Šiuos duomenis papildo kiekybiškai įvertinti BKα subvienetų ekspresijos dažymo imunofluorescenciniais pokyčiais BK stabilios CAD ląstelės, kurios buvo laikinai perkeltos CSPα laukinio tipo arba mutantinėmis formomis (pav. 5B ir C). Bendra eGFP ekspresija buvo naudojama kaip laikinai perkeltų CAD ląstelių žymeklis. Padidėjusi ląstelių BK kanalų ekspresija esant disfunkciniams CSPα mutantams, parodyta 5B paveiksle, tokiu būdu imituoja funkcinį BK srovės tankio padidėjimą, nustatytą vienos ląstelės pleistro spaustuko įrašais (3A pav.). Nors laukinio tipo CSPα laikina ekspresija reikšmingai nepakeitė BK srovės tankio, tai sumažino BKα subvienetų dažymą BK stabiliose CAD ląstelėse (5B pav.). Šis skirtumas greičiausiai atspindi imunocitochemijos gebėjimą aptikti tarpląstelinius ir ląstelių paviršiaus BK kanalų telkinius, kurių pirmuosius gali lengviau paveikti padidėjęs laukinio tipo CSPα kiekis. Atkreipkite dėmesį, kad BK stabiliose CAD ląstelėse, dažytose tik fluorescenciniu būdu pažymėtu antriniu antikūnu, buvo nustatyta tik labai maža foninė fluorescencija (5B paveikslas, vien 2 ° Ab).

Image

(A) CAD ląstelės, stabiliai išreiškiančios BK kanalus, buvo laikinai perkeltos 0, 75 μg CSPα, CSPα HPD-AAA ir pCMV (neigiama kontrolė). Praėjus 48 val. Po transfekcijos, ląstelės buvo pažymėtos 30 min. 4 ° C temperatūroje vonioje naudojant Biotiną. Po lizės 1 ° C tirpių baltymų lizato per naktį streptavidinas buvo ištraukiamas 4 ° C temperatūroje. Baltymai, atskirti streptavidinu, atitraukiami (A grupė, kairė) ir 30 μg tirpaus ląstelinio lizato (A skydas, dešinėje) buvo ištirti „Western Blot“ metodu su anti-BKα subvieneto antikūnu. β-aktinas (apatinis) parodytas kaip mėginio įkrovimo kontrolė. BKα subvieneto duomenys, pateikti A skydelio viršutiniame paveikslėlyje, buvo pasirinkti iš viso ilgio Western blot, kuris parodytas papildomame 2B paveiksle. Histograma (skydelyje B) kiekybiškai apibūdina santykinius ląstelių BK kanalo išraiškos pokyčius esant WT ir įvairioms mutantinėms CSPα formoms (ty HPD-AAA, CSPα L115R ir CSPα Δ116 ), kaip pavaizduota C skydelyje. Duomenys pateikiami taip: vidurkis ± SE; kiekvienoje būklėje ištirtų ląstelių skaičius nurodytas skliaustuose. Statistiškai reikšmingi skirtumai buvo nustatyti naudojant vienpusį ANOVA ir Dunnett post-hoc testą (palyginti su vien tik GFP); * (p <0, 05), ** (p <0, 01). (C) BK stabilių CAD ląstelių imunocitochemija, laikinai transfekuota GFP ir įvairių formų CSPα. Transfekuotos CAD ląstelės buvo imunizuotos anti-BKα subvieneto antikūnais ir ištirtos fluorescencine mikroskopija (žr. Metodus). Kiekybiškai išreikštas BKα subvieneto išraiškos fluorescencijos signalo intensyvumas (kaip parodyta raudonai) atliekant bet kokį gydymą buvo normalizuotas tik GFP sąlygomis. Pateikti duomenys atspindi tris atskirus eksperimentus.

Visas dydis

Diskusija

Šis tyrimas identifikuoja ko-chaperoną CSPα (DnaJC5) kaip kritinį BK kanalo tankio reguliatorių neuronų plazmos membranoje. CSPα be pelių stebėjome, kad CNS sinaptosomų frakcijose BK kanalo baltymo lygis padidėjo maždaug 2, 5 karto, palyginti su laukinio tipo pakratų draugais (1 paveikslas); Įdomu tai, kad CSPα KO nepakeitė kitų neuronų kanalų (ty Ca v 2.2, K v 1.1 ir K v 1.2) lygių. Remdamiesi šiuo nauju pelių atradimu, mes taip pat pastebėjome, kad po kanados CNS išvestų neuroblastomos ląstelių BK kanalo lygis dramatiškai padidėjo po to, kai buvo ekspresuota dominuojanti neigiama CSPα forma, kurioje yra mutavusi HPD seka (2 ir 3 paveikslai). HPD motyvas yra būtinas bendram heterotrimerinio CSPα chaperono komplekso veikimui. Visi šie pagrindiniai pastebėjimai reiškia, kad CSPα paprastai slopina arba riboja BK kanalo tankį ląstelės paviršiuje, o nutildymas ar CSPα veiklos sutrikimas sukelia padidintą kanalų išraišką.

Biologiškai įmanoma, kad laukinio tipo CSPα riboja BK kanalus, naudodamas ląstelinį valdymo mechanizmą, kuriame CSPα veikia (1) sumažindamas BK kanalų eksportą iš endoplazminio retikulumo į ląstelės membraną ir (arba) (2) padidindamas kanalų pašalinimą / išėjimą iš plazmos membranos į lizosomas ar proteasomas. CSPα inaktyvacija dėl mutacijų ar baltymo praradimo sutrikdo šį reguliuojamąjį aktyvumą, todėl BK kanalai leidžia kauptis ląstelės paviršiuje. Tokie reguliavimo veiksmai nėra precedentai; Ankstesni tyrimai parodė, kad CSPα ir Hsp40 riboja cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatoriaus (CFTR kanalo) išėjimą iš ER 39, 56, o DnaJA1 ir DnaJA2 panašiai sumažina hERG (žmogaus eterio-a-go-go geno) ER eksportą. ) 37 kanalas. Mūsų duomenys rodo, kad BK kanalai taip pat yra nukreipti į CSPα, atitinka šią bendrą paradigmą. Tačiau taip pat yra įmanomas alternatyvus scenarijus, kai CSPα nukreiptas į kitus ląstelių baltymus (pvz., Transportavimo mašinas), kurie savo ruožtu reguliuoja BK eksportą į plazmos membraną arba išėmimą iš jos. Fernandezo-Chacono grupė nustatė sinapsinių pūslelių perdirbimo trūkumą motorinių nervų terminaluose CSPα nulinėse pelėse 32, o Chandros grupė nustatė, kad CSPα reguliuoja dinamino, esminio endocitozinės mašinos 24 komponento, polimerizaciją, nurodydamas sinapsinių pūslelių judėjimo problemas. Dėl sugedusio SNAP25 lygio, kurį pranešė Sudhofas ir jo kolegos, dėl netinkamo egzocitinių mechanizmų surinkimo, dar vienas atvejis yra neuronų membranos apykaitos pokyčiai, kai nėra CSPα 30, 31 . Lieka nustatyti, kokį vaidmenį šie kiti CSPα klientai gali atlikti BK kanalo proteostazėje. Atsižvelgiant į tai, iš 1 paveiksle pateiktų duomenų matyti, kad su CSPα susijęs neuronų BK kanalo išraiškos padidėjimas yra selektyvus, remiantis Ca v 2.2, K v 1.1 ir K v 1.2 baltymų lygio pokyčių nebuvimu. Tokiu būdu, be ląstelių jonų kanalų „sprendimų“ dėl lankstymo / netinkamo lankstymo būklės, ląstelinė chaperone sistema taip pat kontroliuoja BK kanalų tankį. Įdomus šio tyrimo tęsinys bus ištirti CSPα vaidmenį moduliuojant mutantinius BK kanalus (pvz., D434G), susijusius su žmogaus epilepsija ir judėjimo sutrikimais 11 .

Mūsų duomenys taip pat rodo, kad neseniai identifikuotos su žmonių ligomis susijusios CSPα mutacijos CSPα Δ116 ir CSPα L115R taip pat gali padidinti BK srovę, leisdamos manyti, kad šias mutacijas cisteino stygų srityje keičia neuronų rūšiavimas ir BK kanalų judėjimas. Nors CSPα Δ116 ir CSPα L115R padidina BK kanalo tankį membranoje, padidėjimas nėra toks didelis, koks stebimas naudojant CSPα HPD-AAA (3 paveikslas), o tai rodo, kad CSPα Δ116 ir CSPα L115R mutacijos gali sukelti tik dalinį CSPα praradimą. funkcija. Tos pačios mutacijos neseniai buvo nustatytos kaip ANCL priežastis jauniems suaugusiesiems 52, 53, 54 ir sukelia lizosominį lipofuscino kaupimąsi kartu su demencija ir motorikos nepakankamumu. Dabartinis supratimas apie CSPα ryšį su lizosomų disfunkcija, keroidų nusėdimu ir sinapsių palaikymu yra ribotas.

Ar CSPα disfunkcija susijusi su kitomis ligomis nei ANCL? Nors CSPα disfunkcija, atsirandanti dėl mutacijų ar genetinės delecijos, buvo susijusi su sinapsių netekimu, CSPα dalyvavimas neurodegeneracinėse, išskyrus ANCL, neaiškus. CSPα sumažėja žmonių, sergančių Alzheimerio liga, priekinėje žievėje 24, kas rodo, kad CSPα neuroprotekcinio pajėgumo sumažėjimas turi įtakos Alzheimerio ligos progresavimui. CSPα niekinių pelių, turinčių α-sinukleino, bet ne α-sinukleino A30P, gelbėjimas, mutacija, susijusi su Parkinsono liga, reiškia ryšį tarp CSPα ir degeneracinės kaskados Parkinsono ligos 29 atvejais . Eksperimentiniuose modeliuose mutantinis medžioklinis tirpalas trukdo CSPα chaperono veikimui, kas rodo, kad CSPα gali būti pažeistas Huntingtono ligos 57 metu . Taip pat pranešama, kad CSPα sumažėja žiurkėms po lėtinio morfino vartojimo 58, 59 . Nepaisant šių pranešimų apie ryšį tarp sumažėjusio CSPα aktyvumo ir patogenezės, kuria grindžiamos atskiros neurodegeneracinės ligos, vis dar reikia išsiaiškinti daugybę detalių dėl galimo priežastinio ryšio tarp CSPα disfunkcijos ir sinapsinio vientisumo praradimo. Daugėja įrodymų, kad didelė J baltymų šeima, veikianti kartu su Hsc70 / Hsp70, turi sąsajų su nervų ligomis. Be DnaJC5 (CSPα) mutacijų, susijusių su ANCL, giminingo J baltymo DnaJC6 (axilin) ​​mutacijos sukelia jaunatvinį parkinsonizmą 59 . Similarly, mutations in sacin lead to autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay 60, mutations in DnaJB2 (HSJ1) cause lower motor neuron disease 61, while mutations in DnaJB6 (mrj) are implicated in muscular dystrophy 62, Parkinson's 63 and Huntington's disease 64 .

Does BK channel over-expression contribute to degeneration under conditions in which CSPα is absent or dysfunctional? CSPα-mediated changes in BK levels may potentially contribute to the progressive activity-dependent neurodegeneration associated with CSPα loss/dysfunction, however there is currently no direct evidence supporting this idea. Indeed, high levels of BK channels in nerve terminals would be predicted to alter membrane excitability and could explain the increased synaptic depression in CSPα null mice observed by Sudhof and colleagues 14 . The severe age-dependent 14 and activity-dependent degeneration 22, 23 of synaptic function in CSPα KO mice argue that increased BK channel activity may be intimately involved in the pathogenic sequence of events that lead to synaptic deterioration; however this scenario has not been directly examined thus far. Future studies will undoubtedly explore the potential link between BK channel-associated neuropathies (ie ataxia, epilepsy) and CNS vulnerability to neurodegeneration in the absence of CSPα.

In summary, our data demonstrate that CSPα is capable of regulating BK channel expression in a neuronal cell model and establish key residues within CSPα for this regulatory activity. Mutations of CSPα in the N terminal J domain or central cysteine string region lead to an increase in total and cell surface BK channel expression, resulting in greater BK channel current density. In parallel, increased BK channel expression is also found in the brain of CSPα null mouse, demonstrating that loss of CSPα function alters BK channel expression in the intact CNS, which may lead to altered neuronal membrane excitability (Figure 6). Based on these findings, we speculate that alterations in the cell surface expression of neuronal BK channels may contribute to the pathogenesis of neurodegeneration associated with either genetic loss or dysfunction of CSPα.

Image

Visas dydis

Metodai

Ląstelių kultūros

CAD (CNS catecholaminergic derived) mouse neuroblastoma cells were seeded into 6 well plates and grown in DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin, as previously described 42, 65 . The established rat aortic smooth muscle cell line A7r5 was grown in DMEM containing 10% FBS, as described previously 55 . Cells were lysed in 40 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Na 3 VO 4, 0.1% SDS, 1% (v/v) Triton X-100, 0.5 mM PMSF and protease inhibitor (Sigma) at 4°C for 1 hour. Lysates were centrifuged at 15000 × g for 5 minutes at 4°C and the supernatant (soluble fraction) was collected and stored at −70°C. For transient transfection, CAD cells grown on 35 mm dishes were washed in PBS and transiently transfected using ~1.5 μg of cDNA and 7 μl of Lipofectamine-2000 (Invitrogen) per dish. Reagents were mixed in 0.2 ml of Opti-MEM medium and then diluted to a total volume of 1 ml with DMEM. Protein concentration of the soluble CAD cell lysate was determined using the Bradford assay (BioRad).

Imunoblotai

Proteins were electrotransferred from polyacrylamide gels to nitrocellulose membrane (0.2 μm pore size) in 20 mM Tris, 150 mM glycine and 12% methanol. Membranes were blocked in phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween 20, 4% (w/v) skim milk powder and then incubated with primary antibody overnight at 4°C. The membranes were washed and incubated with horseradish peroxidase-coupled secondary antibody for ~2 h at room temperature. Bound antibodies on the membranes were detected by incubation with the West Pico chemiluminescence reagent (Pierce Chemical Co.) and exposure to Kodak x-ray film. The chemiluminscent signals were quantified using a Biorad Fluor-S MultiImager Max and Quantity One 4.2.1 software. Representative western blot data were gathered from single blots and single exposures. Primary antibodies were obtained as follows: BK polyclonal and Ca v 2.2 polyclonal (Millipore), BK monoclonal, c-myc monoclonal and flotillin monoclonal (BD Biosciences), K v 1.1 monoclonal and K v 1.2 monoclonal (NeuroMab), SNAP25 monoclonal (Sternberger monoclonals), syntaxin monoclonal, GAP43 monoclonal, and β-actin monoclonal (Sigma-Aldrich).

Quantitative Real Time-PCR

Whole brains were dissected from CSPα null and wild-type mice and immediately frozen at −80°C. Total RNA was isolated using the RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) and reverse transcription was performed with 1 μg total RNA using the Quantitect Reverse Transcription Kit (Qiagen) following the manufacturer's instructions. For the negative control groups, all components except the reverse transcriptase were included in the reaction mixtures. Real-Time PCR with either BKα subunit (KCNMA1) primers (Forward: 5′-TCTCAGCATTGGTGCCCTCGTAAT-3′ Reverse: 5′-GTAGAGGAGGAAGAACACGTTGAA-3′) or actin (ACTB) primers (Forward: 5′ ACTGTCGAGTCGCGTCCA-3′ Reverse: 5′ GCAGCGATATCGTCATCCAT-3′) was performed using the Quantitect SYBR green PCR kit (Qiagen). Mouse ACTB was utilized as the reference gene. The running protocol involved 40 cycles consisting of sequential incubations at 94°C for 15 s, 55°C for 30 s and 72°C for 15 s using an Eppendorf Realplex 4 Mastercycler. PCR specificity was confirmed by dissociation curve analysis. Quantification cycle values (C q ) were determined with Realplex version 1.5 software, using the software's default noise band settings to determine the threshold fluorescence. Relative expression of KCNMA1 normalized to the ACTB reference gene in CSPα KO versus wild-type mice was determined using the 2 −ΔΔCq method (Table 1).

PCR assay validation was performed by testing serial dilutions of pooled template cDNAs, which indicated a linear dynamic range of 33–0.0033 ng template and yielded standard curves with slopes of −3.53 and −3.31 for KCNMA1 and ACTB, respectively, and R 2 values >0.99 and percent efficiencies of 91.8 and 100.3% for KCNMA1 and ACTB, respectively. No fluorescence was detected in negative template controls. RNA integrity was confirmed by performing agarose gel electrophoresis of the isolated mouse brain total RNA preparations denatured with glyoxal sample buffer (Ambion). This analysis yielded intensity ratios between the 28 S and 18 S rRNA bands of 1.85–2.04 for all the samples tested 66 .

Biotinylation of cell surface BK channels

CAD cells stably expressing murine brain BKα subunits 43 were transfected with CSPα variants, as described above. 24 h post-transfection, the cells were washed three times with PBS. CAD cells were then incubated with EZ-Link Sulfo-NHS-SS Biotin (Thermo Scientific) (1 μg/ml) in PBS for 30 min at 4°C. As a negative control, cells were incubated only with PBS. The reaction was neutralized by addition of 1% (w/v) BSA in PBS for 10 min at 4°C. After neutralization, cells were washed thrice with ice-cold PBS to remove non-reacted biotin, and were harvested in 1 ml of PBS containing 1% v/v Triton X-100 and protease inhibitor (complete, EDTA-free, Sigma) by an incubation for 2–5 minutes on ice. The lysates were centrifuged at 15, 000 × g for 15 min at 4°C and the soluble protein concentration was determined using the Bradford assay (Bio Rad).

For streptavidin pull-down, 1 mg of the soluble protein lysate was incubated with 100 μl streptavidin agarose beads (50% slurry) (Thermo Scientific) overnight at 4°C on a rotator. Beads were rinsed thrice with 1% Triton X-100 in PBS. Biotinylated proteins were eluted from the beads by adding 2× Laemmli sample buffer (62.2 mM Tris HCl pH 6.8, 7.5% v/v Glycerol, 2% w/v SDS, 0.015 mM Bromophenol Blue, 1.2% v/v β-Mercaptoethanol and 100 mM DTT) and treating the samples at 37°C for 1 h. Following elution, proteins were separated by SDS-PAGE using a 10% polyacrylamide gel and BKα subunits were detected by Western blot analysis.

Stable transfection of CAD cells

To establish a stable BK channel expressing cell line, CAD cells were transiently transfected in 100 mm culture plates with pcDNA3.1 Zeo(+) plasmid containing cDNA encoding a BKα subunit originally cloned from murine brain 43 . 48 h post-transfection, cells were plated and grown in media containing 0.8 mg/ml Zeocin (Invitrogen). Non-transfected cells were used as negative control. The selection medium was switched every 3 to 4 days until cell foci were identified. Cell foci were isolated with cloning cylinders and transferred into 12-well plates before expanding colonies in 6-well plates. The stable expression of the BK channel was confirmed by Western blot analysis and immunocytochemistry. Individual CAD cell clones stably expressing BKα subunits were subsequently maintained in DMEM/F12 medium containing 0.5 mg/ml Zeocin.

Whole cell patch clamp recordings

Voltage-clamp measurements were performed using conventional, ruptured membrane patch clamp methodology in combination with an Axopatch 200B amplifier, Digidata 1440 series analogue/digital interface and pClamp v10 software. Whole cell electrical signals were typically filtered at 1–2 kHz and sampled at 5 kHz. Glass micropipettes (2–4 MΩ tip resistance) were pulled from thin-walled borosilicate capillaries and contained 100 mM KOH, 30 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0.005 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7.3 with methanesulfonic acid. The bath chamber was placed on the stage of Nikon TE2000 inverted microscope equipped with epifluorescence illumination and perfused with a modified Ringer's saline solution containing 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2.5 mM CaCl 2, 5 mM 4-aminopyridine and 10 mM HEPES, pH 7.3 with 1N NaOH. Cells in the bath chamber were constantly superfused at ~2 ml/min and solution changes were performed by gravity flow from a series of elevated solution reservoirs using manually controlled solenoid valves. All electrophysiological recordings were performed at 35–37°C. CAD cells stably expressing BK channels were transiently transfected with either wild-type or mutant CSPα cDNA constructs, together with eGFP. Transfected cells were identified in the recording bath by their green fluorescence using 488 nm excitation and 510 nm emission filters.

Imunocitochemija

Transfected CAD cells were plated on sterile glass coverslips and washed three times with PBS to remove medium and serum, then fixed by incubation for 25 min at room temperature in PBS containing 1% (w/v) formalin. Cells were washed thrice with PBS and permeabilized by incubation for 5 min in PBS containing 0.01% Triton X-100. Cells were then washed three times in PBS and incubated in blocking solution (5% v/v donkey serum, 0.05% v/v Tween-20 in PBS) to reduce non-specific antibody binding. Cells were then incubated with anti-BK channel polyclonal antibody (Millipore, 1:400 dilution) overnight at 4°C in blocking solution, then washed five times with PBS. Cells were incubated at 4°C for 1 hour in blocking solution containing goat anti-rabbit secondary antibody conjugated to Cy3 (Jackson ImmunoResearch, 1:2000). Cells were rinsed once with blocking solution and washed three times with PBS. Coverslips containing stained cells were mounted onto glass slides with a drop of mounting media (Prolong Gold, anti-fade, Invitrogen) and images were taken on an Olympus Fluoview FV10i confocal microscope using a 60× (oil immersion) objective (NA:1.35). Laser intensity and sensitivity were maintained at 40% for all images, with a confocal aperture of 1.35. Fluorescence signal intensities of individual cells were analyzed and quantified using CellSens Dimension digital imaging software (Olympus).

Isolation of Tissue Fractions from Mouse Brain and Aorta

CSPα −/+ mice were obtained from Jackson Labs (Bar Harbor, Maine) and genotyped as previously described 14 . All mice were maintained in accordance with an animal protocol approved by the University of Calgary and the Guidelines for Lab Animal Safety (NIH). Mice (age 23–27 days) were anesthetized with isofluorane and euthanized and intact brain tissue obtained from wild-type, heterozygote and CSPα KO mice were fractionated. Briefly, a mouse brain was homogenized in 7 mls of ice cold 0.32 M sucrose, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0.1 mM EDTA and 0.3 mM PMSF with 15 up and down strokes using a Teflon glass homogenizer. The homogenate was centrifuged at 4°C for 7 min at 1, 000 × g and the supernatant (S1) collected. The S1 supernatant was then spun for 15 min at 22, 000 × g and the resulting supernatant (S2) was discarded. The pellet (P2) was washed by re-suspension in the above sucrose solution and then re-centrifuged at 22, 000 × g. The final pellet, representing washed-crude synaptosomes, was re-suspended in 4 ml of sucrose buffer.

Thoracic and abdominal aorta was removed following euthanasia and cleaned of extraneous tissue. Each isolated aorta was then placed in an Eppendorf tube, immediately frozen on dry ice and stored at −80°C. Thawed aortic tissue was minced into small pieces and then disrupted in the tube using a tight-fitting plastic pestle. Tissue pieces were suspended in 0.2–0.3 ml of ice-cold solubilization buffer (10 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM benzamidine, and 5 μg/ml each of leupeptin, aprotinin and pepstatin A) and kept on ice for 45–60 min with occasional mixing. The crude homogenate was then centrifuged at 1000 × g for 5 min at 4°C and the supernatant was collected. Following determination of protein concentration, the soluble fraction was used for Western blot analysis.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija ir skaičiai

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.