Vietinė 3d matricos mikroaplinka reguliuoja ląstelių migraciją, atsirandantį dėl nuo kontraktilumo priklausomų adhezijų erdvėtemporalinės dinamikos | gamtos komunikacijos

Vietinė 3d matricos mikroaplinka reguliuoja ląstelių migraciją, atsirandantį dėl nuo kontraktilumo priklausomų adhezijų erdvėtemporalinės dinamikos | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių sukibimas
  • Ląstelinis judrumas
  • Tarpląstelinė matrica

Anotacija

Dvimatės (2D) tarpląstelinės matricos (ECM) fizikinės savybės moduliuoja ląstelių adhezijos dinamiką ir judrumą, tačiau mažai žinoma apie vietinių mikroaplinkos skirtumų vaidmenį trimatėse (3D) ECM. Čia mes generuojame 3D kolageno gelius, turinčius skirtingos matricos mikroarchitektūras, kad apibūdintume jų 3D adhezijos dinamikos ir ląstelių migracijos reguliavimą. ECM, kuriuose yra susietų pluoštų, demonstruoja padidintą vietinį sukibimo masto standumą ir padidintą sukibimo stabilumą per subalansuotą ECM / sukibimo jungtį, o labai lanksčios retikulinės matricos skatina sukibimo atsitraukimą. 3D sukibimo dinamiką lokaliai reguliuoja ECM standumas, integrino / ECM asociacija ir miozino II susitraukiamumas. Skirtingai nuo 2D migracijos, panaikinant kontraktiškumą, 3D migracija sustabdoma, nepaisant ECM porų dydžio. Manome, kad jėga nereikalinga suaktyvėjusiems integruotiems integruotiems trimačiams kolageno pluoštams sujungti. Mes siūlome, kad efektyviam 3D migravimui reikia lokaliai suderinti kontraktiškumą su ECM standumu, kad stabilizuotųsi sukibimai, o tai palengvina aktyvuotų integrinų atsiskyrimą nuo ECM fibrilių.

Įvadas

Ląstelių sąveika su supančia mikroaplinka reguliuoja pagrindinius tarpląstelinius procesus, įskaitant signalų kaskadas, genų reguliavimą ir ląstelių likimą 1 . Šio tipo „išorės į vidų“ signalizacijos apima fizinius tarpląstelinės matricos (ECM) signalus, kurie gali smarkiai paveikti ląstelių migraciją. Fizinės ECM savybės, įskaitant standumą, sudėtį ir topografiją, gali reguliuoti migraciją 2, 3, 4 . Nors ląstelių migracija laikoma ciklišku procesu, kurį sudaro (1) išsikišimas, (2) sukibimas, (3) translokacija ir (4) 5, 6 atitraukimas, tai yra tiesioginis ryšys tarp ląstelės ir ECM integracijos pagrindu sukurtose adhezijos vietose. tai leidžia ląstelėms mechaniškai pajusti savo fizinę aplinką ir pakoreguoti migracijos mechanizmus 7, 8, 9, 10 .

Ant plokščių 2D paviršių adhezijos formavimasis ir brendimas yra gerai apibūdinami ir sukuria fizinį ryšį tarp aktino citoskeleto ir ECM. Po junginio sujungimo ląstelių adhezijos komponentai kaupiasi, kad susidarytų židinio komplekso / besiformuojančios adhezijos, kurios po augimo ir brendimo tampa židinio adhezijomis, sujungus F-aktino struktūras 11, 12 . Siūloma, kad adhezijos veiktų kaip molekulinė sankaba, kur jėgos būtų perduodamos tarp ECM ir citoskeleto, tai parodo įvairių sukibimo baltymų skirtinga apyvarta 7, 8, 13 . Ankstesni tyrimai nustatė, kad vietinės jėgos taikymas gali skatinti ląstelių adhezijos augimą, brendimą ir stabilumą, tuo pačiu prisijungdamas prie ECM 13, 14 . Tai priklauso nuo daugelio adhezijos baltymų, reaguojančių į mechaninį krūvį 10, 15, veikiančių kartu su integrinais ir miozinu II, kurie parodo padidintą afinitetą savo ligandams esant 16, 17 įtampai. Padidėjusi susitraukimo jėga gali sukelti sukibimo išardymą per įtraukimą 14, o miozino II susitraukimo praradimas lemia tai, kad nedelsiant išardomas sukibimas 18 . Šios savybės leidžia manyti, kad sukibimams stabilizuoti reikia jėgų 19 . Sukibimo stabilumas taip pat priklauso nuo mikroaplinkos: 3D ląstelių išgaunamų matricų ir vienos dimensijos pluoštų struktūrų sukibimai yra stabilesni nei ant 2D substratų 20 . Taigi adhezijos vietos parodo dinamišką, nuolat kintantį fizinį ryšį tarp ląstelių sutraukiamųjų elementų ir išorinės aplinkos, kuriai reikia tinkamo sutraukiamųjų jėgų balanso, kad jis atitiktų vietines aplinkos sąlygas.

Nors ląstelių migracija ant 2D substratų buvo plačiai apibūdinta, 3D migracija yra mažai suprantama dėl vietinės mikroaplinkos fizinio sudėtingumo. Be ECM fizikinių reguliatorių, žinomų dėl 2D migracijos (standumas, ligandų tankis ir sudėtis), 3D matrica prideda ECM mikroarchitektūrą, poringumą ir elastingumą 2 . Vilkas ir kt. 4 nustatė, kad padidėjęs kolageno gelio poringumas leidžia greičiau vėžiui ir imuninėms ląstelėms migruoti, sumažėjus ECM proteolizės poreikiui. Cheminis 3D ECM sutvirtinimas trukdo ląstelių invazijai, matricos rekonstravimui ir ląstelių migracijai 21, o suderintos topografijos padidina ląstelių migraciją 22, 23 . Nors fizinė 3D aplinka gali reguliuoti ląstelių migraciją, mažai žinoma apie 3D ECM-ląstelių adhezijos vietų dinamiką. Kubow et al. 24 nustatė, kad 3D ląstelių sukibimo ilgį lemia vietinis derinimas išilgai kolageno ar elektropunso pluoštų ir priklauso nuo miozino II susitraukimų. Tačiau neaišku, kaip vietiniai 3D matricos standumo skirtumai ir kiti ECM fizikiniai veiksniai veikia 3D sukibimų ir ląstelių migracijos mechaninį elgesį.

Šiame tyrime nagrinėjama, kaip 3D matricos fiziniai požymiai reguliuoja ląstelių adhezijos mechaniką ir jų vaidmenį 3D ląstelių migracijoje. Pakeitę I tipo kolageno gelių vietines fizines savybes, kad imituotų labiau in vivo panašią aplinką, pastebime, kad vietinio pluošto standumas gali skirtis iki 10 kartų. Šie mikroaplinkos ECM skirtumai keičia 3D adhezijos baltymų apykaitą ir bendrą adhezijos brendimą bei stabilumą per miozino II susitraukiamumą ir integraino aktyvaciją. Sutraukiamumo panaikinimas sumažina fibroblastų 3D migraciją, nepaisant ECM akytumo, ir atjungia priekinio krašto ir ląstelės kūno judesius; netikėtai didelis integrino aktyvavimas 3D matricoje trukdo ląstelių kūno translokacijai. Mūsų rezultatai rodo, kad 3D ląstelių adhezijos dinamikos reguliavimas per ECM vaidina pagrindinį vaidmenį 3D ląstelių migracijoje.

Rezultatai

ECM struktūros ir standumo sukibimo lygio skirtumai

Norėdami nustatyti ECM struktūros įtaką ląstelių migracijai, polimerizuodavome žiurkės uodegos kolageno gelius esant skirtingoms temperatūroms (37, 21, 16 ir 4 ° C), kad sukurtume 3D ECM architektūras su skirtingomis fizinėmis savybėmis, kurios, kaip anksčiau buvo įrodyta, pakeis fizinę organizaciją. viso gelio 4, 25 (1 pav.). Esant žemesnei polimerizacijos temperatūrai, gelio poringumas padidėjo, o gelinės grotelės tapo nevienalytės nei labai retikuliarus (HR) 37 ° C polimerizuotas kolagenas, tuo tarpu pluošto skersmuo padidėjo (1a, f ir papildomas 1a pav.). Struktūrizuota apšvietimo mikroskopija nustatė, kad šis skersmens pokytis yra daugelio pluoštų sujungimas (1b pav., C, papildomi filmai 1–3). Ši virpamojo pluošto (FB) architektūra nebuvo stebėta esant HR būklei ir retai pasitaikant laisvai retikuliam (LR) 21 ° C kolagenui (1a – c pav.). Fibrilių skersmens analizė atskleidė, kad HR matricas sudarė tik pavienės fibros, kurių skersmuo vidutiniškai ∼ 310 nm. Atvirkščiai, FB16 matricose buvo ∼ 10% pavienių panašaus dydžio fibrilių kartu su susietomis fibrilėmis, kurios kartu buvo vidutiniškai 899 nm. Pakelius gali sudaryti nuo 2 iki 12 ar daugiau atskirų pluoštų. Taigi, skaidulų rišimas, o ne pluošto sutirštėjimas buvo atsakingas už mūsų pastebėtus struktūrinius skirtumus. Nors fibrozinių pluoštų ilgį buvo sunku įvertinti dėl to, kad HR ECM fibriliai sutampa, FB16 ECM parodė beveik septynis kartus didesnį ilgio skirtumą (HR: 3, 6 ± 1, 4 sd μm; FB16: 21, 9 ± 7, 6 μm, papildomas 1b pav.).

Image

a ) Dešimties mikrometrų didžiausio intensyvumo projekcija (MIP) XY (viršuje), 10 μm XZ (viduryje) ir 1 μm MIP XY (apačioje) 3 mg ml – 1 žiurkės uodegos kolageno, polimerizuoto skirtingoje temperatūroje (37, 21, 16 ir 4 ° C), iliustruojančios įvairias ECM struktūras: labai retikuliarus (HR), laisvas retikulinis (LR) ir pluoštinis pluoštas (FB). ( b, c ) HR ( b ) ir FB16 ( c ) kolageno (2 μm MIP) struktūrinės apšvietimo mikroskopija. C rodyklių galvutės rodo išlygintus ryšulinius pluoštus, kurių nėra HR ar LR ECM. d ) Reprezentatyvūs AFM sugeneruotų vietinio aukščio (viršaus) ir Youngo modulio (YM) jėgos tūrio (apačios) žemėlapių pavyzdžiai visoms ECM sąlygoms. e ) vidutinis Youngo gelių ir fibrilų modulis esant kiekvienai ECM būklei; N = 3, n = 9. f ) procentinis 4 μm storio kolageno sekcijos poringumas visomis ECM sąlygomis. N = 3, n > 25. g ) informacinė lentelė, kurioje apibendrinti pagrindiniai kiekvienos ECM būklės struktūriniai ypatumai. * P <0, 05, žymiai skiriasi. † Labai skiriasi pluošto tvirtumas toje pačioje ECM būsenoje, P <0, 05 (ANOVA). Klaidų juostos: sem Skalės juostos: a ) 10 μm; ( b, c ) 2 μm; d ) 20 μm.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme, ar šių fibrilių architektūra (labai retikuliarinė ir pluoštinė pluošto dalis) buvo in vivo . I tipo kolageno imuninis dažymas parodė, kad visų tipų ir pluoštų skersmens pluoštai, kuriuos mes sukūrėme in vitro, buvo suaugusių pelių ausų ir embriono 17 dienos pelių užpakalinėje odoje (papildomas 1c, d pav.), Dažnai esantys greta vienas kito, kaip anksčiau. pranešė 26 . Šie duomenys rodo, kad in vitro HR ir FB kolageno geliai su kontroliuojamais architektūros skirtumais gali būti naudojami kaip alternatyva labai nevienalytėms in vivo fibrilų architektūroms, norint analizuoti ląstelių mechaninę sąveiką su specifinėmis 3D mikroaplinkos ypatybėmis.

Šie struktūriniai skirtumai privertė mus ištirti poveikį gelio standumui. Mes siekėme pastebėti ir išmatuoti ECM standumą dydžių skalėje, kurioje ląstelė mechaniškai sąveikauja su ECM, atlikdami atominės jėgos mikroskopiją (AFM), naudodami kūgio formos piramidės plokšteles, kurių skiriamoji geba yra 1 μm, kurios dydis yra panašus į vieno židinio adheziją. 27 Kolageno gelio paviršių rastrinis nuskaitymas pateikė išsamius aukščio ir Youngo modulio matavimus pagal jėgos ir tūrio žemėlapius (1d pav.). Ląstelės masteliu (32 × 32 μm) ECM neparodė reikšmingų gelio standumo skirtumų (1 pav. E), kurių vertės buvo panašios į ankstesnes ataskaitas, naudojant gelius> 2 mg ml −1 (4 nuoroda). Tačiau ląstelių adhezijos masteliu padidėjęs FB kolageno pluošto storis ir bendras pluošto nevienalytiškumas buvo susijęs su dideliais vietinio pluošto standumo pokyčiais (1d – g pav.). Šis neatitikimas gali būti siejamas su skirtingu AKM tipų akytumu. Porų sričių neįtraukimas į AFM matavimus parodė reikšmingą su fibriliais susijusio standumo padidėjimą ECM, kuriuose yra susietų pluoštų (FB16: tris kartus; FB4: penkis kartus; 1 pav. 1e). Norėdami patvirtinti standumo skirtumus ląstelių adhezijoje, palyginti su ląstelių dydžio skalėmis, mes atlikome AFM matavimus, naudodami 38 μm skersmens granules. Tokie ląstelių masto matavimai parodė sumažintą nevienalytių FB16 ir FB4 matricų standumą (papildomas 1e pav.). Taigi makro / ląstelių masto standumo matavimai gali praleisti papildomus vietinio pluošto standumo skirtumus, susijusius su viena adhezija, greičiausiai dėl porų dydžio ir vietinio gelio heterogeniškumo skirtumų. Šie ECM skirtumai apibendrinti 1g pav.

ECM architektūros įtakoja 3D fibroblastų migraciją

Šių ECM fizikinės savybės paskatino ištirti jų įtaką fibroblastų morfologijai ir migracijai. Žmogaus apyvarpės fibroblastai (HFFs) parodė verpstės formos morfologijas, būdingas 3D ECM (2a – d pav.), Su HR ECM mažiau šoninių procesų. Timelapse mikroskopija ir ląstelių sekimas patvirtino, kad ląstelių migracijos greitis padidėjo didėjant ECM poringumui (2e pav.) 4 . Gyvų ląstelių verpimo disko mikroskopija, atlikta naudojant EGFP-Lifeact, atskleidė pakitusias iškyšas esant susietoms fibriulėms: priekinių kraštų išsikišimai dažnai sekė pluoštą per visą ilgį. Šis kontaktinis-orientacinis efektas buvo ypač pastebimas, kai virvelės buvo lygiagrečios išsikišimų krypčiai (2d, f pav.). Tačiau ląsteliniu mastu fibroblastai rodė panašius migruojančius fenotipus skirtinguose ECM, traukdami priekines kolageno virputes atgal į ląstelės kūną (2f pav., 4 papildomas filmas). Matrica, esanti šalia ląstelės kūno, buvo nublokšta anterogradiškai, ir tai rodo susitraukiančios ašį tarp priekinio ir galinio kraštų. Visi šie duomenys rodo, kad skirtingos matricos architektūros gali paveikti ląstelių migracijos greitį, nors fibroblastai naudoja panašų migracijos procesą, norėdami ištraukti ląstelės kūną per 3D erdvę.

Image

( a - d ) MTP atoteno (žalios) HFFs vaizdai Atto-647N pažymėtuose kolageno geluose (raudoni) rodo ląstelių morfologinius skirtumus, susijusius su HR, LR, FB16 ir FB4 ECM. Įžanga (balta dėžutė d punkte) rodo pseudopodialinį pailgėjimą išilgai surištų kolageno pluoštų FB4 ECM. Atkreipkite dėmesį į ląstelių morfologijos pokyčius kartu su ECM pokyčiais. e ) Fibroblastų judėjimo greitis kiekviename ECM. N > 3 kopijų, n > 60. Klaidų juostos: sem ( f ) FB4 ECM (raudona) fibroblastų, išreiškiančių EGFP-Lifeact (žalia arba pilkos spalvos), gyvų ląstelių mikroskopija. „Timelapse“ montažas (dešiniosios plokštės) iliustruoja aktinomis turtingų filopodinių struktūrų (rodyklių galvučių) formavimąsi išilgai susietų kolageno pluoštų, nukreipdamas migraciją. Baltos žvaigždės rodo pradinę ir galutinę kolageno virpėjimų padėtis fiduciarinės linijos (cianos) atžvilgiu po to, kai ląstelių susitraukimas patraukia matricą link ląstelės kūno, o priekinis kraštas išsikiša į priekį. * P <0, 05 (ANOVA), N ≥ 3, n ≥ 70 visomis sąlygomis. Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

ECM standumas keičia sukibimą, bet ne komponentus

Kadangi adhezijos vietos parodo mechaninę ląstelės ir ECM sąsają, mes ištyrėme, ar 3D sukibimų sudėtis ir kinetika priklauso nuo sukibimo masto standumo skirtumų tarp ECM architektūrų. Adhezijos sudėtis nepakito: aktyvuoto β1 integrino (β1aktyvo) imuninis dažymas parodė integrino jungimąsi kiekviename ląstelės / ECM kontakte per ląstelės ilgį visuose ECM. FB matricose aktino įtempių skaidulos, esančios visose ECM mikroarchitektūrose, buvo išlygintos lygiagrečiai ląstelės ilgiajai ašiai, tačiau įdomu tai, kad β1act labiau linkęs derėti su ECM architektūra nei su viduląstelinėmis įtempių skaidulomis (3a pav.). Tačiau dėl labai retikuliarių, glaudžiai supakuotų pluoštų architektūros HR, tokią β1akto erdvinę orientaciją buvo sunku atskirti HR ECM (papildomas 2 pav.). Imuninis dažymas arba transfekcija su fluorescenciniais baltymais pažymėtais adhezijos baltymais parodė, kad talinas, vinkulinas, tenzinas 1, ziksinas ir paksilinas yra panašiai pasiskirstę visų ECM lipniose struktūrose (3b pav., Papildomas 3 pav.).

Image

a ) Visas MIP, lokalizuojantis aktyvuotą β1 integriną (9EG7: raudonas) ir F-aktino (žalias) dažymą faloidinu FB16 ECM. Pradinė dalis rodo XZ projekciją. 1 ir 2 plokštės iliustruoja integrinus pagal ECM kontūrus, o ne pagal įtempių pluošto išdėstymą (nurodytą rodyklių galvutėmis). 1 ir 2 plokštės yra ląstelės srities dalinės Z projekcijos. b ) Aktyvuoto β1 integrino (9EG7: raudona) ir paksilino (žalia) lokalizacija FB16 (kairėje) ir HR kolageno matricose (dešinėje). Intarpai rodo kintamą kolokalizaciją, matomą priekiniame krašte. Visų vaizdų didžiausio intensyvumo Z projekcija yra ∼ 30 μm. ( c ) MIP atvaizdai, rodantys eGFP – zyxin lokalizaciją HR ar FB16 ECM, įgytus prieš FRAP. 3D YZ MIP parodytas dešinėje. ( d ) Laiko intervalo seka, parodyta c, parodant EGFP-zyxin FRAP kinetiką. Raudonos rodyklės galvutės nurodo FRAP vietą. Laikas yra sekundėmis. ( e - h ) FRAP kinetinė analizė, parodanti t 1/2 ( f ) K išjungimo greitį ( g ) ir nejudrias frakcijas, susijusias su grafike, E. N ≥ 3 ir n ≥ 20 visomis sąlygomis. Klaidų juostos: sem * P <0, 05 (ANOVA). Mastelio juostos: ( a, b ) 10 μm, d ) 5 μm.

Visas dydis

Kadangi adhezijos vietos yra dinamiškos struktūros, reaguojančios į jėgos taikymą, pluošto standumo skirtumai gali turėti įtakos molekulinėje sankaboje dalyvaujančių židinio adhezijos baltymų kinetikai / apyvartai 7, 19, 28, 29 . Norėdami tai patikrinti, mes ištyrėme baltymų apykaitą per fluorescencinį atsistatymą po fotobalinimo (FRAP), naudojant EGFP – zyxin turinčius adhezijas skirtinguose 3D ECM ir ant 2D kolageno, kovalentiškai sujungtą su dangteliais (3c – h pav.). Duomenys rodo didesnį vietinį ECM standumą (2D> FB16> LR> HR), stabilizuodami ziksiną adhezijose pagal surišimo (padidėjęs τ 1/2 ) ir disociacijos (sumažėjęs K off ) greitį, kartu su padidėjusia nejudriąja frakcija (3h pav.). Šie sukibimo kinetikos duomenys rodo, kad standžios skaidulos padidina molekulinės sankabos efektyvumą sukibimų metu, o suderinami ECM padidina sukibimo paslydimą esant neefektyviam sujungimui.

3D sukibimo brendimas priklauso nuo ECM standumo

Vietinis pluošto standumas gali reguliuoti ne tik sukibimo komponentų kinetiką, bet ir visų sukibimų brendimą ir stabilumą. Norėdami įvertinti šiuos įvykius, mes pavaizdavome HFF, išreiškiantį EYFP-paxiliną, ir, naudodamiesi automatiniu sukibimo sekimu, nustatėme sukibimo laiką (4a – e pav.) 30, 31 . Tai apibūdino visų sukibimų ląstelėje sukibimo laiką (> 50 vienoje ląstelėje), o ne fokusavimąsi į santykinai mažą pogrupį, tuo pačiu pateikiant kiekvienos sukibimo erdvinį ir laikiną vektorinį žemėlapį (4c – e pav., 5 papildomas filmas). Kiekvienoje ECM architektūroje individualus sukibimo laikas labai skyrėsi nuo nestabilių atsiradusių sukibimų (NA: 60–120 s.) Iki subrendusių ir labai stabilių sukibimų (SA:> 1500 s; 4f – h pav.). Tačiau besiformuojančių ir subrendusių sukibimų skaičius buvo atvirkščiai susijęs su HR ir FB ECM, dėl ko padidėjo sukibimo trukmė nuo standumo (4g pav., H). Įdomu tai, kad vyraujantis sukibimo potipis (vadinamas tarpiniais sukibimais: IA, 150–1 470 s.) Parodė <10% skirtumų tarp HR ir FB sąlygų. Toliau mes ištyrėme, ar pluošto skersmuo (> 1 mikronas) ar sukibimo išlyginimas išilgai fibrilės geriausiai koreliuoja su adhezijos stabilizavimu FB4 geliuose. Geriausia, kai adhezijos buvo stabilizuotos lygiagrečiai kolageno pluoštams, palyginti su fibrilėmis, kurių skersmuo> 1 μm (papildomas 4a pav.). Visi šie duomenys rodo, kad vietinis pluošto standumas gali nustatyti sukibimo laiką, keičiant santykinį besiformuojančių ir subrendusių sukibimų santykį.

Image

a ) EYFP-paksilino adhezijos, susijusios su FB4 kolageno geliais, MIP. Pradinė dalis rodo ECM struktūrą. ( b, c ) Sukibimo ir sekimo žemėlapių nustatymas adhezijos poslinkiuose per visą jų gyvavimo laiką, tuo tarpu adhezijos vektoriaus žemėlapis ( c ) rodo jų vidutinį momentinį judėjimą. ( d, e ) EYFP-paxillin (balto) adhezijos takelių (rausvai raudonos) ir adhezijos vektorių (žalios) perdanga taško, nurodyto d punkte, ir 30 minučių vėliau ( e ). f ) „Timelapse“ simboliai iš spalvotų dėžučių, iliustruodami sukibimus su skirtingu gyvenimo periodu. Raudona dėžutė: atsirandantys sukibimai (NA: 0–120 s.). Geltona dėžutė: tarpiniai sukibimai (IA: 500–1 500 s.). Žalsvai mėlyna dėžutė: stabilus sukibimas (SA:> 1500 s.). Priklijavimas žalsvai žalsvai atsiranda po kelių kadrų po pradinio laiko. g ) vidutinis kiekvienos būklės sukibimo laikas. h ) sukibimų, laikomų NA, IA arba SA, procentas kiekvienoje ECM sąlygoje. n vertės ( g, h ) yra> 500 adhezijų ir mažiausiai 6 langeliai kiekvienoje sąlygoje. Klaidų juostos: sem * P <0, 05 (ANOVA). Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

Dvi 3D sukibimo populiacijos priklauso nuo ECM / standumo

Tolesnis adhezijos dinamikos tyrimas naudojant adhezijos vektorių žemėlapius atskleidė, kad sukibimo pluoštuose, turinčiuose standžius ryšulinius pluoštus (FB geliai; 5c pav.), Adhezijos poslinkis buvo žymiai mažesnis. Tiesą sakant, visose matricose mes nustatėme stiprią atvirkštinę koreliaciją tarp sukibimo judesio ir jų ilgaamžiškumo; trumpalaikis sukibimas parodė greitą judesį, palyginti su lėtu subrendusių, stabilių sukibimų judesiu (5a – c, e pav., 6 papildomas filmas), tokiu būdu nustatant dvi skirtingas sukibimo populiacijas, kurios kito pagal ECM (5e, f pav.) Papildomas 4b – e pav. Stebėdami kiekvieną sukibimo tipą, atsižvelgiant į supančią ECM, mes nustatėme, kad labai judrūs sukibimai iš tikrųjų buvo atitraukiami, atitraukdami nuo kolageno pluoštų, prie kurių jie prilipo, ir kliudydami toliau priekiniam kraštui progresuoti. Prieš atsiribojant nuo ECM, atitraukiantys sukibimai greitai ir pasikartojamai judėjo toliau nuo matricos pluoštų, prieš tai atsijungdami nuo ECM (5a pav., B; Papildomas 5 pav.; Papildomi filmai 7 ir 8). Priešingai, stabilus sukibimas buvo nuolat susijęs su gretimu ECM ir judėjo išilgai. Šis pasikartojantis „matricos tempimas“ nebuvo pastebėtas esant stabiliems sukibimams ir gali atspindėti santykinį nuoseklų lokalų ryšį tarp ląstelės ir matricos. Apskritai, santykinė šių dviejų adhezijos populiacijų proporcija priklausė nuo vietinės mikroaplinkos, kur minkšta HR palyginti su kietesnėmis FB matricomis rodė atitinkamai didelį atitraukimo ir stabilios adhezijos skaičių (5f pav.). Šie stebėjimai rodo, kad ECM tvirtumas gali stabilizuoti 3D sukibimus, o tai atsispindi atitraukiančio ir stabilaus sukibimo santykiuose.

Image

( a, b ) Greiti EYFP ir paxilino adhezijų judesiai HR kolageno srityje. b ) Regiono, pavaizduoto a . Rodyklės rodo sukibimo judėjimo kryptį: Raudonos rodyklės pabrėžia greitus judesius, kurie atsitraukia nuo priekinio krašto, ir lėtai juda. Laikas yra min. c ) vidutinis sukibimų judėjimas skirtinguose ECM. ( d, e ) Sukibimo judesys nubraižytas atsižvelgiant į sugrupuotą sukibimo laiką ( d ) arba kaip skaldos brėžinys ( e ). E langeliuose nurodomos atitraukiančios (raudonos) ir stabilios (mėlynos) adhezijos populiacijos. f ) sukibimų, kurie kiekvienoje ECM traukiasi (raudona) arba stabili (mėlyna), procentas. ( c ) - ( f ) n vertės yra> 500 adhezijų ir mažiausiai šeši langeliai kiekvienoje sąlygoje. Klaidų juostos: sem * P <0, 05 (ANOVA). Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

Norint efektyviai perkelti 3D, reikalingas subalansuotas sukibimas

Mūsų duomenys rodo, kad ECM / sukibimo jungtis yra sumažinta, naudojant elastingus HR ECM, ir tai sukelia nestabilų sukibimą ir įtraukimą. Mes iškėlėme hipotezę, kad šį nestabilumą lemia susitraukimų disbalansas, kai ląstelių susitraukimas viršija slenksčio jėgą, kurią integruoti / ligandas gali atlaikyti atskiroje adhezijos vietoje, kad sukibimas taptų nestabilus ir atsitrauktų. Siekdami iš naujo subalansuoti kontraktiškumo lygį, kad palaikytume vietinę ECM jungtį HR matricose, iš dalies sumažinome HR ECM ląstelių kontraktilumą, naudodami 5 μM blebbistatino. Traukos jėgos analizė patvirtino, kad ši mažesnė blebbistatino dozė sąlygoja vidutinį (∼ 50%) fibroblastų susitraukimo sumažėjimą, palyginti su beveik visišku nuostoliu esant 25 μM (papildomas 6a – c pav.). 3D sukibimo dinamikos analizė atskleidė diferencinį nuo ECM priklausomą poveikį: minkštuose HR geluose susidarantys sukibimai parodė pailgėjusį sukibimo laiką, brendimą ir stabilizavimąsi, kai sumažėjo besiformuojančių ir atsitraukiančių adhezijų populiacija (papildomas 6d pav.). Sumažėjęs susilpnėjimas turėjo priešingą poveikį sukibimo dinamikai standiose FB16 ECM (6c – f pav.) Ir netgi paskatino labai stabilių sukibimų atsitraukimą (papildomas 6e pav.). Svarbu tai, kad nors sumažėjęs kontraktiškumas sumažino bendrą FB ECM ląstelių migraciją, HR sąlygomis tai žymiai paspartėjo (6i pav.). Šie duomenys patvirtina mūsų hipotezę, kad ląstelių adhezijoms, norint subręsti / stabilizuoti ląsteles ir efektyviai judėti fibroblastus, reikalingas tinkamas kontraktiškumo ir lokalios ECM atitikties balansas. Neoficiali analogija būtų tokia, kad labai lankstiems pluoštams reikalingas minkštas prisilietimas, kad būtų galima stabilizuoti sukibimą, tuo tarpu standžesniems pluoštiniams pluoštams, norint išlaikyti sukibimą, reikia didesnių ląstelių susitraukimo jėgų.

Image

a ) HR kolageno + 5 μM blebbistatino (Bleb; kairė) ir HR kolageno + FN (dešinėje) adhezijos judesiai. b ) 300 μg ml −1 fibronektino (raudonos), susieto su FB16 arba HR kolageno fibrilėmis (žalia), SIM atvaizdai. ( c - f ) Kolageno apdorojimas HPFN arba susitraukimų sumažinimas naudojant 5 μM blebbistatino turi skirtingą nuo ECM priklausomą poveikį adhezijos gyvavimo laikui ( c ) besiformuojančioms ( d ) ir stabilioms adhezijoms ( e ) bei atitraukiamųjų sukibimų populiacijai ( f ). Punktyvios raudonos linijos ( c - f ) žymi neapdorotus kontrolinius lygius (DMSO, Ig G ). N ≥3, n ≥400. ( g, h ) Integrino aktyvacija (TS2 / 16; 2 μg ml −1 ) stabilizuoja sukibimus. Simboliai ( g ) brūkšniuota balta linija) rodo adhezijos paslydimą ir atitraukimą (raudonos linijos), kol bus pridėtas antikūnas TS2 / 16 (punktyrinės cianinės linijos h ). Gydymas antikūnais aktyvina integrinus, kad sugriebtų ECM, ir stabilizuoja sukibimą (horizontalios mėlynos linijos). i ) HPFN, TS2 / 16 arba 5 μM blebbistatinu apdorotų ląstelių migracija, palyginti su kontrolinėmis N = 3, n > 48 (brūkšniuotos raudonos linijos). * Ženkliai skiriasi nuo kontrolinės ECM; P <0, 05 (ANOVA). Klaidų juostos: sem Skalės juostos: a ) 2 μm; ( b, g ) 10 μm.

Visas dydis

Integrino / ECM sąveika daro įtaką 3D sukibimo dinamikai

Nors susitraukimo jėga gali smarkiai paveikti sukibimo stabilizavimą, reguliavimas taip pat gali atsirasti integrino / ECM jungimosi vietoje. Reikšmingas gali būti santykinis integruotų ligandų ligandų judrumas, nes jų sąveika apima nuo jėgos priklausančias sugavimo jungtis 17, 32 . Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes pakeitėme integrinų / ligandų sąveiką trimis būdais: (1) paruoštų kolageno gelių, turinčių fibroblastus, apdorojimas 300 μg ml −1 fibronektino (FN), jo koncentracija kraujyje; (2) integrino avidiškumo didinimas per stimuliacinį antikūną (TS2 / 16); ir (3) integrino aktyvacijos padidinimas pridedant mangano. Išorinis fibronektinas prisijungė prie kolageno pluoštų, dengiančių didžiąją pluošto paviršiaus dalį (6b pav.). AFM patvirtino, kad FN surišimas neturėjo jokios įtakos kolageno gelio elastingumui (HR = 770 ± 30 sd Pa: HR + FN = 795 ± 63 Pa, 3 pakartojimai, n = 12). FN pridėjimas žymiai padidino HR gelių sukibimo laiką, sumažindamas atsirandančius / atitraukiančius sukibimus, ir tai padidino ląstelių migraciją (6d pav., F, i). Tai mėgdžiojo mažinti susitraukimo jėgą, nors sukibimo judesys buvo padidintas (papildomas 6f pav.). FB16 ECM apdorojimas FN, priešingai, sumažino sukibimo trukmę, tačiau smarkiai sumažino sukibimo sukibimų skaičių (nekeisdamas kylančių sukibimų), o ląstelių migracija pagerėjo. ECM / adhezijos jungties stimuliavimas, apdorojant ląsteles TS2 / 16 (2 μg ml −1 ), parodė panašų poveikį kaip FN abiejų ECM ląstelėse. Kymografų analizė rodo, kad netrukus po TS2 / 16 pridėjimo ląstelės dramatiškai sugriebia matricą (6g pav., H). Tačiau užuot sukėlę priekinio krašto atsitraukimą, sukibimai buvo stabilizuoti abiem ECM sąlygomis. Šis padidėjęs stabilumas nepakeitė HR 3D migracijos pokyčių, tačiau žymiai sumažino migraciją per FB ECM. Panašus poveikis buvo nustatytas fibroblastų, apdorotų 50 μM MnCl2 (papildomas 7a pav.). Visi šie duomenys rodo svarbiausią vaidmenį integrinų ir ligandų dinaminėje sąveikoje reguliuojant 3D adhezijos stabilumą, kuris efektyviam migravimui turi būti suderintas su kontraktiškumu.

Kontraktiškumas reguliuoja 3D migraciją, neatsižvelgiant į porų dydį

Rezultatai, rodantys skirtingus jėgos reikalavimus sukibimui stabilizuoti ir migruoti skirtinguose ECM, privertė mus paklausti, ar visiškas susitraukimo praradimas turėtų panašų diferencinį poveikį, priklausomą nuo ECM. Tačiau fibroblastų gydymas 25 μM blebbistatinu sumažino 3D migracijos greitį visomis ECM sąlygomis (7a pav.) Ir tuo pačiu padidino iškyšas, inicijavo ECM atsipalaidavimą ir sulėtino ląstelių kūno judėjimą (7d pav. Ir 9 papildomas filmas). Įdomu tai, kad imuninis dažymas atskleidė aktyvuotus β1 integrinus visomis ECM sąlygomis esant mažoms jėgoms (5 μM blebbistatino; papildomas 7b pav.) Ar net visiškai nesant jėgos (25 μM blebbistatino; 7b pav., 7b papildomas 7c pav.). Tokie konstituciškai sujungti integrinai gali kliudyti 3D migracijai, nebent jie būtų atskirti dėl aktyvios susitraukimo, taikomo adhezijos vietose. Mes išbandėme šią hipotezę, apdorodami HR ir FB16 gelių HFFs mAb13, kad sumažintume β1 integralino jungimąsi (1 ir 10 μg ml −1 ) kartu su 25 μM blebbistatinu. Sumažėjęs jungimasis su integriinais iš dalies išgelbėjo 3D ląstelių migraciją didelių porų geluose (FB), leisdamas ląstelėms praslysti per matricą (7c pav., E ir papildomas filmas 10), o HR vis tiek parodė sumažėjusią migraciją, priklausančią nuo porų dydžio priklausomybės. Visi šie duomenys rodo, kad vykstant fibroblastų 3D migracijai fiziškai reikia atskirti klasterizuotus integrinus, reikia aktyvaus susitraukimo.

Image

a ) Fibroblastų 3D migracijos greičiai kontrolinei (balta) 5 μM (šviesiai pilka) ir 25 μM (tamsiai pilka) blebbistatinai kiekvienoje ECM architektūroje. N = 3, n = 48. b ) MIP, kuriuose lyginamas aktyvuotas β1 integrinas (9EG7) fibroblastuose tarp kontrolinės ir vienos nakties ekspozicijos 25 μM blebbistatino FB4 kolagene. Įžanga iliustruoja, kad aktyvuotas β1 integrinas išlieka susijęs su kolageno fibrilėmis, supančiomis ląstelės kūno sritį, jei nėra miozino II kontraktilumo. c ) integrino jungimosi su β1 integrinu slopinančiu antikūnu (mAb13; 1 ir 10 μg ml −1 ) sumažinimas iš dalies gelbsti migracijos, kuriai trūksta kontraktilumo, tačiau atsižvelgiant į porų dydį. Raudonos punktyrinės linijos nurodo valdymo lygius. N = 3, n ≥ 70. D ) Fibroblastų, ekspresuojančių EYFP-paxilliną FB16 ECM, apdorotų 25 μM blebbistatinu (pridedama 30 min. Prieš pirmąjį kadrą) laiko intervalai. Susidaro daugybė iškyšų (raudonų žvaigždutėmis), tačiau nepadeda ląstelės kūnui judėti (geltonas apskritimas), o pailga uodega (cianinės rodyklės galvutės) trukdo migruoti. e ) blefistatinu ir mAb13 (1 μg ml −1 ) apdorotas HFF turi mažiau išsikišimų, be pailgos uodegos ir slenka per matricą. * P <0, 05 (ANOVA). + Ženkliai skiriasi nuo kontrolės sąlygų; P <0, 05 (ANOVA). Klaidų juostos: sem Skalės juostos: b ) 10 μm; ( d, e ) 30 μm.

Visas dydis

Taigi 3D-migracijos kontraktiškumo reikalavimas gali apimti padidėjusį integruotų grupių susikaupimą. Dėl 2D rutulinio kolageno gydymas blebbistatinu padidina migraciją, tačiau sumažina integralo aktyvaciją ir susikaupimą (8a – c pav.). Norėdami išspręsti šį neatitikimą, dirbtinai suaktyvinome 2D rutulinio kolageno integrinus. Vienintelis aktyvinantis β1 antikūnas TS2 / 16 neturėjo įtakos 2D migracijai, tačiau tuo pačiu metu integrino aktyvinimas ir blebbistatino slopinimas sumažino 2D migracijos greitį iki kontrolinio lygio (8c pav.). Todėl 2D priklausomybės nuo kontraktiškumo skirtumai, palyginti su 3D fibroblastų migracija, gali būti paaiškinti sustiprintu integralo aktyvinimu ir grupavimu į natūralias 3D ECM struktūras.

Image

( a, b ) Palyginus kontrolinį ( a ) ir gydymą 25 μM blebbistatinu ( b ) ant 2D kolageno (50 μg ml −1 ), parodyta, kad nėra aktyvuoto β1 integrino klasterio (žalias), palyginti su K20 anti-viso β1 integrino antikūnu. (raudona). c ) Aktyvinančio β1 integrino antikūno TS2 / 16 (2 μg ml −1 ) pridėjimas prie fibroblastų, migruojančių per 2D kamuolinį kolageną, slopina migracijos padidėjimą, susijusį su 25 μM blebbistatinu, N = 3, n > 80 (ANOVA). Klaidų juostos: sem ( d ) Ląstelių adhezijos dinamikos 3D mikroaplinkos reguliavimo schema. Adhezijos populiacija susideda iš besiformuojančios (raudonos) ir subrendusios adhezijos, pastarąją sudaro įtraukiantis (žalias) tarpinis (baltas) arba stabilus (mėlynas). Didėjant ECM pluošto standumui (iš apačios į viršų), santykinis atsirandančių ir atitraukiančių sukibimų skaičius sumažėja, tuo pačiu skatinant labai stabilų sukibimą. HR, LR ir FB16 adhezijos populiacijos parodo faktinius kiekvienos būklės apskaičiuotus procentus. e ) Mažindamas santykinį ląstelių susitraukiamumą, minkštųjų (HR) ir standiųjų (FB) ECM formuojasi besiformuojančių ir atitraukiančių sukibimų pusiausvyra, skatindamas tolesnį sukibimo stabilumą. Kritinio balanso slenkstis rodomas geltonai. Rodyklės rodo sukibimo populiacijos pokytį virš ar žemiau slenksčio. f ) schematinis ląstelių adhezijos populiacijų vaizdas heterogeninėje standžiųjų fibrilių matricoje (kairėje) ir homogeninėje minkštųjų fibrilių matricoje (dešinėje). Sukibimo spalva parodo sukibimo tipą, parodytą d . * Ženkliai skiriasi nuo visų kitų sąlygų; P <0, 05 (ANOVA). Svarstyklės, 10 μm.

Visas dydis

Diskusija

Čia aprašome, kaip vietinė mikroaplinka lemia 3D adhezijos brendimą ir reguliuoja ląstelių judrumą. Vietiniai struktūriniai skirtumai nevienalytėse matricose, kuriose yra rišamųjų pluoštų, lemia didelius pluošto standumo svyravimus, kurie, mūsų manymu, keičia mechaninį efektyvumą ir sujungimą tarp atskirų sukibimų ir vietinių ECM struktūrų, kad būtų galima moduliuoti sukibimo stabilizaciją. Be to, mes nustatėme naują koncepciją, paaiškinančią kontraktilinės jėgos poreikį, kai fibroblastai migruoja 3D kolagene: 3D ECM vidinės fibrilinės struktūros skatina integraino aktyvaciją ir susikaupimą, o tai reikalauja fizinės jėgos, kad būtų galima atjungti sukibimą. Šios dvi sąvokos iliustruoja, kaip ląstelių struktūras, judesius ir bendrą migraciją reguliuoja 3D ECM vietiniai fiziniai požymiai.

Atradimas, kad mišrių pavienių ir lygiagrečių paketų kolageno pluoštų nevienalytėse matricose skirtumai drastiškai skiriasi adhezijos masto skirtumais, rodo, kad vidutinio 3D gelio standumo matavimai nenurodo vietinio standumo, kurį ląstelė gali „jausti“ esant fibrilų / ląstelių adhezijos skalė. Vieno kolageno pluošto standumas gali būti MPa diapazone, kai matuojamas išilgai 33, 34, 35 . Tačiau šis standumas yra daug mažesnis, kai matuojamas statmenai ilgajai ašiai, kuris dažniausiai būna atsitiktinai sulygiuotų kolageno gelių atveju ir kuris, mūsų manymu, gali atsižvelgti į kelių dydžių mechaninio standumo skirtumus. Ankstesniuose tyrimuose, apibūdinančiuose kolageno hidrogelio standumą, dažniausiai buvo naudojami tūriniai reologiniai matavimai, viršijantys ląstelių skalę, ir dažnai atliekant šlyties jėgą ekstrapoliuojant gelio standumą 25 . Mūsų išvados rodo, kad nevienalytėms matricoms vietiniai mikronų lygių skirtumai tarp atskirų pluoštų standumų greičiausiai yra svarbus veiksnys reguliuojant atskirų ląstelių adhezijos lygio mechanines reakcijas. Įrodyta, kad kiti vietiniai fibrilių mikrostruktūros pokyčiai, tokie kaip tarpfibrilių išsišakojimo laipsnis, daro įtaką endotelio ląstelių 3D vaskuliarizacijai, o kryžminis ryšys per lizilo oksidazę gali pakeisti vėžio ląstelių migraciją, tai rodo, kad kiti mikronų masto ECM standumo pokyčiai gali pakeisti ląstelių įvykius 36, 37, 38 .

Šiame tyrime mes tiksliai nenustatome, ar standumas ar padidėjęs pluošto paviršiaus plotas sukelia didesnę atsakomybę už padidėjusį sukibimo brendimą ir stabilizaciją, kurią stebime FB matricose. Tačiau mes nustatėme, kad adhezijos suderinimas išilgai fibrilės yra ypač stipriai susijęs su adhezijos stabilizavimu FB geliuose; iš tikrųjų kolageno pluoštai turi MPa standumą išilgai savo ašies, tačiau pasižymi mažesniu standumu, kai surišami iš 35 pusės. Šis atradimas gali papildyti Kubow et al. 24, kad fibrilų išlyginimas gali nulemti sukibimo dydį. Pranešama, kad bendras skaidulų dydis turi įtakos 3D migracijai 39 . Tačiau 2D tyrimų duomenys, kuriuose sukibimo dydis nėra ribojamas, rodo, kad ECM standumas yra pagrindinis sukibimo ilgaamžiškumą lemiantis parametras 9 . Vietinis mažų pluoštų sukibimų pašalinimas iš homogeninių matricų atitinka aktyvų aplinkos ląstelių zondavimą, kad būtų nustatytas tinkamas pagrindas, panašus į fibroblastinį zondavimą labai reikalavimus atitinkančiuose 2D paviršiuose 40 . Tikėtina, kad panašus zondavimas vyksta su standžiais pluoštiniais pluoštais prieš greitą stabilizavimą. Mūsų rezultatai rodo, kad fibroblastai reaguoja į pluošto standumą per jų sugebėjimą stabilizuoti adhezijas, kad būtų skatinamas migracija.

Anksčiau fibroblastų tyrimai 3D matricose parodė ląstelių adhezijos ir bendrosios morfologijos skirtumus, palyginus su 2D plokščiais paviršiais arba ląstelėmis, sėjamosiomis ant kolageno gelių 41, 42, 43, 44 . Grinnelis parodė, kad fibroblastai generuoja daugybę dendritinių procesų kolageno geliuose, kuriuos galima sustiprinti pridedant PDGF 42, tuo tarpu kiti parodė labiau į verpstą panašią, labai poliarizuotą morfologiją, panašią į 3D ląstelių išgaunamas matricas 44, 45 . Reikėtų pažymėti, kad kolageno koncentracijos skirtumai gali smarkiai pakeisti matricos porų dydį, o tai gali pakeisti ląstelių morfologiją 4 . Naudodami pastovią 3 mg ml – 1 kolageno koncentraciją, mes pastebime, kad matricos architektūra iš tikrųjų gali būti pagrindinė fibroblastų morfologijos priežastis. Mūsų HR būklės metu aptikti trumpi, ploni pluoštai, sudarantys gana sandariai austą retikulį su mažu ECM porų dydžiu, neorientuoja ląstelių procesų, tuo tarpu FB matrica, susidedanti iš surinktų storų ilgų pluoštų, turinčių didesnius porų dydžius, gali skatinti kreipimąsi į kontaktą. su keliais slapyvardžiais, besitęsiančiais išilgai fibrilių migracijos metu (2f pav. ir papildomas 1d pav.) Iš tikrųjų fibroblastai, pasėti ant storo kolageno gelio, nesugeba įsibrauti į HR ECM (<20 vertikalių mikronų per 72 valandas), tačiau per 24 valandas FB4 ECM gali perbraukti 300 vertikalių mikronų (duomenys nepateikti), o tai dar labiau paveikia matricos architektūrą. reguliuojančią migraciją. Duomenys iš Wolf ir kt. 26, taip pat mūsų pačių, rodo, kad šios dvi ECM architektūros imituoja atrastas in vivo , kiekviena iš jų sukuria skirtingas fizines kliūtis veiksmingai ląstelių migracijai.

Mūsų duomenys rodo, kad fibroblastų adhezijos 3D kolageno viduje yra panašios į tas, kurios aptinkamos iš 3D ląstelių gautose matricose, išskyrus α5 integrino 45 nebuvimą, tačiau adhezijos molekulinė sudėtis nebuvo jautri ECM architektūros skirtumams, kuriuos mes tyrėme čia. Tačiau įvyksta nuo ECM architektūros priklausomi zyxin apyvartos, sukibimo trukmės ir subrendusių ir atitraukiančių sukibimų santykiai, rodantys, kad vietinė mikroaplinka gali reguliuoti 3D sukibimo dinamiką ir ląstelių migraciją 3D, tai gali atsirasti dėl subtilių sukibimo pokyčių / ECM mova. Kaip apibendrinta 8d pav., E, padidėjęs ECM standumas daro įtaką visai adhezijos populiacijai keliais būdais: (1) padidėja adhezijos brendimas; 2) sumažėja subrendusių sukibimų, kuriems priekiniame krašte atsitraukiama, populiacija, atspindinti sustiprintą vietinę ECM / sukibimo jungtį; ir 3) padidėja labai stabilių sukibimų populiacija. Sumažėjęs zyxin mobilumas rodo efektyvesnį sukibimą / ECM jungtį su mažesne sukibimo sukibimu.

2D ląstelių migracijos metu ištirta nuo ECM priklausanti ląstelių dinamikos kontrolė. Lamelių aktino srautas rodo atvirkštinį ryšį su adhezijos tarnavimo laiku, nes ligando tankis padidėja 19 . Atvirkščiai, didėjant 2D substrato atitikčiai, padidėja trinties slydimas tarp integrinų ir apatinio ECM 13, o tai gali būti analogiška padidėjusiam sukibimo atitraukimui minkštesnėse matricose mūsų tyrime. Hence, several ECM-dependent regulators in 2D correlate with adhesion lifetime and dynamics, as we observed in 3D environments. Interestingly, even though we classified the majority of 3D adhesions as intermediate, it is the small nascent, retracting and highly stable adhesion populations that determine the cellular response and become rate limiting. Recent evidence suggests these types of population-based shifts can occur at the molecular level within adhesions 46 .

So how does this local regulation of adhesions by fibre stiffness promote cell migration? Our findings suggest increased fibre stiffness can withstand the repetitive contractile pulling at adhesion sites, allowing adhesion/ECM coupling that supports adhesion stability. Stabilizing leading edge adhesions promotes further protrusion, as we previously showed for migration on 1D fibre-like micropatterns 20 . These adhesions provide an anterior foothold and together with the stable adhesions surrounding extending pseudopods, create a mechanical axis to promote cell migration. Thus, extracellular factors can indirectly affect downstream mechanisms. The different ECM-dependent shifts in adhesion populations in low-contractility (5 μM blebbistatin) and ligand/integrin interaction experiments suggest a required force balance dictated or set by the ECM, which could be conceptualized as shifting the adhesion population above or below a critical 'balance threshold' to regulate migration (Fig. 8e). We further elaborate and present a model for the control of adhesions in 3D as supplemental information (Supplementary Fig. 8).

Previous investigations have shown a requirement for contractile force in 3D cell motility 4, 23, 42, 47, 48, 49, which for cancer cells could be pore size dependent. Here we illustrate that the loss of contractility leads to similar decreases ( ∼ 50%) in fibroblast motility regardless of the 3D matrix pore size; this surprising finding is likely due to the high degree of activated integrins. The associated elevated level of integrin binding may represent a significant rate-limiting step for fibroblast migration but not for certain cancers cells due to the differential mechanical interactions of fibroblasts within collagen gels. A discrepancy between the ECMs was only observed under low-contractility conditions (5 μM blebbistatin) and only for HR ECMs; in this condition, intrinsic cellular contractility appeared to be unbalanced with respect to the low ECM stiffness. We hypothesize that in this situation, cells likely contracted or pulled harder than the highly elastic fibres could withstand before ECM ligand interactions were disrupted. Focal adhesions are known to be sensitive to force, requiring it for their stabilization; however, continually increasing force can initiate adhesion disassembly and retraction 9, 50 . Reducing contractility with 5 μM blebbistatin allowed partial stabilization of adhesions and enhanced, rather than reduced, migration rates in HR collagen gels. This instability in HR ECMs could also be alleviated by increasing ligand interaction via FN treatment or increasing integrin activation using two different approaches. By partially reducing contractility, cellular force became balanced with the low ECM stiffness. However, a complete loss of contractility reduced the ability of cells to disengage clustered, activated integrins.

The differential regulation of 2D and 3D cell migration by cytoskeletal contractility has been a conundrum attributed to ECM-dependent confinement 4, 20, 47 . While this concept appears correct for ECMs with limited pore size (HR condition in this study), increasing matrix pore size should reduce this effect. Instead, our data suggest that for fibroblasts, a key process is disengaging clustered, activated integrins. Although integrin activation is a force-independent event, mechanical force is a prerequisite for integrin clustering and strengthening 2D adhesions 51 . Our findings that integrin clustering can occur along collagen fibrils without myosin II contractility suggests the nanoscale geometry of ECM binding sites alone may promote integrin clustering. In fact, integrin activation negated the contractility-independent acceleration of 2D migration, so this discrepancy depending on dimensionality may be due to increased drag on the membrane from enhanced integrin ligation.

While determining the roles of local 3D microenvironments in cell migration is challenging, our findings reveal the importance of local cell-matrix dynamics at the subcellular cell adhesion scale. Here a constant balancing of local internal and external mechanical signals culminates in global differences regulating the efficiency of 3D cell migration. Because in vivo ECMs with diverse architectures can be found juxtaposed to each other, or even change with age or disease progression, our results highlight the importance of understanding how these physical aspects of the ECM can alter cellular mechanics. In the future it will be pertinent to understand how other cell types, including cancer cells, diverge from this mesenchymal fibroblast blueprint of 3D mechanotransduction.

Metodai

Cells culture and transfection

Human foreskin fibroblasts (HFF) were a kind gift from Susan Yamada (NIDCR/NIH) and were derived from human foreskin tissue samples provided by the Cooperative Human Tissue Network (funded by the National Cancer Institute). HFFs were cultured in phenol red-free DMEM (Hyclone) containing 10% fetal bovine serum (Hyclone), 100 U ml −1 penicillin/streptomycin (GIBCO), and 2 mM L -glutamine (GIBCO) at 37 °C with 10% CO 2 . eGFP-zxyin null MEFs were a gift from Mary Beckerle (University of Utah) and were maintained at 37 °C and 5% CO 2 in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (Hyclone).

Plazmidės ir transfekcijos

pmApple-paxillin was from Mike Davidson (Florida State University). pEYFP-paxillin was generated by subcloning the sequence encoding human paxillin into the HindIII–XbaI sites of pEYFP-C1 (Takara Bio Inc.) that contained a modified multiple cloning site. pEGFP-tensin 1 was described previously 52 . pEYFP-talin was generated by subcloning the sequence encoding human talin (from Richard Hynes) into the Not1-EcoR1 sites of pEYFP-NBC1 that contained a modified multiple cloning site. EGFP-lifeact was purchased from Ibidi. Plasmids were transfected into fibroblasts by electroporation using a Bio-Rad Gene Pulsar TM at 170 V, 960 μFd with external capacitance and a time constant of 17–22 μs in 0.4-cm gap cuvettes.

Reagentai

Sources were: dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma), Atto-488 and Atto-647N dyes (Sigma), mouse anti-vinculin (Sigma, 1:200, Cat# V9131-.5ML), rat anti-mouse CD29 (clone: 9EG7; BD Pharmingen, 10 μg ml −1, Cat# 553715 ), mouse anti-paxillin (BD Pharmingen, 1:75, Cat# 610052), mouse anti-beta 1 integrin (clone TS2/16; Novus Biologicals, 2–10 μg ml −1, Cat# NB100-77779), rhodamine phalloidin (Molecular Probes, 1:200, Cat# R415), mouse anti-phosphotyrosine (Upstate 1:100, Cat# 05-3211MG), rabbit anti-mouse collagen type I (Millipore, 1:200, Cat# ABT-123), blebbistatin (–/–; Calbiochem or Cayman Chemicals); rabbit anti-fibronectin R745, rabbit anti-beta 1 integrin (mAb13), and rabbit anti-talin (4392) were generated in our laboratory and used at 10 μg ml −1 unless otherwise specified.

Activation of glass imaging chambers

Glass-bottomed dishes (MatTek Corp., #1.5 thickness coverglass, 20-mm imaging area) were acid-washed with 68% nitric acid (Fisher Scientific) for 25 min, rinsed under a continuous flow of dH 2 O for 1 h, treated with 200 mM NaOH for 15 min, rinsed twice with dH 2 O, then dried under forced air and kept covered until needed. Triethoxysilylbutraldehyde (Gelest Inc.) was diluted to 2% in 100% ethanol then added to glass surfaces and incubated for 5 min. Silane solution was aspirated then rinsed two times with 100% ethanol and once with dH 2 O. Surfaces were then blown dry with forced air and cured at 65 °C for 2 h, and finally stored desiccated at 4 °C.

PVA blocking of glass coverslips

To locally deter collagen attachment to the center of the 20-mm imaging area, custom-made O-rings (inner diameter of 10 mm and outer diameter of 16 mm) were mechanically punched from Press-to-Seal silicone sheets (Invitrogen). O-rings were centred within the 20-mm area and firmly pressed in place, creating a watertight seal. A marker was used on the underside of the dish to indicate the inner edge of the washer for reference while imaging. PVA (molecular weight 98, 000; 98% hydrolysed; Sigma-Aldrich) was diluted in H 2 O to a 6.5% stock solution. This mixture was solubilized at 90 °C in a water bath and was immediately 0.2-μm filtered to remove impurities.1, 124 μl 2N HCl was added to 8, 876 μl of the PVA solution ( ∼ 6% PVA). 200–400 μl of the PVA solution was added to the center of each washer and incubated in a covered humid container for 40 min. The solution was gently aspirated from the surface and washed three times with dH 2 O. The aldehyde-hydroxyl bonds were reduced through treatment with 800 μg ml −1 NaBH 4 in 200 mM ethanolamine buffer for 8 min. After rinsing three times with dH 2 O, the silicone washers were removed and dishes were kept in an enclosed humid environment and used within 48 h. Cells were only imaged within the 10-mm unattached region to rule out boundary effect issues.

Collagen gel formation

Rat tail monomeric collagen was a kind gift from Greg Kitten and was prepared similar to Chandrakasan et al. 53 . Briefly, rat tail tendons were dissected out with special care given to remove fragments of bone, cartilage, blood vessels and even the tendon sheaths, all of which can contribute 'contaminating' collagens (II, III, IV and so on) and other ECM components (fibronectin, proteoglycans) which may cause lot-to-lot variations. Tendon fibres were then suspended in 0.5 M acetic acid and stirred at 4 °C for 48 h. The resulting solution of solubilized collagen was filtred through several layers of gauze and centrifuged at 14, 000 × g for 1 h. The supernatant was collected and then dialysed against three changes of acetic acid (0.02 M) at 4 °C over a three-day period. Protein concentration was determined by comparing pre and post weights following lyophilization of five to six tubes containing 1 ml of solution and was confirmed with a Sircol collagen assay kit (Biocolor).

A stock collagen I solution was generated on ice by mixing rat tail collagen I (6.03 mg ml −1 ) with 10 × DMEM (Sigma) and 10 × reconstitution buffer (200 mM HEPES, 262 mM NaHCO 3 ) in a 10:1:1 ratio. The pH was then adjusted to 7.4 with 1N NaOH. PBS ++ (PBS containing both calcium and magnesium) and cells (5.0 × 10 5 cells per ml collagen) were finally added to bring the final gel concentration to 3.0 mg ml −1 . One hundred and fifty microlitres of the gel was added to a 35-mm MatTek dish (20 mm glass, #1.5 thickness). HR Gels were polymerized at 37 °C in a tissue culture incubator (10% CO 2 ). LR and FB16 gels were polymerized on an Echotherm chilling/heating dry bath (Torrey Pines Scientific) at 21 and 16 °C, respectively. FB4 gels were polymerized at 4 °C without cells in a refrigerator after sealing the dishes with parafilm. Gel polymerization times varied between conditions and were approximately 15, 20, 45 min and overnight for HR, LR, FB16 and FB4 gels, respectively, after which all gels were allowed to reach room temperature ( ∼ 22 °C) for 10 min (30 min for the 4 °C condition) before medium or PBS ++ at the same temperature was added. Collagen turbidity assays (data not shown) were performed to verify that the collagen gels were completely polymerized using a PerkinElmer LS 55 fluorescence spectrometer (UK) with excitation and emission set to 600 and slits set to 2.5 nm. After FB4 gel polymerization, cells were added to the 3D lattice and allowed to invade for 48 h before imaging. The polymerization temperature did not affect cell viability or function, as cell migration was normal, and few if any cells showed signs of apoptosis in all conditions. For AFM experiments, gels were polymerized the day before measurements, then PBS ++ containing 100 U ml −1 penicillin/streptomycin was added as described above, sealed with Parafilm, and maintained at 4 °C until use (within 48 h).

Fluorescent labelling of collagen

To fluorescently label collagen gels, the method of Ghersi et al. 54 was modified. Briefly, 5 ml of a 3 mg ml −1 collagen I solution was polymerized at room temperature. After gelation, the gel was incubated with 50 mM borate buffer (pH 9.0) for 10 min. This was aspirated and replaced by 5 ml of a NHS-ester dye solution in the same buffer and incubated at room temperature in the dark for 1 h. The concentration of dye (diluted in DMSO) varied and was based on the dye's molar-excess calculated by the company. The dye solution was aspirated, and any remaining NHS-esters were quenched with 10 ml of 50 mM TRIS buffer (pH 7.5) for 10 min. The gel was then rinsed 6–10 times with PBS ++ over several hours. Gels were then acidified in 200 mM HCl and mixed until the gel was completely solubilized. The collagen solution was then dialysed against 20 mM glacial acetic acid (Fisher Scientific) for 4 h at a 1:1, 000 ratio. Collagen concentration was measured using a Sircol collagen assay kit. A fluorescent collagen stock solution was created and mixed in bulk (6 ml at a time) for consistency. About 2–4% of the unlabelled collagen I solution was removed and replaced with the same amount of labelled collagen (calculated based on protein weight). The final collagen I solution concentration was then calculated and used for all experiments.

Imunofluorescencinis dažymas

All fixation and permeabilization steps were performed at 37 °C. Cells were permeabilized and fixed in 3% paraformaldehyde (Electron Microscopy Sciences), 0.5% Triton X-100 (Sigma), with 10 μg ml −1 nonfluorescent phalloidin (Invitrogen) in cytoskeletal buffer (CBS; 10 mM MES, 138 mM KCl, 2 mM EGTA, 3 mM MgCl 2 plus 5% sucrose) for 90 s, post-fixed in 4% paraformaldehyde in CBS for 15 min. Cells were rinsed 3X in PBS ++ and permeabilized with 0.5% Triton X-100 in CBS for 5 min. Cells were rinsed 5 × over 40 min with PHEM+glycine (60 mM PIPES, 2 mM HEPES, 10 mM EGTA, 2 mM MgCl 2, 100 mM glycine, pH 6.9). Non-specific sites were blocked with 20% donkey serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories), together with MOM reagent (Vector Laboratories), in PHEM+glycine buffer for 1 h. Cells were rinsed three times with PHEM+glycine over 30 min. Primary and secondary antibodies were diluted in PHEM+glycine with 10% donkey serum and incubated for 45 and 25 min, respectively. Secondary antibodies were either from Jackson ImmunoResearch Laboratories or Molecular Probes.

3D cell adhesion processing and stability calculations

To reduce the background of collagen image stacks, a rolling ball subtraction (radius=5 pixels) was applied before deconvolution. All 3D Z-stacks were then deconvolved using an adaptive point spread function with AutoQuant (Media Cybernetics, Bethesda MD). Spherical aberration was corrected and the distance from coverslip was taken into consideration during processing. The number of iterations was sample dependent. Following deconvolution, adhesion image Z-stacks were filtered using 2 × 2 low-pass filter and a 9 × 9 unsharpen mask (scaling=0.5). From these images stacks, an average projected image was subtracted from a maximum projected image for each time point to enhance adhesion structures. For deconvolved collagen Z-stacks, no other filtering was applied. The average and max projected images of these Z-stacks were added together and used for analysis and images.

3D adhesion tracking

Adhesions and/or fiduciary marks in the collagen ECM were tracked using Speckle TrackerJ, an ImageJ plugin originally developed for speckle microscopy 31 . From this analysis, adhesion lifetime and movement were calculated and vector and adhesion track images created. Briefly, the diffusing _NCC model was used to track adhesions/spots of 5 pixels or larger ( ∼ 1 micron). Intensity threshold (on a 16-bit scale) varied depending on the cell. A minimum track separation was set between 3–8 pixels. The minimum duration was set to three frames (60 s) to exclude noise spikes being counted. Link frame distance was set to three frames. Search size was set to three. All adhesions were auto-tracked by the software and then individually verified and corrected by ADD

FRAP analysis

FRAP kinetics were analysed similar to Humphries et al. 55 . Briefly, each FRAP time series was adjusted for photobleaching using ImageJ software (NIH, Bethesda, MD). To calculate t 1/2 times, fractional fluorescence was plotted based on calculations from Snapp et al. 56 .

Image

. FRAP curves were fit to single exponentials using Prizm4 by Graphpad. k off rate was analysed similar to Lele et al. 28 .

Dermal explants and mouse back skin preparations

Dermal explants were isolated from 12-week-old pregnant female ICR mouse ears (mice obtained from Harlan Laboratories) and were prepared by separating the dorsal and ventral surfaces as described by Lammermann et al. 57 Back skin was isolated from E17.5 ICR mouse embryos (with morning of plug discovery counted as E0.5; also from Harlan). All mice were housed, bred and killed according to an approved NIDCR animal study protocol. Sample were not fixed or permeabilized. Nonspecific protein-interaction sites were blocked with 20% donkey serum (Jackson Immuno-Research Laboratories) together with mouse on mouse reagent (MOM; Vector Laboratories) in PHEM buffer for 1 h. Primary and secondary antibody Alexa-fluor 488 donkey anti-rabbit, Jackson Labs) were mixed with 10% donkey serum in PHEM buffer and incubated for 1 h with 5 washes of PHEM buffer between labelling steps. Imaging was carried out using a LSM 510 NLO META confocal microscope (Carl Zeiss Inc.) equipped with a Apochromat × 63 1.2 NA water objective and a 488-nm Argon laser was used to provide excitation.

Traction force microscopy

Traction force microscopy was performed as described previously 40 . Briefly, cells transfected with M-apple-N1 were plated on polyacrylamide gels that had a stiffness of 4.3 kPa, embedded with 655 fluorescent microspheres (Life Technologies), and images acquired before and after release of cells with 10% SDS. Images of deformed and relaxed substrates were aligned using MetaMorph software, and movement of the microspheres was quantified with the ImageJ PIV plugin created by Tseng et al. 58 .

Porosity and fibril calculations

To calculate porosity, 2% Atto-488-labelled rat–tail collagen was polymerized and the different permissive temperatures and imaged on a spinning disk confocal microscope with a × 60 objective. Twenty-micrometre thick Z-stacks were imaged every 0.2 microns beginning 5 μm above the coverslip surface. These Z-stacks were then deconvolved with Autoquant software and then subdivided into 4 μm Z-stacks (20 frames), max projected to a single image, and further filtered using a custom Gaussian 5 × 5 kernel, background flattening (pixel width=15), and then a low sharpening (3 × 3) filter in MetaMorph. From these filtered images a thresholding mask was set to the average pixel intensity of the image and grayscales below this value were subtracted from the image. From these images an inverted threshold (dark threshold) was used to calculate the per cent area that was not considered a fibre and used as a per cent porosity measurement. For collagen fibril analysis, line segments were drawn across the widths and lengths of fibrils found in calibrated SIM images for HR and FB16 ECMs using MetaMorph software.

AFM force volume measurement

The collagen gels were measured by AFM, using a Bioscope Catalyst device (Bruker Santa Barbara, CA) attached to an inverted optical microscope (IX71, Olympus, Japan) in a similar manner as described previously 27, 59, 60, 61 . Briefly, the gels were probed under PBS ++ with a V-shaped cantilever (conical tipped, nominal k =0.01 N m −1 ; Bruker, Santa Barbara, CA), whose spring constant was precalibrated by the thermal fluctuations method in air. The relationship between photodiode signal and cantilever deflection was computed from the slope of the force displacement curve obtained at a bare region of a coverslip or cell culture dish (that is, a hard surface). For each gel, we used force-volume mode in which we acquired multiple force-displacement ( F - z ) curves (where F = k · d , d being the deflection of the cantilever) by monitoring F and z while the piezo translator was ramped forward and backward at constant speed (for example, 8 μm amplitude, 1 Hz and ∼ 1 μm of indentation, much less than the tip height of 2.5 to 8.0 μm) as it moved across an area defined as 32 × 32 μm 2 or 64 × 64 μm 2 . Each experimental F - z curve is fitted to the conical indenter Sneddon model:

Image

where E is the Young's modulus, ν is the Poisson's ratio, α=18° is the indenter half-angle and δ is the indentation depth 48 . The parameter ν is assumed to be the instantaneous Poisson's ratio of incompressible composites, which is 0.5 (ref. 62), as the collagen gels in aqueous environment are idealized to behave at the high rate of AFM indentation 27 . At slower deformation rates, large non-linear stress/strain or under dehydration, a wide range of Poisson's ratios have been documented for reconstituted collagen ECMs 63 and native tissues such as cartilage 64, reflecting the underling fibril microstructure and the complexity of modern materials 62, 63, 64 . The value E and the tip-gel contact point z 0 were estimated by a least-squares fit of this equation to the F - z curve recorded for each point in the gel area (for example, 32 μm × 32 μm) using Nanoscope Analysis Software. Shear modulus, G , is a very common parameter that is published alongside the Young's modulus, E , and for wet collagen gel idealized as essentially incompressible materials 62 one estimates that

Image

AFM data analysis

The AFM data were analysed using Nanoscope Analysis Software (Ver. 1.4–1.5, Bruker, Santa Barbara, CA). Considering the viscoelastic nature of collagen, we explored the force volume data (individual force versus displacement curves) by looking at the indentation force 61 . We were able to show the stress stiffening property of collagen by seeing how changes in the indentation force causes differences in the Young's modulus. When comparing collagen gels of all conditions, we see that the modulus distribution becomes narrower at higher indentation force. We used 10–100% of the baseline to trigger force fit boundaries for acquiring the Young's modulus values. We only included data points having an R 2 value predominantly between 0.8 and 0.996 and disregarded a small fraction of force curves that did not show a designed trigger force of typically 1 nN.

Statistika

Prism 4 by GraphPad software was used for all graphs and statistical analysis. One-way analysis of variance, using a Tukey post-test for more than two data sets, and Mann–Whitney t -tests, were used to establish significant differences ( P <0.05). All error bars indicate sem. In figure legends, N =the number of independent experiments, and n =the number of data points.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-8, Supplementary Discussion, Supplementary Methods and Supplementary References

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas filmas

    Structured illumination microscopy (SIM) illustrating the strikingly different architectures of homogeneous HR (top) and heterogeneous FB16 (bottom) Atto-488 labeled collagen gels 8-μm Z-stacks.

  2. 2.

    2 papildomas filmas

    SIM rotational view of a 25-μm thick FB16 Atto-488 labeled collagen gel.

  3. 3.

    3 papildomas filmas

    SIM rotational view of a 25-μm thick HR Atto-488 labeled collagen gel.

  4. 4.

    4 papildomas filmas

    Timelapse movie of a fibroblast transfected with EGFP-Lifeact (green) demonstrates contact guidance-based protrusion along bundled collagen fibrils within a FB4 ECM (red). 30 seconds between frames. Total time 45 minutes.

  5. 5.

    5 papildomas filmas

    Timelapse movie of a demonstrating of adhesion tracking within 3D FB4 collagen gels (red). EYFP-paxillin (green: 1st panel, white: panels 2-5) adhesions are shown with tracks (magenta) and vectors (green) that illustrate the local movements of cellular adhesions during 3D migration. 30 seconds between frames. Total time 33.5 minutes.

  6. 6.

    6 papildomas filmas

    Timelapse movie of a HFF expressing EYFP-paxillin (green or white) migrating through 3D HR collagen (red). Vectors (right panel) show the retrograde movement of adhesions. Red vectors illustrate adhesions that undergo rapid movement indicative of adhesion retraction. 30 seconds between frames. Total time 48.5 minutes.

  7. 7

    7 papildomas filmas

    Timelapse movie of a HFF expressing EYFP-paxillin (green or white) migrating through 3D HR collagen (red). Right panel shows dual adhesion/ECM tracking (green/red vectors, respectively). Over the lifetime of the adhesion, there is relative lack of adhesion/ECM coupling as shown by the divergence of vectors as the adhesion retracts away from the ECM. 30 seconds between frames. Total time 30 minutes.

  8. 8.

    8 papildomas filmas

    Timelapse movie of a HFF expressing EYFP-paxillin (green or white) migrating through 3D FB16 collagen (red). Right panel shows dual adhesion/ECM tracking (green/red vectors, respectively). Here in a highly stable adhesion, the relative adhesion/ECM coupling is high as demonstrated by the coinciding vector displacements. 30 seconds between frames. Total time 30 minutes.

  9. 9.

    9 papildomas filmas

    HFF expressing EYFP-paxillin (green or white) migrating through 3D FB16 collagen (red). Cell was treated with 25 μM blebbistatin at the indicated time point. Note the increase in protrusion and reduced cell body translocation occurring after the relaxation of the ECM. Stage was moved during imaging, and then realigned to track cells over long time periods. 5 minutes between frames. Total time 5 hours.

  10. 10.

    10 papildomas filmas

    HFF expressing EYFP-paxillin (green or white) migrating through 3D FB16 collagen (red). Cell was treated with 25 μM blebbistatin and 1 μg ml -1 mAb13 to reduce β1 integrin binding. Inhibitors were added at the indicated time point. Protrusion initially occurs without cell body translocation. However, this is followed shortly by a release of the cell body, which slips through the ECM, rescuing the contractility-deficient condition. Stage was moved during imaging, and then realigned to track cells over long time periods. 5 minutes between frames. Total time 6 hours.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.