Lipidų-nanostruktūros hibridai ir jų pritaikymas nanobiotechnologijose | NPP Azijos medžiagos

Lipidų-nanostruktūros hibridai ir jų pritaikymas nanobiotechnologijose | NPP Azijos medžiagos

Anonim

Dalykai

  • Biomedžiagos
  • Nanostruktūros

Anotacija

Ląstelių membranose yra įvairių lipidų ir funkcinių baltymų, kurie siūlo aktyvias platformas, kurios membranos komponentus suskirsto į funkcinius mazgus ir atlieka biologiškai svarbias reakcijas. Dinaminis ir sudėtingas membranų pobūdis daro jas patrauklias medžiagas, tačiau tuo pačiu metu tyrėjai praneša apie didelę eksperimentinę neapibrėžtumą kontroliuodami membranų reakcijas ir išgaudami vertingą informaciją. Įspūdingos naujos nanomedžiagų struktūros ir savybės galėtų būti panaudotos sprendžiant minėtus klausimus, o lipidų-nanostruktūros hibridų projektavimas ir sintezė galėtų būti naudingi tiriant lipidų membranų biotechnologijas ir nanobiotechnologijas. Šios hibridinės struktūros yra panašios į biologinių molekulių ir struktūrų matmenis bei fizikines ir chemines savybes, atsirandančias dėl lipidų ir nanomedžiagų. Todėl lipidų-nanostruktūros hibridai siūlo papildomas galimybes sintetinamoms struktūroms valdyti, suteikia naujų žinių apie nanostruktūrų ir biologinių sistemų supratimą ir suteikia galimybę pamėgdžioti funkcinius tarpląstelinių membranų komponentus ir stebėti su membranomis susijusias reakcijas labai jautriai ir kontroliuojamai. Šioje apžvalgoje pateikiame naujausius įvairių lipidų-nanostruktūros hibridų sintezės ir šių struktūrų taikymo biotechnologijose ir nanotechnologijose pasiekimus. Toliau aprašome mokslinius ir praktinius lipidų-nanostruktūros hibridų pritaikymo būdus aptikti į membraną nukreiptas molekules, susieti nanostruktūras su gyvomis ląstelėmis ir sukurti membraną imituojančias platformas įvairiems tarpląsteliniams procesams tirti.

Įvadas

Ląstelių membranas pirmiausia sudaro įvairūs lipidai, dviejų asimetrinių lapelių ir funkcinių baltymų pavidalu. Membranos nusako ląstelės ribą ir suteikia pagrindinę platformą, leidžiančią griežtai reguliuoti daugelį biologinių procesų, įskaitant medžiagų pernešimą, signalo perdavimą, judėjimą, patogeninius kelius, tarpląstelinę organizaciją ir atsaką į tarpląstelinę matricą. Šie procesai pirmiausia yra susiję su membranų sudedamųjų dalių konformaciniu pasikeitimu ir pertvarkymu, kurie pagreitina laikinį ir erdvinį ląstelių membranų heterogeniškumą. Toks dinamiškas ir sudėtingas pobūdis reiškia, kad vietinės ląstelių membranos yra eksperimentinio neapibrėžtumo šaltiniai, todėl reikia didelių sugebėjimų tiksliai įvertinti ląstelių membranų fizikinį ir cheminį specifiškumą, kad būtų sumažintas eksperimentinis sudėtingumas ir netikrumas, ir galimybės panaudoti pagrindinės lipidų savybės, įskaitant šoninį sklandumą, struktūros universalumą ir suderinamumą su kitais ląstelių membranos komponentais. Fosfolipidinės pūslelės, kurias pirmą kartą 1965 m. Pastebėjo Banghamas ir kt., 1 yra universalūs supramolekuliniai agregatai, kuriuos galima lengvai paruošti su įvairiomis formomis, dydžiais ir kompozicijomis. Fizinės lipidinių pūslelių savybės yra panašios į natūralių ląstelių membranų savybes, kuriose ląstelės vidus yra izoliuojamas nuo išorinės aplinkos lipidų ir baltymų turinčių dinaminių ribų. Lipidinių pūslelių gebėjimas sureguliuoti cheminę sudėtį ir įterpti bei kapsuliuoti įvairias medžiagas palengvino pūslelių naudojimą daugelyje sričių, įskaitant ląstelių membraną imituojančias medžiagas ir vaistų tiekimą. Vėliau Tamm ir McConnell sukūrė palaikomus lipidinius dvisluoksnius sluoksnius (SLB) arba savarankiškai surinktas lipidų membranas ant kieto pagrindo. 2, 3 SLB yra pavyzdinė membranos platforma, kuri sintetiniu būdu kontroliuoja tvirtas dirbtinių ląstelių membranas, pakartoja svarbiausių membranų funkcijas ir leidžia ištirti paviršiaus membranų struktūrinius pokyčius ir reakcijas naudojant įvairias optines ir apibūdinimo priemones. Per pastaruosius du dešimtmečius SLB buvo dekoruoti įvairiomis su membranomis susijusiomis molekulėmis, padengtomis ant įvairių kietų atramų ir sujungtų su mikrohidroelektronikos ir mikrotraumos metodais. 4, 5 Šie pasiekimai leido sukurti SLB pagrįstas membraną imituojančias sistemas, skirtas jutimo membranų reakcijoms tirti, tarpląsteliniam signalizavimui ir membranų rūšių atskyrimui. 6, 7, 8, 9

Kad būtų galima modeliuoti ir stebėti įvairius ląstelių membranų procesus, reikia atkurti šoninį subceluliarinio matmens nevienalytiškumą, o molekulinę sąveiką nuskaityti su dideliu atkuriamumu ir dideliu jautrumu. Nanomedžiagos sukėlė didelį susidomėjimą, nes jų dydis, forma, matmenys ir nuo kompozicijos priklausomos savybės yra panašios į biologinių molekulių ir struktūrų savybes, leidžiančias ištirti biologinius reiškinius tarpląsteliniame lygmenyje. Naujausi tikslinių nanostruktūrų (tai yra metalinių nanodalelių, puslaidininkinių nanodalelių, metalų oksidų nanodalelių, nanovamzdelių / laidų, nanoporų ir nanotopografinių paviršių, turinčių aukštą valdymą) sintezės ir gamybos metodų pasiekimai paskatino naujų platformų ir metodikų, skirtų vertingoms medžiagoms išgauti, kūrimą. informacija apie sudėtingus biologinius procesus. Tokie lūžiai pasinaudojo unikaliomis fizikinėmis ir cheminėmis pasekmėmis (pavyzdžiui, paviršiaus plazmonų rezonansas, superparamagenetizmas, puikios liuminescencijos savybės, didelis paviršiaus ir tūrio santykis bei didelis signalo ir triukšmo santykis ir panašiai), atsirandančios dėl skirtingo dydžio, nanomedžiagų sudėtis, forma ir išdėstymas. 10, 11, 12 Paprastos lipidų struktūros gali būti paverčiamos universaliomis hibridinėmis nanostruktūromis, jei nanostruktūros naudojamos kaip tvirta atrama. Lipidų-nanostruktūros hibridai dažnai pasižymi naujomis struktūromis ir savybėmis, kurių neįmanoma gauti naudojant atskirus komponentus. Lipidų-nanostruktūros hibridų sintezė taip pat leidžia sukurti dirbtinių ląstelių membranų aplinką nanomedžiagų paviršiuje, galinčiose priimti biomolekules, mažai trikdant biologinį aktyvumą, molekulinę struktūrą ir orientaciją. Ši parinktis sukuria nanoskalės paviršių, kuriame būtų ir fizinių, ir cheminių ženklų, į kuriuos ląstelės galėtų reaguoti, ir tai sudarytų pagrindą gyvų, negyvenančių sąsajų platformoms kurti. Be to, hibridinę sistemą galima naudoti įvairiais atvejais, pradedant nanomedžiagų pagrindu sukurtais biojutikliais ir baigiant membranos paviršiuje vykstančiomis molekulinėmis reakcijomis. Dvisluoksniai lipidų sluoksniai taip pat gali būti naudingi kuriant naujus darbo principus, pagrįstus unikaliomis savybėmis, tokiomis kaip didelis elektrinis atsparumas ir šoninis sklandumas. Taigi lipidų sluoksnių ir nanomedžiagų hibridai suteikia naujų įdomių galimybių ląstelių membranų tyrimams, kurių jautrumas, erdvinė skiriamoji geba ir valdomumas yra precedento neturintys. Tačiau sintetiniai metodai ir tokių hibridinių struktūrų susidarymo pasekmės dar nėra iki galo ištirti ar suprantami, ir šių klausimų sprendimai yra labai svarbūs norint patikimai ir praktiškai naudoti nanostruktūras ir lipidus tiek medžiagose, tiek biologinėse reikmėse. Šiame darbe apžvelgiame naujausią pažangą kuriant ir sintezuojant SLB pagrįstus lipidų-nanostruktūros hibridus ir panaudojant šias struktūras biotechnologijų ir nanotechnologijų srityse. Šioje apžvalgoje, be tipinių sintetinių schemų, skirtų liposomų-nanostruktūros hibridams, ir analitinėms reikmėms, 13, 14 daugiausia dėmesio skiriame lipidų-nanostruktūros hibridų pritaikymui biomolekulėms, sąveikaujančioms su giminingų membranų receptoriais, sukurti ir gyvų ląstelių ląstelėms sukurti. imituojančios ir sąveikaujančios platformos tarpląsteliniams procesams, vykstantiems membranų sankryžose, ištirti.

Lipidų-nanostruktūros hibridų formavimasis, jų struktūros ir savybės

Jei lipidinės plėvelės yra mechaniškai palaikomos nanostruktūrizuotais substratais, susidariusią hibridinę struktūrą daugiausia lemia laikančiųjų nanomedžiagų struktūra ir savybės, nes lipidų sluoksnių morfologija dubliuoja apatinių atramų struktūrą ir tuo pačiu išlaikant artimą paviršiaus artumą. Tokiu atveju lipidų molekulės turėtų būti adsorbuojamos ir vėliau pertvarkomos savaime susidedant iš nanostruktūrizuoto paviršiaus. Vis dėlto didėja susirūpinimas dėl lipidų membranų ir baltymų biologinių funkcijų išsaugojimo, kai jos yra integruotos su nanostruktūrizuotomis atramomis, nes nanotopografinės savybės (pasižyminčios grubiu paviršiumi, dideliu išlinkiu ir (arba) pakitusiais matmenimis) gali turėti didelį poveikį struktūroms. gautų lipidų membranų ir jų komponentų savybes, atsižvelgiant į formavimosi kinetiką, stabilumą, gelio-skysčio sambūvio režimą ir lipidų molekulių dinamiką. Todėl suprantant tokią membranos ir apatinio nanostruktūrinio substrato sąveiką ir pasirinkus tinkamą sintetinį metodą, bus galima racionaliai suprojektuoti ir sintetinti didelio aktyvumo nano-bio hibridus.

Lipidų, dvisluoksnių, modifikuotų nanotopografinių substratų

Įprasti plokštieji SLB dažniausiai formuojami naudojant pūslelių suliejimo metodą. Kai mažos vienaląstelės pūslelės, paprastai kurių skersmuo ∼ 100 nm, inkubuojamos su hidrofilinėmis kietomis atramomis, pūslelės yra adsorbuojamos paviršiuje ir deformuojamos sąveikaujant su kietu substratu. Atramos sukeltą stresą dar labiau padidina šalia esančių pūslelių adsorbcija. Adsorbuotos liposomos plyšta ir sudaro ištisinį lipidų dvisluoksnį sluoksnį ant kieto pagrindo, esant tam tikram pūslelių paviršiaus tankumui, kuris atitinka kritinę vezikulinės dangos dalį. Šis pūslelių suliejimo metodas taip pat buvo plačiai naudojamas formuojant lipidų-nanostruktūros hibridus. Tačiau lipidų-nanostruktūros hibridų formavimosi kinetika ir membranos fizika žymiai skiriasi nuo plokščių SLB.

Visų pirma, naujausi eksperimentiniai rezultatai parodė, kad tam tikras paviršiaus kreivumo laipsnis skatina struktūrinio vientisumo praradimą ir lipidų membranų formavimąsi nanostruktūrizuotuose substratuose. 16, 17 atliktas atominės jėgos mikroskopijos tyrimas atskleidė, kad substrato palaikomos silicio dioksido nanodalelės, kurių skersmuo nuo 1, 2 iki 22 nm, pramušė L-α-dimiristoilo fosfatidilcholino dvisluoksnį, tuo tarpu dalelės, nepatenkančios į tokio dydžio diapazoną, palaikė L-α-dimyristoil fosfatidilcholino membraną be porų susidarymas (1a pav.). Nepilnas dvisluoksnis susidarymas buvo priskirtas dėl nepalankios membranos lenkimo energijos, sudarančios labai išlenktą struktūrą. Krioelektroninės mikroskopijos tyrimas atskleidė, kad detalus smulkių vienaląsčių pūslelių, kurios sudarė ištisą dvisluoksnį ant labai išlenktų silicio dioksido nanodalelių, plyšimo mechanizmas yra susijęs su atskirais plyšimo procesais, mažesniais už vietinį pūslelių kritinį tankį, reikalingą skatinti SLB formavimąsi plokštumoje. silicio dioksido paviršiaus (1b paveikslas). Šis tyrimas taip pat parodė lipidų kompozicijos svarbą konstruojant ištisinį ir nepažeistą lipidų dvisluoksnį sluoksnį. Pilnas SLB susidarymas silicio dioksido nanodalelėse buvo pasiektas naudojant liposomas su teigiamais, neutraliais arba mažais grynaisiais neigiamais krūviais, tuo tarpu liposomos su dideliu grynu neigiamu krūviu liko neskaidytos silicio dioksido nanodalelėse (1b paveikslas). Mažų vienaląsčių pūslelių dydis taip pat daro didelę įtaką pūslelių transformacijos į dvisluoksnę kinetiką nanostruktūroms, į kurias įdėtos nano kiaurymės. Taip pat pranešta apie tyrimus, kurių tikslas - suprasti SLB susidarymą nanotopografiniuose paviršiuose ir suprojektuoti lokalizuoto paviršiaus plazmoninio rezonanso (LSPR) membranos biojutiklius, sudarytus iš lipidais padengtų metalinių nanodalelių arba nanodalelių. 20, 21

Image

Palaikomi lipidiniai dvisluoksniai sluoksniai (SLB) ant nanotopografinių kietų substratų. a ) Viršuje: schemos iliustruoja lipidų dvisluoksnių sluoksnių struktūras, turinčias skirtingo dydžio silicio dioksido nanodaleles. Apačia: atitinkamos atominės jėgos mikroskopijos (AFM) viršutinių schemų nuotraukos. 16 ( b ) viršuje: krioperdavimo elektroninio mikroskopo vaizdai iš silicio dioksido dalelių ir 1, 2-dioleoil- sn -glicerono-3-fosfocholino (DOPC) / 1, 2-dioleoil- sn -glicero-3-fosfo-L mišinių serinas (DOPS) (4: 1) mažos vienaląstelinės pūslelės (visureigiai), greitai užšaldomos po 1 min. inkubacijos laiko. Daugelio dalelių paviršiuose yra vienas ar du lipidų dvisluoksnės pleistrai (juodos rodyklės). Nedaug dalelių turi adsorbuotas, neardytas pūsleles ant jų paviršiaus (baltos žvaigždutės). Apačia: SLB, suformuotos tik su visureigiais, turinčiais tik neutralių lipidų (DOPC, 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicerolio-3-fosfocholino (POPC) ir L-α-dimiristoilfosfatidilcholino (DMPC)) ir didelę neigiamai įkrautų lipidų koncentraciją (DOPC / DOPS, 1: 1). Mastelio juostos yra 50 nm. 18

Visas dydis

Lipidų dvisluoksniai sluoksniai ant nanopatternų

Lipidiniai dvisluoksniai sluoksniai yra atrenkami kaip skysčiai ant konkrečių medžiagų, paprastai silicio dioksido, paviršiaus. Kaip difuzijos barjerą gali būti naudojama struktūra, trukdanti susidaryti dvisluoksniam sluoksniui arba lipidų molekulių slydimui ant paviršiaus. „Boxer“ grupė pasiūlė ir išsamiai ištyrė modeliuotų lipidų dvisluoksnių sluoksnių gamybos metodus, naudodama įvairius modeliavimo būdus. 22, 23 Šie metodai buvo naudojami daugiakompozicinių lipidų mikrotraumams gaminti ir membranos dinamikai valdyti. 24 Mažų vienaląsčių pūslelių, inkubuotų su barjeriniu raštu pagrindais, inkubacija lemia lipidų membranų, kurios riboja molekulinius judesius, erdvinius modelius. 7, 25, 26 Pažangos modeliavimo metodais su įvairiomis medžiagomis ir erdvine skiriamąja geba suteikia galimybę gaminti nanopatvirtintus skysčio paviršius, kurie moduliuoja membranos rūšių judėjimą nanometro matmenyje.

Elektroninių pluoštų litografija buvo dažniausiai naudojama gaminant Cr nanopatternus, kurie visiškai ardo lipidų dvisluoksnį sluoksnį, todėl jie galėtų tarnauti kaip pasyvūs barjerai, trukdantys lipidų šoninei difuzijai (2a pav.). 27 Pakėlimo procesas yra atsparus modeliams, sugeneruotiems naudojant elektronų pluošto litografiją, paprastai sukuriančios kelių barometrų aukščio ir šimto nanometrų pločio Cr barjerus. Šios kliūtys yra naudojamos ląstelių membranų receptorių, esančių sąveikaujant su gyvomis ląstelėmis, erdviniu organizavimu. Tačiau šis metodas gali būti naudingas formuojant modelius santykinai mažame plote (kelių mikrometrų dydžio), o substrato veikimas didelio vakuumo aplinkoje riboja šio metodo naudojimą tiesioginiam ir daugiakomponenčiam biomolekulių modeliavimui. .

Image

Lipidų-nanodalelių hibridų formavimasis. a ) metalinių linijų apdirbimas naudojant elektronų pluošto litografiją ir vėlesnis raštuotų lipidų dvisluoksnių sluoksnių formavimas. 27 ( b ) Kairė: schematiškai parodyta lygiagrečių skirtingų lipidų modeliavimas tarpląstelinėse skalėse, naudojant daugialypį panardinamojo rašiklio nanolitografijos (DPN) konsoles. Dešinėje: daugiasluoksnių 1, 2-dioleoil- sn -gliceroz-3-fosfocholino (DOPC) struktūrų, turinčių fluoroforu pažymėtų lipidų (rodamino / raudonos ir fluoresceino / žalios) fluorescenciniai vaizdai. 32 ( c ) Kairė: atominės jėgos mikroskopijos (AFM) pagrįstos nanodalinių litografijos schema, skirta nanoskalės palaikomiems lipidų dviejų sluoksnių (SLB) formavimui. Dešinėje: nano nuskusto galvijų serumo albumino (BSA) monosluoksnio (viršuje) ir SLB linijų (apačioje) epifluorescenciniai vaizdai. Mastelio juosta yra 3 μm. 33 ( d ) viršuje: į nanodalelių rinkinį įterptų SLB schema. Vidurys: iš kairės, etaloninis aukso nanodalelių matricų SEM vaizdas ir fotoaktyvuotos lokalizacijos mikroskopijos (PALM) vaizdas atskirų efrin-mEos-His10 molekulių, konjuguotų toje pačioje aukso nanodalelių matricoje. Masto juosta abiem atvejais yra 200 nm. Dešiniajame paveikslėlyje pavaizduotas radialinio paskirstymo funkcijos palyginimas su visu PALM atvaizdu (juodas) ir pamatiniu SEM atvaizdu (raudonas). Apačia: fluorescencinis atsistatymas po fotobalinimo (FRAP) ant DOPC dvisluoksnio stiklo, padengto 0, 5% Texas Red-1, 2-dihexadecanoyl- sn -glicero-3-fosfoetanolamino (DHPE). 34

Visas dydis

Tušinuko švirkštimo priemonės nanolitografija (DPN) yra nuskaitymo zondo pagrindu sukurta litografijos technika, kuria rašalo molekulės tiesiogiai tiekiamos iš atominės jėgos mikroskopo galiuko į apatinį substratą. 28 Buvo įvesta masiškai lygiagreti DPN technika, kad būtų galima gaminti daugybinius įvairių molekulių modelius ir didelio pralaidumo molekulinius atspaudus. 29 Rašant lipidų molekules, poli (dialidimetilamonio chloridas) buvo naudojamas kaip dažymo molekulė DPN, siekiant įvesti difuzijos barjerus ir biofunkcionalizacijos vietas SLB. 30 Po SLB susidarymo, gauti poli (dialidimetilamonio chlorido) modeliai suteikė baltymų adsorbcijos ir lipidų difuzijos slopinimo šabloną. Tam tikrais atvejais buvo suformuotos nesuskaidytos poli (dialdimetilamonio chlorido) linijos, ir tokios struktūros galėjo būti naudojamos imituoti ribotą difuziją ląstelėse ir ištirti membranoje surištų molekulių difuzijos difuziją. Fosfolipidai, pagrindinės ląstelių membranų sudedamosios dalys, buvo tiesiogiai perkelti ir suformuoti į modelines skysčių lipidų plėveles, naudojant DPN. 31 Esant tinkamam drėgnumui ir nuskaitymo greičiui, nusodinto lipidų sluoksnio storis gali būti kontroliuojamas iki vieno dvisluoksnio storio, o šoninė skiriamoji geba gali būti sumažinta iki 100 nm bangos lygio. Daugiakomponentių lipidų ir lipofilinių medžiagų masyvus lygiagretus ir tiesioginis tiekimas į kietą paviršių daugybėje ilgio mastelio leidžia DPN įgalinti natūralių ląstelių membranų heterogeninių mikro- ir nano-domenų imitaciją, panašų į lipidų plaustus (2b paveikslas). 32 Atominės jėgos mikroskopijos antgalis gali vietoje pašalinti esamą ploną plėvelę iš kietos atramos; šis metodas yra žinomas kaip nanodalinių litografija (2c paveikslas). Kai nuskusta sritis vėl užpildoma kitu lipidų sluoksniu, gali susidaryti toks siaurų kaip 50 nm lipidų raštas. Kitais atvejais baltymų modifikavimo vietų, esančių SLB, nanodalelės buvo įvestos naudojant bloko kopolimero micelių nanolitografiją (2d pav.). 34 Auksinių jonų turinčių dvisluoksnių kopolimerų micelių savaiminis surinkimas į šešiakampį matricą ir po to atliekamas oro plazminis apdorojimas. Substrate susidarė ∼ 5–7 nm aukso nanodalelės, o ant šio pagrindo buvo suformuota SLB, naudojant pūslelių suliejimo metodą. Šis metodas leidžia kontroliuoti tarpus tarp dalelių masyve nustatant polimero molekulinę masę ir nereikalauja sudėtingų modeliavimo procedūrų. Auksinės nanodalelės, įterptos į SLB, buvo modifikuotos įvairiomis biologinėmis molekulėmis per tiolio jungiklius. Šis požiūris siūlo metodus, kaip funkcionalizuoti baltymus ar kitus ligandus, susijusius su skystu lipidų komponentu, fiksuotomis nanodalelėmis arba lipidais ir nanodalelėmis dideliame plote.

Lipidų-1D-nanostruktūros hibridai

Unikalios vienmačių (1D) nanostruktūrų geometrinės savybės leidžia jas efektyviai integruoti į funkcinius įrenginius didelio tankio matricos formatu, o jų nanoskalės dydžio poveikis (toks didelis jautrumas paviršiaus rišamiesiems įvykiams) gali būti panaudotas įvairiems. jutiminės programos. 35 Lipidinio dvisluoksnio įvedimas į 1D nanostruktūrizuotą paviršių leidžia integruoti įvairias su membranomis susijusių biomolekulių funkcijas ir struktūras ant išdėstytų 1D nanostruktūrų ir imituoti ląstelių membranomis susijusių pluoštinių struktūrų chemines ir mechanines savybes inžinerijos būdu sukurtose 1D nanostruktūrose. .

Supramolekulinis lipidų susiformavimas ant anglies nanovamzdelių (CNT), viršijantis kritinę micelių koncentraciją, buvo stebimas perdavimo elektronų mikroskopu. 36 Taikant šį metodą, lipidai buvo adsorbuojami CNT paviršiuje įprasto žiedo, spiralės arba dvigubos pusės cilindro spiralės pavidalu, atsižvelgiant į CNT simetriją ir skersmenį, ir šie rezultatai labai patvirtina hipotezę, kad lipidai gali būti organizuojami. išilgai grafito tinklo. Nekovalentinis paviršiaus dekoravimas amfifiliais yra perspektyvus būdas išsaugoti būdingąsias CNT savybes ir paversti CNT tirpiais vandeningoje aplinkoje. Nors šis statinis lipidų-CNT hibridas yra pakankamai tvirtas ir suteikia daug privalumų CNT paviršiaus inžinerijai, skysto lipidų dvisluoksnio formavimasis CNT ir natūralios struktūros bei funkcijų išsaugojimas su membranomis susijusioms biomolekulėms yra labai sudėtingas uždavinys. užduotys. Buvo pranešta, kad lipidų molekulės susideda iš skystos 1D nanostruktūros ant CNT šablono, o lipidų šoninis sklandumas buvo patikrintas nustatant CNT skersmenį (3a pav.). 37 Kad palaikytų hidrofilines lipidų dvisluoksnės galvos grupes, CNT sluoksniai buvo apvynioti polioelektrolitais. Surinkti polielektrolitai elektrostatiniu būdu stabilizavo lipidų dvisluoksnį 1D konfigūraciją ir leido kontroliuoti struktūros skersmenį. CNT štampuotas 1D lipidų sluoksnis turėjo struktūrinį tęstinumą ir išlaikė lipidų molekulių šoninį mobilumą, net ir labai išlenktoms struktūroms. Tačiau jų difuzijos koeficientai buvo beveik dviem laipsniais mažesni nei kitų polimerais palaikomų plokščių lipidų dvisluoksnių sluoksnių. Vėliau buvo pranešta apie 1D nanostruktūros palaikomas lipidų membranų hibridines struktūras, turinčias aukštus difuzijos koeficientus ir beveik 100% lipidų judrumą (3b pav.). 38 Šiame darbe amorfiniai siliciu dengti CNT, kurių skersmuo nuo 20 iki 200 nm, buvo pakabinti per mikropluoštus kanalus Si / SiO2 substratuose, kurie buvo naudojami kaip kietos hidrofilinės atramos. Šios struktūros pasižymėjo ypač siauru skersmens pasiskirstymu ir lygiomis sienomis, ir suteikė patikimą pagrindą ištirti, kaip substrato kreivumas veikia lipidų judrumą. Šių vamzdinių nanostruktūrų lipidų difuzijos koeficientai buvo išmatuoti 2–10 μm 2 s – 1 intervale, vertės panašios į lipidų difuzijos koeficientus ant plokščio stiklo pagrindo, o difuzijos koeficiento reikšmė dar labiau padidėjo, jei nanosienos buvo susiaurintos. iki 50 nm. Šią tendenciją prognozavo laisvosios erdvės difuzijos modelis, kuriame teigiama, kad lipidų molekulės juda greičiau, kai labiau išlenktas paviršius sukelia papildomą laisvą erdvę tarp lipidų galvos grupių. Lipidinės pūslelės kelia didelį susidomėjimą, nes bendras lipidinių pūslelių tūris yra daug mažesnis nei 10–12 l - tokio dydžio negalima pasiekti naudojant įprastus mikrofluidinius prietaisus. Vogelis ir kt. 39 susintetinti ir surinkti attoliterio molekuliniai indai į tvarkingas matricas ant stiklinio substrato, naudojant mikrokontaktų spausdinimo techniką ir specifinę ligando ir receptoriaus sąveiką. Ant kieto paviršiaus imobilizuotos lipidinės pūslelės buvo naudojamos kaip nanoreaktorius, išskiriantis ypač mažą tirpalo tūrį kartu su reagentais ir produktais. 40, 41, 42, 43, 44. Kontroliuojamas molekulinių reakcijų maišymas ir sukėlimas savaiminio uždarų pūslelių tūryje gali būti naudingas, tačiau įgyvendinti šias sąvokas yra labai sudėtinga. Milžiniškos vienaląsčių pūslelių 1D lipidų nanovamzdelių tinklo sistemos leidžia pernešti reaktyviąsias medžiagas iš konteinerių ir inicijuoti bei valdyti chemines reakcijas ypač mažais kiekiais. 13, 45, 46. Milžiniško vienalamelės pūslelės prasiskverbimas į daugiasluoksnį membranos rezervuarą su mažu buferiniu stikliniu pipete ir po to atliekamas mechaninis traukimas pagamino lipidų vamzdelį, sujungiantį injekcinio stiklo galiuką su originalia pūsleline. Lėtai įpurškiant buferį, lipidų nanovamzdelio gale atsirado nauja pūslelė (3c paveikslas). Lipidai, reikalingi naujoms pūslelėms augti, buvo gaunami iš pritvirtintų daugiasluoksnių pūslelių, naudojant tempimo mechanizmą. Naudojant šį metodą, buvo sėkmingai sukurti geometriškai sudėtingi 3D lipidų nanovamzdelių-pūslelių tinklai. 48

Image

Vieno matmens (1D) nanomedžiagų hibridai. a ) Viršuje: schematiškai parodyta polimero ir lipidų jungtis ant anglies nanovamzdelių (CNT). CNT yra padengti keliais kintamais sluoksniais priešingai įkrautų polielektrolitų, o išorinis paviršius yra padengtas lipidų dvisluoksniu sluoksniu. CNT perdavimo elektroniniu mikroskopu (TEM) atvaizdai, padengti penkiais kintamaisiais poli (dialildimetilamonio chlorido) (PDDA) / poli (natrio 4-stireno sulfonato) (PSS) sluoksniais. Mastelio juosta yra 20 nm. Apačia: eksperimentinės (taškinės) ir modelinės (linijinės) fluorescencijos atkūrimo kreivės dviejų fluorescencijos atkūrimo kreivių metu po fotobalinimo (FRAP) ciklų toje pačioje vietoje ant lipidų dengtų nanovamzdelių. Mastelio juosta yra 5 μm. 37 ( b ) viršuje: siliciu dengtų CNT, modifikuotų lipidų dvisluoksniais sluoksniais, schema. Silikonu padengtų CNT SEM vaizdas, pakabintas per 5 μm pločio kanalą. Apačia: išmatuotas lipidų judrumas buvo palygintas su laisvosios erdvės difuzijos modeliu. 38 c ) Schemos brėžiniai, kuriuose parodytas pūslelių ir nanovamzdelių tinklų formavimasis ir vidinis funkcionalizavimas naudojant pipetes. 47

Visas dydis

Nanoporos-lipidų membranų hibridai

Tinkamai kontroliuojant tiek SLB formavimąsi, tiek nanostruktūrizuotą mechaninę atramą, galima padidinti atstumą tarp apatinio membranos lapelio ir pagrindo laisvai pakabinto dvisluoksnio konfigūracijos. Ši tvarka suteikia galimybę įtraukti transmembraninius baltymus į didelę tarpląstelinį domeną aktyvia forma, taip pat naudoti apatinį vandeninį skyrių translokacijos įvykiams per membraną matuoti. Viena intensyviausiai ištirtų kietų atramų laisvai suspenduotiems lipidų dvisluoksniams sluoksniams yra porėta membrana, kurios porų skersmuo svyruoja nuo ∼ 10 iki ∼ 100 nm (pavyzdžiui, anodinis aluminumo oksidas, 49 polikarbonato membranos 50 ir fotolitografiškai sudarytos silicio membranos). 51, 52, atsižvelgiant į akytų atramų paviršių, dvisluoksnis sluoksnis formuojamas plyšiant didelėms arba milžiniškoms vienaląstelėms pūslelėms ir dažant lipidus, ištirpintus organiniame tirpiklyje (4a paveikslas). 53 Tokios konfigūracijos yra panašios į juodosios lipidų membranos, kurioje plokštuminiai lipidų sluoksniai yra formuojami per teflono angas, kurių skylių skersmuo yra 0, 1–1 mm. Skirtingai nuo juodosios lipidų membranos, iš esmės sumažėjęs porų dydis suteikia lipidų sluoksniams ilgalaikį stabilumą ir suderinamumą su automatizuotais ir miniatiūriniais elektroniniais prietaisais. Mechaninis atskyrimas tarp gretimų skylių per chemiškai imobilizuotą apatinį dvisluoksnio lapelį ant skylės krašto sukelia individualų pakabinto dvisluoksnio plyšimą ir suteikia prietaisams ilgesnį tarnavimo laiką nei klasikinė juodoji lipidų membrana, kuri praranda visą savo funkciją vieno plyšimo įvykis. Didėjant poreikiui kurti sudėtingesnes jonų kanalų biojutėjimo ir didelio našumo vaistų patikros sistemas, buvo imtasi daugybės pastangų, kad būtų pasiektas GΩ sandariklis tarp dviejų vandeninių skyrių, atskirtų lipidų sluoksniais, ir pagerinamas jų gyvenimo laikas iki kelios dienos. Didelis atsparumas membranai, reikalingas vieno jonų kanalo matavimui, buvo pasiektas susidarius lipidiniam dvisluoksniui ant auksu dengto porėto aliuminio oksido substrato, kurio paviršius buvo funkcionalizuotas 1, 2-dipalmitoil-sn-glicerolio-3-fosforio-etanoliu. 49 Nors anodiniai aluminumoksidas-SLB parodė gerus elektros izoliacijos ir mechaninio stabilumo rodiklius, šių struktūrų integravimas į mikrofluidinę sistemą ir porų dydžio bei išdėstymo valdymas plačiame diapazone yra sudėtinga užduotis. Be to, didelis anodo aluminumoksido kraštinių santykis slopina laisvą jonų kanalų selektyviai pernešamų jonų difuziją, sukuriant jonų koncentracijos gradientą ir trukdant laisvai molekulėms patekti į apatinį dvisluoksnio sluoksnį. Litografiniu būdu sukurtas nanoporos masyvas silicio pagrindu pagamintoje neorganinėje plonoje plėvelėje buvo pasiūlytas kaip alternatyvi platforma norint įveikti šiuos vidinius anodinių aluminumoksido atramų apribojimus. 51, 52, 55 Siekiant maksimaliai padidinti atskirai esančio lipidų dvisluoksnio stabilumą, atominių jėgų mikroskopu 52, 53, 56 buvo ištirtas tokių cheminių ir struktūrinių parametrų kaip silicio ir silicio nitrido nanoporų atramų porų skersmuo. (4b pav.) Ir varžos spektroskopija. Rezultatai rodo, kad paprastai ant mažesnių porų matricų suspenduoti dvisluoksniai sluoksniai laikui bėgant yra stabilesni, o lipidų membranų senėjimo stabilumas priklauso nuo dvisluoksnių medžiagų chemijos. Fosfatidil-etanolamininiai dvisluoksniai yra stabilesni nei fosfatidilcholino dvisluoksniai sluoksniai, nes cilindriniai fosfatidil-etanolamino lipidai ant porėto substrato sudaro stabilų plokštumą, tuo tarpu fosfatidilcholino lipidai yra energingai linkę egzistuoti lenktąja forma, pavyzdžiui, lipoma. Lipidų grandinių įsotinimo laipsnis taip pat yra svarbus parametras nustatant mechanines dviejų sluoksnių savybes. Poras apimančių lipidų dvisluoksnių sluoksnių mechaninis elgesys buvo patikrintas atliekant vietinius įspaudų bandymus atominės jėgos mikroskopijos antgaliu (4c paveikslas). 53 Membranų atsakai buvo visiškai elastingi, tačiau šių linijinių reakcijų kilmė kinta priklausomai nuo paruošimo būdo ir lipidų sudėties.

Image

Lipidiniai dvisluoksniai nanoporos hibridai. a ) Kairė: nepadengtų lipidų dvisluoksnio sluoksnio (SLB), suformuoto paskleidžiant milžiniškas liposomas ant hidrofilinio akyto silicio substrato, schema. Dešinė: porus apimantis hibridinis lipidų dvisluoksnis dažymas lipidais organiniame tirpiklyje ant oktanetiolio (OT) modifikuotų aukso sluoksnių. 53 ( b ) Kairė: atominės jėgos mikroskopijos (AFM) topografijos ir DPhPC / BodipyPC (99: 1) fluorescencinių vaizdų koreliacija ant auksu dengtų akytų silicio substratų, kurių porų spindulys yra 400 nm. Aukso paviršius buvo modifikuotas OT, kad būtų sudaryti hibridiniai lipidų dvisluoksniai sluoksniai. Dešinė: membranomis uždengtų ir neuždengtų porų aukščio ir fluorescenciniai profiliai (balta linija kairiajame paveikslėlyje). 53 c ) Jėgos įtraukimo kreivės. Ši legenda nurodo fosfolipidų / paviršiaus funkcionalumą / porų spindulį / paruošimo metodą ir atitinkamą tariamą spyruoklės konstantą k app (mėlyna linija). Ant ratlankio esančios kreivės rodomos raudonai. Kairė: DPhPC / OT / 400 / n-dekanas, k = 40 mN m –1 . Vidurys: DPhPC / OT / 225 / n-dekanas, k = 52 mN m –1 . Dešinė: DPhPC / silicio / 250 / be tirpiklių SLB /, k app = 230 μN m –1 . 53

Visas dydis

Lipidų-nanostruktūros hibridai jutimo taikymo srityse

Nekovalentiškas lipidų dvisluoksnio montažas nanostruktūros paviršiuje leidžia suartėti tarp labai modernios žmogaus sukurtos platformos ir gamtos sintezuotos funkcinės sistemos. Su membrana susiję molekulinio atpažinimo įvykiai ir jonų pernešimas į membraną sujungtais jonų kanalais vyksta šalia ląstelės membranos paviršiaus. Šis išdėstymas skatina naudoti jautrius paviršinius principus, kad aptiktų molekulinės jungties įvykių sukeltą pokytį artimoje membranoje esančioje aplinkoje. LSPR, tai yra koherentiniai laidžiųjų elektronų virpesiai metalo paviršiuje, yra jautrus regiono lūžio rodiklio pokyčiui maždaug 10 nm atstumu nuo metalo paviršiaus. 57 Kai metalinės nanostruktūros yra glaudžiai sujungtos su fosfolipidinėmis membranomis (paprastai maždaug 5 nm storio), LSPR pakeitimas gali lemti tikslinį rišimą sukelto lūžio rodiklio pokyčio pokyčius membranos ir skysčio sąsajoje. Tipiškame pavyzdyje streptavidinų prisijungimas prie biotiniluotų lipidų membranomis padengtų auksinių nanorodų buvo aptiktas stebint nanodalelių SPR spektrus vaizdavimo spektrometru kartu su tamsaus lauko mikroskopu (5a pav.). 20 Lipidų membranos pasklidimas ir vėlesnis visiško streptavidinų sluoksnio nusėdimas ant nanododų sukelia vidutinius atitinkamai 3, 6 nm ir papildomus 2, 5 nm plazmoninius raudonuosius poslinkius. Panašiu būdu Groves ir kt. 58 pranešta, kad tiksliniai baltymai jungiasi prie stiklo palaikomų membranų, į kurias buvo įtaisyti hidrofobiniai alkanetiolio savarankiškai surinkti viengubo sluoksnio modifikuoti sidabro nanokubai. Ši nanocube-membranos hibridinė struktūra parodė apskaičiuotą 4, 5 ng cm- 2 aptikimo ribą ir leidžia dinamiškai kinetiškai analizuoti tikslinį prisijungimą prie giminingų receptorių be etiketės. Šie tyrėjai toliau sukūrė tirpalo fazės jutiklį lipidų ir baltymų surišimui, naudojant SLB surinktus sidabro nanokubus su itin plonu silicio dioksido apvalkalu. 59 Šis metodas be etikečių yra pagrįstas nanokubų LSPR, kuris leidžia išmatuoti baltymų prisijungimą prie membranos paviršiaus standartine laboratorinės spektroskopijos schema. Baltymų prisijungimas prie membranos substrato sukelia išmatuojamą atspindžio indekso pokytį šalia nanocube paviršiaus. LSPR poslinkiai buvo matuojami esant skirtingiems paviršiaus baltymų tankiams, ir buvo pastebėta koreliacija tarp LSPR poslinkio ir baltymų masės tankio, kai aptikimo riba buvo ∼ 0, 19 ng cm −2 .

Image

Hibridiniai lipidų ir nanostruktūrų optiniai biosensoriai. a ) Viršuje: schematiškai parodytas auksinis nanorodis (geltonasis), padengtas biotino (raudona) inkorporuota lipidų membrana (oranžinė). Strepavidinas pažymėtas žalia spalva. Apačia: atskirų aukso nanodalelių sklaidos spektrai įvairiomis dangos sąlygomis. 20 ( b ) viršuje: lipidų pririštų aukso nanodalelių, turinčių choleros toksino B subvienetą (CTB), sukeltos gelio ir skysčio sambūvio režimo, dvimatės difuzijos schema. Apačia: paucivalentinės aukso nanodalelės aiškiau diferencijuoja nuo CTB koncentracijos priklausomą difuzijos koeficiento pokytį nei daugiavalentės nanodalelės. 65 ( c ) viršuje: schema, parodanti užpildytų švirkštimo priemonių nanolitografijos (DPN) generuotų lipidų groteles. Apačia: grotelių intensyvumo stebėjimas leidžia be etiketės nustatyti baltymų prisijungimą prie receptorių modifikuotų lipidų nanostruktūrų. 66

Visas dydis

Kitu požiūriu, optiškai plonos Au plėvelės, perforuotos atsitiktine tvarka išdėstytomis nanodalelėmis, turėjo ekstinkcijos smailę matomoje ar artimoje infraraudonojoje spektro dalyje, kuri yra glaudžiai susijusi su elektronine poliarizacija, panašia į LSPR metalo nanodalelėse. 60 Kadangi LSPR laukas iš mažo cilindrinio tuštumos dipolinio rezonanso yra griežtai ribojamas su skylutėmis, ši optinė konfigūracija buvo gerai tinkama atpažinti biologinio atpažinimo įvykius, vykstančius metalinių skylių viduje. 61 Stačiatikių paviršiaus modifikavimo strategija, erdviniu būdu apimanti LSPR laukus ir receptorius į tą patį mažą tūrį, leidžia aptikti įvairias biomolekules zeptomolio režimu. 62

Cheminiai fluoroforai daugiausia naudojami kaip aptikimo etiketės, nes jie yra prekyboje, lengvai įdedami į lipidų sistemą ir yra pastebimi ant įprastos optinės platformos. Neseniai plazmoninės nanodalelės buvo pririštos prie lipidų dvisluoksnių sluoksnių, ir šios dalelės parodė gerą dalelių judrumą lipidų platformoje. Šios plazmoninės etiketės buvo laikomos alternatyvia optiniu etiketu membranos dinamikai ir heterogeniškumui tirti. Ląstelių membranų molekulinė sąveika dažnai yra susijusi su membranos komponentų pertvarkymu, o tai skatina lipidų mobilumo pokyčius. 63, 64 Ši koncepcija buvo realizuota ant SLB modelio membranos su gerai žinoma toksinų ir receptorių pora, choleros toksinu ir GM 1 . Tikslinio surišimo sukeltas membranos sklandumo pokytis buvo įvertintas naudojant tamsaus lauko mikroskopija pagrįstą lipidų pririštų aukso nanodalelių sekimą mikroskopu, siekiant nustatyti tikslinių molekulių koncentraciją tirpale (5b pav.). 65 Nam et al. naudotos galvijų serumo albuminu modifikuotos paucivalentinės Au nanodalelės, turinčios mažiau atvirą paviršių lipidų konjugacijai, nei daugiavalentės pliko aukso nanodalelės, siekiant optimizuoti aptikimo jautrumą ∼ 100 p M. Skirtingai nei cheminiai fluoroforai, šie metaliniai zondai nemirksi ir nebalina fotojuostos ir yra stabilūs realaus laiko ir ilgalaikio stebėjimo tikslais. Šios konstrukcijos turėtų būti naudingos praktikoje, kur reikalingas didelis jautrumas, platus dinaminis diapazonas ir ilgalaikis bei realiu laiku stebimas ląstelės ir SLB sąsaja.

Nanostruktūrizuotos lipidų membranos suteikia galimybę optiškai nustatyti lipidų ir baltymų sąveiką tirpale (5c paveikslas). 66 Šioje sistemoje biologiškai funkciniai daugiasluoksniai lipidiniai sluoksniai buvo modeliuojami DPN ant optinio bangolaidžio paviršiaus, kad būtų suformuotos optinės grotelių struktūros, turinčios kintamas linijas, kurių periodiškumas yra panašus į matomos šviesos bangos ilgį. Baltymams prisijungiant prie lipidų grotelių receptorių, struktūra virsta paviršiaus įtempimo pokyčių sukeltu drėkinimu ir baltymų sąveika, atsižvelgiant į tikslinę koncentraciją ir grotelių aukštį. Šis struktūrinis pokytis daro įtaką difrakcijos efektyvumui, kai baltymų koncentracija yra maža kaip 500 p M.

Vieno matmens nanostruktūros, tokios kaip nanolaidai ir nanovamzdeliai, gali būti sujungtos su ląsteliniais elementais, tokiais kaip lipidų dvisluoksniai sluoksniai, ir buvo plačiai naudojamos kaip elektrinės biojutimo platformos. Pvz., Smarkiai pasklidę silicio nanodaleliai buvo padengti lipidų dvisluoksniais sluoksniais, kurie neleido redokso-aktyvioms medžiagoms pernešti į nanovielio elektrodo paviršių, o šios nanovielių-lipidų hibridinės struktūros siūlo veiksmingą ir universalią bioelektrochemijos platformą, skirtą aptikti jonų kanalų įterpimą (pav. 6a). 67 Į bakterijos egzotoksino α-hemoliziną įterptas lipidų dvisluoksnis sluoksnis ant Si nanolaidų leidžia Fe (CN) 6 4 – jonams pasiekti elektrodą ir padidina Faradic srovę. Selektyvus jonų pernešimas per gramicidino A ir alamethicino poras, rekonstruotas lipidų dvisluoksniuose sluoksniuose ant Si nanolaidų, buvo suprojektuotas kaip cheminis ir pritaikytas įtampos suveikimo elektroninis signalo perdavimo modulis. 68 Aktyvus jonų pernešimas buvo stebimas priėmus papildomus biologinius komponentus, tokius kaip baltymų jonų pompa ir Na + / K + -ATPazė, CNT tranzistoriaus paviršiuje. 69 Užuot sukūręs joninį gradientą per membraną, molekulinis jungimasis prie SLB tiesiogiai veikia apatinio CNT lauko efekto tranzistoriaus (FET) elektrinę elgseną per paviršiaus krūvio moduliaciją. Vienas pastebimas pavyzdys yra baltymų prisijungimo prie giminingų receptorių aptikimas SLB CNT FET (6b paveikslas). 70 Šioje sistemoje baltymai, esantys membranos paviršiuje, buvo kaupiami šalia viengyslių CNT. SLB lipidų molekulės laisvai juda per nanovamzdelį, tuo tarpu baltymai, esantys membranos paviršiuje, negali judėti per nanovamzdelį; todėl nanovamzdeliai veikė kaip baltymų barjeras. Kai streptavidinas buvo pridėtas sąveikauti su biotiniluotu SLB ir buvo varomas šalia CNT, CNT FET slenkstinė įtampa pasikeitė į labiau teigiamą vertę. Grafenas taip pat gali būti sujungtas su lipidine membrana, kad būtų sudaryti hibridiniai membranos-grafeno tranzistoriai. Antimikrobinio peptido sukeltas membranos plonėjimas priartina proksimalinius membranos lapelius prie 10 mM NaF tirpalo Debye ilgio, o tai suteikia galimybę patikrinti padengtos lipidų membranos priemaišų potencialą ir keičia elektros laidumą.

Image

Hibridiniai lipidų ir nanostruktūrų elektriniai biosensoriai. a ) Viršuje: schema, vaizduojanti alfa-hemolizino poromis sujungtus lipidus, padengtus dvisluoksniu silicio nanosienu. Apačia: elektrocheminis pliko, lipidų, dvisluoksnio, padengto nano laido ir alfa-hemolizino turinčio lipidų, dvisluoksnio, padengto vieno silicio nanoliedu, elgesys. 67 ( b ) Viršuje: schematiškai parodyta SWNT FET vaizdas, integruotas į polidimetilsiloksano (PDMS) mikrofluidinį kanalą. Apačia: padengtas biotinu sujungtas lipidų dvisluoksnis (SLB) ir lipidų surištų streptavidinų (SA) kaupimasis ant vienos sienos nanovamzdelio (SWNT) moduliuoja nuo elektrolitų priklausomą mažo dažnio juostos nanovamzdelių lauko efekto tranzistoriaus (NT) laidumą., FET). 70 ( c ) viršuje: schema, vaizduojanti biotino-SA kompleksų perkėlimą per lipidų, padengtų dvisluoksniu sluoksniu, nanoporą. Apačia kairė: srovės ir laiko pėdsakai rodo, kad biotino modifikuotas lipidų dvisluoksnis dramatiškai padidina translokacijos įvykių dažnį ir sulėtina translokacijos greitį. Dešinė apačia: mažiausia tūrinė koncentracija, reikalinga stebėti bent 30–100 translokacijos įvykių per sekundę SA, polikloniniams anti-biotino Fab fragmentams (Fab) ir monokloniniams anti-biotino imunoglobulino G (IgG) antikūnams. 74

Visas dydis

Funkciniai jonų kanalai buvo įterpti į membraną ir buvo paremti nanoporomis (apimantys kelis šimtus nanometrų), kurios trukdo jonų transportavimui per membraną. Ši hibridinė konfigūracija gali būti naudojama ilgą laiką tiriant ligandų turinčius jonų kanalus. Vienas biologinio atpažinimo įvykis tarp jonų kanalų, sujungtų su receptoriais, ir specifinio ligando, sukelia daugybę jonų, kurie praeina per jonų kanalą. Toks biomimetiniu būdu sustiprintas elektrinio signalo perdavimas leidžia elektrochemiškai nustatyti ligandų turinčio vieno jonų kanalo aktyvumą. 49, 72

Neseniai nanoporos, kurių bangos ilgis <10 nm, buvo naudojamos atskiroms biomolekulėms aptikti be etikečių ir didelio pralaidumo. 73 Rezistinės srovės impulsų registravimas atskirų molekulių perkėlimo metu, vadinamasis Coulter skaičiavimas, pateikia išsamią informaciją apie biomolekulių dydį, sudėtį ir struktūrą. Vis dėlto plačiai naudojant nanoporus praktikoje, reikia išspręsti daugelį klausimų, susijusių su tiksliu nanoporų pagaminimu sub nanometrų skalėje, translokacijos laiko kontrole ir analizei būdingu perkėlimu. Kitame pavyzdyje buvo parodyta, kad membranos ir nanoporos hibridinė platforma, įkvėpta vabzdžių antenų uoslės sensilos, yra geras sprendimas, kai nanoporos paviršius buvo padengtas skysčio lipidų dvisluoksniu sluoksniu, įterptu į receptorius (6c paveikslas). 74 Mobilieji receptoriai iš anksto sutelkė tikslinius baltymus ant nanoporės paviršiaus, apribodami 3D baltymų difuziją iki 2D difuzijos. Šis procesas palengvina dažnesnius translokacijos įvykius, kartu sulėtindamas tikslinių baltymų translokaciją, tokiu būdu įvedant cheminį specifiškumą ir išvengiant užsikimšimo.

Lipidų-nanostruktūros hibridai, skirti lipidų membranos moduliavimui, vietinių ląstelių membranos imitavimui ir nano-bio sąsajoms

Natūralių ląstelių membranose citoskeletas ir su citoskeletu susiję baltymai sudaro pusiau pralaidžius barjerus, kurie selektyviai priima ir pašalina membranų sudedamąsias dalis, kad susidarytų membranos domenai, atliekantys specifines ląstelių funkcijas. 75 Šis procesas sąlygoja didelę molekulinės difuzijos moduliaciją ląstelių membranose. Paprastai difuziją daug labiau sumažina apynių difuzija, kai trumpi ir ilgi difuzijos periodai atspindi atitinkamai laisvus ir trukdytus judesius. Nutrūkusių nanodalelių įvedimas difuzijos barjeruose leidžia apynių difuzijos būdu valdomas molekules rasti natūralių ląstelių membranose.

Vienos molekulės, stebėjusios fluorescenciškai pažymėtus lipidus ant Ag nanogap modifikuoto substrato, apynių difuzijos būdas patikrino su tam tikra pabėgimo tikimybe. Buvo pranešta apie panašų metodą, imituojant anomalią ląstelės membranos difuziją. Tame tyrime stiklo substratai buvo modeliuojami 50 nm pločio Cr linijomis su 125 nm arba 250 nm tarpais ir mažesniais kaip 50 nm tarpais, esančiais tarp Cr barjerų (7a pav.). Atlikus fluorescencijos atkūrimą atlikus fotobalinimo eksperimentus, buvo įrodyta, kad lipidų tolimoji difuzija ant šių substratų buvo žymiai sumažinta, tuo tarpu trumpo nuotolio difuzija buvo išsaugota. Be to, choleros toksino B / GM1 subvienetų kompleksai peržengė nanoskalės barjerus rečiau nei atskiros lipidų molekulės. Ši pusiau pralaidi savybė yra glaudžiai susijusi su pagrindiniu gyvų ląstelių membranų biologinio aktyvumo padidinimo mechanizmu, padidinant vietinę funkcinių baltymų koncentraciją. Nors difuzijos barjeru modeliuotas SLB leidžia tiksliai valdyti šoninę difuzijos būseną tokiu pačiu būdu kaip natūralios ląstelės membrana, statinis ir visiškas atskyrimas tarp uždarymo ir atidarymo vietų diskrečiu lipidų dvisluoksniu sluoksniu skiriasi nuo natūralios ląstelės membranos struktūros., turinčią ištisinę lipidų membraną, kurioje aktyviai prekiaujama įvairiausiais membranos komponentais. Plazmos membrana turi galimybę 3D formatu sulenkti ir lenkti. 78 Lipidai, membraną surišantys baltymai ir citoskeletiniai baltymai dalyvauja kontroliuojant membranos kreivumą, tačiau membranos kreivumas taip pat turi įtakos jų struktūroms ir savybėms. Membranos išlinkimas turi įtakos pagrindiniams membranos komponentų suskirstymo į chemiškai specifinius funkcinius mazgus principams. Vezikulės, tarpląstelinės signalinės sankryžos ir filopodija turi labai sulenktas membranines struktūras. Tokie vietiniai membranos kreivių spinduliai nanometrų skalėje yra gausūs. 80 Nanotopografija gali suteikti SLB su tiksliai apibrėžtu išlinkiu, kuris paveikia lipidų grandinės įpakavimą ir fazių atskyrimą panašiai kaip vietinių ląstelių membranos. Ląstelių membranose mikrometro dydžio plaustai susidaro per plaukus formuojančių komponentų dinaminių nanoskalės agregatų, kuriuos sukelia išoriniai signalai arba membranos judėjimas, griežtinimo procesą. 81 <10 nm nanoraftos smulkinimas į makroskopinę skysčių eilės sritį buvo pakartotinai pateiktas masyvo formatu (7b pav.). 82 Šiame darbe topografine siena atskirtų nanodalelių viršutinių paviršių ir nanosmotyvų apatinių paviršių derinys iš anksto apibrėžė energijos barjerų kraštovaizdį, kad būtų slopinamas nanoraftų viršutinio paviršiaus šiurkštus procesas, tačiau leido skatinti selektyvų mikrometrų susidarymą. dydžio plausto fazė šulinio dugne.

Image

Lipidų-nanostruktūros hibridai, skirti moduliuoti lipidų membraną. a ) Viršutinė: substrato su pertraukiamais nanodalelėmis (kairėje) ir palaikomo lipidų dvisluoksnio (SLB), suformuoto ant nanopatvirtinto substrato, schemos skerspjūvis. Apatinė dalis: lipidų difuzijos koeficientai statmena metalo nanogapo modeliams (dešinėje) buvo žymiai modifikuoti, palyginti su lygiagrečia kryptimi (kairėje). 77 ( b ) Viršuje: SLB ant topografinės sienos, sukuriančios elastingus energijos barjerus abiejuose šonuose (baltos linijos). Apatinė kairė dalis: gelio fazės domenų formavimosi laiko evoliucija masyvioje nanosmotorinėje srityje. Epifluorescencinis signalas ateina iš Teksaso raudonojo 1, 2-diheksadekanoil- sn -glicerono-3-fosfoetanolamino (DHPE). Mastelio juosta yra 200 μm. Apatinė pusė dešinėje: epifluorescencinis mikroskopo vaizdas gelio fazės mikrodomenų masyvuose, sureagavusiame su Alexa 488-CTB (choleros toksino B subvienetas). Mastelio juosta yra 200 μm. 82

Visas dydis

Ląstelės sąveikauja su savo aplinka per biocheminius ir mechaninius nurodymus. Paprastai ląstelių receptoriai membranoje veikia kaip pradiniai gaunamų signalų sąlyčio taškai. Šie receptoriai jungiasi prie specifinių ligandų, o šie surišimai sukelia signalo pernešimą per membraną į cheminių signalinių reakcijų kaskadą. 83, 84, 85 SLB buvo naudojama kaip ląstelių paviršių imituojanti platforma, skirta stimuliuoti ir kontroliuoti imunines ląsteles, epitelio ląsteles, vėžio ląsteles ir neuronų ląsteles, jungiantis prie receptorių ir jungiant juos į grupes. Imunologinis T ląstelės sinapsių formavimas buvo atstatytas ant SLB paviršiaus, kuriame yra pagrindinis peptido histo suderinamumo kompleksas, imituojantis antigeną pateikiančią ląstelę. 86 Fiziniai receptorių-ligandų komplekso apribojimai, kuriuos sukelia raštuoti lipidų dvisluoksniai sluoksniai, suteikia svarbių įžvalgų apie ląstelių ir ląstelių sąveiką. Pavyzdžiui, T-ląstelių receptorių (TCR) mikroklasteriai buvo identifikuoti kaip aktyvūs signalizacijos vienetai, o kiti pagrindiniai veiksniai, tokie kaip aktinas, buvo gausiai įdarbinami signalizacijos procese. 63 Šiame tyrime kaip dirbtinis antigeną pateikiantis ląstelės paviršius buvo naudojamas su glikozilfosfatidilinozitoliu susietas peptido-pagrindinio histo suderinamumo kompleksas ir tarpląstelinio adhezijos molekulės 1 modifikuotas SLB ant nanoskalės Cr modelio substrato (8a pav.). TCR sąveikavo su pagrindiniu peptidinio histo suderinamumo kompleksu ir tarpląstelinio adhezijos molekulėmis 1 ant dirbtinio antigeną pateikiančio ląstelės paviršiaus - būtino proceso, kad antigenas atpažintų gyvas T ląsteles. TCR-ligando kompleksams SLB buvo taikomi geometriniai mobilumo apribojimai, kuriuos sukėlė Cr linijos. Įrodytas erdvinių suvaržymų poveikis sinapsinių signalų perdavimui per TCR grupavimą naudojant Cr barjerinę-nanopatvirtą membranos atramą. Be to, vėžio ląstelių EphA2 signalizacijos kelias buvo erdviškai ir mechaniškai sureguliuotas Cr metalo linijos nanofabrikuotu substratu, sukurtu naudojant elektronų pluošto litografiją (8b paveikslas). 87 EphA2, tirozino kinazės receptorė, yra ekspresuojama ∼ 40% žmogaus krūties vėžio ląstelių. EphA2 dimerizacija vyksta jungiantis prie membranoje įtvirtinto efrin-A1. Šis EphA2-efrin-A1 kompleksas, kaip žinoma, vaidina svarbų vaidmenį vystant vėžį. Po receptoriaus-ligando įsitraukimo į signalizacijos kaskadą įtraukiamos kelios signalizacijos molekulės. Parodytos ir kiekybiškai išanalizuotos 26 pieno epitelinių ląstelių linijų receptorių-ligandų kompleksų erdvinės struktūros ant nanopatvirto SLB paviršiaus. Rezultatai atskleidė, kad kompleksų erdvinės struktūros skirtumas yra stipriai susijęs su vėžinių ląstelių invazijos galimybėmis. Kito tyrimo metu buvo tiriama EphA2-efrin-A1 jukstakrino signalinė sąveika, naudojant aukso nanodalelių išdėstytą SLB. MDA-MB-231 ląstelės, labai invazinė žmogaus krūties epitelio vėžio ląstelių linija, buvo auginamos ant nanodalelių įterpto palaikomo dvisluoksnio substrato. Šiame straipsnyje buvo apibūdintas ir išsamiai ištirtas nanodalelių sujungimo efektyvumas ir fiksuoto nanodalelių masyvo įtaka aplinkinės membranos vientisumui. Salaita ir kt. stebėjo epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGFR) 30 ir adhezijos receptorių organizavimą ląstelės paviršiuje, naudodami DPN modelio SLB platformą su fibronektinu ir epidermio augimo faktorių (EGF). Šiame paviršiuje buvo kultivuojamos EGFR per daug ekspresuotos krūties vėžio ląstelės HCC1143, kad būtų galima stebėti ląstelių paviršiaus receptorių pertvarkymą kartu su nanopatvirtu SLB. Tyrėjai stebėjo, kaip susiformuoja EGF – EGFR klasteriai, kurie persikėlė į ląstelės paviršiaus sankirtos centrą, greičiausiai, naudodamiesi retrogradinio srauto mechanizmu, ir EGFR judesio ribojimą ląstelės membranoje poli (dialidimetilamonio chlorido) -fibronektino adsorbatais (8c paveikslas). . Kitame pavyzdyje, norint suaktyvinti Jurkat T ląsteles, ant stiklo substrato buvo sukurti DPN sukurti baltymai, pririšti prie lipidų. 32 Daugiasluoksniai lipidų modeliai buvo stabilūs ląstelių kultūros sąlygomis, o baltymų surištų lipidų struktūrų biomimetinė funkcija buvo parodyta ištyrus nanopatterių sugebėjimą suaktyvinti T ląsteles. Ši grupė modifikavo du skirtingus aktyvinančių antikūnų tipus, specifinius TCR CD3 e grandinei (a-CD3e), kartu stimuliuojančiam receptoriui (a-CD28). Jurkat T ląstelės buvo selektyviai priklijuotos prie kvadrato formos kampų, o T ląstelių aktyvacija buvo patvirtinta CD69 raiška fluorescenciniu vaizdavimu (8d pav.).

Image

Sintetinių lipidų dviejų sluoksnių sujungimas su gyvomis ląstelėmis. a ) Kairė: gyvų T ląstelių palaikomos membranos jungties schema. Dešinė: T ląstelės ir ligandų šviesus laukas ir fluorescenciniai vaizdai. Sinapsių formavimąsi keičia substrato geometriniai apribojimai. T-ląstelių receptoriai (TCR; žalia) ir tarpląstelinio adhezijos molekulė 1 (ICAM-1) (raudona) buvo pažymėti fluorescencinėmis žymėmis. 63 ( b ) Kairė: eksperimentiškai palaikoma lipidų dvisluoksnio (SLB) platforma, kuri suaktyvina ir manipuliuoja EphA2 receptoriais ant gyvų ląstelių paviršiaus. Dešinė: 26 ląstelių linijų vidutinio efrin-A1 ligando radialinio pasiskirstymo funkcijos yra kiekybiškai įvertintos ir parametruotos. Nustatyta, kad vidutinė radialinio paskirstymo funkcija koreliuoja ( r = 0, 91, P = 7 × 10 –8 ) su invazijos potencialais, kurie buvo nustatyti modifikuotos Boydeno kameros analizės būdu. Apatinė dalis: fluorescenciniu būdu pažymėtų EphA-A1 ligandų EphA2 ekspresuojančių pieno epitelio ląstelių atvaizdai ant laikomos membranos. 87 ( c ) Dvejetainės ligando sistemos, pateikiančios imobilizuotą FN-Cy3 ir šonuose judrų EGF-647, schema. Reprezentaciniai šviesiųjų laukų, RICM ir fluorescencinės mikroskopijos vaizdai iš trijų ląstelių, kurios yra sujungtos su nanopatvirtu palaikoma membrana. 32 d ) Ant stiklo paviršiaus esančių fosfolipidinių nanopatternų fluorescencinis vaizdas. Trijų kanalų paveikslėlyje pavaizduotos T ląstelės, prilipusios prie lipidų-baltymų artimųjų švirkštimo priemonių nanolitografijos (DPN) kampų ir aktyvuotos anti-CD3 / anti-CD28 (žalia = lipidų struktūra, mėlyna = ląstelių branduolys 4, 6-diamidino-2-fenilindolas (DAPI), raudonas = CD69 anti-CD69-fosfatidiletanolamino (PE) ir anti-PE-tetrametilmetamidamino-5 (ir -6) -izotiocianato (TRITC) dėka.

Visas dydis

Išvados ir perspektyvos

Mes pristatėme ir apžvelgėme įvairius lipidų-nanostruktūros hibridus, susijusius su apdirbimo strategijomis ir šių platformų naudojimu tiriant biologines molekules ir ląsteles. Lipidai SLB veikia ne tik kaip ląstelių membranos elementai, bet ir kaip skysčio molekulės, kurias galima dinamiškai ir aktyviai surinkti bei išardyti. Nanostruktūros yra ypač įdomios, nes jos iš esmės turi nanomalių pagrįstas savybes (tai yra optines, elektrines ir magnetines savybes) ir dydžius, kurie gerai atitinka biologines struktūras ir daugelį biologinių įvykių, pvz., Biomolekulių klasterizaciją, vykstančią nanometrų skalėje. Be to, daugybė skirtingų biologiškai funkcinių nanometrų mastelio struktūrų ir savybių gali vienu metu būti sąsajose su mikroskalės elementu, kuris suteikia galimybę kontroliuoti ir tyrinėti dominančias ląsteles manipuliuojamoje platformoje. Susiejus šias nanostruktūras su lipidais, pagrindiniais ląstelės membranos komponentais, atsiveria naujos galimybės tirti ir analizuoti daugelį biologiškai svarbių klausimų, pavyzdžiui, ląstelių ir ląstelių ryšius. Daugybė pavyzdžių parodė, kad šios hibridinės struktūros kontroliuojamu būdu sėkmingai atkuria tokius biologinius įvykius kaip ligandų ir receptorių erdvinis organizavimas, membranos kreivumas ir fazių segregacija. Tai paskatina naujus atradimus biologijoje, kurių nepavyko rasti naudojant įprastas platformas. Tačiau norėdami praktiškiau panaudoti ir išnaudoti visas šių sistemų galimybes, dabar turime integruoti šiuos elementus į funkcinius prietaisus, išspręsti lipidų dvisluoksnio stabilumo problemas, kurias sukelia SLB struktūrinis trapumas atšiauriomis sąlygomis (pvz., Dehidracija ir didelė druskos koncentracija). ) ir adresai, susiję su nespecifiniu rišimu, ypač skirti naudoti biojutimui ir ląstelių sąveikai. 88, 89. Be to, labai sunku integruoti funkcinius baltymus, tokius kaip transmembraniniai baltymai, į lipidų sluoksnį, panašų į in vivo , išlaikant jų funkcionalumą. Galiausiai, nanodalelių ląstelių membranų ypatybių generavimo dabartiniai metodai daugiausia grindžiami vienalyčių nevienalyčių membranų struktūrų sukūrimu. Norint sukurti sudėtingesnes ir į gamtą panašias struktūras, turėtų būti sukurtos ir kontroliuojamos kelių ląstelių komponentų erdvinės konfigūracijos, atsižvelgiant į biologiškai reikšmingą dydį ir laiko skalę. 90, 91 Analitinių biojutikliais integruotų ląstelių sąsajų turinčių nanostruktūrų gamyba taip pat suteikia daugiafunkcinių hibridinių platformų galimybę ir leidžia in situ tirti ląstelių reakcijas, kurias sukelia įvairūs dirgikliai, pavyzdžiui, nanomalės vietinis signalinių molekulių poveikis, topografija ir elektriniai ir šiluminiai signalai. Realių ir ilgalaikių gyvų ląstelių tyrimams taip pat labai svarbu sukurti naujus nanoprobus, galinčius išspręsti problemas, susijusias su cheminiais fluoroforais, įskaitant fotobalinimą ir foto mirgėjimą.