Interleukino 33 ekspresijos praradimas storosios žarnos kriptoje - potencialus ligos remisijos žymeklis opinio kolito metu | mokslinės ataskaitos

Interleukino 33 ekspresijos praradimas storosios žarnos kriptoje - potencialus ligos remisijos žymeklis opinio kolito metu | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Interleukinai
  • Transliaciniai tyrimai
  • Opinis kolitas

Anotacija

Interleukinas 33 (IL-33) yra citokinas, kuris, visų pirma, yra padidėjęs ūminio opinio kolito (UC) atvejais ir daro įtaką jo patogenezei. IL-33 vaidmuo žarnyno uždegime yra nevisiškai suprastas, aprašytos tiek priešuždegiminės, tiek reguliuojančios savybės. Taip pat yra prieštaringų pranešimų apie ląstelių šaltinius ir IL-33 tarpląstelinę vietą storosios žarnos gleivinėje, pagrindžiančius atidžiau pažvelgti į IL-33 raišką tiksliai apibrėžtose klinikinėse UC stadijose. Iš viso 50 tyrime dalyvavusių pacientų (29 UC pacientai ir 21 sveika kontrolinė grupė) buvo įtraukti iš būsimos pacientų, sergančių uždegiminėmis žarnyno ligomis, grupės, gydomos iki ligos remisijos infliksimabu, naviko nekrozės faktoriaus alfa (TNF) inhibitoriumi, grupės. Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis tyrimas, tiriantis gleivinės IL-33 raišką prieš ir po anti-TNF terapijos. Atliekant storosios žarnos gleivinės biopsijas, IL-33 geno ekspresijos padidėjimas padidėjo 3 kartus, lyginant ūminį UC ir sveiką kontrolinę grupę (p <0, 01). Žymiai sumažėjęs IL33 sumažėjimas tarp ūminio UC ir ligos remisijos, kai TNF normalizavosi gleivinėje (p = 0, 02). Imuninis dažymas atskleidė IL-33 išsklaidytų storosios žarnos kriptų epitelinių ląstelių branduoliuose ūmios ligos metu, o remisijos metu IL-33 nebuvo aptinkamas. Tai yra naujas atradimas, rodantis, kad uždegimo mediatoriai sukelia ir palaiko enterocitų gautą IL-33.

Įvadas

Opinis kolitas (UC) yra lėtinė uždegiminė žarnyno liga (IBD), kuriai būdingas nuolatinis poodinio storosios žarnos uždegimas. Patogenezė yra sudėtinga ir atrodo susijusi tiek su genetiniu jautrumu, tiek su aplinkos veiksniais, kurie kartu lemia pusiausvyros sutrikimą tarp priešuždegiminių ir priešuždegiminių citokinų žarnyno gleivinėje ir lėtinio uždegimo išsivystymą 1, 2 . Šią prielaidą patvirtina sėkmingas priešuždegiminio citokinų naviko nekrozės faktoriaus alfa (TNF) slopinimas, kuris pasirodė esąs efektyvus gleivinės gijimui esant IBD 3, 4 .

Interleukinas 33 (IL-33), interleukino-1 citokinų šeimos narys, sukėlė susidomėjimą IBD tyrimų sritimi po to, kai buvo pranešta apie jo 5, 7, 7, 7, 9, 9, 9, 9 derereguliaciją . Visų pirma, IL-33 yra padidėjęs ūminio IBD metu ir ryškiausiai UC 6, 7, 8, 10, 11, 12 . Be to, genetiniai IL-33 ar jo receptoriaus IL1RL1 (slapyvardžio IL-33R, ST2) genetiniai polimorfizmai yra susiję su padidėjusia IBD rizika ir platesniu kolitu 9 . Atliekant eksperimentinį kolitą, nustatyta, kad IL-33 skatina ir uždegimą skatinančius, ir apsauginius audinių kelius 6, 13, 14, 15, 16, 17, 18, pastarasis įvertina svarbų IL-33 vaidmenį skatinant audinių gijimą ir didinant IL-33, kaip galimo terapinio taikinio, domėjimasis IBD 16, 17 .

Iš pradžių IL-33 buvo atrastas kaip aukštų endotelio venulių branduolinis faktorius 19 . Nuo to laiko buvo rastas platus ląstelių spektras, išreiškiantis IL-33, įskaitant ląsteles vietose, saugančiose kūną nuo išorinės aplinkos, tokios kaip oda, kvėpavimo takai ir virškinimo traktas 13, 20 . Terminas „alarminas“ yra naudojamas apibūdinti IL-33 vaidmenį išsiskiriant iš sužeistų ar nekrozinių ląstelių, reaguojant į audinių pažeidimus 21, 22 . Išleistas IL-33 veikia kaip stiprus žarnyno imuninės sistemos aktyvatorius, surišdamas transmembraninę IL-33 receptoriaus IL1RL1 izoformą. IL-33 / IL1RL1 kompleksas suaktyvina NF-κB (aktyvuotų B ląstelių branduolio faktoriaus kappa šviesos grandinės stipriklį) ir MAPK (mitogenų suaktyvintas baltymų kinazes), įskaitant TH2 ląstelių atsako indukciją T ląstelėse 5, 22, 23 Naujausi atradimai taip pat rodo, kad IL-33 skatina T reguliuojančių ląstelių diferenciaciją žarnyne, susijusią su apsauga nuo disreguliuojamų uždegiminių reakcijų 16 . Pelių modeliai, turintys DSS (dekstrano sulfato natrio) sukeltą kolitą, patvirtina IL-33, kaip dvigubos funkcijos citokino, hipotezę. Kelios nepriklausomos grupės parodė, kad išorinis gydymas IL-33 padidina ūminio kolito sunkumą 6, 13, 15, 24 . Įdomu tai, kad pelėms, kurioms trūksta IL-33, po sukeltos kolito epizodo 18 vėluojama atsigauti ir atsigauti. Neseniai gydant IL-33, paūmėjusį DSS kolitą, naujausioje ataskaitoje nustatyta, kad gydymas IL-33 skatina epitelio atstatymą, kurį lemia įgimtos 2 tipo limfoidinės ląstelės ir regeneraciniai augimo faktoriai 17 . Kartu tai reiškia, kad IL-33 vaidmuo opinio kolito patogenezėje skiriasi priklausomai nuo uždegimo ir gleivinės gijimo etapų.

Šio tyrimo tikslas buvo apibūdinti IL-33 moduliaciją pacientų, sergančių ūminiu UC, gydomų TNF inhibitoriumi infliksimabu, žarnyno gleivinėje ir išsiaiškinti IL-33 dinamiką gleivinės gijimo procese. Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis tyrimas, tiriantis IL-33 gleivinės reakciją po anti-TNF terapijos IBD.

Rezultatai

Tyrimo populiacija

Buvo įtraukti penkiasdešimt tyrimo dalyvių, 29 UC pacientai ir 21 sveika kontrolinė grupė. Pradinė tiriamųjų populiacijos demografija parodyta 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Gleivių IL33 mRNR kiekis padidėja ūminio ŪS metu

Kiekybinė PGR analizė atskleidė gleivinės IL33 nuorašų padidėjimą 3 kartus biopsijose iš ūminių UC pažeidimų, palyginti su sveikais kontroliniais mėginiais (p <0, 001, 1a pav.). IL33 receptoriaus IL1RL1 ekspresija taip pat buvo sureguliuota, kaip ir keletas kitų priešuždegiminių citokinų, parodytų 1a pav. Pateikti atskirų pacientų IL33 ir IL1RL1 duomenys (atitinkamai 1c, d pav.). Toliau įvertinome šio citokinų profilio moduliaciją kiekviename paciente prieš gydymą infliksimabu ir po jo (ūminė liga ir remisija), stebėdami stiprų kelių citokinų sumažėjimą, tuo tarpu IL33 ar IL1RL1 transkripto lygio pokyčiai nepasiekė statistinio reikšmingumo (1b pav. ).

Image

(A) skydelyje parodytas padidėjęs gleivinės mRNR ekspresijos padidėjimas atrinktų citokinų iš storosios žarnos biopsijų metu, lyginant ūminį opinį kolitą (n = 29) su sveika kontroline grupe (n = 21). (B) skyriuje parodytas tas pats citokinų profilis pacientams, sergantiems opiniu kolitu (n = 29), palyginus biopsijas, paimtas aktyvios ligos metu ir remisijos metu. IL33, IL1RL1 ir IL4 pokyčių nenustatyta (p> 0, 05). Rezultatai ( a, b ) pateikiami kaip kartų pokytis (2 −CT ) su vidutinėmis vertėmis, o viršutinė 95% pasikliovimo intervalo riba yra klaidų juostos. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant Mann U Whitney testą ( a ) ir Wilcoxon Signed Ranks Test ( b ), kai * p vertė <0, 01, ** p vertė <0, 001, parodyta skydeliuose. (C) ir (d) skydeliai parodo atskiras IL33 ir IL1RL1 santykinės genų ekspresijos (2 –CT ) reikšmes atitinkamai ūminei ligai ir normaliai kontrolei, o horizontalioji linija rodo vidurkį.

Visas dydis

IL33 gleivinės genų ekspresija sumažėja, kai TNF lygis normalizuojasi

IL33 geno ekspresijos sumažėjimo stoka remisijos metu šiek tiek stebino, atsižvelgiant į IL33 ekspresijos ryšį su priešuždegiminiu citokinų profiliu. Todėl mes stratifikavome savo kohortą pagal TNF normalizaciją (apibrėžtą kaip anksčiau paskelbtos normalios kontrolinės grupės 95% pasikliovimo intervalo viršutinė riba) 25, 26, gavę du pogrupius; tiems, kurių normalizuotas TNF gleivinės lygis (n = 10), ir tiems, kurių padidėjęs gleivinės TNF (n = 19). Citokinų ekspresija buvo palyginta tarp šių pogrupių, parodytų 2a pav. Žymus IL33 mRNR sumažėjimas buvo pastebėtas tik normalizuotoje TNF grupėje (p = 0, 02, žr. C pav.), Tuo tarpu mes nepastebėjome jokio skirtumo, palyginti su IL1RL1 (2a, c pav.).

Image

Pacientų, gydytų UC prieš ir po infliksimabo terapijos (ūminė liga, palyginti su ligos remisija), storosios žarnos biopsijos palyginimas buvo tiriamas realiojo laiko qPCR. Pacientai skirstomi į tuos, kuriems gleivinės TNF normalizavosi remisijos metu (n = 10), ir pacientų, kuriems ligos remisijos metu gleivinės TNF padidėjo (n = 19). Rezultatai pateikiami kaip vidutinis kartų pokytis (2 –CT ) su klaidų juostomis, žyminčiomis viršutinę 95% pasikliovimo intervalą. Labiau pastebimas uždegiminių citokinų transkripcijos sumažėjimas buvo pastebėtas grupėje, kur normalizavosi gleivinės TNF, įvertintas Wilcoxon Signed Ranks Test ( a ). Plokštėse (b, c) parodyta individuali IL33 ir IL1RL1 geno ekspresija kiekvienam pacientui, sergantiems ūmine liga (baltas taškas) ir remisijai (juodas taškas), nurodant 2 −CT, o ∆CT vertės apskaičiuotos pagal sveikos kontrolinės grupės vidurkį. . IL33 parodė reikšmingą TNF normalizuotos grupės sumažėjimą (p = 0, 02), bet ne tada, kai TNF išliko padidėjęs (p = 0, 8).

Visas dydis

Branduolinio IL-33 praradimas epitelio kripto ląstelėse išgydytoje gleivinėje

Pastebėję, kad IL33 transkripcija buvo sumažinta tik pacientams, kurių TNF lygis normalizuotas, toliau įvertinome IL-33 baltymo ekspresijos lygį imunohistochemine analize. Buvo įtraukti devyni UC pacientai, kurių gleivinės biopsijos buvo paimtos iš to paties regiono tiek esant ūmiam uždegimui (pre-infliksimabui), tiek esant remisijai. Ūminio uždegimo pažeidimuose 8 iš 9 biopsijų parodė teigiamą branduolio IL-33 signalą epitelio ląstelėse išsklaidytose storosios žarnos kriptose. Mes toliau tyrėme, ar šios kriptos buvo susijusios su kriptų abscesais ar uždegiminėmis ląstelių grupėmis, tačiau jokio skirtingo modelio neaptikome. Stebėtina, kad IL-33 nebuvo aptinkamas visose storosios žarnos kriptuose ir epitelio ląstelėse tuo metu, kai liga buvo remisija po gydymo infliksimabu (žr. 3 pav.). Tarptinklinis susitarimas dėl IL-33 teigiamų ląstelių kiekybinio nustatymo davė svertinį kappa koeficientą 0, 83 (duomenys pateikti papildomoje S1 lentelėje).

Image

(A) skydelyje rodomos 3 reprezentatyvių pacientų, sergančių ūminiu UC, gaubtinės žarnos biopsijos, gydomos infliksimabu (anti-TNF) iki ligos remisijos. Endoskopinės biopsijos buvo paimtos iš labiausiai uždegiminių storosios žarnos regionų prieš gydymą infliksimabu (ūminė liga) ir pakartotos iš to paties regiono remisijos metu. Biopsijos buvo fiksuotos formalinu, parafinas buvo įterptas imunofermentiniu IL-33 (rudos spalvos) dažymu, naudojant monokloninį pelės antikūną (Nessy-1). IL-33 teigiamos ląstelės pastebimos epitelio kriptoje ūminės ligos metu. Remiantis liga, epitelio dažymas IL-33 nebuvo pastebėtas. Ląstelių branduoliai (mėlyni), padengti hematoksilinu. Mastelio juosta = 0, 1 mm. (B) skyriuje parodyta reprezentatyvi visa ūminio opinio kolito (padidinimo x40) biopsija, nudažyta kaip aprašyta aukščiau, o dėžutėse - didelės galios padidinimas. Mastelio juosta = 0, 05 mm. (C) skydelyje parodytas IL-33 teigiamų ląstelių, esančių mm 2, kiekis kiekvienam pacientui (n = 9) epitelyje ir lamina propria.

Visas dydis

IL-33 lamina propria

IL-33 raiška UC pažeidimų lamina propria daugiausia nustatyta kraujagyslių endotelio ląstelėse ir miofibroblastų tipo ląstelėse 7, 11 . Kiekybiškai įvertinus IL-33 teigiamas ląsteles šiame skyriuje, teigiamas IL-33 ląstelių skaičius lamina propria nepakito, lyginant ūminį UC ir ligos remisiją (3c pav.). Normalioje kontrolinėje grupėje (n = 10) buvo pastebėtos tik kelios IL-33 teigiamos lamina propria ląstelės, dauguma jų morfologiškai įvertintos kaip kraujagyslių endotelio ląstelės, atitinkančios ankstesnes ataskaitas 7, 27 . Normalios kontrolinės grupės epitelio kraštinėje ar storosios žarnos kriptoje nebuvo pastebėta IL-33 ekspresuojančių ląstelių (4 pav.).

Image

Plokštėse (a, b) pateikiamos formalinu fiksuotos, parafino pavidalu įterptos biopsijos su imunofermentiniu IL-33 (rudos spalvos) nustatymu, naudojant monokloninį pelės antikūną (Nessy-1), kurio koncentracija yra [1 μg / ml], o ląstelių branduoliai (mėlyni) priešingi hematoksilinui. (A) skydelyje pateiktos reprezentatyvios 3 sveikų kontrolinių organų storosios žarnos biopsijų dalys. Epitelio ląstelėse nebuvo pastebėtas IL-33 dažymas. IL-33 teigiamos ląstelės pastebimos stromoje, daugiausia susijusios su kraujagyslių endotelio ląstelėmis (juoda rodyklė). Mastelio juosta = 0, 1 mm. Skydelis (b) rodo iš kairės į dešinę; ūmus UC su IL-33 teigiama gaubtinės žarnos kripta, izotipu ir koncentracija atitiko kontrolę iš tos pačios biopsijos ir teigiamą kontrolę naudojant žmogaus tonzilių audinį. Mastelio juosta = 0, 1 mm. Iš ūmaus UC pagamintos formalinu fiksuotos, parafinu įterptos storosios žarnos biopsijos imunofluorescenciniai vaizdai ( c ) su dvigubu dažymu IL-33 polikloniniam ožkos antikūnui (raudonas) ir IL-33 monokloniniam pelės antikūnui (žalias). Sujungtas vaizdas (kairėje) rodo gerą abiejų antikūnų lokalizaciją (žr. Baltą rodyklę), patvirtinantį antikūnų specifiškumą. Ląstelių branduoliai išlyginami Hoechst. Mastelio juosta = 20 um.

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime stebėjome selektyvų branduolio IL-33 indukciją enterocituose išsklaidytose ūminių UC pažeidimų kriptose. Stebėtina, kad ši išraiška buvo prarasta po sėkmingo anti-TNF gydymo remisijai gydyti. Tai yra nauji atradimai, suteikiantys įžvalgos apie dinamišką IL-33 raišką tiksliai apibrėžtose klinikinėse UC stadijose.

Nors nuolat nustatyta, kad IL-33 padidėjęs ūminis UC, literatūroje yra skirtumų, susijusių su jo ląstelių vieta 6, 7, 8, 28, 29, ypač epitelio žarnyno barjeru 6, 7, 8, 29 . Šiame tyrime mes nustatėme, kad IL-33 buvo pacientų, sergančių ūminiu UC, išsklaidytų epitelio kriptų ląstelių branduoliuose, tuo tarpu ligos remisijos ir sveikų kontrolinių medžiagų metu jo nebuvo galima nustatyti. Šie duomenys rodo, kad IL-33 gali būti uždegimo sukeltas veiksnys žmogaus žarnyno epitelio barjerui. Tam pagrindžiant naujausiuose kitose epitelio barjerų vietose atliktuose tyrimuose aprašyta, kad branduolinis IL-33 yra susijęs su uždegimu, darančiu poveikį bendram IL-33 reguliavimo keliui, įskaitant stemplės plačia epitelio ląsteles ir odos epitelio barjero keratinocitus 30, 31 Mes iškėlėme hipotezę, kad atsitiktinis IL-33 teigiamų žarnyno kriptų pasiskirstymas gali būti susijęs su sunkesnio uždegimo vietomis, tokiomis kaip kriptų abscesai, artumas epitelio sužalojimui ar uždegiminių ląstelių sankaupos, tačiau mes nepastebėjome jokio skirtingo modelio. Reikia atsižvelgti į biopsijos orientacijos skirtumus ir jie galėjo nepakankamai įvertinti mūsų radinius dėl IL-33 teigiamų ląstelių. Kita hipotezė yra tai, kad enterocitų gautas IL-33 sukelia vietiniai aplinkos veiksniai individualiuose storosios žarnos kriptų liumenuose, todėl pastebimas išskaidytas pasiskirstymas.

IL-33 apibūdinamas kaip dvigubų funkcijų citokinas, susijęs su jo, kaip endogeninio aliarmino, vaidmeniu, taip pat su jo branduolinėmis, transkripcinėmis represinėmis funkcijomis 21 . Mes nustatėme, kad IL-33 yra epitelio ląstelėse kartu su uždegimu, tačiau mūsų duomenys nereiškia, ar šioje aplinkoje IL-33 gali būti uždegiminio atsako induktorius ar slopiklis. Be to, vis dar nežinomi jo žemėjimo, skilimo ar sekrecijos iš branduolių mechanizmai. Ateities tyrimai turėtų būti skirti suprasti, kurie uždegimo mediatoriai sukelia ir reguliuoja IL-33 raišką kripto ląstelėse, ir tai yra mūsų tyrimų grupės dėmesio sritis.

IL33 gleivinės geno ekspresija buvo padidinta esant ūminiam UC, kartu su kitais žinomais ūmaus uždegimo tarpininkais, įskaitant TNF. Gleivinės TNF ekspresijos normalizavimas anksčiau buvo susijęs su ilgalaikiu ligos remisija UC 32 . Įdomu tai, kad pacientų pogrupyje (n = 10), kuriems pavyko normalizuoti gleivinės TNF lygį, įskaitant žymų IL-33 sumažėjimą (p = 0, 02), nustatėme ryškesnį uždegiminių citokinų reguliavimą. Priešingai, IL33 išliko sureguliuotas pacientų grupėje su padidėjusiu TNF kiekiu klinikinės remisijos metu (žr. 2 pav.). Šie radiniai gali rodyti IL33 žarnyno gleivinėje normalizavimo laiką, galbūt priklausomą nuo priešuždegiminių citokinų, įskaitant gleivinės TNF, išsamesnio normalizavimo. IL33 receptorius IL1RL1 parodė panašią tendenciją, tačiau tai turi būti aiškinama atsargiai, nes mūsų tyrimas neskyrė skirtumų tarp membraninių ir tirpių IL1RL1 izoformų - problemą, į kurią reikėtų atkreipti dėmesį būsimuose tyrimuose. Remiantis aukščiau pateiktais duomenimis, mes siūlome, kad gleivinės IL33 raiška būtų sumažinta tik remisijos stadijoje, kuri leistų normalizuoti gleivinės TNF lygį.

Šiame tyrime aprašėme pacientų, sergančių kliniškai panašia ligos eiga, grupę, kurioms gydymas anti-TNF metu buvo atliekamas nuo ūmaus UC iki ligos remisijos. Biologinis kitimas buvo sumažintas palyginus to paties paciento serijos biopsijas. Mes taip pat sugebėjome ištirti gleivinės IL-33 atsaką į TNF moduliavimą in vivo . Priešingai nei reikšmingas epitelio IL-33 sumažėjimas, pastebėtas reaguojant į anti-TNF, mes negalėjome aptikti jokio IL-33 teigiamų lamina propria ląstelių sumažėjimo (žr. 3 pav.). Prie šio rezultato gali prisidėti keli veiksniai, įskaitant skirtingą IL-33 ekspresijos reguliavimą ląstelėje. Endotelio ląstelės, stebimos kaip pagrindinis IL-33 teigiamų ląstelių šaltinis remisijos metu, rodo konstitucinę nuo Notch priklausomą IL-33 raišką, o šis reguliavimo mechanizmas nebuvo aprašytas kitų tipų ląstelėse 33 . Kiti veiksniai yra mėginio dydis (n = 9), o endoskopinės biopsijos imamos tik iš storosios žarnos gleivinės paviršiaus, išskyrus gilesnius stromos sluoksnius iš mūsų analizės.

Ligos remisijos pasiekimas yra susijęs su geresne UC prognoze ir yra pagrindinis terapijos tikslas 34 . Neišspręsti klausimai apima tai, kada terapija gali būti sėkmingai nutraukta pasiekus ligos remisiją. Remdamiesi ankstesniais atradimais mes siūlome, kad klinikinių ir endoskopinių kriterijų nepakanka norint nustatyti ligos remisiją, taip pat reikia įrodymų, kad uždegiminių mediatorių gleivinė normalizuojasi 26, 32 .

Išvada

Mes apibūdinome IL-33 raišką tiksliai apibrėžtose klinikinėse opinio kolito stadijose. IL-33 buvo enterocitų branduoliuose išsklaidytose storosios žarnos kriptose esant ūminiam opiniam kolitui, tačiau šių ląstelių nebuvo klinikinės ligos remisijos metu. Bendras IL-33 gleivinės genų ekspresijos sumažėjimas buvo pastebėtas tik pacientams, kurių gleivinės TNF lygis normalizuotas. Atsižvelgiant į ląstelių buvimo vietą, reikalingi tolesni tyrimai, skirti ištirti IL-33 reguliavimo ir branduolinį vaidmenį. Epitelio IL-33 ekspresijos sumažėjęs reguliavimas gali būti naudojamas kaip remisijos žymeklis UC kartu su kitais biomarkeriais, įskaitant gleivinės TNF.

Medžiagos ir metodai

Tyrimo protokolą, įskaitant biologinių mėginių saugojimą, patvirtino Šiaurės medicinos ir sveikatos tyrimų etikos regioninis komitetas (nuorodos Nr. 1349/2012) ir jis buvo vykdomas pagal Helsinkio principų deklaraciją. Iš visų dalyvių buvo gautas rašytinis ir informuotas sutikimas.

Tyrimo populiacija ir įtraukimo kriterijai

Pacientai buvo įdarbinti iš perspektyvaus tyrimo, kuriame dalyvavo IBD pacientai Šiaurės Norvegijos universitetinėje ligoninėje, ≥ 18 metų. Gleivinės biopsijos buvo gautos iš pacientų, sergančių vidutinio sunkumo ir sunkiu UC, nustatomu pagal Majo balą ≥ 6 pradiniame 35 lygyje . Pacientai buvo diagnozuoti pagal nustatytus klinikinius, endoskopinius ir histologinius kriterijus 36 . Visi pacientai buvo gydomi infliksimabu (anti-TNF terapija) į veną 5 mg / kg dozėmis 0, 2 ir 6 savaites ir kas 4 savaites iki ligos remisijos, apibrėžtos kaip „Mayo“ balas ≤ 2, endoskopinis pokytis - 0 arba 1. Išskyrimas. kriterijai buvo anti-TNF terapija per pastarąsias 12 savaičių, nėštumas, ankstesnis vėžys ar pirminis sklerozuojantis cholangitas. Kontrolinę grupę sudarė pacientai, kuriems atlikta endoskopija ambulatorijoje žarnyno vėžio patikrai. Šios grupės išskyrimo kriterijai buvo viduriavimas ir storosios žarnos polipai. Visų kontrolinių grupių atlikta normali kolonoskopija ir histologiškai normali storosios žarnos gleivinė, kurią įvertino du patologai.

Storosios žarnos biopsijos

Prieš pradedant gydymą infliksimabu buvo gautos endoskopinės gleivinės biopsijos iš labiausiai uždegusios žarnos srities, o remisijos metu - iš to paties regiono gauta nauja biopsija. Sveikų kontrolinių asmenų gleivinės biopsijos buvo paimtos iš tiesiosios žarnos arba sigmoidinės žarnos. Gleivinės biopsijoms, kurios buvo nedelsiant panardintos į 10% formaliną arba RNR, buvo naudojamos standartinės endoskopinės biopsijos žnyplės (Ambion Inc., Austin, TX, USA). RNR buvo išskirta naudojant Promega metodą (Promega Corp., Madison, WI, JAV), anksčiau išsamiai paskelbtą 26, 37, arba naudojant AllPrep RNR / DNR miniKit, naudojant Qiacube (Qiagen, Hilden, Vokietija), ir laikoma –70 ° C.

Kiekybinė PGR analizė

Pagal gamintojo instrukcijas atvirkštinė transkriptazė buvo atlikta naudojant „Quantitect 2“ rinkinį (Qiagen, Hilden, Vokietija). Gleivinės citokinai buvo išmatuoti dviem egzemplioriais, naudojant hidrolizės zondus. Beta aktinas (ACTB) buvo naudojamas kaip etaloninis genas normalizacijai. Anksčiau buvo išbandytas ACTB stabilumas esant dabartinei padėčiai 26 . Teigiama ir neigiama kontrolė buvo įtraukta į kiekvieną plokštelę su standartizuotomis ciklo ribomis. Tyrimai, išskyrus gama interferoną (IFNG), buvo atlikti vidiniuose ir išvardyti papildomoje S2 lentelėje. Visi duomenys buvo išreikšti naudojant ∆CT reikšmes, o kartų pokytis išreikštas kaip 2 ∆∆CT . Laboratorijos tyrėjai buvo aklai įsimenami į klinikinius duomenis.

Imuninis dažymas

Formalinu fiksuotų, parafinu įterptų biopsijų sekcijos (4 μm) buvo deparafinuotos ir rehidratuotos. Antigenas buvo imamas citrato buferiniame tirpale, pH 6, vandens vonioje 100 ° C temperatūroje 20 minučių, po to 20 minučių aušinamas. Pelių IL-33 monokloninis antikūnas („Nessy-1“, „Enzo life Sciences“) buvo naudojamas 1 μg / ml arba polikloninis ožkos antikūnas IL-33 - 0, 1 μg / ml (AF3625, R&D Systems). Pirminiai antikūnai buvo inkubuojami 60 minučių kambario temperatūroje arba per naktį 4 ° C temperatūroje. Fermentinis aptikimas naudojant 3, 3 diaminobenzidiną buvo atliktas naudojant DAKO pavyzdžių rinkinį (DAKO, Glostrup, Danija), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, ir uždengtas hematoksilinu. Neigiama kontrolė buvo atliekama reguliariai, kai pirminis antikūnas buvo pakeistas izotipu ir koncentracija suderintu antikūnu (pelės IgG1, DAKO). Tonzilinis audinys buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. Imunofluorescencijos aptikimui stikleliai buvo užblokuoti 10% asilo serumu (20 minučių). Buvo naudojami antriniai antikūnai, konjuguoti su Alexa488 arba Alexa546 (Life Technologies), o Hoechst (33258, Life Technologies) - kaip priešpilnis.

Vaizdai buvo gauti naudojant „Olympus BX51“ mikroskopą su „Olympus U-TVO.5XC“ kamera naudojant „AnalySIS 3.2“ programinę įrangą (minkšta vaizdo gavimo sistema). Imunofluorescenciniai vaizdai buvo padaryti naudojant Zeiss Axio stebėtoją, Z1 LSM780 CLSM sistemą („Carl Zeiss Microscopy GmbH“, Jena, Vokietija), kuriant „Zen 2012“ (juodasis leidimas) programinę įrangą. Vaizdai buvo apdoroti „Adobe Photoshop CS6“ („Adobe Systems Software Ireland Ltd“, Dublinas, Airija), vaizdų histogramų koregavimai buvo taikomi tik ištisiems vaizdams. Du nepriklausomi stebėtojai (SWS, MDG) atliko IL-33 teigiamų ląstelių kiekybinį įvertinimą. 3 reprezentatyvūs didelės apimties vaizdai iš padidinimo x 400 per biopsiją, kai buvo suskaičiuotos teigiamos ir neigiamos epitelio ir kripto ląstelės ir susumuotos į šias kategorijas: neigiamos <1%, silpnos 1–9%, vidutinio 10–24%, didelės 25–49%. ir labai didelis ≥ 50%. Teigiamos stromos ląstelės buvo suskaičiuotos viename mm 2, remiantis NIS elementų AR 3.1 programinės įrangos (Nikon Instruments, Europa) biopsijos ploto skaičiavimais.

Statistiniai metodai

Visa statistika atliekama naudojant „IBM SPSS“ statistikos versiją 22.0 („IBM corp.“, „Armonk“, NY, JAV) arba „GraphPad Prism“ 6.03 versiją („La Jolla“, CA, JAV). Normalumo brėžiniai buvo įvertinti naudojant histogramas ir Shapiro-Wilks testą, naudojant tinkamą t-testą arba lygiavertį neparametrinį testą. Tiriamųjų intervakcinis kitimas buvo įvertintas naudojant svertinę Coheno kappa imunohistochemijos analizei.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Gundersen, MD et al . Interleukino 33 ekspresijos praradimas storosios žarnos kriptoje - potencialus ligos remisijos žymeklis opinio kolito metu. Mokslas. Rep. 6, 35403; „doi“: 10.1038 / srep35403 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.