Vien limmo faktorius lmo4 reguliuoja bmp7 geno raišką per hdac2 priklausomą mechanizmą ir kontroliuoja ląstelių proliferaciją ir pieno epitelio ląstelių apoptozę | onkogenas

Vien limmo faktorius lmo4 reguliuoja bmp7 geno raišką per hdac2 priklausomą mechanizmą ir kontroliuoja ląstelių proliferaciją ir pieno epitelio ląstelių apoptozę | onkogenas

Anonim

Anotacija

Branduolinis tik baltymas 4 (LMO4) yra sureguliuotas sergant krūties vėžiu, ypač estrogeno receptorių neigiamais navikais, o jo per didelis ekspresas pelėse sukelia hiperplaziją ir naviko formavimąsi. Čia parodyta, kad LMO4 išbraukimas iš pelių pieno liaukų sukelia sutrikusią lobuloalveolių plėtrą dėl sumažėjusio epitelio ląstelių proliferacijos. Siekdami atrasti potencialius LMO4 taikinius turinčius genus, mes taip pat sukūrėme sąlyginės ekspresijos sistemą MCF-7 ląstelėse tiek LMO4, tiek dominuojančiai neigiamajai (DN) formai, kuri yra jo reguliatorius, LIM domenų kofaktorius (Clim / Ldb / Nli). ). Tada mes panaudojome DNR mikrotraumus, kad nustatytume genus, reaguojančius į LMO4 ir DN-Clim padidėjusį reguliavimą. Vienas iš abiejuose duomenų rinkiniuose esančių genų buvo kaulų morfogeninis baltymas 7 ( BMP7) , kurio išraiška taip pat reikšmingai koreliuoja su LMO4 transkripto lygiais dideliame duomenų apie žmogaus krūties vėžį rinkinyje, kas rodo, kad BMP7 yra bona fide tikslinis LMO4 genas krūtyje. vėžys. BMP7 slopinimas iš dalies blokuoja LMO4 poveikį apoptozei, nurodydamas, kad BMP7 tarpininkauja bent kai kuriose LMO4 funkcijose. Genų perkėlimo tyrimai rodo, kad LMO4 reguliuoja BMP7 promotorių, o chromatino imunoprecipitacijos tyrimai rodo, kad LMO4 ir jo kofaktorius Clim2 yra įdarbinami į BMP7 promotorių. Be to, mes parodome, kad HDAC2 verbavimąsi prie BMP7 promotoriaus slopina padidėjęs LMO4 reguliavimas ir kad HDAC2 numušimas padidina promotoriaus reguliavimą. Šie tyrimai rodo naują LMO4 veikimo mechanizmą: LMO4, Clim2 ir HDAC2 yra transkripcijos komplekso dalis, o padidėjęs LMO4 lygis gali sutrikdyti kompleksą, dėl kurio sumažėja HDAC2 įdarbinimas ir padidėja promotoriaus aktyvumas.

Įvadas

Tik limito baltymas 4 (LMO4) priklauso keturių žinduolių branduolinių LMO šeimai, kuriai būdingi du tandemo LIM domenai ir nėra jokių kitų funkcinių domenų (Bach, 2000). LIM domenai tarpininkauja baltymų ir baltymų sąveikai, o visi branduoliniai MTO su dideliu afinitetu jungiasi prie LIM domenus (Clim) / LIM domenus jungiančio baltymo (Ldb) / branduolinių LIM interakcionierių (Nli), transkripcinį kofaktorių, kurie padidina LIM homeodomenų faktorių ir kai kurie kiti DNR surišantys baltymai (Bach, 2000). Siūloma, kad MTO veiktų kaip transkripcijos aktyvatoriai, įdarbindami klijus prie DNR jungiančių baltymų. LMO taip pat gali slopinti LIM homeodomeno funkciją, išstumdami Clim iš LIM homeodomain baltymų (Milan et al., 1998). Neseniai chromatiną modifikuojantys transkripcijos kofaktoriai, įskaitant HDAC, buvo identifikuoti kaip LMO4 interaktoriai (Singh ir kt., 2005).

MTO vaidina svarbų vaidmenį žinduolių vystymosi keliuose, o jų raiškos panaikinimas yra susijęs su onkogeneze (Rabbitts et al., 1999). LMO4 buvo susijęs su krūties vėžio (Sum et al., 2005b), burnos ertmės plokščialąstelinių karcinomų (Mizunuma ir kt., 2003) ir pirminio prostatos vėžio priežastimi ar progresavimu (Mousses ir kt., 2002). LMO4 genas yra labiausiai ekspresuojamas pieno epitelio ląstelėse nėštumo vidurio metu (Wang ir kt., 2004) - aktyvaus proliferacijos ir invazijos stadijoje; trukdymas baltymui (Wang et al., 2004) arba geno trynimas (Sum et al., 2005c) lemia sutrikusią pieno liaukos vystymąsi lobuloalveoliniu būdu. LMO4 yra per daug ekspresuojamas daugiau nei pusės pirminio krūties vėžio atvejais ir jo išraiška yra susijusi su blogesne prognoze (Visvader et al., 2001; Sum et al., 2005b). Be to, per didelis LMO4 ekspresija pelių pieno liaukoje sukelia hiperplaziją ir intraepitelinę neoplaziją (Sum et al., 2005b). Be to, LMG4 geną suaktyvina heregulinas (Wang ir kt., 2004) ir yra per daug ekspresuojamas Her2 sukeltuose navikuose (Landis ir kt., 2005). Šie stebėjimai kartu parodo, kad LMO4 turi kritinių funkcijų pieno epitelio ląstelėse.

Nors naujausi tyrimai rodo, kad LMO4 skatina normalų vystymąsi ir naviko susidarymą pieno liaukoje, molekuliniai mechanizmai, kuriais grindžiamas šis poveikis, išlieka nežinomi. Šiame tyrime mes nustatome kaulų morfogeninį baltymą 7 ( BMP7 ) kaip tikslinį LMO4 geną krūties vėžio ląstelėse. Mes parodome, kad LMO4 asocijuojasi su BMP7 promotoriumi ir kad LMO4 lygio pokyčiai gali reguliuoti histono deacetilazės HDAC2 pritraukimą į šį promotorių. Mūsų tyrimai nustatė naują LMO4 transkripcijos mechanizmą, kuriame jis suaktyvina transkripciją mažindamas HDAC2 įdarbinimą į BMP7 promotorių.

Rezultatai

Dėl LMO4 pašalinimo sumažėja pieno epitelio ląstelių proliferacija ir sutrinka lobuloalveolių vystymasis.

Pelės iš LMO4 išmušimo metu miršta embriogenezės metu ar gimdamos (Hahm ir kt., 2004; Lee ir kt., 2005; Sum ir kt., 2005c), neleidžiant jų naudoti tiriant LMO4 vaidmenį pogimdyminėse pieno liaukose. Todėl mes suklasifikavome transmisines LMO4 pelių (Lee ir kt., 2005) su išrūgų rūgštinio baltymo (WAP) (Wagner ir kt., 1997) ir pelių pieno navikų viruso (MMTV) (Wagner ir kt., 1997) transgenais. pelėms, norint pasiekti dviejų rūšių Cre rekombinazės tarpininkaujamą LMO4 geno deleciją pelių pieno liaukose (papildomas paveikslas S1). Norint ištirti LMO4 delecijos poveikį pieno liaukų vystymuisi, buvo naudojamas viso sąnario ir histologinis tyrimas. WAP -Cre-LMO4 fl / fl pieno liaukų lobuloalveolinės struktūros sumažėjo 13, 5 ir 17, 5 nėštumo dienomis bei pirmąją laktacijos dieną (1a pav.). MMTV -Cre-LMO4 fl / fl pelėms buvo nustatytas ryškus lobuloalveolinio vystymosi sutrikimas jau 5, 5 nėštumo dienos (1b paveikslas, viršutinės plokštės). Duktular augimo sumažėjimas taip pat pastebėtas 3 savaičių amžiaus MMTV -Cre-LMO4 fl / fl grynosiose pelėse (papildomas S2 paveikslas). Dėl sutrikusio lobuloalveolinio išsivystymo, LMO4 nokautuojančių motinų auklėms nustatyta, kad žymiai sumažėjęs svorio padidėjimas (papildomas paveikslas S3). Šie tyrimai kartu rodo, kad LMO4 yra pieno liaukų vystymosi moduliatorius.

Image

Pelių pieno liaukose pašalinus LMO4 geną, sumažėja pieno epitelio ląstelių proliferacija ir sutrinka lobuloalveolių vystymasis. a ) Viso sudėjimo (pirmosios dvi kolonėlės) ir histologinės analizės (paskutinės dvi kolonėlės, x 100 padidinimas) ketvirtosios kirkšnies pieno liaukos iš WAP- Cre - LMO4 fl / fl pelių ir jų kontrolinės dalies ( WAP- Cre - LMO4 fl / + ). b ) MMTV- Cre - LMO4 fl / fl pelių ketvirtosios kirkšnies pieno liaukos ir jų kontrolinės dalies (MMTV- Cre - LMO4 fl / ) viso kūno (pirmosios dvi stulpeliai) ir histologinės analizės (paskutinės dvi kolonėlės, x 100 padidinimas) + ). Ki67 teigiamų ląstelių kiekybinis įvertinimas pelėse WAP - Cre - LMO4 fl / fl ( c ) ir MMTV- Cre - LMO4 fl / fl ( d ) kartu su jų kontrole iš nurodytų stadijų; 500 ląstelių buvo suskaičiuotos mažiausiai trijose laukinio tipo ir išmušimo pelėse. KO, nokautas; L, laktacija; Preg, nėštumas; CTL, kontrolė.

Visas dydis

Norėdami nustatyti sumažėjusio lobuloalveolinio išsivystymo priežastis pelėms iš LMO4 , ištyrėme pieno epitelio ląstelių proliferaciją, naudodamos imunopiliejimą Ki67 . Įprastoje pieno liaukoje proliferacijos žymeklio Ki67 ekspresija būna didžiausia nėštumo metu, o pirmąją laktacijos dieną yra nedaug teigiamų ląstelių. Žindymo epitelio ląstelių proliferacija 13, 5 ir 17, 5 nėštumo dienomis sumažėjo maždaug 50% tiek MMTV- Cre - LMO4 fl / fl , tiek WAP- Cre - LMO4 fl / fl pelėse (1c ir d paveikslai). Nors 13.5 dieną WAP- Cre - LMO4 fl / fl pelėse aptikome pieno epitelio ląstelių apoptozės padidėjimą (duomenys nepateikti), MMTV- Cre - LMO4 fl / fl pelėse apoptozė nepadidėjo, todėl mes padarėme išvadą kad sumažėjęs epitelio ląstelių proliferacija yra pagrindinė sumažėjusio lobuloalveolinio vystymosi priežastis pelėms, kurioms išmušama ląstelė LMO4 . Šie duomenys papildo ankstesnius tyrimus (Wang ir kt., 2004; Sum ir kt., 2005c), kuriuose nurodomas LMO4 genas lobuloalveoliniame vystymesi, parodant nuoseklius dviejų tipų pieno liaukų nokautų fenotipus ir parodant, kad LMO4 veikia jau dieną. 5, 5 nėščiosios pieno liaukoje.

LMO4 padidina MCF-7 krūties vėžio ląstelių apoptozę

Norėdami pradėti tirti LMO4 poveikį krūties vėžiui, pasirinkome žmogaus MCF-7 krūties vėžio ląstelių liniją, kad būtų sukurta indukuojama LMO4 ekspresijos sistema; MCF-7 ląstelės turi žemą LMO4 lygį (Wang ir kt., 2004). Mes panaudojome „Tet-off“ sistemą, norėdami sukurti kelis skirtingus MCF-7 ląstelių klonus, vadinamus MCF7-LMO4-TetOff ląstelėmis, kuriuose „Myc“ pažymėto LMO4 ekspresija buvo slopinama dėl doksiciklino buvimo terpėje (2a paveikslas). . Sukeltas LMO4 lygis yra panašus į LMO4 ekspresijos lygį, rastą T47D krūties vėžio ląstelėse (duomenys nepateikti). Pirmiausia apibūdinome LMO4 poveikį proliferacijai ir neradome jokio reikšmingo LMO4 padidėjimo įtakos ląstelių skaičiui (duomenys nepateikti). Tada mes ištyrėme, ar LMO4 ekspresija paveikė apoptozę MCF-7 ląstelėse. Doksiciklino pašalinimas žymiai padidino apoptozę MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse, o ląstelėse perneštose ląstelėse jokio efekto nepastebėta (2b paveikslas, kairysis skydelis). Laiku vykstančiuose eksperimentuose LMO4 padidino apoptozę priklausomai nuo laiko (2b paveikslas, dešinė panelė). Remiantis apoptozės tyrimo rezultatais, FACS analizė nustatė nedidelį aneksino V dažymo dažų padidėjimą, taip pat daugiau aneksino V teigiamų negyvų ląstelių padidėjimą, kai nebuvo doksiciklino (padidėjo LMO4) nei esant doksiciklinui (mažai LMO4) ( 2c pav.). Be to, padidėjusi LMO4 ekspresija padidino suskaidytos kaspazės-7 kiekį, kaip nustatyta Western blot analizėje su antikūnais prieš neišvalytą ir suskaidytą kaspazę-7 (2d paveikslas, kairysis skydelis). Kai MCF7-LMO4-TetOff ląstelės buvo apdorotos bendru kaspazės inhibitoriumi Z-VAD-FMZ, LMO4 nesugebėjo sukelti apoptozės, nurodydamas, kad procesas priklausė nuo kaspazės (2d paveikslas, dešinė panelė). LMO4 poveikis apoptozei neapsiriboja MCF7 ląstelėmis, nes panašus apoptozės padidėjimas pastebėtas žmogaus pieno epitelio ląstelėse (HMEC), perduodamose su retrovirusais, ekspresuojančiais LMO4 (papildomas S4 pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad padidėjęs LMO4 reguliavimas gali sukelti nuo kaspazės priklausomą apoptozę krūties vėžio ląstelėse.

Image

LMO4 ekspresija padidina apoptozę MCF-7 ląstelėse. ( a ) LMO4 ekspresijos Western blot analizė trijuose skirtinguose MCF7-LMO4-TetOff ląstelių klonuose, L1–3. Iš ląstelių, apdorotų (+) ir be (-) doksiciklino, ekstraktai buvo tiriami antikūnu, kad būtų galima aptikti Myc pažymėtą LMO4 (viršutinė plokštė) ir GAPDH (apatinė panelė). ( b ) Kairiajame skydelyje MCF7-LMO4-TetOff ląstelės ir MCF-7 ląstelės, perkeltos vien tik su vektoriu, buvo gydomos (užpildytomis juostomis) ir be (atvirų juostų) doksiciklino 6 dienas. Dešiniajame skydelyje parodytas laiko tėkmės tyrimas, kurio metu MCF7-LMO4-TetOff ląstelės (atviros juostos) ir MCF-7 ląstelės, perkeltos tuščiu vektoriu (užpildytos juostos), buvo nurodytą laiką apdorotos doksiciklinu ir be jo. Praturtėjimo koeficientas yra apoptozės santykis ląstelėse, išaugintose be DOX, ir apoptozės santykis atitinkamose kontrolinėse ląstelėse, išaugintose esant DOX. ( c ) MCF7-LMO4-TetOff ląstelės buvo auginamos, esant doksiciklinui, o jo nebuvo 6 dienas, ir analizuojamos dažant propidum jodidą / aneksiną-V-FITC. Skaičiai dešinėje apačioje ir viršutinėje kiekvieno skydelio pusėje rodo atitinkamai ankstyvųjų ir vėlyvųjų apoptozinių ląstelių procentinę dalį. ( d ) Kairiajame skydelyje MCF7-LMO4-TetOff ląstelės 6 dienas buvo gydomos (+) ir be (-) doksiciklino. Ląstelių lizatai buvo analizuojami kaspazės-7 ir suskaidytų kaspazės-7 antikūnais. Dešiniajame skydelyje MCF7-LMO4-TetOff ląstelės buvo gydomos (užpildytomis juostomis) ir be (atvirų juostų) doksiciklinu 4 dienas, naudojant nešiklį arba kaspazės inhibitorių Z-VAD-FMK. Kiekybiniai duomenys ( b ir d ) rodo mažiausiai trijų skirtingų bandymų vidurkį ir vertę.

Visas dydis

Į LMO4 reaguojančių genų identifikavimas

Norėdami identifikuoti į LMO4 reaguojančius genus, mes suklasifikavome genų ekspresiją trijuose skirtinguose MCF7-LMO4-TetOff ląstelių klonuose, esant doksiciklinui (mažas LMO4) ir jo neturint (padidėjęs LMO4) (2a pav.). Naudodami ribinę vertę P <0, 01 (Baldi ir Long, 2001), mes nustatėme, kad iš beveik 18 000 išreikštų zondo rinkinių tik 111 ir 98 buvo atitinkamai sureguliuoti ir sureguliuoti (3a pav.). Tarp diferencijuotai išreikštų genų, apoptozė yra vienintelė genų ontologijos biologinio proceso kategorija, kuri yra žymiai praturtinta ( P = 0, 006; Dennis ir kt., 2003), atitinkanti biologinius duomenis 2 paveiksle.

Image

LMO4 taikinių genų identifikavimas. a ) Duomenų, skirtų mikrorajono geno ekspresijos profiliavimo eksperimentams MCF-7 ląstelėse su indukuojama LMO4 ir DN-Clim ekspresija, apdorojimo apžvalga. b ) Kiekybinis realaus laiko PGR patvirtinimas LMO4 mikrotraumų duomenims. c ) Apoptozės slopinimas MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse follistatino ir estradiolio dėka. Iš MCF7-LMO4-TetOff ląstelių kultūrų buvo pašalintas doksiciklinas, o po 3 dienų pridedama follistatino (250 ng / ml) arba estradiolio (20 n M). Rezultatai rodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį ir sem. ( d ) LMO4 transkripto lygiai, parodyti kaip 2-osios loginės bazės transformuotos RMA (tvirta daugialypės terpės vidurkis) normalizuotos ekspresijos lygiai ankstesniame 49 atskirų krūties vėžio mėginių mikrorajono tyrime (Farmer et al., 2005). Pertrauktos vertikalios linijos atskiria tris šiame tyrime apibrėžtus naviko potipius: A; apokrinas, B; bazinis ir L; liumenas. e ) kairiajame skydelyje parodyta koreliacija tarp LMO4 ir BMP7 ekspresijos lygių krūties navikuose. „Pearson“ produkto momento koreliacijos koeficientas r , neužfiksuotoms RMA reikšmėms yra 0, 69. Dešinysis skydelis rodo koreliacijos koeficientų pasiskirstymą tarp LMO4 išraiškos ir kiekvieno zondo, nustatyto Affymetrix HG-U133A masyve, visiems krūties navikams. Raudona rodyklė, zondas nustatytas BMP7. Juoda rodyklė, kitas zondas, skirtas LMO4.

Visas dydis

LMO baltymams trūksta DNR surišančių domenų ir jie reguliuoja genų ekspresiją bent dviem skirtingais mechanizmais (Bach, 2000). Pirmiausia, LMO gali įdarbinti LIM domeno transkripcijos kofaktorius Clim / Ldb / Nli į DNR jungiančius baltymus genų reguliavimo regionuose ir taip suaktyvinti transkripciją. Antra, LMO gali veikti kaip DN molekulės ir slopinti transkripciją, sekvestruodamos Klimus nuo DNR jungiančių baltymų. Kadangi abu LMO veikimo modeliai yra pagrįsti sąveika su Clims, mes pagrįstai nusprendėme, kad įsikišimas į Clim funkciją MCF-7 ląstelėse padėtų nustatyti bona fide į LMO4 reaguojančius genus. Todėl mes taip pat sukūrėme MCF7-DN-Clim-TetOff ląstelių linijas, kuriose, pašalinus doksicikliną, sukeliama Myc-pažymėto dominuojančio neigiamo (DN) Clim baltymo ekspresija (papildomas paveikslas S5). DN-Clim baltymas yra sudarytas iš C-galinio domeno, atsakingo už sąveiką su LIM domenais ir kitais DNR jungiančiais baltymais, tačiau jam trūksta N-galo, kuris yra būtinas dimerizacijai ir transaktyvacijai (Jurata ir kt., 1998). Todėl DN-Clim blokuoja produktyvią LMO4 ir Clims sąveiką.

Tada mes atlikome mikrotraumos analizę MCF7-DN-Clim-TetOff ląstelėse, palygindami ekspresijos profilius kontrolinėmis sąlygomis su ląstelėmis, ekspresuojančiomis DN-Clim (3a pav.); mes taip pat nustatėme apoptozės kategorijos praturtėjimą ( P = 0, 049) diferencijuotai išreikštuose genuose. Įdomu tai, kad abu genai buvo reikšmingai diferencijuoti ( P <0, 01) tiek LMO4, tiek DN-Clim: BMP7, GAS5 ir LIN7A. Visi trys genai buvo pakeisti ta pačia kryptimi abiejose ląstelių linijose, o tai rodo, kad MCF-7 ląstelėse LMO4 padidėja reguliavimo funkcija, nutraukiant Clim turinčius transkripcijos kompleksus šiuose reaguojančiuose genuose. Tai panašu į Drosophila sparną, kur LMO4 reguliavimas ir DN-Clim turi panašų poveikį (Milan ir kt., 1998). Kelių į LMO4 reaguojančių genų, įskaitant BMP7, mikrotraumos rezultatus patvirtino kiekybiniu realaus laiko PGR metodu (3b pav.). Doksiciklinas neturėjo įtakos šių genų ekspresijai ląstelių klonuose, transfekuotuose vien tik su vektoriais (neparodyta). Pateikiami išsamūs LMO4 ir DN-Clim diferencijuotai išreikštų genų sąrašai, kurių ribos P <0, 05 (atitinkamai, S6 ir S7 paveikslai). Visus pirminius mikrotraumų duomenis galima rasti tinklalapyje www.ncbi.nlm.nih.gov/geo (GSE7382).

Tolesniam tyrimui pasirinkome BMP7, nes BMP7 tarpininkauja epitelio – mezenchiminio signalo perdavimui (Dean ir kt., 2004), epitelio ląstelių apoptozė ir proliferacija keliose skirtingose ​​organų sistemose (Luo ir kt., 1995; Monroe ir kt., 2000). Remdamiesi šiais stebėjimais, mes nustatėme, kad BMP7 gali sumažinti normalių ir vėžinių pieno epitelio ląstelių proliferaciją ir padidinti apoptozę (papildomas paveikslas S8). Be to, follistatinas, kuris yra BMP5-7 poklasio inhibitorius (Augsburger et al., 1999), sumažino MCF7 ląstelių LMO4 sukeltą apoptozę (3c paveikslas), nurodydamas, kad LMO4 stimuliuojama apoptozė bent iš dalies yra tarpininkaujama BMP. Įrodyta, kad estradiolis slopina BMP7 ir jo receptorių ActRIIB įvairiose į hormonus reaguojančiose epitelio ląstelėse (Kusumegi ir kt., 2004). Iš tikrųjų estradiolis slopina apoptozę reprodukcinės epitelio epitelinėse ląstelėse slopindamas BMP7 signalus (Monroe et al., 2000). Įdomu tai, kad estradiolis visiškai slopino LMO4 tarpininkaujamą apoptozę MCF7 ląstelėse (3c paveikslas). Kartu su BMP7 ir gydymo folistatinu eksperimentų rezultatai rodo, kad BMP7 yra tarpininkas kandidatas į LMO4 poveikį pieno epitelio ląstelėse.

Norėdami ištirti, ar yra ryšys tarp LMO4 ir BMP7 lygio žmogaus krūties vėžyje, išanalizavome pirminio krūties vėžio išraiškos profiliavimo tyrimą (Farmer ir kt., 2005). Remiantis ankstesne ataskaita, rodančia ryšį tarp aukštos LMO4 ekspresijos ir ER neigiamos navikų būklės (Gruvberger ir kt., 2001), vidutinis LMO4 ekspresijos lygis yra žymiai didesnis (2, 21 karto; P <0, 0001) baziniame nei luminaliniame. navikai (3d pav.). Be to, yra stiprus ryšys ( r = 0, 69) tarp visų navikų potipių LMO4 ir BMP7 ekspresijos lygių (3e paveikslas, kairysis skydelis). Koreliacijos koeficientų pasiskirstymas tarp LMO4 išraiškos ir kiekvieno zondo, nustatyto Affymetrix masyve, tarp visų krūties navikų rodo, kad BMP7 turi vieną iš didžiausių koreliacijos koeficientų ir yra reikšmingai ( P <0, 0001) koreliuojamas (3e pav., Dešinė panelė). Kaip ir tikėtasi, aukščiausias koreliacijos koeficientas yra kitam LMO4 zondo rinkiniui (3e paveikslas, dešinė plokštė). Šie rezultatai rodo, kad LMO4 gali reguliuoti BMP7 ekspresiją krūties vėžio ląstelėse.

BMP7 genas yra tiesioginis LMO4 taikinys

Norėdami ištirti, ar LMO4 tiesiogiai reguliuoja BMP7 geną, mes klonavome 1, 9 kb BMP7 geno proksimalinio 5 ′ kraštinės srities (Kawai ir Sugiura, 2001) prieš luciferazę (pGL3-1.9BMP7). LMO4 sugebėjo padidinti liuciferazės aktyvumą net aštuonis kartus (4a paveikslas, kairysis skydelis). Šis poveikis buvo specifinis, nes LMO4 neturėjo jokio poveikio nesusijusios GAL-TK-luciferazės plazmidės ekspresijai (duomenys nepateikti). Tolesnis specifiškumas buvo įrodytas tiriant LMO4 poveikį pGL3-1.9BMP7 plazmidės 5 'delecijos mutantams (4a paveikslas, dešinė panelė). LMO4 nesugebėjo suaktyvinti BMP7 reporterio plazmidžių, turinčių 1, 2 ir 0, 6 kb proksimalinės 5 ′ šoninę seką, ekspresijos. Kartu šie rezultatai rodo, kad BMP7 gali būti tiesioginis LMO4 taikinys ir kad promotoriaus regionas nuo –1, 2 iki –1, 9 kb yra kritinis, norint LMO4 aktyvuoti BMP7 promotorių. Įdomu tai, kad šiame rėmėjo regione buvo pasiūlyta turėti represoriaus elementą (Kawai ir Sugiura, 2001).

Image

LMO4 ir Clim2 asocijuojasi su BMP7 promotoriumi ir jį reguliuoja. ( a ) Kairiajame skydelyje pGL3-1.9BMP7-luciferazės reporterio plazmidė buvo kotransfekuota į HEK293T ląsteles nurodytais kiekiais LMO4 ir DN-Clim ekspresijos plazmidžių. Dešiniajame skydelyje nurodytos pGL3-1.9BMP7 delecijos konstrukcijos buvo kotransfekuotos LMO4 ekspresijos plazmidėmis į HEK293T ląsteles. Liuciferazės aktyvumas parodo mažiausiai trijų nepriklausomų transfekcijų vidurkį ir sem. ( b ) ChIP tyrimai MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse, kai yra (DOX +) ir nėra (DOX−) doksiciklino. ( c ) Dvigubi ChIP tyrimai MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse nurodytomis sąlygomis. Pirmasis antikūnas prieš „Myc“ nusodino „Myc“ pažymėtą LMO4. Antrasis antikūnas atpažino endogeninį „Clim2“ baltymą. ( d ) Dvigubi ChIP tyrimai T47D ląstelėse. Pirmasis antikūnas atpažino endogeninį LMO4 baltymą, o antrasis - atpažino endogeninį „Clim2“ baltymą.

Visas dydis

Norėdami patikrinti, ar LMO4 jungiasi su BMP7 promotoriumi, mes atlikome chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) tyrimus MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse, esant arba be doksiciklino. Myc-tag antikūnas nusodino BMP7 promotorių, nesant doksiciklino (didelis LMO4) (4b paveikslas, 6 juosta), rodantis, kad LMO4 yra susijęs su BMP7 promotoriumi. Šie rezultatai yra specifiniai, nes BMP7 promotorius nebuvo nusodintas IgG (4b paveikslas, 5 juosta), o „Myc-tag“ antikūnas nesukėlė U6 promotoriaus (4b paveikslas, apatinė panelė). Atkreipkite dėmesį, kad kadangi mes naudojome „Myc-tag“ antikūną, kuris aptinka tik pažymėtą indukuojamą baltymą, mes nenustatėme endogeninio LMO4 baltymo, esant doksiciklinui (didelis LMO4) (4b paveikslas, 4 juosta). Norėdami patikrinti, ar Climas ir LMO4 gali sudaryti kompleksą ant BMP7 promotoriaus, mes atlikome dvigubus ChIP tyrimus MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse, pirmiausia nusodindami pažymėtą LMO4 „Myc“ antikūnu, o paskui endogeninį „Clim2“ baltymą su „Clim2“ antikūnu. Didelės LMO4 ekspresijos sąlygomis Clim antikūnas gali nusodinti LMO4 kompleksą ant BMP7 promotoriaus (4c paveikslas, 6 juosta), nurodydamas, kad tiek LMO4, tiek Clim2 jungiasi prie BMP7 promotoriaus, greičiausiai komplekse, atsižvelgiant į didelio afiniteto sąveiką tarp šie baltymai (Deane ir kt., 2004; Ryan ir kt., 2006). Šie rezultatai yra specifiniai, nes „Clim2“ antikūnas negalėjo nusodinti IgG nusodinto BMP7 promotoriaus (4c paveikslas, 5 juosta). Toliau mes išbandėme, ar endogeninis LMO4 ir Clim2 tuo pačiu metu gali jungtis prie BMP7 promotoriaus T47D krūties vėžio ląstelėse, kurios ekspresuoja palyginti aukštą LMO4 kiekį (Visvader et al., 2001). Šiuose eksperimentuose, kur mes pirmiausia nusodinome su LMO4 antikūnu, o paskui su „Clim2“ antikūnu, tiek LMO4, tiek „Clim2“ asocijuojasi su BMP7 promotoriumi (4d paveikslas, 3 juosta). Visi šie rezultatai rodo, kad transkripcinis kompleksas, kuriame yra LMO4 ir Clim2, tiesiogiai reguliuoja BMP7 promotoriaus aktyvumą.

Histono dezacetilazė HDAC2 dalyvauja reguliuojant BMP7 LMO4

Kadangi tiek LMO4 reguliavimas, tiek DN-Clim molekulės ekspresija padidina BMP7 ekspresiją, LMO4 gali suaktyvinti BMP7, atmesdamas represyvius kompleksus iš promotoriaus. Todėl mes ištyrėme, ar reguliuojamas histonų deacetilazių įdarbinimas į BMP7 promotorių gali lemti BMP7 geno reguliavimą LMO4. Pirmiausia atlikome BMP7 ChIP tyrimus MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse, naudodami specifinius antikūnus prieš HDAC1–4. Esant mažai LMO4 ekspresijai, mes aiškiai nustatėme HDAC2 ir HDAC3 ryšį su BMP7 promotoriumi (5a paveikslas, 2 ir 3 juostos). Nors HADC3 jungimasis nepakito, HDAC2 prisijungimas prie BMP7 promotoriaus sumažėjo esant aukštai LMO4 ekspresijai (5a paveikslas, 6 ir 7 juostos ir b, 3 ir 6 juostos). Šie duomenys rodo, kad LMO4 gali iš naujo sureguliuoti BMP7 geną, sumažindamas HDAC2 pritraukimą prie promotoriaus. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes atlikome dvigubus ChIP tyrimus, pirmiausia nusodindami LMO4, o paskui HDAC2 MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse (5b paveikslas). Remdamiesi HDAC2 įdarbinimo LMO4 reguliavimo modeliu, mes nustatėme, kad HDAC2 pirmiausia buvo verbuojamas į BMP7 promotorių esant žemam LMO4 lygiui (5b paveikslas, 3 ir 6 juostos). Kaip ir tikėtasi, tik ląstelių, turinčių aukštą „Myc“ pažymėtą LMO4 lygį, IP atskleidė, kad „Clim2“ pritraukė prie promotoriaus šiose ląstelėse (5b paveikslas, 2 ir 5 juostos). Tolesnis LMO4 dalyvavimo HDAC2 reguliavime palaikymas gaunamas iš IP eksperimentų, kai HDAC2 antikūnai galėjo nugriauti Myc pažymėtą LMO4 (5c pav.), Remiantis naujausia ataskaita, taip pat parodančia, kad LMO4 gali sąveikauti su HDAC2 (Singh ir kt., 2005). Atliekant transfekcijos testus, HDAC2 shRNR ir HDAC2 ekspresijos vektoriai atitinkamai padidėjo ir sumažino BMP7 promotoriaus ekspresiją (6a pav.), Parodydami, kad HDAC2 slopina promotorių bazinėmis sąlygomis. Western blot analizė rodo efektyvų HDAC2 lygio silpninimą HDAC2 RNR, o ne kontroliuojančiomis RNR (papildomas S9 paveikslas). Kai HDAC2 ekspresijos vektorius buvo transfekuotas kartu su LMO4, jis blokavo BMP7 promotoriaus stimuliuojamą LMO4 (6a pav.), Kas rodo, kad sumažėjęs HDAC2 įdarbinimas gali lemti promotoriaus LMO4 reguliavimą.

Image

LMO4 ir HDAC2 sąveika BMP7 promotoriuje. ( a ) ChIP tyrimai MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse, kai yra (DOX +) ir nėra (DOX−) doksiciklino. Antikūnai buvo prieš HDAC1–4, o pradmenys buvo tokie patys kaip 4b paveiksle. ( b ) Dvigubi ChIP tyrimai MCF7-LMO4-TetOff ląstelėse nurodytomis sąlygomis. Pirmasis antikūnas buvo prieš „Myc-tag“, kad nusodintų „Myc“ pažymėtą LMO4. Antrasis antikūnas atpažino HDAC2 arba Clim2; IgG buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. ( c ) MCF7-LMO4-TetOff ląstelių IP lizato IgG ir HDAC2 antikūnai. Western blot buvo tiriamas antikūnu prieš Myc, kad būtų galima aptikti Myc pažymėtą LMO4.

Visas dydis

Image

BMP7 promotorius reguliuoja LMO4-HDAC2 sąveika. ( a ) PGL3-1.9 BMP7 reporterio plazmidė buvo kartu transfekuota su nurodytomis ekspresijos plazmidėmis į HEK293T ląsteles. Liuciferazės aktyvumas parodo mažiausiai trijų nepriklausomų transfekcijų vidurkį ir sem. ( b ) BMO7 promotoriaus aktyvavimo pagal LMO4 pavyzdys. Neapibrėžtas DNR jungiantis kompleksas, su kuriuo sąveikauja LMO4 / Clim / HDAC2, parodytas geltonai.

Visas dydis

Kartu šis darbas nustatė BMP7 geną kaip tiesioginį LMO4 taikinį. Mūsų išvados rodo naują mechanizmą, kaip LMO tarpininkaujant skatinti genų ekspresiją. Pagal šį modelį (6b paveikslas), transkripcijos kompleksas, kuriame yra LMO4 ir Clim2, yra jautrus komponentų stechiometrijai, todėl, kad dėl per didelio LMO4 ekspresijos ar sumažinimo arba dėl DN-Clim ekspresijos sumažėja HDAC2 pasisotinimas promotoriuje ir aktyvinimas. transkripcija.

Diskusija

Šis tyrimas pratęsia ankstesnius tyrimus (Wang ir kt., 2004; Sum ir kt., 2005c), parodydamas, kad dviem skirtingais LMO4 sukeltais pieno liaukos Cre sukeltais pieno liaukų išstūmimo būdais sumažėja pieno epitelio ląstelių proliferacija, pradedant ankstyvuoju laikotarpiu. nėštumas, dėl kurio sumažėja lobuloalveolių vystymasis ir pieno liaukų veikla nėštumo pabaigoje. Todėl vienas iš LMO4 vaidmenų yra išlaikyti pieno epitelio ląstelių proliferaciją ankstyvojo nėštumo metu.

Aukščiausias diferencijuotai išreikštas genas, reaguojant į LMO4 ekspresiją, yra BMP7 , kaulų morfogenezinių baltymų šeimos narys, kuris turi daugiau nei 15 žinduolių narių. Žmogaus krūties vėžio atvejų raiškos profilių analizė (Farmer ir kt., 2005) parodė labai reikšmingą koreliaciją tarp LMO4 ir BMP7 raiškos lygių, parodydama, kad BMP7 gali reaguoti į LMO4 žmogaus krūties vėžiui. Ryšys tarp LMO4 ir BMP7 yra ypač intriguojantis, nes BMP yra sekretuojami citokinai, kurie gali valdyti daugybę ląstelių procesų, įskaitant proliferaciją, diferenciaciją ir apoptozę (Hogan, 1996). Reguliuodamas BMP7, LMO4 gali turėti pleiotrofinį poveikį tiek vėžiui, tiek vystymuisi. Be to, LMO4 gali modifikuoti BMP7 signalizaciją pasroviui, sąveikaudamas su Smad8 (Lu ir kt., 2006), vienas iš efektingiausių Smads, tarpininkaujančių BMP7 signalizavimui. Šie tyrimai kartu rodo, kad LMO4 gali pagerinti BMP7 signalizaciją dviem skirtingais lygmenimis.

Atsižvelgiant į tai, kad atrodo, kad LMO4 veikia kaip protumorigeninis faktorius, įdomu tai, kad reaguodami į LMO4 padidėjusį reguliavimą normaliose pieno epitelio ląstelėse ir MCF-7 krūties vėžio ląstelėse, pastebėjome aiškų nuo kaspazės priklausomą proapoptozinį poveikį. Be to, WAP- Cre - LMO4 fl / fl pelėse aptikome padidėjusią pieno epitelio ląstelių apoptozę. Šie duomenys rodo, kad padidėjęs arba sumažėjęs LMO4 lygis, galbūt priklausomai nuo konteksto, gali sustiprinti apoptozę. Šis dvifazis poveikis yra panašus į radinius su keliais kitais apoptozės efektoriais, įskaitant c-myc ir ras (Chi ir kt., 1999; Pelengaris ir kt., 2002). Be to, naujausi tyrimai rodo, kad ryšys tarp ląstelių išgyvenimo ir vėžio yra sudėtingesnis, nei manyta anksčiau. Pavyzdžiui, kepenų sistemoje padidėjusi ląstelių mirtis susijusi su hepatokarcinogeneze, galbūt dėl ​​kompensacinio proliferacijos (Maeda ir kt., 2005). Todėl įmanoma, kad apoptozės skatinimas gali būti LMO4 naviką skatinančio poveikio komponentas. LMO4 poveikis ląstelių išgyvenimui taip pat gali labai priklausyti nuo koncentracijos. Pavyzdžiui, mes stebėjome U formos dozės ir atsako kreivę tarp LMO4 lygio ir Smad tarpininkaujant transkripcijai (Lu ir kt., 2006). Galiausiai tikėtina, kad LMO4 poveikis priklauso nuo konteksto; LMO4 tarpininkavimas signalizuojant stromas ir (arba) kitas kaimynines ląsteles gali būti svarbus skatinant proliferacinį ir auglį didinantį LMO4 reguliavimą in vivo . Šiuo atžvilgiu svarbu nustatyti BMP7 kaip tikslinį LMO4 geną, nes BMP7 daro ryškų poveikį stromos ląstelėms (Dean ir kt., 2004), ir yra žinoma, kad augimo signalizaciją iš stromos fibroblastų pieno liaukų vystymosi metu reguliuoja TGF β ligadai (Cheng ir kt., 2005).

Kaip ir LMO4, BMP7 yra labai išreikštas besivystančio pieno liaukos kaukolės galiniuose pumpuruose (Sum et al., 2005a, 2005b) - aktyvaus proliferacijos ir stromos invazijos į pieno epitelį vietoje. LMO4 ir BMP7 taip pat yra labai ekspresuojami pirminio krūties vėžio atveju (Visvader ir kt., 2001; Alarmo ir kt., 2006) ir, kaip parodyta čia, jų išraiška reikšmingai koreliuoja žmonių krūties vėžio atvejais. Tai, kad BMP7 taip pat, kaip ir LMO4, reguliuoja pieno epitelio ląstelių apoptozę, atitinka mintį, kad jis tarpininkauja kai kuriems LMO4 veiksmams. Įdomu tai, kad LMO4 ir BMP7 nokautuotoms pelėms būdingi bendri fenotipai, įskaitant ankstyvą mirtį po gimdymo, neteisingus sphenoidinius kaulus ir kai kurių šonkaulių suliejimą (Luo ir kt., 1995). Tvirtiausi įrodymai, kad BMP7 veikia pasroviui nuo LMO4, gauti iš tyrimų, rodančių, kad follistatinas, BMP5-7 blokatorius, gali iš dalies blokuoti proapopotinį LMO4 poveikį (3c paveikslas).

Mes nustatėme naują mechanizmą, kaip LMO4 gali suaktyvinti transkripciją. Histono dezacetiltransferazės HDAC2 asocijuojasi su BMP7 promotoriumi (5a ir b paveikslai) ir slopina jo aktyvumą, kaip parodyta tiek su padidėjusia HDAC2 ekspresija, tiek dėl funkcijos praradimo (6a pav.). Tikėtina, kad BMP7 promotoriuje HDAC2 asocijuojasi su kompleksu, kuriame yra LMO4 ir Clim2. Palaikant šią galimybę, dvigubi ChIP eksperimentai su LMO4 ir HDAC2 nusodina BMP7 promotorių (5b paveikslas), o LMO4 ir HDAC2 sąveikauja tirpale (5c paveikslas) (Singh ir kt., 2005). Mes siūlome, kad LMO4 tiesiogiai bendrautų su HDAC2, įdarbindamas jį į BMP7 rėmėją. Kai LMO4 yra sureguliuotas, HDAC2 yra atskirtas nuo promotoriaus, dėl kurio vyksta transkripcijos aktyvacija (6b paveikslas).

Apibendrinant, mes nustatėme , kad BMP7 yra į LMO4 reaguojantis genas žmogaus krūties vėžyje. Biocheminiai eksperimentai rodo, kad BMP7 yra tiesioginis taikinio genas, LMO4 asocijuojasi su jo promotoriumi ir kontroliuoja transkripciją reguliuodamas histono deacetilazės HDAC2 įdarbinimą. LMO4 ir BMP7 daro panašų poveikį pieno epitelio ląstelių proliferacijai ir apoptozei, o follistatinas iš dalies blokuoja LMO4 poveikį, leisdamas manyti, kad BMP7 gali bent iš dalies tarpinti LMO4 poveikį pieno epitelio ląstelėms. Šios išvados yra ypač įdomios, atsižvelgiant į tai, kad LMO4 yra per daug išreikštas (Visvader ir kt., 2001), ypač ER neigiamais atvejais, ir yra susijęs su prasta baigtimi (Gruvberger ir kt., 2001; Sum ir kt.)., 2005b).

medžiagos ir metodai

Pelių pieno liaukos LMO4 išmušimas

B6129-Tg (WAP- Cre ) 11738Mam / J ir B6129-Tg (MMTV- Cre ) 4Mam / J pelės (Wagner ir kt., 1997) buvo nupirktos iš Jackson laboratorijos (Bar Harbor, ME, JAV). LMO4 fl / fl pelės C57 / BL6 fone buvo aprašytos anksčiau (Lee ir kt., 2005). Pelės, gavusios pieno liaukų LMO4 išmušimus, sugeneravo WAP- Cre ir MMTV- Cre peles su LMO4 fl / fl pelėmis. Remdamiesi Džeksono laboratorijos instrukcijomis, MMTV- Cre ir WAP- Cre pelėms identifikuoti panaudojome publikuotas PGR pradmenų sekas. PGR pradmenys, skirti aptikti laukinio tipo, perpuvusius ir ištrintus LMO4 alelius, yra paskelbti anksčiau (Lee ir kt., 2005).

Realaus laiko kiekybinė PGR analizė

Bendra RNR buvo ekstrahuota TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV), o cDNR buvo pagamintos naudojant didelės talpos cDNA archyvo rinkinį (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) pagal gamintojo protokolą. Realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant „SYBR Green“ arba komerciškai prieinamus „TaqMan“ geno ekspresijos testus („Applied Biosystems“).

Visas pieno liaukų paruošimas, histologija ir imuninis dažymas

Kiaulinės pieno liaukos buvo apdorotos viso sąnario analizei (Wang ir kt., 2004). Histologiškai pieno liaukos per naktį buvo fiksuotos 10% neutraliame formaline, įterptas parafinas, o 6 μm sekcijos dažytos hematoksilinu ir eozinu. Norėdami įvertinti pieno liaukų ląstelių proliferaciją, pjūviai buvo nudažyti Ki67 antikūnais (Novocastra, Norwell, MA, JAV) praskiedžiant 1: 1000. Mes įvertinome ląstelių proliferaciją, suskaičiavę 500 ląstelių atsitiktiniuose laukuose iš kiekvienos pelės ir nustatėme ląstelių, nudažytų Ki67 antikūnu, dalį.

Ląstelių proliferacijos ir apoptozės tyrimai

Ląstelių skaičius buvo įvertintas naudojant „CellTiter 96 ® AQueous“ neradioaktyvaus ląstelių proliferacijos testą (Promega, Madisonas, WI, JAV). Apoptozė buvo įvertinta naudojant ląstelių mirties aptikimo ELISA PLUS rinkinį (Roche) ir dažant aneksinu V (Roche, Indianapolis, IN, JAV; 1858777) ir FACS analize (Lu et al., 2006).

Plazmidžių konstravimas

Tetracikliną reprezentuojančias LMO4 ir DN-Clim ekspresijos plazmides sukūrėme klonuodami Myc žymėtą LMO4 (Sugihara et al., 1998) ir DN-Clim (Wang et al., 2004) į pTRE2hyg vektorių (BD Biosciences, San Jose, CA, JAV).

Ląstelių kultūra ir stabilių ląstelių linijų generavimas

MCF7 Tet-Off ląstelių linija buvo gauta iš „Clontech“ (Mountain View, CA, JAV) (kat. 630907) ir prižiūrima pagal pardavėjo rekomendacijas. Įprasti HMEC buvo įsigyti iš Cambrex (East Rutherford, NJ, JAV) ir auginami pagal gamintojo instrukcijas. Anksčiau buvo aprašyti pLNCX2 retrovirusiniai vektoriai (Lu ir kt., 2006).

Mikro matricų analizė

Bendra RNR buvo išskirta iš trijų skirtingų MCF7-LMO4-TetOff ląstelių linijų ir trijų skirtingų MCF7-DN-Clim-TetOff ląstelių linijų, esant DOX po 6 dienų. Norėdami sumažinti kintamumą, mes surinko RNR iš trijų eksperimentų kiekvienai iš trijų ląstelių linijų. RNR buvo pažymėta ir hibridizuota su „Affymetrix“ DNR mikroschemomis.

Pereinamojo laikotarpio transfekcijos reporterio tyrimai

1 dieną prieš transfekciją HEK293T ląstelės buvo pasėtos į šešių šulinėlių plokšteles. Liuciferazės reporteris (1 μg ) ir efektorinės plazmidės (0, 5 μg ) buvo kartu transfekuotos kalcio fosfato metodu, o luciferazės aktyvumas buvo išmatuotas praėjus 2 dienoms po transfekcijos, kaip aprašyta (Lu ir kt., 2006). Visi eksperimentai buvo atlikti bent tris kartus, kiekvieną kartą po tris egzempliorius.

Koemunoprecipitacijos ir chromatino imunoprecipitacijos tyrimai

Koimuniniai nusodinimai (Co-IP) buvo atlikti su ekstraktais iš MCF7-LMO4-TetOff ląstelių, kaip aprašyta anksčiau (Lu ir kt., 2006). ChIP tyrimai buvo atlikti pagal „Upstate Cell Signaling Solutions“ protokolą. Išsami informacija apie antikūnus ir PGR pradmenis pateikiama papildomoje informacijoje.

Išsamius medžiagų ir metodų aprašymus galite rasti papildomoje informacijoje.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma medžiaga

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc).