Lidamycinas pasižymi labai stipriu citotoksiškumu mielomos ląstelėms ir slopina navikų augimą pelėms acta pharmaologica sinica

Lidamycinas pasižymi labai stipriu citotoksiškumu mielomos ląstelėms ir slopina navikų augimą pelėms acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti lidamycino (LDM) poveikį pelių mielomos ląstelių linijai (SP2 / 0) ir žmogaus daugybinės mielomos ląstelių linijoms (U266 ir SKO-007) ir sudaryti pagrindą naudoti LDM vėžio terapijoje.

Metodai:

Norint nustatyti augimo slopinimo laipsnį, buvo naudojamas 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] 5- [3-karboksimetoksifenil] -2- [4-sulfofenil] 2H -tetrazolio vidinės druskos (MTS) tyrimas. šiame tyrime analizuoti vaistai. Ląstelių ciklo pasiskirstymas ir analizė buvo išmatuoti srauto citometrija, sujungta su propidium jodidu (PI). Poveikis apoptozei buvo matuojamas dažant Hoechst 33342 ir srauto citometrijos metodu, derinant su fluoresceino-izotiocianatų-aneksino V / propidium jodido (FITC-Annexin V / PI) dažymu. Baltymų ekspresija buvo nustatyta atlikus Western blot analizę. In vivo priešnavikinis aktyvumas buvo matuojamas naudojant pelių mielomos modelį BALB / c pelėms.

Rezultatai:

Po gydymo LDM žymiai sumažėjo ląstelių proliferacija. Bendras augimo slopinimas koreliavo su padidėjusia apoptozinių ląstelių mirtimi. LDM sukelta ląstelių apoptozė buvo susijusi su c-Jun-N-galo kinazės (JNK) aktyvacija ir kaspazės-3/7 bei poli (ADP-ribozės) polimerazės (PARP) skaidymu. LDM ryškiai slopino naviko augimą pelių mielomos modelyje.

Išvada:

LDM sukelia apoptozę pelių mielomos SP2 / 0 ląstelėse, taip pat žmogaus mielomos U266 ir SKO-007 ląstelių linijose. Nuolatinis JNK aktyvinimas gali vaidinti lemiamą reikšmę LDM sukeltai apoptozei SP2 / 0 ląstelių linijoje. LDM įrodė reikšmingą priešnavikinį pelių mielomos SP2 / 0 ląstelių poveikį. Apibendrinant, mūsų duomenys suteikia tam tikrų užuominų apie tolesnius LDM poveikio žmogaus daugybinei mielomai tyrimus.

Įvadas

Išsėtinė mieloma (MM) yra tam tikros rūšies kraujo plazmos ląstelės, ty kaulų čiulpų imuninės sistemos ląstelės, gaminančios antikūnus. Gydant šią ligą padaryta nedidelė pažanga, nepaisant dešimtmečius trukusio gydymo skirtingais chemoterapijos režimais, dėl kurių 5 metų išgyvenamumas buvo <10% 1 . Nors didelėmis dozėmis skiriama chemoterapija ir kamieninių ląstelių transplantacija pagerino visiško remisijos laipsnį, kai kurios mielomos ląstelės išvengia gydymo ir todėl beveik visi MM pacientai patiria atkrytį 2 . Tikimasi, kad nauji sukėlėjai galės ilgalaikę ligų kontrolę ar galbūt išgydymą. Dvi naujos vaistų klasės radikaliai pakeitė išsėtinės mielomos valdymą. Thalidomido analogai 3 ir bortezomibo 4, 5 keičia dabartinę antraciklino, vinca alkaloidų ir deksametazono chemoterapijos gydymo paradigmą, po kurios eina autologinė kaulų čiulpų transplantacija.

Plazminių ląstelių mieloma pasireiškia spontaniškai, bet retai C3H, AK, BALB / c 6 ir keliose kitose pelių padermėse. SP2 / 0 pelės mielomos ląstelių linija paprastai naudojama kaip partneris gaminant pelių hibridomą gaminančius monokloninius antikūnus 7 .

Lidamycinas (LDM, iš pradžių pavadintas C-1027) yra enedienų grupės antibiotikų šeima, gauta iš Streptomyces globisporus C1027 padermės 8 . Kaip DNR žalojanti medžiaga, LDM pasižymi tuo, kad skatina didesnį DNR dvigubų stygų pertraukų (DSB) santykį nei vienos grandinės pertraukų (SSB) 9 . Gerai žinoma, kad DSB yra sunkiausias DNR pažeidimas, kuris gali paaiškinti labai stiprų LDM citotoksiškumą vėžio ląstelėms. LDM rodo ypač stiprų citotoksiškumą, antiangiogeninį aktyvumą ir ryškų persodinamų navikų slopinimą pelėms 9, 10, 11 . LDM molekulėje yra enedileno chromoforas ( M r 843 Da), atsakingas už ypač stiprų biologinį aktyvumą, ir nekovalentiškai surištas apoproteinas ( M r 10, 5 kDa), kuris sudaro hidrofobinę kišenę 12 chromoforo apsaugai. Apoproteinas ir chromoforas gali būti atskirti ir atkurti, o atstatytos molekulės biologinis aktyvumas yra panašus į natūralaus LDM 13 .

LDM gali sukelti apoptozę arba mitozinę ląstelių mirtį daugelyje vėžio ląstelių 14, 15 . Naujausi tyrimai parodė, kad LDM sukelia neįprastą DNR pažeidimo reakciją į dvigubų stygų pertraukas 16 . Tai keičia ląstelių ciklo progresą ir sukelia chromosomų aberacijas 17, 18 . Kaip pranešama, priešvėžinį LDM poveikį gali sustiprinti kiti agentai 19 .

Šiuo metu LDM atliekami II fazės klinikiniai tyrimai Kinijoje. Didžioji dauguma tyrimų, kurių tikslas buvo išaiškinti LDM veikimo būdą, buvo atlikti kietose vėžio ląstelėse. Kol kas nėra pranešimų, apibūdinančių LDM poveikį mielomos ląstelėms. Šiame tyrime mes ištyrėme LDM sukelto citotoksiškumo mechanizmus pelių mielomos SP2 / 0 ląstelių linijoje, taip pat žmogaus mielomos ląstelių linijose, įskaitant U266 ir SKO-007. Mes pastebėjome, kad LDM sukėlė apoptozę priklausomai nuo dozės. LDM sukelta apoptozė buvo susijusi su padidėjusia c-Jun NH2 galine kinaze (JNK) ir kaspazės-3/7 bei poli (ADP-ribozės) polimerazės (PARP) skaidymu. JNK aktyvumo slopinimas sumažino LDM sukeltą citotoksiškumą ir apoptozę, o tai rodo, kad JNK vaidino svarbų vaidmenį lemiant LDM sukeltą citotoksiškumą ir apoptozę. Be to, LDM sukėlė G2 / M fazės sustojimą SP2 / 0, U266 ir SKO-007 ląstelių linijose ir slopino auglių augimą BALB / c pelėse. Šie duomenys suteikia tam tikrų užuominų apie tolesnį LDM poveikio žmogaus išsėtinei mielomai tyrimą.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra ir chemikalai

Pelės mielomos SP2 / 0 ląstelės buvo kultivuojamos DMEM (Gibco BRL, Grand Island, NY), o žmogaus MM ląstelių linijos U266 ir SKO-007 buvo kultivuojamos RPMI-1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY), papildyta 10% šilumos. inaktyvuotas vaisiaus vaisiaus serumas („Sigma Chemical Co“, Sent Luisas, Misūris), 100 V / ml penicilino ir 100 μg / ml streptomicino, esant 37 ° C, drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5% CO 2 . SP2 / 0, U266 ir SKO-007 ląstelių linijas maloniai pateikė prof. Bei-fen SHEN (Pekino pagrindinių medicinos mokslų institutas).

LDM dosniai pateikė prof. Lian-fang JIN (Medicininės biotechnologijos institutas, CAMS). LDM pradinis tirpalas (10 μmol / l) buvo paruoštas 0, 9% NaCl ir laikomas -70 ° C. 5-fluorouracilis (5-FU) buvo „Shanghaixudong Pharmaceutical Co, Ltd“, Kinija, produktas. Deksametazonas (DEX) buvo gautas iš Jiangsusuxin Pharmaceutical Co, Ltd, Kinija. Adriamicinas (ADM) ir vinkristinas (VCR) buvo įsigyti iš „Shenzhenwanle Pharmaceutical Co, Ltd“, Kinija. Visos kitos cheminės medžiagos buvo standartinės analitinės klasės.

Vakarų pūtimas

Ląstelės buvo surinktos ir nuplautos PBS tirpalu. Ištisų ląstelių ekstraktai buvo paruošti inkubuojant ląsteles lizės buferyje, kuriame yra 50 mmol / L Tris – HCl, pH 7, 5, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA, 2 mmol / L EGTA, 1 mmol / L ditiotreitolio, 1 % Nonidet P-40, 0, 1% SDS, proteazės inhibitoriai (1 mmol / L PMSF, 5 μg / ml aprotinino, 5 μg / ml leupeptino ir 5 μg / ml pepstatino) ir fosfatazės inhibitoriai (20 mmol / L β-glicerofosfatas), 50 mmol / L NaF ir 1 mmol / L Na 3 VO 4. Ląstelių lizatai išvalomi centrifuguojant 12 000 x g 12 minučių. Baltymų koncentracijos buvo nustatytos Bradfordo tyrimu. Vienodi lizatų kiekiai (40 μg) buvo išspręsta SDS-PAGE ir perkelta į polivinilideno difluorido membraną (Millipore Corp, Bedford, MA). Membranos užblokuojamos TBST, turinčioje 5% neriebaus pieno, kambario temperatūroje 2 valandas ir zonduojamos pirminiais antikūnais per naktį 4 ° C temperatūroje. Tada membranos. buvo apibarstyti tinkamu antriniais antikūnais, susietais su krienų peroksidaze (Santa Cruz Biotechnology). Baltymai buvo vizualizuoti naudojant e nepakitę chemoliuminescenciniai Western blotting aptikimo reagentai (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Piscataway, NJ, USA).

Ląstelių proliferacijos tyrimas

Ląstelių proliferacija buvo nustatyta naudojant CellTiter 96 ® vandeninį neradioaktyvų ląstelių proliferacijos testą (Promega, Madison, WI, JAV) pagal gamintojo protokolą. Trumpai tariant, ląstelės (10 000 ląstelių / duobutėje) buvo pasodintos trimis egzemplioriais 96 šulinėlių plokščio dugno plokštelėse 90 μL kultūrinėje terpėje be jokių priešvėžinių vaistų. Po 2 valandų inkubacijos, trigubai šulinėliai buvo apdoroti priešvėžiniais vaistais (10 μL) įvairiomis koncentracijomis. Ląstelės buvo veikiamos 20 μL tirpalo, turinčio MTS ir PMS (MTS ir PMS santykiu 20: 1) per paskutines 4 valandas 48 valandas trukusias kultūras. Absorbcija buvo nuskaityta 490 nm, naudojant „Microplate Reader“ („Thermo Labsystem“, JAV). Eksperimentai buvo daromi mažiausiai tris kartus, kiekviename eksperimente buvo trys egzemplioriai.

Ląstelių ciklo analizė

Ląstelės buvo surinktos ir pritvirtintos ledo šaltame 70% etanolyje ir laikomos 4 ° C temperatūroje per naktį. Tada mėginiai buvo du kartus plaunami PBS ir vėl suspenduojami PI (50 μg / ml) ir RNazės A (200 μg / ml) tirpale PBS 30 minučių 37 ° C temperatūroje tamsoje. Nudažytos ląstelės buvo filtruojamos per 40 μm marlės, o vienos ląstelės suspensijos buvo analizuojamos naudojant fluorescenciniu būdu aktyvuotą ląstelių rūšiatorių (EPICS, Coulter).

FITC-aneksino V / PI apoptozės tyrimas

Ląstelės buvo surinktos ir pakartotinai suspenduotos 200 µL rišančiame buferyje. Tada buvo pridėta 10 μL FITC pažymėto aneksino V ir 100 ng propidium jodido. Inkubuojant tamsoje (15 min., Kambario temperatūroje arba 30 min. 4 ° C), mėginiai buvo praskiedžiami 300 μL rišančio buferio. Srauto citometrija buvo atlikta naudojant FACScan instrumentą (Becton Dickinson) ir duomenys buvo apdoroti naudojant WinMDI / PC-programinę įrangą.

Dažymas „Hoechst 33342“

SP2 / 0 ląstelės buvo apdorotos kontroline terpe arba LDM įvairiomis koncentracijomis 48 valandas, tada ląstelės buvo surenkamos. Po centrifugavimo ir plovimo PBS, ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu 10 minučių kambario temperatūroje, po to plaunamos PBS. Į fiksuotas ląsteles buvo pridėta Hoechst 33342 (5 μg / ml), ir jie buvo inkubuojami 10 minučių kambario temperatūroje. Tada ląstelės buvo paskleistos ant dangtelių ir pavaizduotos naudojant „Olympus IX-70“ apverstą fluorescencinį mikroskopą.

In vivo terapinis poveikis

Dvidešimt keturios BALB / c pelių patelės (20 ± 2 g, gautos iš Kinijos medicinos mokslų akademijos Eksperimentinių gyvūnų instituto, Pekinas), būdamos 4–6 savaičių, buvo naudojamos SP2 / 0 pelių mielomos izografams. Gyvūnai buvo atsitiktinai suskirstyti į grupes ( n = 6) tokiu būdu, kuris sumažino kūno svorio skirtumą tarp grupių. SP2 / 0 ląstelės (1 × 106), suspenduotos 200 μL PBS, buvo švirkščiamos į poodį BALB / c pelėms. +1 dieną po inokuliacijos pelėms buvo skirtas LDM arba PBS (nešiklio kontrolinis) gydymas. Gydymas LDM arba PBS (tirpiklio kontrolė) buvo atliekamas į veną kartą per savaitę per uodegos veną, iš viso dvi injekcijas. LDM dozės buvo atitinkamai 0, 06, 0, 04 ir 0, 02 mg / kg. Pelės buvo pasvertos ir naviko dydis buvo matuojamas apkaba ir registruojamas kas 3 dienas. Naviko tūris buvo nustatytas pagal formulę (ilgis × plotis 2 ) × 0, 5.

Statistikos analizė

Rezultatai nurodomi kaip vidurkiai ± SD. Gydymo poveikis buvo palygintas naudojant Studento t testą, o skirtumai tarp priemonių buvo laikomi reikšmingais, kai P <0, 05.

Rezultatai

LDM citotoksiškumas SP2 / 0 ląstelėms

Mes ištyrėme LDM augimą slopinantį poveikį SP2 / 0 ląstelių linijoje naudodami MTS testą, kaip aprašyta skyriuje Medžiagos ir metodai. Ląstelės buvo kultivuojamos 48 valandas (1A pav.) Esant LDM esant įvairioms koncentracijoms. Tuo tarpu tyrime taip pat buvo naudojami keli įprasti terapiniai agentai, įskaitant ADM, 5-FU, VCR ir DEX. SP2 / 0 ląstelėms po gydymo vaistais sumažėjo ląstelių proliferacija, ypač ląstelėms, paveiktoms LDM. SP2 / 0 LDM IC50 vertė buvo 0, 5623 ± 0, 0051 nmol / L, mažesnė nei kitų vaistų (ADM, 5-FU, VCR ir DEX) buvo 177, 8 ± 19, 7 nmol / L, 178, 0 ± 22, 5 nmol / L, atitinkamai 275, 0 ± 18, 9 nmol / L ir 155 000 ± 360 nmol / L). Kalbant apie IC50 vertes, LDM citotoksiškumas buvo daug stipresnis nei kitų tirtų vaistų. Ląstelės buvo nurodytą laiką kultivuojamos naudojant LDM (0, 01, 0, 1, 0, 5 ir 1 nmol / L) ir taip pat analizuojamos MTS tyrimu (1B paveikslas). SP2 / 0 ląstelėms, apdorotoms nurodyta LDM doze, sumažėjo ląstelių proliferacija priklausomai nuo laiko. Panašūs rezultatai buvo stebimi U266 ir SKO-007 ląstelių linijose (duomenys nepateikti).

Image

SP2 / 0 ląstelių augimo slopinimas LDM ir kitais vaistais. (A) Ląstelės buvo veikiamos vaistais 48 valandas ir jas nustatė MTS. (B) Ląstelės buvo nurodytą laiką kultivuojamos naudojant LDM (0, 01, 0, 1, 0, 5 ir 1 nmol / L) ir nustatomos MTS. Duomenys gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų. VCR, vinkristinas; 5-FU, 5-fluoruracilas; DEX, deksametazonas; ADM, adriamicinas.

Visas dydis

Apoptozės indukcija LDM SP2 / 0, U266 ir SKO-007 ląstelėse

Toliau mes ištyrėme molekulinius mechanizmus, pagal kuriuos LDM sukelia citotoksiškumą SP2 / 0, U266 ir SKO-007 ląstelėse. Pirmiausia atlikome ląstelių ciklo profiliavimą, naudodami PI dažymą, Hoechst 33342 dažymą ir FITC-Annexin V / PI dažymą trijose ląstelių linijose. Ląstelės buvo kultivuojamos 48 valandas naudojant kontrolinę terpę arba LDM (0, 1, 0, 5, 1 ir 2 nmol / L). PI dažymas parodė, kad LDM sukėlė ląstelių ciklo sustojimą G2 / M fazėje SP2 / 0 ląstelėse. Esant 0, 5 nmol / L LDM, G 2 / M fazės ląstelių skaičius pasiekė piką. Panašūs rezultatai buvo nustatyti U266 ir SKO-007 ląstelių linijose (2 paveikslas).

Image

Ląstelių, apdorotų LDM, ląstelių ciklo analizė. Ląstelės buvo nudažytos PI po 48 val. Veikimo skirtingomis LDM koncentracijomis. Bendros ląstelių populiacijos procentai skirtingose ​​ląstelių ciklo fazėse buvo nustatyti srauto citometrine analize. Kontroliniai G2 / M santykiai, 0, 1 nmol / L LDM ir 0, 5 nmol / L LDM, yra 10, 22%, 66, 69% ​​ir 76, 72% SP2 / 0 ląstelėse; 1, 08%, 13, 96% ir 92, 16% U266 ląstelėse; SKO-007 ląstelėse atitinkamai 12, 12%, 70, 69% ir 79, 55%.

Visas dydis

Dažant Hoechst 33342, neapdorotų ląstelių branduoliai buvo normalios išvaizdos ir parodė difuzinį chromatino dažymą. Po 48 val. Veikimo LDM, dauguma ląstelių pasižymėjo tipiniais morfologiniais pokyčiais, susijusiais su apoptozė, tokiais kaip chromatino kondensacija ar susitraukęs branduolys (3 paveikslas).

Image

Ląstelių apoptozės indukcija LDM SP2 / 0, U266 ir SKO-007 ląstelėse. Ląstelės 48 valandas buvo apdorotos LDM nurodytomis koncentracijomis ir nudažytos DNR rišančiu dažu Hoechest 33342 (x 400). Parodytas vienas trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas.

Visas dydis

FITC-aneksino V / PI dažymas parodė, kad LDM, esant 0, 1 nmol / L, sukėlė ankstesnę apoptozę SP2 / 0 ląstelėse. Apoptozinių ir gyvų ląstelių santykis žymiai padidėjo, kai ląstelės buvo inkubuojamos su 1 arba 2 nmol / L LDM 48 valandas. Tai rodo, kad apoptozė buvo vyraujantis LDM sukeltų ląstelių žūties būdas (4 pav.). Panašūs rezultatai buvo stebimi U266 ir SKO-007 ląstelių linijose (duomenys nepateikti).

Image

Ląstelių apoptozės indukcija, naudojant LDM SP2 / 0 ląstelėse. Ląstelės 48 valandas buvo apdorotos LDM nurodytomis koncentracijomis, po to surinktos ir paženklintos FITC-Anneksiin V ir PI deriniu ir atlikta srauto citometrinė analizė. Kontrolė (1, 70%); 0, 1 nmol / l LDM (14, 66%); 0, 5 nmol / l LDM (18, 36%); 1 nmol / L LDM (43, 65%); 2 nmol / L LDM (82, 88%).

Visas dydis

JNK / kaspazės aktyvavimas LDM sukeltoje apoptozėje SP2 / 0 ląstelėse

Norint nustatyti, ar LDM sukeltas citotoksiškumas yra susijęs su aktyvacija kaspazės ir (arba) PARP, SP2 / 0 ląstelės buvo apdorotos LDM įvairiomis koncentracijomis 48 valandas arba 0, 5 nmol / L LDM skirtingais laiko intervalais. LDM sukėlė kaspazės-3/7 ir PARP skilimą priklausomai nuo dozės ir laiko (5A pav.). Tyrimai parodė, kad JNK aktyvacija vaidina svarbų vaidmenį apoptozėje, kurią sukelia kai kurie priešvėžiniai agentai 20, 21, 22, 23, 24 . Toliau mes ištyrėme, ar LDM ląstelių apoptozės metu skatina JNK fosforilinimą. SP2 / 0 ląstelės buvo apdorotos LDM įvairiomis koncentracijomis 48 valandas arba 0, 5 nmol / L LDM skirtingais laiko intervalais. Mūsų tyrimas parodė, kad LDM stipriai sukėlė JNK fosforilinimą SP2 / 0 ląstelėse, priklausomai nuo dozės ir laiko (5B pav.). Norint nustatyti JNK vaidmenį tarpininkaujant LDM sukeltam citotoksiškumui, SP2 / 0 ląstelės buvo apdorotos LDM skirtingomis koncentracijomis, esant JNK inhibitoriui SP600125 arba jo neturint. Nesant LDM, vien JNK slopinimas reikšmingai nepakeitė ląstelių augimo SP2 / 0 ląstelėse, tuo tarpu SP600125 reikšmingai sumažino LDM sukeltą citotoksiškumą (5C pav.). Atsižvelgiant į sumažintą LDM sukeltą citotoksiškumą, JNK fosforilinimas ir kaspazės-3/7 bei PARP suskaidymas, sukeltas LDM, buvo užblokuotas SP600125 (5D pav.), Patvirtindamas, kad JNK aktyvacija ir kaspazės-3/7 skaidymas. ir PARP yra susijusios su LDM sukelta apoptozė. Šie rezultatai rodo, kad JNK, bent iš dalies, vaidina vaidmenį SP2 / 0 ląstelių apoptozėje, kurią sukėlė LDM.

Image

JNK aktyvacijos poveikis LDM sukeltai apoptozei. (A) Ląstelės buvo kultivuojamos naudojant LDM skirtingose ​​koncentracijose 48 valandas, po to lizuojamos ir atliktos Western blot analizės, naudojant anti-kaspazės-3, anti-kaspazės-7 ir anti-PARP bei anti-aktino antikūnus. Parodytas vienas trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. (B) Ląstelės nurodytais laikotarpiais buvo kultivuojamos naudojant LDM (0, 5 nmol / L), po to lizuojamos ir atliktos Western blot analizės, naudojant anti-p-JNK, anti-JNK ir anti-Actin antikūnus. Parodytas vienas trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. (C) Ląstelės buvo kultivuojamos 48 valandas naudojant kontrolinę terpę arba atitinkamai esant 0, 001 nmol / L, 0, 01 nmol / L, 0, 1 nmol / L ir 1 nmol / L LDM, esant arba ne SP600125 (10 μmol / L) ir nustatoma pagal MTS analizę. Duomenys parodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkius ± SD. (D) Ląstelės buvo kultivuojamos naudojant LDM (0, 5 nmol / L) 48 valandas, esant arba nesant SP600125 (10 μmol / L). Tada ląstelės lizuojamos ir atliktos Western blot analizės, naudojant anti-p-JNK, anti-PARP, anti-kaspazės-3, anti-kaspazės-7 ir anti-aktino antikūnus. Parodytas vienas trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. Kaspa, kaspazė; CF, suskaidytas fragmentas.

Visas dydis

SP2 / 0 mielomos naviko augimo slopinimas

Toliau siekėme išsiaiškinti, ar LDM slopina SP2 / 0 mielomos naviko augimą BALB / c pelėms. SP2 / 0 ląstelės (1 × 106), suspenduotos 200 μL PBS, buvo švirkščiamos į poodį dešiniajame BALB / c pelių ašyje. Gydymas buvo pradėtas +1 dieną po ląstelių inokuliacijos. LDM buvo švirkščiamas į veną 0, 06 mg / kg, 0, 04 mg / kg arba 0, 02 mg / kg dozėmis per kaukolės veną. +8 dieną LDM buvo duotas antrą kartą. Kontrolinėms pelėms buvo duotas tik PBS tirpiklis. Norint apskaičiuoti naviko tūrį, kas 3 dienas buvo imami statmeno skersmens serijinio apkabos matmenys. Vartojant LDM reikšmingai sumažėjo SP2 / 0 mielomos naviko augimas, palyginti su kontroliniais gyvūnais, kurie buvo gydomi tik PBS nešikliu. Palyginus naviko tūrį 20 dieną po naviko implantacijos, statistiškai reikšmingai skyrėsi skirtumai tarp grupių ir paaiškėjo žymiai mažesni naviko tūriai LDM gydytų grupių, palyginti su kontroline grupe. Gydymas LDM 0, 06 mg / kg, 0, 04 mg / kg ir 0, 02 mg / kg dozėmis slopino SP2 / 0 mielomos augimą atitinkamai 92, 1%, 74, 6% ir 35, 9%. 35 dieną po naviko implantavimo BALB / c pelės buvo paaukotos dėl gimdos kaklelio išnirimo, augliai buvo kruopščiai paimti ir pasverti. Palyginus naviko svorį, taip pat paaiškėjo, kad mažesnis naviko svoris LDM gydomose grupėse, palyginti su kontroline grupe. Nebuvo pastebimo kūno svorio sumažėjimo gydomose grupėse, palyginti su kontroline grupe. Visi gyvūnai išgyveno eksperimento laiką (6 paveikslas).

Image

LDM poveikis SP2 / 0 mielomos augimui BALB / c pelėms. SP2 / 0 ląstelės buvo subkutuojamos į poodį BALB / c pelių dešiniajame ašiliariniame regione. Dvidešimt keturias valandas po ląstelių užkrėtimo pelėms buvo švirkščiama į veną atitinkamai PBS, 0, 02 mg / kg LDM, 0, 04 mg / kg LDM ir 0, 06 mg / kg LDM. Antroji injekcija buvo atlikta po septynių dienų. Naviko tūris buvo stebimas kas 3 dienas 5 savaites.

Visas dydis

Diskusija

Nepaisant naujų gydymo būdų atsiradimo pastaraisiais metais, išsėtinė mieloma vis dar yra nepagydoma liga. Tai būdinga piktybinių plazminių ląstelių, esančių daugiausia kaulų čiulpuose, buvimui. Esamas gydymas daugiausia siekia sumažinti piktybinių ląstelių masę ir įveikti su liga susijusias komplikacijas. Nors pirminis chemoterapinis gydymas gali būti sėkmingas, ligos progresavimo metu dažnai atsiranda atsparumas vaistams, todėl reikia vartoti alternatyvius vaistus. Per pastaruosius kelerius metus reikšminga įžvalga apie mielomos ląstelių įvairių signalo perdavimo būdų disreguliaciją lėmė naujų sukėlėjų atsiradimą.

Šiuo metu klinikinių tyrimų metu LDM vertinamas kaip galimas priešvėžinis agentas Kinijoje. Jo veikimo būdas yra sudėtingas. Didžioji dauguma tyrimų, kurių tikslas buvo išaiškinti LDM veikimo būdą, buvo atlikti kietose naviko ląstelėse. Nei vienas tyrimas neištyrė šio vaisto poveikio mielomos ląstelėms. Šiame tyrime LDM parodė labai stiprų citotoksiškumą SP2 / 0 ląstelėse. SPM / 0 LDM IC50 vertė buvo 0, 56 nmol / L, daug mažesnė nei ADM, 5-FU, VCR ir DEX. Apoptozės greičio padidėjimas pastebėtas po inkubacijos SP2 / 0, U266 ir SKO-007 ląstelėse, kurių LDM buvo nuo 0, 1 iki 2 nmol / L, ir ląstelės pasižymėjo tipiškomis apoptozinėmis savybėmis, įskaitant ląstelių morfologinius pokyčius ir chromatino kondensaciją. Be to, LDM sukeltas ląstelių ciklas sustoja G 2 / M fazėje. LDM sukelta apoptozė gali būti susijusi su tam tikrais molekuliniais pokyčiais, apimančiais kaspazės-3/7 ir PARP skilimą.

Visi šie rezultatai aiškiai rodo, kad LDM sukelia nuo kaspazės priklausomą apoptozę SP2 / 0 ląstelėse. Kaip pranešama, JNK vaidina lemiamą vaidmenį apoptozėje, kurią sukelia nauji terapiniai agentai, įskaitant bortezomibo, perifozino ir lizofosfatidinės rūgšties aciltransferazės-β inhibitorius 20, 21, 22, 23 . Be to, nuolatinis JNK aktyvavimas vaidina lemiamą vaidmenį arseno trioksido sukeltos ląstelių apoptozės metu daugybinėse mielomos ląstelių linijose 24 . Įrodyta, kad JNK kelio aktyvinimas yra dažnas streso sukeltos apoptozės reiškinys, reaguojant į streso dirgiklius, tokius kaip UV šviesa, šilumos šokas ir jonizuojančioji spinduliuotė 25 . Be to, JNK kelią suaktyvina tarpląsteliniai stresai, tokie kaip baltymų sintezės slopinimas, DNR pažeidimas ir gydymas priešvėžiniais preparatais 25, 26, 27, 28 . Aktyvuoto JNK vaidmuo LDM sukeltoje apoptozėje vis dėlto turi būti išaiškintas. Šiame tyrime mes ištyrėme LDM sukeltą JNK fosforilinimą mielomos ląstelių apoptozės metu ir ryšį tarp LDM sukeltos apoptozės ir JNK aktyvacijos laipsnio.

Ląstelių, apdorotų įvairiomis LDM koncentracijomis, analizė skirtingais laiko momentais parodė, kad norint palaikyti LDM sukeltą SP2 / 0 ląstelių apoptozę, reikia nuolatinio JNK aktyvavimo. Kaip ir tikėtasi, JNK inhibitorius SP600125 blokuoja kaspazės-3/7 ir PARP skilimą bei citotoksiškumą. Visi šie rezultatai rodo, kad JNK vaidina svarbų vaidmenį atliekant LDM sukeltą SP2 / 0 ląstelių apoptozę. JNK stimuliuojama apoptozė gali apimti Baxą ir Baką, kurie yra būtini JNK reguliuojamai apoptozei.

Pelių 5T33MM mielomos modelis ir pelių SP2 / 0 mielomos modelis naudojami tiriant priešnavikinių vaistų poveikį in vivo 29, 30 . Pelių 5T33MM mielomos modelis naudojamas dažnai. Mūsų tyrime LDM yra gerai toleruojamas ir labai efektyvus in vivo pelių SP2 / 0 mielomos modelyje. Tai rodo reikšmingas naviko augimo slopinimas pelėms, gydomoms 0, 06 mg / kg, 0, 04 mg / kg arba 0, 02 mg / kg LDM vieną kartą. per dvi savaites, švirkščiama per kaukolės veną. Šie rezultatai kartu su gyvūnams gerai toleruojamomis efektyviosiomis dozėmis sudaro pagrindą tolesniems žmogaus išsėtinės mielomos LDM gydymo tyrimams.

Autoriaus indėlis

Yong-Zhanas Zhenas sukūrė ir atliko tyrimus bei parašė darbą; Ya-jun LIN atliko tyrimus; Yi LI atliko tyrimus; Yong-su ZHEN sukurti tyrimai.

Santrumpos

LDM, lidamycinas; VCR, vinkristinas; 5-FU, 5-fluoruracilas; DEX, deksametazonas; ADM, adriamicinas; PI, propidium jodidas; JNK, c-Jun N-galo kinazė; DMSO, dimetilsulfoksidas; FITC, fluoresceino izotiocianatas; PARP, poli (ADP-ribozės) polimerazė; CF, suskaidytas fragmentas; Kaspa, kaspazė; MM, išsėtinė mieloma; MTS, 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] 5- [3-karboksimetoksifenil] -2- [4-sulfofenil] 2H -tetrazololio vidinė druska; PMS, fenazino metosulfatas.