Laukinių ir prijaukintų phaseolus vulgaris rizosferos mikrobiomų kompozicijos susiejimas su genotipiniais ir šaknies fenotipiniais požymiais | nežinomas žurnalas

Laukinių ir prijaukintų phaseolus vulgaris rizosferos mikrobiomų kompozicijos susiejimas su genotipiniais ir šaknies fenotipiniais požymiais | nežinomas žurnalas

Anonim

Dalykai

  • Mikrobų ekologija
  • Mikrobiomas

Anotacija

Augalų prijaukinimas buvo pagrindinis žmonijos istorijos laimėjimas, tačiau jis taip pat lėmė genetinės pasėlių rūšių įvairovės sumažėjimą, palyginti su jų laukiniais protėviais. Iš esmės nežinoma, kaip ši sumažėjusi genetinė įvairovė paveikė augalų ir mikrobų sąveiką po žeme. Čia mes ištyrėme šiuolaikinių ir laukinių paprastųjų pupelių ( Phaseolus vulgaris ), išaugintų žemės ūkio dirvožemyje iš Kolumbijos aukštumų, vieno iš paprastųjų pupelių įvairinimo centrų, genetinius ryšius, šaknies fenotipinius bruožus ir šakniastiebių junginių sudėtį. Įvairovės masyvo technologijomis pagrįstas vietinių paprastųjų pupelių prisijungimų genotipų nustatymas ir fenotipų nustatymas parodė reikšmingus genetinius ir šaknies architektūrinius skirtumus tarp laukinių ir šiuolaikinių prieigų. Laukinių prieigų šaknų ilgis yra didesnis. Kanoninė korespondencijos analizė parodė, kad rhizobakterijų bendruomenės sudėties skirtumai tarp laukinių ir šiuolaikinių pupelių yra siejami su specifinio šaknies ilgio skirtumais. Palei pupelių genotipinę trajektoriją, eidama iš laukinių į šiuolaikines, mes pastebėjome laipsnišką santykinio bakteroidų, daugiausia chitinophagaceae ir Cytophagaceae , gausumo mažėjimą bei Actinobacteria ir Proteobacteria santykinį gausėjimą, atitinkamai Nocardioidaceae ir Rhizobiaceae . Visi šie rezultatai nustato ryšį tarp pupelių prijaukinimo, specifinių šaknų morfologinių bruožų ir rhizobakterijų bendruomenės.

Įvadas

Rizosferos mikrobiomas daro didelę įtaką augalų sveikatai ir augimui, nes suteikia pagrindines funkcijas, susijusias su maistinių medžiagų įsisavinimu, abiotinio streso toleravimu ir apsauga nuo patogenų infekcijos (Mendes ir kt., 2011, 2013; Bulgarelli ir kt., 2013). Edafiniai veiksniai ir augalų genotipas tam tikru mastu formuoja rizosferoje esančių bakterijų bendruomenių sudėtį ir metabolinį aktyvumą (Berg ir Smalla, 2009; Bulgarelli ir kt., 2012; Lundberg ir kt., 2012; Philippot ir kt.). 2013). Buvo pasiūlyta, kad augalų genotipo poveikį rizosferos mikrobiomų sudėčiai bent iš dalies lemia kiekybiniai ir kokybiniai šaknų eksudato sudėties skirtumai (Lakshmanan ir kt., 2012; Badri ir kt., 2013; Carvalhais ir kt.)., 2013; Lebeis ir kt., 2015). Taigi tam tikro rizosferos mikrobų komplekso sudėtis priklauso nuo augalų rūšies (Turner et al., 2013; Ofek et al., 2014) ir net nuo tam tikros augalų rūšies veislės (Peiffer et al., 2013).

Augalų prijaukinimas buvo būtinas žmonijos istorijai, tačiau jis taip pat ženkliai sumažino pasėlių rūšių genetinę įvairovę, palyginti su jų laukiniais protėviais (Doebley ir kt., 2006). Ar šis genetinės įvairovės sumažėjimas paveikė specifinius šaknų morfologinius bruožus, mikrobų įvairovę ir aktyvumą rizosferoje, vis dar nežinoma. Iki šiol nedaug tyrimų parodė, kad šiuolaikinėse augalų veislėse, palyginti su jų laukiniais protėviais, galėjo būti paveiktas rizosferos mikrobiomų rinkimas (Bulgarelli ir kt., 2015; Leff ir kt., 2016; Pérez-Jaramillo ir kt.)., 2016). Atsižvelgiant į tai, buvo pasiūlyta laukinių giminaičių, taip pat laukinių šeimos atstovų, vertingų žinių apie augalų ypatybes ir genus, susijusius su mikrobiomų surinkimu, leidžiančią neatsiejamą mikrobiomų rinkimo vaidmenį būsimose augalų veisimo programose. Tačiau apie daugumą ekonomiškai svarbių maisto kultūrų turima mažai žinių apie augalų prijaukinimo poveikį šaknų bruožams ir rizosferos mikrobiomų rinkimui. Čia mes nustatėme laukinių ir šiuolaikinių paprastųjų pupelių ( Phaseolus vulgaris ) genetinį ryšį ir šaknies morfologinius požymius bei išanalizavome jų rizosferos mikrobiomų sudėtį. Paprastosios pupelės yra svarbiausias ankštinių augalų derlius mažas pajamas gaunantiems ūkininkams Lotynų Amerikoje ir Afrikoje (Broughton ir kt., 2003; Akibode ir Maredia, 2011). Laukinė paprastosios pupelės atsirado centrinėje Meksikoje ir paplito visoje Centrinėje ir Pietų Amerikoje (Gepts, 1998; Bitocchi ir kt., 2012; Desiderio ir kt., 2013). Šis platus pasiskirstymas lėmė geografinę laukinių paprastųjų pupelių izoliaciją ir leido gerai apibūdintus genetinius telkinius (Gepts and Bliss, 1985). Daugybė prieinamų priedų, pradedant laukiniais giminaičiais ir baigiant labai produktyviomis šiuolaikinėmis veislėmis, sudaro paprastųjų pupelių gerą pavyzdinę sistemą, kad būtų galima ištirti prijaukinimo poveikį šaknų fenotipiniams bruožams ir ekonomiškai svarbių maisto augalų augalų rizobakterijų sudėčiai. Be to, paprastosios pupelės ir kitos ankštinės augalų rūšys suteikia puikias eksperimentines sistemas, tiriančias susipynusius ryšius tarp mazgelių ir rizosferos mikrobiomų rinkinio (Zgadzaj ir kt., 2016).

Šiame tyrime pasirinkome „grįžimo prie šaknų“ metodą (Pérez-Jaramillo ir kt., 2016) ir atrinkome aštuonis paprastųjų pupelių prisijungimus Kolumbijoje, įskaitant laukinius giminaičius, landrasus ir šiuolaikines veisles, ir apibūdinome jų genetinį ryšį pagal įvairovę. „Array Technology“ (Jaccoud ir kt., 2001). Vėliau pasirinktos pupelių dalys buvo auginamos žemės ūkio dirvožemyje, surinktame iš Antioquia aukštumų Kolumbijoje. Kolumbijos kalnai laikomi svarbiu bendro pupelių įvairinimo centru, kur natūralių buveinių dar galima rasti laukinių ir paprastųjų pupelių, esančių iš dviejų pagrindinių genetinių telkinių (Mesoamerikos ir Andų), teritorijose (Gepts ir Bliss, 1986). Atrinktiems paprastųjų pupelių priedams buvo atlikta skirtingų šaknų ypatybių fenotipinė analizė, taip pat rhizobakterijų bendruomenės analizė 16S rRNR amplikono seka.

medžiagos ir metodai

Paprastųjų pupelių prieigos ir Kolumbijos dirvožemio pasirinkimas

Paprastosios pupelės ( Phaseolus vulgaris ) buvo parinktos dvi laukinės, trys sausumos veislės ir trys patobulintos veislės (šiuolaikinės veislės) atsižvelgiant į šias savybes: jos priklauso Kolumbijos Mesoamerikos genetiniam fondui; landrasai ir šiuolaikiniai prisijungimai yra ta pati rasė, jie demonstruoja mezoamerikos fazolino baltymų tipą; jie kilę iš to paties aukščio diapazono; ir jie turi tą patį augimo tipą (tai yra, laipiojimas, o ne krūmas). Pastaroji savybė būdinga visoms pasirinktoms įstaigoms, išskyrus prisijungimą prie G5773, kuri yra krūminė komercinė veislė, plačiai paplitusi ir plačiai naudojama Lotynų Amerikoje ir Afrikoje. Sėklos buvo maloniai parūpintos pagal Tarptautinio atogrąžų žemdirbystės centro (CIAT), esančio Palmira, Kolumbija, genetinių išteklių programą. Augalo pasas pateiktas papildomoje S1 lentelėje. Šiame tyrime naudojamas dirvožemis buvo surinktas iš žemės ūkio lauko El Carmen de Viboral savivaldybės kaimo vietovėje (Antioquia – Kolumbija, 6 ° 4′55 ″ šiaurės platumos, 75 ° 20′3 ″ W). Paprastosios pupelės šiame regione buvo auginamos dešimtmečius, o dirvožemio sąlygos yra optimalios kelių paprastųjų pupelių veislių augimui. Dirva buvo surinkta trijose atsitiktinėse vietose nuo 30 cm gylio, išdžiovinta oru, perleista per 2 mm tinklo sietą, kad būtų pašalintos (augalų) šiukšlės ir laikomos tolimesniam naudojimui. Fizikinės ir cheminės analizės buvo atliktos Kolumbijos nacionalinio universiteto Medeljino dirvožemio mokslo laboratorijoje, naudojant standartines procedūras (papildoma S2 lentelė).

Paprastųjų pupelių priedų genotipas

Pupelių sėklos buvo sterilizuojamos paviršiaus ir sudygtos ant filtravimo popieriaus, sudrėkinto steriliu vandentiekio vandeniu. Po 2–5 dienų daigintos sėklos buvo perkeltos į 500 ml talpos vazonėlius, užpildytus žemės ūkio dirvožemiu. Kiekvienam pupelių prisijungimui du sodinukai buvo persodinti į vazoną (po 1 vazoną kiekvienam įsodinimui), atsitiktinai išdėstyti auginimo kameroje (25 ° C, 16 val. Dienos šviesos) ir laistomas kiekvieną dieną. Po 10 dienų buvo surinktas jauniausias kiekvieno augalo lapas ir DNR buvo išskirtas naudojant „PowerPlant Pro“ DNR išskyrimo rinkinį („Mo Bio Laboratories“, Carlsbad, CA, JAV). Buvo laikomasi gamintojo nurodymų, o DNR išeiga ir kokybė buvo įvertinta naudojant agarozės gelio elektroforezę ir „Qubit 2.0“ fluorimetrą („ThermoFisher Scientific“, Waltham, MA, JAV). Genomo profiliavimas buvo atliktas naudojant sudėtingumo genomo redukcijos metodą, kurį sukūrė „Diversity Arrays Technology Pty Ltd“ (DArT P / L, Bruce, Australija) (Jaccoud ir kt., 2001). Pavienis nukleotidų polimorfizmų (SNP) lentelėms gauti buvo naudojamas patentuotas analitinis vamzdynas, kurį sukūrė DArT P / L; iš viso 10 Buvo gauti 732 SNP. SNP iškvietimas buvo atliktas naudojant pasirinktinį R scenarijų („R Core Team“, 2015) ir po filtravimo iš viso 7527 SNP buvo išsaugoti tolesnei analizei.

Augalų genetinė įvairovė

Programoje PLINK (v. 1.9) (Chang ir kt., 2015) buvo sukonstruota atstumo pagal atskirą būseną matrica ir sukurtas kaimyno jungiantis filogenetinis medis naudojant „Phylip“ programinės įrangos paketą (v.6.695). Norint kiekybiškai įvertinti grupių skaičių grupėje, buvo atlikta Bajeso klasterių analizė, naudojant modeliu pagrįstą metodą, įdiegtą programinėje įrangoje STRUCTURE (Pritchard ir kt., 2000). Šis metodas naudoja kelių lokusų genotipinius duomenis, kad individai būtų suskirstyti į grupes ar grupes (K) be išankstinių žinių apie jų populiacijos giminingumą ir prisiima lokusus Hardy – Weinberg pusiausvyroje. Programinė įranga buvo paleista atsižvelgiant į K reikšmes nuo 1 iki 6 (hipotetinis grupių skaičius) su priemaišų modeliu su koreliuojamais alelių dažniais. Kiekvienas bėgimas buvo įgyvendintas su 20 000 deginimų kartojimų, po kurių 200 000 MCMC (Markovo grandinės Monte Karlo) iteracijų tiksliam parametrų įvertinimui. Kiekvienam K buvo atlikti penki nepriklausomi važiavimai. Genetinių grupių skaičius buvo įvertintas naudojant programinę įrangą STRUCTURE HARVESTER (Earl, 2012) pagal Evanno kriterijų (Evanno ir kt., 2005). Taip pat buvo atlikta daugiamatė mastelio analizė naudojant PLINK. Įsiveržimo koeficientas ir homozigotinių segmentų atsiradimas buvo apskaičiuoti PLINK komandomis '- het ' ir '- homozyg '. Kiekvienam pupelių prisijungimui buvo nustatytas homozigotinių regionų skaičius ir jų genomo vietos. Pupelių prisijungimo prie G51283K1 panašumas su kitais priedais buvo nustatytas apskaičiuojant poros tapatumą pagal valstybes. Genomas buvo suskirstytas į 109 blokus ir kiekviename bloke buvo apskaičiuota porų tapatybė pagal būseną visiems pupelių prisijungimams; nulis yra visiškai skirtingas, o du yra visiškai identiški. Prisijungimas G51283K1 buvo lyginamas su visais G22304 ir landrace G23998 genomais kaip laukiniai prisijungimai, su moderniais prisijungimais G5773 ir G51695 kaip moderniais prisijungimais ir su landrace G50632I1. Visos genetinės įvairovės ir homozigotinės analizės buvo atliktos PLINK (v1.9) ir vizualizuotos R.

Šaknų morfologija

Sėklos sudygo, kaip aprašyta aukščiau, ir perkeliamos į 3 l vazonus, užpildytus aukščiau aprašytu žemės ūkio dirvožemiu. Vienam genotipui buvo naudojami trys augalai. Augalai buvo auginami aplinkos aplinkos sąlygomis, kurių vidutinė temperatūra buvo 25 ° C ° C ir 12 h dienos šviesos. Pasiekus V4 stadiją (3-iasis trifoliato lapas), augalai buvo kruopščiai nuimami ir šaknų sistema švelniai nuplaunama vandeniu iš čiaupo, kol prie šaknų neprisijungė daugiau dirvožemio dalelių. Vėliau visa šaknies sistema buvo nudažyta metileno mėlyna spalva, nusodinta ant „Scanjet G4050“ skaitytuvo („Hewlett-Packard“, Palo Alto, CA, JAV) ir nuskaityta 600 skyra. dpi. Tada vaizdai buvo analizuojami naudojant programinę įrangą WinRHIZO („Regent Instruments Inc.“, Kvebekas, QC, Kanada), ir buvo užfiksuoti keli šaknies matavimai (papildoma S3 lentelė). Po nuskaitymo šaknys buvo išdžiovintos ir išmatuotas šaknų sausasis svoris (rww). Vėliau mes apskaičiavome savitąjį šaknies ilgį (SRL), naudodami rl / rdw lygtį , ir šaknies audinio tankį (D), naudodami rdw / rv lygtį (Martín-Robles et al., 2015). Šie parametrai buvo apskaičiuoti, variacijų normalumas ir homogeniškumas buvo patikrinti atitinkamai naudojant Shapiro – Wilko testą ir Levene testą. Vieno būdo ANOVA ir post-hoc testai buvo naudojami šaknies morfologijos skirtumams tarp pupelių prisijungti įvertinti.

Rizosferos dirvožemio rinkimas ir DNR išskyrimas

Tokia pati aukščiau aprašyta sėklų dygimo procedūra. Daigai buvo perkelti į 3 l vazonus, kuriuose buvo žemės ūkio dirvožemis. Kiekvienam prisijungimui buvo naudojami keturi pakartojimai su vienu augalu kiekviename pakartotiniame puode. Augalai buvo išdėstyti atsitiktine tvarka šiltnamyje, kurio aplinkos sąlygos buvo vidutinės 25 ° C ° C ir 12 h dienos šviesos. Keturiuose vazonuose su tuo pačiu dirvožemio kiekiu, bet be augalų, buvo naudojami kaip kontroliniai mėginiai. Augalai buvo renkami žydėjimo metu, kad būtų galima sinchronizuoti visų jungčių mikrobiomų analizę toje pačioje fenologinio augimo stadijoje. Šakniastiebio dirva buvo surinkta Lundberg ir kt. Metodu. (2012). Trumpai tariant, iš puodų buvo paimta visa šaknies sistema, laisvai prie šaknų pritvirtinta dirva, pašalinta visa šaknų sistema į tris dalis ir kiekviena perkelta į 15 ml mėgintuvėlį, kuriame yra 5 ml LifeGuard dirvožemio išsaugojimo tirpalo (Mo Bio laboratorijos). Vamzdeliai buvo stipriai sukratyti, šaknys pašalintos ir DNR išskyrimui iš mėginio buvo paimta mažiausiai 1 g (šlapio svorio) rizosferos dirvožemio. Biriam dirvožemiui iš kiekvieno kontrolinio puodo buvo surinkta maždaug 1 g dirvožemio, kuris taip pat panardintas į 5 ml LifeGuard tirpalo. Buvo įvertintas šaknų sausas svoris, dienų skaičius iki žydėjimo ir bendras mazgelių skaičius vienoje šaknies sistemoje. Rizosferos DNR gauti buvo atlikta pagal RNR „PowerSoil“ DNR eliuacijos priedų rinkinį („Mo Bio Laboratories“), atlikus ankstesnį RNR ekstrahavimo ir eliuavimo, naudojant RNR „PowerSoil“ viso RNR izoliacijos rinkinį („Mo Bio Laboratories“). Tada kiekvienas gautas DNR mėginys buvo nuvalytas „PowerClean“ DNR valymo rinkiniu („Mo Bio Laboratories“). DNR derliui ir kokybei patikrinti buvo naudojama agarozės gelio elektroforezė ir ND1000 spektrofotometras (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, JAV). DNR mėginiai buvo laikomi –80 ° C temperatūroje iki tolimesnio naudojimo.

16S rRNR amplikono sekos nustatymas

Iš rizosferos išgauta DNR buvo naudojama 16S rRNR amplifikacijai ir sekai nustatyti, nukreipiant į kintamas V3-V4 sritis (pirmyn nukreiptas pradmuo = 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 ′

Grįžtamieji gruntai = 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3 ′), gaunantys maždaug ~ 460 bp amplikonus. Dvigubi indeksai ir „Illumina“ sekos adapteriai naudojant „Nextera XT Index Kit“ buvo pritvirtinti prie V3 – V4 amplikonų. Vėliau buvo atliktas bibliotekos kiekybinis įvertinimas, normalizavimas ir sujungimas, o MiSeq v3 reagentų rinkiniai buvo naudojami galutinai įkelti mėginius MiSeq sekai nustatyti. Norėdami gauti daugiau informacijos, skaitykite „Illumina MiSeq System“ gairėse (Illumina, 2013).

KPP plėtinys iki PANDASeq (Masella ir kt., 2012), pavadintas Assembler (Cole ir kt., 2014), buvo naudojamas sujungti suporuotų galų skaitymus, kurių mažiausias sutapimas buvo 10 bp ir bent Phred balas - 25. Primer sekos buvo pašalintos iš FASTQ failų pavyzdžių, naudojant Flexbar 2.5 versiją (Dodt ir kt., 2012). Sekos buvo konvertuotos į FASTA formatą ir sujungtos į vieną failą. Visi skaitymai buvo sugrupuoti į veikiančius taksonominius vienetus (OTU), naudojant UPARSE strategiją, pašalinant replikaciją, suskirstant pagal gausumą bent dviem sekomis ir sugrupuojant naudojant UCLUST smallmem algoritmą (Edgar, 2010). Šie veiksmai buvo atlikti naudojant VSEARCH 1.0.10 versiją (Rognes ir kt., 2015), kuri yra atvirojo kodo ir 64 bitų daugiapakopė suderinama alternatyva USEARCH. Tada chimerinės sekos buvo aptiktos naudojant UCHIME algoritmą, įdiegtą VSEARCH (Edgar ir kt., 2011). Visi prieš nurašymo etapą perskaityti duomenys buvo susieti su OTU, naudojant VSEARCH įdiegtą metodą usearch_global, kad būtų sukurta OTU lentelė, ir konvertuoti į BIOM-Format 1.3.1 (McDonald et al., 2012). Galiausiai kiekvieno BIU taksonominė informacija buvo įtraukta į BIOM failą naudojant RDP klasifikatoriaus 2.10 versiją (Cole et al., 2014). Visi veiksmai buvo įgyvendinti naudojant „Snakemake“ darbo eigą (Köster ir Rahmann, 2012). OTU lentelė buvo filtruojama naudojant QIIME (1.9.1) pasirinktinius scenarijus (Kuczynski et al., 2012). Bakterijų sritis buvo išgauta naudojant komandą split_otu_table_by_taxonomy.py, o singletonai, doubletons ir chloroplastų sekos buvo išmesti su komanda filter_otus_from_otu_table.py, gaunant filtruotą OTU lentelę tolimesnei analizei.

Šakniastiebių bakterijų įvairovė ir ryšys su genotipiniais ir šaknies fenotipiniais bruožais

Alfa įvairovė buvo apskaičiuota naudojant QIIME muitinės scenarijus. Komanda alpha_rarefaction.py buvo naudojama retinti OTU lentelę, kad suskaičiuotų iki 50 000 skaito. Tai buvo mažiausias sekos nustatymo gylis, gautas iš mėginio, todėl jis buvo naudojamas kaip slenkstis retamfaktūros ir alfa įvairovės skaičiavimams (Gotelli ir Colwell, 2001). Komanda „ alpha_diversity.py“ buvo pritaikyta retiems duomenims ir buvo gauti stebimi OTU, Shannon, Chao1 ir Faith filogenetinės įvairovės rodikliai. R. buvo atlikti vienpusiai ANOVA ir Tukey HSD. Beta įvairovės skaičiavimams buvo naudojama visa filtruota OTU lentelė ir normalizuota, naudojant funkciją cumNorm iš R paketo metagenomeSeq (v.1.12) (Paulson et al., 2016). . Mes panaudojome kaupiamosios sumos mastelio keitimo metodą, kuris apskaičiuoja mastelio koeficientus, lygius skaičių sumai iki tam tikros kvantilės, kad normalizuotų skaitymų skaičių, kad būtų išvengta poslinkių, atsirandančių naudojant dabartines sekos nustatymo technologijas, dėl nevienodo sekvenavimo gylio (Paulson et al ., 2013). Bray – Curtis skirtumų matrica buvo apskaičiuota ir panaudota filogenetinės grupės, tai yra, protėvių (A1 ir A2) ir modernios (nuo M1 iki M5), suvaržytai pagrindinių koordinačių analizei ir suvaržytai pagrindinių koordinačių analizei, naudojant funkcijos kapsulę, gautą iš veganiško paketo (Oksanen ir kt., 2016) (v.2.3-2) ir įdiegti „Phyloseq“ pakete (McMurdie ir Holmes, 2013) (v.1.10), abu R. Neparametrinis adonis testas buvo naudojamas norint įvertinti variacijos procentą. paaiškinta filogenetine grupe kartu su jos statistine reikšme. Siekiant įvertinti suvaržytų pagrindinių koordinačių analizių, tiek paimtų iš „Phyloseq“, tiek ir „Vegan“, paketus, reikšmingumui įvertinti buvo atliktos permutacinės daugiamatės dispersijos analizės. Taip pat buvo atlikta reguliuojama kanoninė koreliacijos analizė, siekiant grafiškai pavaizduoti, ar pupelių prisijungimų genetinis pagrindas koreliuoja su jų rizobakterinių bendrijų struktūromis, naudojant R paketo CCA (González ir Déjean, 2012). Funkcija rcc buvo naudojama, tai yra kanoninės koreliacijos analizės pratęsimas, siekiant nustatyti koreliacijas tarp dviejų duomenų matricų. Vėliau grafikai sugeneruoti buvo naudojama plt.cc funkcija. Kanoninė korespondencijos analizė (CCA, Canoco 5.0) taip pat buvo atlikta su visu kumuliacinių sumų mastelio normalizuotų 16S rRNR duomenų ir šaknies morfologinių požymių, Šaknų tankis, Šaknų sausasis svoris ir mazgelių skaičius, rinkiniu. Buvo apskaičiuoti pakoreguoti paaiškinti variantai ir neribotos permutacijos, siekiant nustatyti reikšmingą kiekvieno kintamojo indėlį, ir pritaikytos Bonferroni pataisos, kad būtų pakoreguotos P vertės . Apribotos įšventinimai buvo sukurti naudojant šakniastiebius ar jų šeimas kartu su augalų genotipiniais ir šaknies morfologiniais požymiais kaip aiškinamuosius kintamuosius.

Rūšių gausumo pasiskirstymas ir diferenciacijos gausos analizė

Rūšių gausos pasiskirstymo modeliai buvo naudojami siekiant nustatyti, ar neutralūs ar nišiniai mechanizmai valdė bakterijų sankaupas. Mes panaudojome komandą „Radfit“ iš „R“ paketo „Vegan“, kad įvertintume sudužusio lazdelės, pirmenybės, normaliojo loginio, „Zipf“ ir „Zipf – Mandelbrot“ rango gausos modelius ir nulinės sumos daugianaujų (ZSM) modelį, naudodami „TeTame2“ programinę įrangą (Jabot et al., 2008). Tinkamų modelių palyginimas atliktas remiantis „Akaike“ informacijos kriterijumi, naudojant lygtį: „Akaike“ informacijos kriterijus = −2 log-likehood + 2 × npar (Mendes et al., 2014). Buvo palygintos „Akaike“ informacijos kriterijaus vertės, kurios buvo pasirinktos kaip žemiausios kaip tinkamiausios duomenims (Dumbrell ir kt., 2010). Norėdami palyginti taksonominės sudėties skirtumus ir įvertinti, ar kai kurių bakterijų taksonai buvo skirtingai gausūs, atlikome trijų etapų analizę, kurios metu atskirai įvertinome skaitytų skaičių, remiantis prieglobsčio, šeimos ir OTU lygiu. Prieglobsčio ir šeimos lygmeniu buvo naudojamos pasirinktinės R komandos, kad visi skaitymai būtų sujungti pagal pasirinktą lygį. Atliekant OTU lygio analizę, filtruotoje OTU lentelėje buvo taikoma funkcija „calcEffectiveSamples“ iš „metagenomeSeq R“ paketo ir pašalintos funkcijos, turinčios mažiau nei vidutinį efektyviųjų pavyzdžių skaičių visose savybėse. Atliekant analizę prieglobsčio, šeimos ir OTU lygiu, mes panaudojome normalizuotas lenteles, taikydami kaupimo sumos mastelio normalizavimą, kaip aprašyta aukščiau. Tada, naudojant „ fitZig“ funkciją iš „metagenomeSeq“, buvo pritaikytas nulio pripūstas Gauso paskirstymo mišinio modelis. Naudodami modelio koeficientus, pritaikėme moderuotus t- testus tarp priedų, naudodamiesi komandomis makeContrasts ir eBayes, gautomis iš R paketo „Limma“ (v.3.22.7) (Ritchie et al., 2015). Gautos P vertės buvo pakoreguotos naudojant Benjamini – Hochberg korekcijos metodą. Taksonų gausos skirtumai tarp prisijungimų buvo laikomi reikšmingais, kai pakoreguotos P vertės buvo mažesnės nei 0, 1 prieglobsčio ir šeimos lygyje, o 0, 05 - OTU lygyje. Vulkanų plotai buvo sukurti grafiškai atvaizduoti moderuotų t- testų rezultatus naudojant R paketą ggplot2 (v.2.0.0) (Wickham, 2009). Norėdami grafiškai pavaizduoti rezultatus, gautus prieglobsčio ir šeimos lygiu, scenarijus, kurį sukūrė Bulgarelli ir kt. (2015) buvo pritaikytas, kuriame buvo naudojamas santykinis skaitinių parodymų milyje skaičius, taip pat dėžutės grafiko vaizdai naudojant R paketą ggplot2. Taksometrai, viršijantys 5 ‰ santykinį gausumą, buvo pavaizduoti brėžinių ir šeimos lygmens analizei. Medžių žemėlapis (v.3.7.3) buvo naudojamas vizualizuoti žymiai gausų OTU, anotuotą taksonomiją, pakoreguotą P vertę ir santykinį milijono tūrį mil milimetruose, kuriuose burbuliukų dydis parodo santykinį gausumą mil. neapdorotų skaitymų skaičius.

Prieiga prie duomenų ir bioinforminės analizės

Duomenys apie seką saugomi Europos nukleotidų archyve, prisijungimo numeriu PRJEB19467. Duomenis, scenarijus ir kodus, naudojamus statistinei ir bioinformatinei analizei, galima rasti atitinkamai: //doi.org/10.5281/zenodo.580027 ir //doi.org/10.5281/zenodo.556538.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Paprastųjų pupelių prisijungimų genetinis ryšys

Įvairovės masyvo technologijos analizė leido gauti 7527 SNP kaip genetinius žymenis aštuoniems atrinktiems vietiniams bendriems pupelių prisijungimams. Filogenetinis ir Bajeso klasterizacijos metodai, taip pat daugialypis mastelio keitimas leido mums iššifruoti pasirinktų pupelių priedų skirtumus (1b ir c paveikslai; papildomas S1 paveikslas). Pupelių prieaugiai G22304 ir G23998, kurie iš pradžių buvo pasirinkti šiam tyrimui kaip laukiniai ir sausumos augalai, parodė stiprią genetinę atitiktį ir buvo klasifikuojami kaip laukiniai arba „protėvių“ prisijungimai atitinkamai A1 ir A2 (1 pav. Ir papildoma S1 lentelė). Dėl prisijungimo prie G51283K1, kuris iš pradžių buvo pasirinktas kaip laukinis, viso genomo palyginimas parodė, kad jis labiau panašus į šiuolaikinių pupelių prisijungimus, nei į laukinių prisijungimus (papildomas paveikslas S2). Mes postuluojame, kad G51283K1 tikriausiai yra piktžolių prisijungimas, tai yra laukinių paprastųjų pupelių ir šiuolaikinės veislės kryžiaus produktas (Toro ir kt., 1990). Taigi prisijungimas prie G51283K1 kartu su G50398, G14947, G51695 ir G5773 buvo klasifikuojamas kaip „modernus“. Toliau šios penkios jungtys vadinamos atitinkamai M1 – M5 (1 pav. Ir papildoma S1 lentelė). Prisijungimas G50632I1, pasirinktas kaip landrasas, neparodė reikšmingo panašumo su jokiais kitais pupelių priedais ir buvo pavadintas L1 (1b ir c paveikslai; papildomas S3 pav.). Pasirinktų pupelių prisijungimų genetinės įvairovės įvedimas dar labiau patvirtino mūsų klasifikaciją: M1 – M5 prisijungimai turi didesnį homozigotinių segmentų skaičių ir aukštesnius įbrėžimo koeficientus nei sausumos L1 ir laukiniai prisijungimai A1 ir A2 (1d ir e paveikslai). A1 ir A2 jungtys yra kilusios iš tos pačios geografinės vietovės, kurioje buvo surinkti keli laukinių paprastųjų pupelių giminaičiai (Blair ir kt., 2012) (1a pav.). Kolekcijų vietų artumas gali iš dalies paaiškinti šių dviejų laukinių prisijungimų genotipinius panašumus.

Image

Paprastųjų pupelių prisijungimo kilmė ir genetinė struktūra. a ) Kolumbijos žemėlapis, kuriame pavaizduota pupelių prieinamumo geografinė kilmė, prisijungimo numeris ir klasifikacija pagal DArT genotipą, atliktą šiame tyrime; b ) kaimynų sujungimas ir filogenetinis ryšys; c ) STRUKTŪROS analizė ( k = 3); d ) homozigotinių segmentų skaičius; e ) Veisimosi koeficientai ( F vertės). Žalia spalva priskiriama protėvių prieigoms A1 ir A2, mėlyna - prie žemės savininko prisijungimo L1 ir raudona - šiuolaikinėms prieigoms M1 – M5. DArT, įvairovės masyvo technologija.

Visas dydis

Šakniniai fenotipiniai laukinių ir šiuolaikinių pupelių prisijungimo bruožai

Laukiniai priestatai A1 ir A2 turėjo panašų savitąjį šaknies ilgį (SRL: šaknies ilgio ir sausos masės santykis) ir panašų šaknų tankį (sauso svorio ir tūrio santykis), skirtingai nuo kitų pupelių priedų (2 paveikslas). Šie rezultatai patvirtina ir pratęsia ankstesnius laukinių paprastųjų pupelių rezultatus, palyginti su veislėmis (Martín-Robles ir kt., 2015). Didelis SRL ir mažas skersmuo kartu rodo plonesnes šaknis ir gali užtikrinti didesnį vandens paieškų ir pasisavinimo efektyvumą, savybes, kurios yra svarbios laukinėms pupelėms, kad jos klestėtų ir išliktų sausose vietinėse buveinėse (Toro ir kt., 1990, Comas ir kt.) al., 2013). Derliaus nuėmimo metu žydėjimas buvo pastebėtas reikšmingas pupelių prisijungimo prie dienų skaičius iki žydėjimo dienų skaičiaus, šaknų sauso svorio ir mazgelių skaičiaus (ANOVA, P <0, 005; papildomas S4 paveikslas). Remiantis ankstesniais atradimais (Toro ir kt., 1990), protėvių grupės pupelių augalams žydėti reikia daugiau dienų nei šiuolaikiniams priedams. Tik A2 turėjo žymiai didesnį mazgelių skaičių vienoje šaknies sistemoje, tuo tarpu reikšmingų skirtumų tarp kitų prisijungimų nerasta (papildomas S4c paveikslas).

Image

Šaknies morfologijos parametrai. a ) Šaknies savitasis ilgis yra šaknies ilgio, padalyto iš šaknies sauso svorio, sandauga. b ) Šaknies tankis yra šaknies sauso svorio produktas, padalytas iš šaknies tūrio. Šaknies ilgį ir šaknies tūrį nustatė WinRHIZO. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp SRL ir šaknies tankių vidutinių vidurkių buvo nustatyti naudojant vienpusę ANOVA ( P < 0, 05). Kiekvienai stojimui buvo naudojami trys pakartojimai. Skirtingos raidės rodo statistiškai reikšmingus skirtumus (Fišerio LSD testas).

Visas dydis

Paprastųjų pupelių šakniastiebių įvairovė

Kadangi šaknų eksudacijos profiliai gali keistis dėl specifinių šaknų architektūros ypatumų (Marschner ir kt., 2002), mes hipotezavome, kad stebimos priešingos šaknų morfologijos ir genetinis skirtumai tarp prisijungimų gali turėti įtakos rizobakterijų bendruomenės sudėčiai. Augalai buvo nuimami žydėjimo metu, kad būtų galima sinchronizuoti visų pupelių mikrobiomų analizę toje pačioje fenologinėje stadijoje. Atliekant 16S rRNR V3 – V4 srities sekvenavimą, buvo atkurta 2, 4 mln. Kokybės rodmenų, identifikuojančių 12 293OTU, esant 97% sekos panašumui (papildoma S4 lentelė). Kalbant apie α įvairovę, pastebėjome reikšmingą visų pupelių prisijungimo rizosferos sumažėjimą, palyginti su biriu gruntu (ANOVA, P <0, 05) (papildomi S5 ir S6 paveikslai). Tačiau tarp prisijungimų reikšmingų įvairovės indeksų skirtumų nerasta, išskyrus stebimų OTU skaičių, kuris M1 buvo didesnis nei A1 (Tukey HSD, P <0, 05). Bray – Curtis metrika ir pagrindinių koordinačių suvaržytos analizės taip pat parodė, kad mikrohabitas (dirvožemis, rizosfera) paaiškino 30, 2% β įvairovės, tai yra bendrą bakterijų bendruomenės struktūros kintamumą tarp grupių (PERMANOVA, P < 0, 001). Atitinkamai buvo pastebėtas reikšmingas rizosferos ir birios grunto atsiskyrimas (PERMANOVA P <0, 005) (3a paveikslas). Šis selektyvus rizosferos slėgis mikrobiomų kompozicijai yra gerai žinomas (Lakshmanan ir kt., 2012; Badri ir kt., 2013). Labiausiai tikėtina, kad jį lemia šaknies eksudatų kiekis ir kokybė kartu su skirtingais augimo greičiais, substrato panaudojimo spektrais ir konkurencingi šakniastiebių genčių gebėjimai. Rezultatai taip pat parodė, kad pupelių genotipas paaiškino 13, 5% viso rizobakterijų bendruomenės sudėties kintamumo (PERMANOVA, P < 0, 001). Sumažinta pagrindinių koordinačių analizė pagal filogenetinę grupę buvo reikšminga (PERMANOVA , P <0, 005) (3b paveikslas). Reguliari kanoninė koreliacijos analizė papildomai patvirtino, kad laukinių pupelių prisijungimo genetinis pagrindas yra susijęs su jų rizobakterijų bendruomenės sudėtimi (papildomas S7 pav.). Šie rezultatai atitinka ankstesnius duomenis apie kukurūzus ir miežius, kur augalų genotipo poveikis formuoja nuo šeimininko priklausomas rizosferos bakterijų bendrijas (Peiffer ir kt., 2013; Bulgarelli ir kt., 2015).

Image

Paprastosios pupelės Rhizosferos bakterijų bendruomenės struktūra. Sumažinta 16S rRNR įvairovės pagrindinių koordinačių (BŽŪP) analizė aštuonių šiame tyrime naudojamų paprastųjų pupelių prisijungimų rizosferoje atitinkamai ( a ) ir be ( b ) 16S rRNR įvairovės biriame dirvožemyje. Bray – Curtis atstumams apskaičiuoti buvo naudojami CSS modifikuoti rodmenys, o apribota analizė atlikta mikrohabitatu ( a ) (30, 2% bendro dispersijos; P <0, 005) ir pupelių grupe ( b ) (13, 47% bendro dispersijos; P < 0, 005). Statistinė suvaržytos analizės reikšmė buvo įvertinta Permanova ( P <0, 005). CSS, kaupiamoji suma.

Visas dydis

Nisze pagrįsti procesai rizobakterijų bendruomenės susirinkime

BAD modeliai ir „Akaike“ informacinio kriterijaus verčių palyginimas parodė, kad šakniastiebių rūšių gausa visų prieigų rizosferoje ir biriame dirvožemyje paaiškinama paskirstymu nišomis (papildomas S8 paveikslas ir papildoma S5 lentelė). Rizosferos aplinkos atveju šaknų išsiskyrimas yra stiprus moduliacinis rizobakterinių bendruomenių veiksnys, kai keli taksonai gali klestėti ir tapti labai gausūs, o kiti bendruomenės nariai - mažai paplitę (Jones ir kt., 2009). Mes taip pat išbandėme neutralų modelį, kad BAD būtų galima palyginti su kitais nišomis pagrįstais modeliais. Pagal šį modelį gaunamas parametras ( m ), kuris atspindi imigracijos į vietos bendruomenes procentą iš regioninio fondo (Etienne, 2005). Artimiausios 1 vertės rodo, kad sklaida nėra ribojama. Birių dirvožemio mėginių m vertės buvo artimesnės 1, palyginti su rizosferos mėginiais, ir tai rodo galimą neutralių procesų poveikį biriame dirvožemyje ir tuo pat metu stipresnį nišą sąlygotą procesą visų rūšių rizosferoje. išbandytos pupelių prieigos (papildoma S6 lentelė).

Rizobakterijų bendruomenės sudėties susiejimas su paprastojo pupelių genotipu

Norint nustatyti, kurie rizobakterijų taksonai buvo paveikti priklausomai nuo pupelių genotipo, diferencialo gausumui įvertinti buvo naudojamas nulio pripūstos Gauso modelis. Prieglobsčio lygyje visi aštuoni pupelių prisijungimai parodė, kad, palyginti su biriu dirvožemiu, buvo praturtintos proteobakterijos ir mažesnis acidobakterijų skaičius (papildomi S9a paveikslai). Phyla Bacteroidetes ir Verrucomicrobia buvo žymiai gausesni laukinių pupelių prisijungimų rizosferoje, tuo tarpu aktinobakterijų buvo daugiau šiuolaikinių pupų prisijungimo rizosferoje (FDR < 0, 1; 4a ir b paveikslai). Šeimos lygmeniu pastebimas reikšmingas Rhizobiaceae ir Sphingomonadaceae gausumas visų pupelių prieigose, palyginti su biriu dirvožemiu (papildomi S9b paveikslai). Laikydamiesi pupelių genotipinės trajektorijos nuo A1 iki M5 (remiantis veisimosi koeficientu ir homozigotiškumu), mes pastebėjome laipsnišką Chitinophagaceae ir Cytophagaceae , tiek Bacteroidetes, prieglobsčio , santykinio sumažėjimo (FDR < 0, 1; 4c ir d paveikslai). Laikantis tos pačios trajektorijos, palaipsniui padidėjo Nocardiodaceae (aktinobakterijos) ir Rhizobiaceae (proteobakterijos) (4g ir h paveikslai) ir tam tikru mastu Streptomycetae (4f paveikslas). Tačiau Bacillaceae pupelių genotipo trajektorijoje specifinio santykinio gausumo modelio nepastebėta; ši šeima buvo žymiai gausesnė tik M5 rizosferoje (4e pav.).

Image

Santykinis bakterinių fitų ir šeimų gausumas rizosferoje įvairių pupų prieigose. Buvo naudojamas santykinis Phyla ir keturių pakartojimų šeimų skaičius (‰) per įstojimą. Prieglobsčio lygyje rodomi ( a ) bakteroidų ir aktinobakterijų bei b ) mikroorganizmų ir verrikomikrobijų rezultatai. Šeimos lygyje rodomi Bacteroidetes ( Chitinophagaceae ( c ) ir Cytophagaceae ( d )) atstovai. Firmicutes ir aktinobakterijų rezultatai pateikti Bacillaceae ( e ), Streptomycetaceae ( f ) ir Nocardioidaceae ( g ) rezultatams. Priemonių proteobakterijų atveju parodytas santykinis šakniastiebių ( h ) gausumas. Skirtingos raidės rodo reikšmingus skirtumus tarp prisijungimų (modeliuojama t- test, FDR <0, 1).

Visas dydis

Toliau mes padidinome konkrečius OTU, kurie skirtingai praturtėjo ar išeikvojo tarp pupelių priedų, naudodami filtruotą OTU lentelę. Remiantis veisimosi koeficientais ir homozigotinių segmentų skaičiumi (1d ir e pav.), Pupelių prisijungimai A1 ir M5 buvo labiausiai skirtingi, todėl pirmiausia buvo palyginta, ar šis skirtumas taip pat atsispindi šakniastiebių bendruomenės sudėtyje. Mes radome 221 OTU, praturtintą A1 rizosferoje, ir 181 OTU, praturtintą M5 rizosferoje (5 pav. Ir papildoma S7 lentelė). A1 žymiai praturtėjo Chitinophagaceae šeimos atstovais (25 OTU). Dyadobacter gentis iš Cytophagaceae šeimos buvo ypač praturtinta A1 rizosferoje. M5 rizosferoje trys iš 10 gausiausių OTU buvo žymiai praturtinti, priklausantys Rhizobium (OTU9047), Streptomyces (OTU7) ir Burkholderiales (OTU8). Taip pat praturtinti M5 buvo du labai gausūs Arthrobacter genties OTU (OTU17 ir OTU886) ir keli OTU iš Nocardioidaceae šeimos (13 OTU) ir Lysobacter genties (8 OTU). Visi mikrobiomų palyginimai tarp A1 ir kitų pupelių priedų parodė panašų praturtėjimą (papildomi paveikslai S10 – S14). Bendrai atliktos analizės parodė, kad bakteriidų ir verrukomikrobijų OTUs buvo praturtinti stojimo A1 rizosferoje, o aktinobakterijų OTUs buvo nuosekliai praturtinti stojimo M5 rizosferoje. Panašiai, lygindami A2 su M4 ir su M5, mes pastebėjome, kad Chitinophagaceae šeimos OTU buvo nuolat praturtinti A2 rizosferoje (papildomi S15 ir S16 paveikslai). Taip pat, kai sujungėme atskirų pupelių prisijungimo duomenis į bendrą abiejų pupelių genotipų grupių (tai yra, protėvių ir šiuolaikinių) duomenų rinkinį, buvo pastebėti panašūs bendrieji rizobakterijų bendruomenės sudėties modeliai ir skirtumai: Bacteroidetes (8 OTU). ir verrukomikrobijos (5 OTU) buvo praturtintos protėvių grupėje, o prieglobsčio aktinobakterijos (2 OTU) buvo praturtintos šiuolaikinėje grupėje (papildomas paveikslas S17).

Image

Diferencinis bakterinių OTU gausumas tarp laukinių pupelių prisijungimo A1 ir šiuolaikinių pupų prisijungimo M5. Palyginimas buvo atliktas naudojant nulio pripūstą Gauso paskirstymo mišinio modelį, po kurio sekė modeliuotas t- testas ir Bajeso metodas. Buvo naudojami keturių pakartojimų duomenys apie kiekvieną stojimą. Parodyti tik tie OTU, kurie žymiai praturtėjo vienu iš dviejų prisijungimų (FDR <0, 05). Didžiausi apskritimai atstovauja Prieglobsčio lygiui. Vidiniai apskritimai rodo klasės ir šeimos lygį. Apskritimų spalva parodo OTU, praturtintus laukinės stojimo A1 (žalia) arba modernaus prisijungimo M5 (raudona) rizosferoje, kuriai priskiriami gentys kursyvu. Apskritimo dydis yra vidutinis santykinis gausus OTU gausumas.

Visas dydis

Įdomu tai, kad Bacteroidetes taip pat gausu didesnio kitų laukinių augalų rūšių ir laukinių augalų giminaičių rizosferoje, įskaitant Cardamine hirsuta (Schlaeppi et al., 2014), Beta vulgaris subsp . maritima (Zachow et al., 2014) ir Hordeum vulgare subsp. spontaneum (Bulgarelli ir kt., 2015). Atliekant žmogaus mikrobiomų tyrimus, bakteroidai sulaukė daug dėmesio dėl jų sąsajų su mažai angliavandenių turinčiomis dietomis, liesomis pelėmis ir svorio netekimu žmonėms (Ley ir kt., 2006; Turnbaugh ir kt., 2006; De Filippo ir kt., 2010; Brown ir kt.) al., 2012). Atsižvelgiant į padidėjusį Bacteroidetes gausumą paprastųjų pupelių laukinių giminaičių šaknyse ir didesnį santykinį Actinobacteria ir Proteobacteria gausumą ant storesnių šiuolaikinių veislių šaknų, kyla pagunda pateikti analogiją „liesoms pupelėms“ ir „nutukusioms pupelėms“. . Ar asociacija su bakteroidais gali sąlygoti sveikesnį augalų vystymąsi, kaip parodyta gyvūnams, ir ar padidėjęs laukinių giminaičių šaknų gausumas yra koevoliucijos požymis, vis dar spėliojama ir atveria įdomias galimybes tolesniems tyrimams. Kalbant konkrečiau, tariamas ryšys tarp šios bakterijos prieglobsčio gausos laukinių augalų giminaičių rizosferoje ir jos sugebėjimo skaidyti sudėtingus biopolimerus (Thomas ir kt., 2011) bus būsimų eksperimentų objektas. Taip pat kalbant apie augalų sveikatą, pasiūlyta Chitinophagaceae šeima, priklausanti Bacteroidetes, dėl jų galimo vaidmens apsaugant nuo dirvoje esančių patogenų (Yin et al., 2013; Chapelle et al., 2016).

Rizobakterijų bendruomenės sudėties susiejimas su šaknies fenotipiniais bruožais

Kanoninė korespondencijos analizė atskleidė, kad bendras šakniastiebių bendruomenės sudėties kitimas paaiškinamas 11, 4% (Bonferroni pakoreguotas P = 0, 002) skirtingais šaknies fenotipiniais bruožais (6a paveikslas), o tai primena procentinę procentinę dalį (13, 5%) rizizobakterijų sudėtyje. paprastojo pupelės genotipas (3b paveikslas). Tarp šaknies morfologinių ir fenologinių bruožų, įtrauktų į analizę, SRL buvo atsakingas už didžiąją dalį paaiškintų variacijų (Bonferroni pakoreguota P = 0, 008), po kurios atsirado mazgelių skaičius (Bonferroni pakoreguotas P = 0, 016). Šaknies tankio ir šaknies sausojo svorio kintamųjų paaiškinimo procentas nebuvo statistiškai reikšmingas. Įdomu tai, kad laukinių prisijungimų A1 ir A2 skirtumus daugiausia lemia mazgelių skaičius. Kai aiškinamieji kintamieji naudojami kartu su bakterijų fila (6b paveikslas) ir bakterijų šeimomis (6c paveikslas), rezultatai rodo, kad Bacteroidetes šeimų gausą paaiškina SRL, priešingai nei aktinobakterijų šeimų gausa.

Image

Apribota kanoninė korespondencijos analizė 16S sekos duomenų ir šaknų morfologinių bruožų. a ) Šaknies morfologiniai bruožai, kaip aiškinamosios aštuonių skirtingų pupelių pupelių bendrosios rizobakterijų bendruomenės sudėties skirtumai. Rizobakterijų bendruomenės sudėtis pagrįsta CSS normalizuotu skaičiumi. Žali trikampiai žymi laukinių pupelių prisijungimų A1 ir A2 pakartojimus, mėlyni kvadratai - žemės jungties prisijungimą L1, o raudoni apskritimai - šiuolaikinių pupelių priedus M1 – M5. Spalvotos strėlės rodo šaknies morfologinius požymius: mazgelių skaičių ir sausos šaknies svorį (juoda), savitąją šaknies ilgį (SRL) ir šaknies tankį (raudona). b ) Tas pats, kaip a punkte, vaizduojantis šaknies morfologinius požymius kaip aiškinamuosius kintamuosius skirtumus tarp skirtingų bakterinių fililų. Tik fijos, kurių santykinis gausumas didesnis kaip 1%, yra spalvos: Acidobakterijos (oranžinės), Actinobacteria (raudonos), Bacteroidetes (žalios), Firmicutes (mėlynos), Proteobacteria (geltonos) ir Verrucomicrobia (šviesiai mėlynos). c ) Tas pats kaip ir b punkte, pavaizduojantis šaknies morfologinius požymius kaip aiškinamuosius kintamuosius skirtumus tarp bakterijų šeimų. Čia buvo išskirtos tik bakterijos, priklausančios Actinobacteria (raudona), Bacteroidetes (žalia), Verrucomicrobia (šviesiai mėlyna) ir Firmicutes (mėlyna). CSS, kaupiamoji suma.

Visas dydis

Išvados

Šiame tyrime mes nustatėme reikšmingus ryšius tarp rizobakterijų bendruomenės sudėties, bendro pupelių genotipo ir specifinių šaknų fenotipinių bruožų. Phyla Bacteroidetes ir Verrucomicrobia buvo labiau paplitę laukinių paprastųjų pupelių prisijungimo rizosferoje, tuo tarpu phyla Actinobacteria ir Proteobacteria atstovai buvo praturtinti šiuolaikinių pupų įsisavinimo šaknimis. Ateityje bus tiriami, kokie bus pastebėti mikrobiomų sudėties pokyčiai paprastųjų pupelių augimui ir sveikatai. Galiausiai bus atsakyta į didesnį klausimą, jei augalų prijaukinimas pakenkė (ar ne) teigiamąjį rizosferos mikrobiomo poveikį. Rizobakterijų bendruomenės sudėties skirtumai tarp laukinių ir šiuolaikinių pupų prielaidų rodo augalų genetinį pagrindą šakniastiebių mikrobiomų rinkinyje. Nors šios sąvokos galioja ir kitiems svarbiems maistiniams augalams (pavyzdžiui, javams), tik su ankštiniais augalais galima ištirti, kaip susipynę mazgeliai, rizosferos mikrobiota ir santykiai tarp šių dviejų augalų ir mikrobų rūšių sąveikos. Mūsų tyrime tik prisijungus prie laukinių pupelių A2, atsirado didesnis mazgelių skaičius vienoje šaknies sistemoje, tuo tarpu reikšmingų skirtumų tarp kitų pupelių prisijungimų nerasta. Tai rodo, kad simbiotinis azoto fiksavimas per se gali būti ne pagrindinis šaknies mikrobiomų kompozicijos variklis, kaip neseniai buvo elegantiškai parodyta Lotus japonicum atveju (Zgadzaj ir kt., 2016). Šie rezultatai taip pat reiškia, kad pupų rizosferos mikrobiotą formuoja kiti ar papildomi užuominos, gautos iš šeimininko. Mūsų tyrime naudojamas palyginti mažas mėginio dydis neleidžia atlikti statistiškai patikimos GWAS analizės, tačiau jis pateikė gerai diferencijuotų savybių rinkinį laukiniuose ir šiuolaikiniuose prisijungimuose, susijusiuose su daugybe bakterinių taksonų. Norint išsiaiškinti genus ar molekulinius žymenis, kurie galiausiai gali būti naudojami augalų veisimo programose įdarbinant konkrečius augalus naudingus augalus, reikės nuodugnios genetinės ir fenotipinės analizės didesnei augalų daliai (Kraft ir kt., 2009). mikrobų taksai.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

  2. 2.

    Papildomos lentelės

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija pridedama prie šio dokumento „ISME Journal“ svetainėje (//www.nature.com/ismej)